一种兽用破伤风、犬瘟热、狂犬病联合疫苗的制作方法

1.本发明属于动物疫苗领域，具体涉及一种兽用破伤风、犬瘟热、狂犬病联合疫苗。
技术背景
2.犬瘟热(cdv)是由犬瘟热病毒引起的一种高度接触性传染病，主要感染犬科动物，属二类动物疫病，通过与病兽直接接触传染，也可通过空气或食物传染。该病传染性强，死亡率高达80％以上，在犬所患的各种疾病中无论是传染强度，病情的严重程度，还是死亡率上都可列榜首。同时犬瘟热的发病过程中大多会引起细菌的混合感染。
3.破伤风是由破伤风杆菌引起的，破伤风杆菌是一种革兰氏阳性厌氧菌，存在于灰尘、土壤、人和动物的粪便中，当受外伤时，破伤风杆菌会经伤口侵入，释放出一种高度毒性蛋白——破伤风痉挛毒素，经血液循环和淋巴系统并且和血清球蛋白结合而到脑神经，引起神经症状肢体痉挛性麻痹(局部性破伤风)；破伤风痉挛毒素还可以进一步引起毒素的全身兴奋作用，如毒素量大，就会产生全身抽搐(全身性破伤风)，其特征是患病动物全身骨骼肌强直性痉挛，对外界刺激的反射兴奋性增高。
4.狂犬病是一种自然疫源性疾病,是由狂犬病毒引起的所有温血动物都易感的人兽共患性疾病,任何动物都可能患上狂犬病。一旦发病死亡率为100％，是迄今为止人类病死率最高的急性传染病。
5.目前针对犬瘟热、狂犬病主要使用减毒活疫苗，由于减毒活疫苗具有一些未知的潜在风险，比如病毒的毒力返祖增强，使本来用于预防疾病的疫苗本身具有一定的毒力，使健康的动物带病，影响动物本身及群体的健康。而对于破伤风等细菌类的疾病，目前主要采取破伤风类毒素疫苗进行预防。
6.联合疫苗由于含有二个或多个生物体或者提纯的抗原，能够同时预防多种疾病，因此有利于提高疫苗覆盖率和接种率，减少疫苗管理上的困难和接种成本，同时还可减少疫苗生产中必含的佐剂剂量，减低疫苗的不良反应，对保障动物福利和畜牧业持续健康发展具有重要现实意义。
7.目前，针对犬类已有犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病、犬传染性肝炎、犬副流感病毒等联合疫苗问世，而将以上灭活疫苗与破伤风类毒素联合的报导还很少。本发明通过将灭活的犬瘟热、狂犬病毒与破伤风类毒素进行联合，制备可以预防犬科动物犬瘟热、狂犬病、破伤风的联合疫苗。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种能够同时预防和治疗犬科动物犬瘟热、狂犬病与破伤风疾病的联合疫苗。
9.上述目的是通过以下技术方案实现的：
10.一种兽用破伤风、犬瘟热、狂犬病联合疫苗，所述疫苗包括免疫量的灭活犬瘟热病毒抗原、免疫量的灭活狂犬病病毒抗原和免疫量的破伤风类毒素抗原。
11.优选地，所述灭活犬瘟热病毒抗原的病毒含量不低于0.5x105tcid
50
/ml；所述灭活狂犬病病毒抗原的抗原效价不低于1iu/ml；所述破伤风类毒素抗原的毒素效价不低于2lf/ml。
12.进一步优选地，所述灭活犬瘟热病毒抗原的病毒含量为0.67x105tcid
50
/ml；所述灭活狂犬病病毒抗原的抗原效价为1.67iu/ml；所述破伤风类毒素抗原的毒素效价为2.33lf/ml。
13.本发明进一步提供一种制备所述联合疫苗的方法，该方法包括以下步骤：
14.(1)将vero细胞复苏、传代，分别接种犬瘟热病毒和狂犬病病毒，经增殖培养后收集病毒液，浓缩、离心后加入β－丙内酯进行灭活，经sepharose柱层析纯化后得到灭活犬瘟热病毒抗原液和灭活狂犬病病毒抗原液；
15.(2)将破伤风梭状芽孢杆菌进行培养产生毒素，经甲醛杀菌，硫酸铵精制，脱毒，除菌过滤得到破伤风类毒素抗原液；
16.(3)将三种抗原液按一定体积比进行混合，加入佐剂后进行分装，即得。
17.优选地，步骤(1)中，所述病毒接种和增殖培养的方法是：将病毒毒种用35℃水淋解冻，按0.01～0.1moi的感染指数接种vero细胞，加入含0.2～0.5％牛血清的199营养液作为维持液，置33℃～35℃进行病毒培养，培养液中按24iu/ml加入庆大霉素。
18.优选地，步骤(1)中，用100kd～300kd超滤膜进行病毒液的浓缩，浓缩倍数是20～40倍体积。
19.优选地，步骤(1)中，向浓缩、离心后的病毒液加入新配制的β－丙内酯，使β－丙内酯与浓缩液的体积比为1：4000，摇匀30分钟，放2～8℃冷库中24小时灭活后，再于37℃放置2小时进行水解。
20.优选地，所述三种抗原液的体积比为1：1：1。
21.按照上述方法，能够得到破伤风类毒素含量为6～10lf/ml，狂犬病病毒抗原含量为4～6iu/ml，犬瘟热病毒抗原含量为2～4x105tcid
50
/ml的三种原液，将三种原液按照1:1:1的比例进行混合，置2-8℃冷库环境下再进行充分搅拌结合,使得破伤风类毒素的含量每剂不低于2lf,狂犬病病毒抗原每剂效价不低于1iu，犬瘟热病毒抗原的每剂灭活前病毒含量不低于0.5x105tcid50/ml的标准。
