一种用于治疗2型糖尿病合并冠心病的药物

1.本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种用于治疗2型糖尿病合并冠心病的药物。


背景技术：

2.2型糖尿病是一种常见的代谢性疾病，其患病率逐年增长。目前，2型糖尿病已经不再只是发达国家的富贵病，包括中国在内的发展中国家也已经变成了2型糖尿病的重灾区。2型糖尿病一般会引起全身血管破坏损伤，因为其受累血管遍及全身，且不可逆转，因此，2型糖尿病已经成为现代疾病中的重要杀手。
3.血糖的持续升高是2型糖尿病患者的显著特点，长期高血糖使2型糖尿病患者患心血管疾病的概率较非糖尿病人显著提高，而糖尿病合并冠心病则是其心血管并发症致死或致残的主要原因。患2型糖尿病合并冠心病是糖尿病性冠心病的一种，是在2型糖尿病的基础上导致冠状动脉粥样硬化或冠状动脉功能改变，心脏血腔狭窄、阻塞或心脏局部缺血、缺氧甚至坏死的心脏病。因此，需要实现2型糖尿病的早诊断和早治疗，从而提升患者的生存质量。
4.同时，现有的研究发现，长期的糖脂代谢异常导致内皮功能障碍，因此有效的降低高糖所导致的内皮损伤将有助于2型糖尿病合并冠心病的治疗。


技术实现要素：

5.本发明要解决的问题是提供一种用于治疗2型糖尿病合并冠心病的药物和提供一种诊断2型糖尿病合并冠心病的标志物。
6.为解决上述问题，本发明提供了如下技术方案：一种用于治疗2型糖尿病合并冠心病的药物，所述用于治疗2型糖尿病合并冠心病的药物含有lncrna-ac141930.2的sirna和药物载体。
7.进一步地，所述药物载体为胆固醇、脂质体、纳米颗粒中的一种或多种；进一步地，所述药物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮给药等方式进行给药。
8.进一步地，所述lncrna-ac141930.2的转录本序列如seq id no.1所示，所述sirna的序列如seq id no.4和seq id no.5所示。
9.lncrna-ac141930.2的sirna在制备治疗糖尿病合并冠心病药物中的应用。
10.进一步地，所述lncrna-ac141930.2的转录本序列如seq id no.1所示，所述sirna的序列如seq id no.4和seq id no.5所示。
11.lncrna-ac141930.2的sirna在制备抑制高糖引起的细胞衰老的生物制剂中的应用。
12.进一步地，所述lncrna-ac141930.2的转录本序列如seq id no.1所示，所述sirna
的序列如seq id no.4和seq id no.5所示，所述细胞为人微血管内皮细胞。
13.lncrna-ac141930.2的sirna在制备抑制高糖引起的细胞血管生成能力降低的生物制剂中的应用。
14.进一步地，所述lncrna-ac141930.2的转录本序列如seq id no.1所示，所述sirna的序列如seq id no.4和seq id no.5所示，所述细胞为人微血管内皮细胞。
15.检测lncrna-ac141930.2表达量的试剂在制备诊断糖尿病合并冠心病试剂盒中的应用。
16.进一步地，所述lncrna-ac141930.2的转录本序列如seq id no.1所述，所述试剂为lncrna-ac141930.2的pcr引物，所述pcr引物的序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
17.本发明的有益效果是：本发明所提供的lncrna-ac141930.2的sirna可以降低高糖导致的人微血管内皮细胞衰老并且可以降低高糖导致的人微血管内皮细胞成管能力下降，因此可将其用于制备治疗2型糖尿病合并冠心病的药物。同时，本发明所提供的lncrna-ac141930.2可以作为标志物来诊断糖尿病合并冠心病的患者。
附图说明
18.图1 lncrna-ac141930.2在不同分组中的表达差异；图2 健康对照组和2型糖尿病合并冠心病组间的roc曲线；图3 2型糖尿病组和2型糖尿病合并冠心病组间的roc曲线；图4 冠心病组和2型糖尿病合并冠心病组间的roc曲线；图5 高糖对于人微血管内皮细胞中lncrna-ac141930.2的rna水平的影响；图6 本发明所设计的si-lnc的干扰效果；图7 si-lnc对于高糖引起的人微血管内皮细胞的细胞衰老的影响；图8 si-lnc对于高糖引起的人微血管内皮细胞的细胞成管能力的影响。
具体实施方式
19.为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式对本发明的内容进行进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前体下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
20.实施例1（1）收集正常人外周血血液（30例，健康对照组），2型糖尿病患者外周血血液（30例，2型糖尿病组），冠心病患者外周血血液（30例，冠心病组）2型糖尿病合并冠心病患者外周血血液（30例，2型糖尿病合并冠心病组），各组之间年龄，性别差异无统计学意义，患者自愿参加本研究，并填写知情同意书；（2）糖尿病诊断标准：空腹血糖≥7.0 mmol
·
l
－ 1
，或随机血糖≥11.1 mmol
·
l
－ 1
；冠心病诊断标准：冠状动脉造影检查至少有1支心外膜大血管狭窄≥50；（3）糖尿病合并冠心病的诊断标准：空腹血糖≥7.0 mmol
•
l － 1，或随机血糖≥
11.1 mmol
•
l － 1且冠状动脉造影检查至少有1支心外膜大血管狭窄≥50%；（4）排除标准：糖尿病组排除糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、高血压病、周围动脉硬化症，正在服用降糖、降脂、降压及使用胰岛素治疗的患者；急慢性感染、肝肾功能不全、严重脑血管意外、恶性肿瘤、风湿、免疫系统疾病、甲亢、痛风及垂体疾病等内分泌疾病病史；女性患者需要排除哺乳期及妊娠可能；存在心理疾病的患者；（5）抽取实验入选者的清晨空腹静脉血，使用离心机3000r/min离心15min后取上清，得到样本血清。
21.实施例2提取样本的rna（1）取200ul的样本血清加入到离心管中，加入200ul的rna裂解液，震荡混匀30s；（2）室温下放置5min之后，12000rpm离心10min后，吸取上清至新的离心管中；（3）加入200ul氯仿，震荡15s之后，室温下放置5min后，12000rpm离心15min，将上层的水相转移至新的离心管中；（4）加入等体积的异丙醇，混匀后放置10min后，12000rpm离心10min，弃去上清，保留沉淀；（5）加入500ul预冷的depc水配置的70%乙醇溶解沉淀后，8000转离心5min，进行1次重复后，弃去上清，室温干燥10min后，加入depc水，得到rna。
22.实施例3逆转录反应（1）逆转录过程参照takara公司的primescript
™ꢀ
rt reagent kit 试剂盒进行操作;（2）配置如下的反应体系：试剂使用量5
×
primescriptbuffer（forrealtime）2.0
µ