22.本发明的有益效果是：
23.本发明利用破伤风类毒素大分子蛋白促进机体免疫应答的作用，与犬瘟热、狂犬病病毒抗原进行联合，提高了犬瘟热、狂犬病抗原的中和抗体水平，使其既能够有抗狂犬病病毒与抗犬瘟热病毒的抗体产生，同时也产生抗破伤风毒素的抗体，进行破伤风疾病的预防，做到一针预防三种疾病，减少动物饲养过程中的抗生素使用。本发明还能减少活病毒疫苗可能的风险，具有安全好、便于贮存和运输和抗母源抗体干扰等优点。
具体实施方式
24.下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
25.实施例1联合疫苗的制备
26.1.灭活病毒的制备
27.vero细胞复苏：从液氮罐中取出vero细胞迅速放入盛有37～39℃注射用水的烧杯
中摇动使其在1分钟内迅速溶化，将溶化的细胞悬液管用消毒液擦拭消毒移入操作室内。将vero细胞悬液吸出放入培养瓶中，补足培养液置37℃恒温培养，细胞培养液为含5～10％小牛血清的199培养液。
28.vero细胞传代：将细胞培养瓶中的培养液倒掉，用细胞消化液进行消化，当细胞壁上出现毛玻璃状时进行吹打混悬，将细胞悬液补足细胞培养液后置37℃恒温培养供疫苗生产使用。
29.病毒接种：将病毒毒种用35℃水淋解冻，按0.01～0.1moi的感染指数接种细胞，加入含0.2～0.5％牛血清的199营养液作为维持液，置33℃～35℃进行病毒培养，培养液中按24iu/ml加入庆大霉素。
30.病毒收获：经培养3～5天后，收获病毒液，各次收获的病毒液为病毒单次收获液，收获液置2～8℃保存不得超过3个月。
31.合并及超滤浓缩：同批细胞生产的病毒收获液可在严格无菌操作的条件下合并为1批，并经100kd～300kd超滤膜进行20～40倍体积浓缩，浓缩液经7000rpm离心30分钟进行澄清。
32.病毒灭活：澄清后的浓缩病毒液加入新配制的β－丙内酯，使β－丙内酯与浓缩液的体积比为1：4000，摇匀30分钟，放2～8℃冷库中灭活24小时后，再于37℃放置2小时水解。
33.病毒纯化：经浓缩并检定合格后的病毒液，用sepharose 4ff凝胶层析柱进行纯化。
34.原液检定：纯化后的灭活病毒进行原液检定，获得符合质量要求的病毒原液作为抗原。
35.2.破伤风类毒素原液制备：
36.破伤风梭状芽孢杆菌，用破伤风培养基经大罐深层培养产生毒素，经0.3-0.6％甲醛杀菌，硫酸铵精制，再经37℃，0.15％的甲醛15～22天脱毒，除菌过滤，精制得到破伤风类毒素原液。
37.根据上述实施方式获得一批疫苗抗原原液，按照不同抗原传统的检定方法得知该批原液混合前抗原含量分别为：破伤风类毒素的含量为7lf/ml，狂犬病病毒抗原效价5iu/ml，犬瘟热病毒抗原含量为2x105tcid
50
/ml，将三种原液按照1:1:1的比例进行混合，即可得到破伤风类毒素的含量为2.33lf/ml，狂犬病病毒抗原效价为1.67iu/ml，犬瘟热病毒抗原含量为0.67x105tcid
50
/ml的联合疫苗半成品。同时该批抗原原液每一种稀释3倍作为实验对照。
38.实施例2：联合疫苗的抗体效价
39.按照生物制品检定规程中的相关制品的检定动物进行免疫，对比联合后抗原与各单一抗原免疫后的效价。
[0040] 破伤风效价狂犬病效价犬瘟热效价实验动物小鼠小鼠大鼠3倍稀释的单一抗原7.33iu1.67iu1040iu联合抗原7.67iu3.50iu1877iu
[0041]
对比发现联合抗原免疫后检测破伤风效价没有明显变化，而狂犬病、犬瘟热抗原免疫后的抗体效价均明显高于对应的单一抗原。
[0042]
实施例3：
[0043]
由市场购买经elisa检测无相关疾病抗体的2月龄幼犬8只，分别注射联合抗原和3个单一抗原，一个月后采集血清采用市场购买的相应elisa抗体检测试剂盒进行血清抗体检测取平均值进行对比。
[0044] 破伤风效价狂犬病效价犬瘟热效价3倍稀释的单一抗原9.02.01549联合抗原8.673.832355
[0045]
上述不同动物实施例实验，可以看出本发明产品犬瘟热、狂犬病抗原的中和抗体均高于普通的单一疫苗，其效果是明显的，三种抗原经过充分的结合后同时注射机体，没有产生相互的免疫抑制，机体产生抗体的提升可能是破伤风类毒素大分子蛋白协同免疫的结果，本发明的产品从技术上既提高了相同犬瘟热、狂犬病抗原量的中和抗体水平，又同时产生了破伤风的免疫抗体，一次免疫解决了犬科动物感染犬瘟热与狂犬病的风险，同时也解决了犬科动物在其活动中感染破伤风的风险，还避免了动物感染破伤风后抗生素的使用，符合国家限制大规模使用抗生素的宏观政策，将在动物疾病的防治中起到非常重要的作用。