lprimescriptrtenzymemixi0.5
µ
loligodtprimer（50μm）*10.5
µ
lrandom6mers（100μm）*10.5
µ
ltotalrna500ngrnasefreedh2oupto10
µ
l（3）按照如下条件在pcr仪上进行逆转录反应：37℃ 15 min *3；85℃ 5s；4℃静置5min。
23.实施例4pcr反应（1）pcr反应参照takara 公司 tb green
®ꢀ
premix ex taq
™ꢀ
ii 试剂盒步骤进行操作；（2）配置如下的反应体系：试剂使用量
tbgreenpremixextaqii（tlirnasehplus）12.5
µ
lpcrforwardprimer（10μm）1.0
µ
lpcrreverseprimer（10μm）1.0
µ
lcdna模板2.0
µ
l灭菌水8.5
µ
ltotalupto25
µ
l（3）按照如下反应条件进行反应：step1 95℃ 30s，step2 95℃ 5s，60℃ 30s 40 cycle；（4）设计并合成本发明所要检测的lncrna-ac141930.2的引物序列：基因名称引物序列（5'to3'）产物长度lncrna-ac141930.2ggctgcacattcgttaccac，seqidno.2114bplncrna-ac141930.2acgaccacagtgactcaacc,seqidno.3 （5）得到的结果如图1所示。
24.相较于健康对照组，2型糖尿病组的lncrna-ac141930.2的表达量为0.93
±
0.53，差异无统计学意义，冠心病组的lncrna-ac141930.2的表达量为1.10
±
0.54，差异无统计学意义，2型糖尿病合并冠心病组的lncrna-ac141930.2的表达量为2.40，差异具有统计学意义，同时，相较于2型糖尿病组和冠心病组的差异也同样具有统计学意义。
25.根据图1的结果，绘制2型糖尿病合并冠心病组和健康对照组的roc曲线，绘制2型糖尿病合并冠心病组和2型糖尿病组的roc曲线，绘制2型糖尿病合并冠心病组和冠心病组的roc曲线，得到的曲线分别如图2，图3和图4所示，其中，图2中的auc值为0.9180，图3中的auc值为0.9278，图4中的auc值为0.8971，可以看出当使用lncrna-ac141930.2作为诊断标志物时可以有效的区分健康对照组，2型糖尿病组和合并冠心病组。
26.实施例5高糖对于人微血管内皮细胞（hmec-1）中lncrna-ac141930.2表达的影响（1）将hmec-1细胞接种于6孔板中，置于细胞培养箱中进行培养；（2）待细胞密度达到85%以上时，对照组添加普通dmem培养基，实验组a添加含有30mmol/l d-葡萄糖的dmem培养基，实验组b添加含有25mmol/l甘露醇的dmem培养基，每个分组设置3个重复；（3）细胞培养48h后，提取rna检测不同分组中lncrna-ac141930.2的表达情况。
27.实验结果如图5，其中实验组a中lncrna-ac141930.2的表达水平为3.68
±
0.52，差异具有统计学意义，实验组b中lncrna-ac141930.2的表达水平为0.98
±
0.10，差异不具有统计学意义。上述结果说明，高糖能够引起人微血管内皮细胞中lncrna-ac141930.2的表达升高，而且表达升高不是由渗透压导致的。
28.实施例6构建lncrna-ac141930.2的sirna（1）设计并合成lncrna-ac141930.2的sirna，为表示方便，命名为si-lnc，si-lnc的序列如下所示：正义链：auuucauaauugcauuugc，seq id no.4；反义链：gcaaaugcaauuaugaaau, seq id no.5；
（2）将hmec-1接种于6孔培养板中，待细胞密度达到85%以上时，将si-nc和si-lnc转染到细胞中；（3）转染48h之后，提取细胞rna，检测lncrna-ac141930.2的表达水平。
29.实验结果如图6，本发明所提供的si-lnc可以有效的抑制hmec-1细胞中的lncrna-ac141930.2的表达水平，抑制率为82.3%。
30.实施例7转染si-lnc对于高糖引起的hmec-1的细胞衰老的影响（1）将hmec-1接种于6孔培养板中，待细胞密度达到85%以上时，对照组：转染si-nc，并使用普通dmem培养基进行培养，实验组a：转染si-nc并使用含有30mmol/l d-葡萄糖的dmem培养基进行培养，实验组b：转染si-lnc并使用含有30mmol/l d-葡萄糖的dmem培养基进行培养；（2）转染48h之后，去除培养基，使用pbs清洗细胞3次；（3）加入1ml的细胞固定液固定细胞，室温放置20min；（4）固定结束后，去除固定液，使用pbs清洗细胞后，加入β-半乳糖苷酶染色液，37℃染色过夜；（5）染色结束后,去除染色液，使用pbs清洗细胞2次，加入2mlpbs后于显微镜下进行拍照，检测细胞阳性率。
31.实验结果如图7所示，可以看出，转染si-lnc可以有效的抑制高糖导致的细胞衰老。
32.实施例8转染si-lnc对于高糖引起的hmec-1成管能力降低的影响（1）实验前一天将matrigel胶置于冰盒中，放入4℃冰箱，使胶过夜缓慢融化；（2）将ecm培养基和matrigel胶按照1:1的比例进行混合，得到混合液；（3）在48孔板中，每孔加入180
µ
混合液，将48孔于37℃放置30min，使胶凝固；（4）对照组使用转染si-nc并使用普通培养基培养的细胞，实验组a使用转染si-nc并使用含有30mmol/l d-葡萄糖的dmem培养基培养的细胞，实验组b使用转染si-lnc并使用含有30mmol/l d-葡萄糖的dmem培养基培养的细胞，将500ul含有4
×
104个细胞借助于48孔板中，37℃进行孵育；（5）孵育4h后，在倒置显微镜下进行拍照，并计算分支数。
33.实验结果如图8所示，可以看出，转染si-lnc后，可以有效的恢复高糖导致的成管能力降低。