一种具有镇痛作用的乌头属植物二萜生物碱的高效细胞筛选方法

1.本发明属于中药利用技术领域，进一步属于中药活性成分分离提取技术领域，具体涉及一种具有镇痛作用的乌头属植物二萜生物碱的高效细胞筛选方法。


背景技术：

2.疼痛是机体对有害刺激的一种保护性防御反应，它是临床上最常见的症状之一，超过3个月的持续性或反复性疼痛，即发展为慢性疼痛，会导致一系列的生理和病理的反应，给病人带来极大的痛苦，也给病人家庭和社会带来巨大的经济负担，已成为当今困扰人类健康最严重的问题之一。据统计，全球每年有20%的成年人遭受疼痛的危害，其中10%是慢性疼痛，我国受慢性疼痛影响的人群占人口总数20~30%。
3.乌头属植物是我国传统的药用植物，常用于治疗神经痛、风湿和心力不足等。现代植物化学研究结果发现二萜生物碱是其主要活性成分，约占总重的7~10%，具有抗炎、镇痛、镇静、解热、抗肿瘤等活性。目前，从乌头属植物中鉴定和分离出约1000余种二萜生物碱，根据其母核中碳原子个数，可分为c~18型、c~19型、c~20型和双二萜生物碱。
4.乌头属植物二萜生物碱镇痛分子机制包括：通过去甲肾上腺素能和5~羟色胺能神经活化下行疼痛抑制系统，或通过抑制突触前递质释放进而抑制脊髓背角c~纤维突触长程增强效应、阻断神经元上电压依赖型钠离子通道而产生镇痛效应。根据最新的文献报道，认为乌头属植物二萜生物碱激活神经系统中小胶质细胞gs/camp/pka/p38β/creb信号通路，随后刺激强啡肽表达，激动神经突触后膜κ阿片受体而产生镇痛作用。强啡肽的表达是乌头属二萜生物碱发挥镇痛的关键。目前乌头属二萜生物碱数量多，在动物模型上进行筛选周期长，操作繁琐，难度大且经济成本高。因此，研发出高效表达强啡肽水平对乌头属二萜生物碱进行镇痛药效筛选的方法是迫切需要解决技术难题。


技术实现要素：

5.本发明目的在于提供一种技术路线简单，方法操作简便，实施成本低，基于强啡肽表达水平的细胞高效筛选方法，即具有镇痛作用的乌头属植物二萜生物碱的高效细胞筛选方法。
6.本发明的目的是这样实现的，所述的乌头属二萜生物碱镇痛作用的高效细胞筛选方法，通过下列工艺步骤实现：（1）选取小胶质细胞作为筛选细胞，用含10�s的dmem高糖培养基进行培养。
7.（2）将处于生长对数期的细胞消化，制成细胞悬液，血球计数板计数后调整细胞密度，接种于孔板中，置于培养箱中进行培养；（3）贴壁后，弃去细胞上清液，加入含有乌头属二萜生物碱的培养基，继续培养2~8h；（4）收集细胞上清液及细胞检测强啡肽基因和蛋白的表达，根据强啡肽表达水平
筛选出具有镇痛潜力的乌头属二萜生物碱。
8.（5）根据细胞筛选结果，将筛选出的部分乌头属二萜生物碱在动物疼痛模型上验证其镇痛作用。
9.本发明以hapi小胶质细胞为模型，通过乌头属二萜生物碱刺激细胞强啡肽表达水平的变化评估生物碱的镇痛作用。实验表明，细胞模型中强啡肽表达与动物行为表现一致。本发明方法可靠性强，操作简便，可高效筛选出具有镇痛作用的乌头属二萜生物碱，对于开展镇痛药物的研究与开发具有重要意义。
附图说明
10.图1为不同浓度乌头属二萜生物碱对hapi小胶质细胞系和原代小胶质细胞表达强啡肽基因的影响（`x
±
s,n=3），其中*表示该组实验数据与正常对照组比较，在统计学上有显著差异（p《0.05），***表示该组实验数据与正常对照组比较，在统计学上有极显著差异（p《0.001）；图2为乌头属二萜生物碱作用不同时间对hapi小胶质细胞系和原代小胶质细胞强啡肽基因的影响（`x
±
s,n=3），其中*表示该组实验数据与正常对照组比较，在统计学上有显著差异（p《0.05）；图3为乌头属二萜生物碱对hapi小胶质细胞系creb磷酸化、creb及强啡肽蛋白的影响；图4为乌头属二萜生物碱作用hapi小胶质细胞系后强啡肽基因的表达水平（`x
±
s,n=3），其中*表示该组实验数据与正常对照组比较，在统计学上有显著差异（p《0.05）；图5为腹腔注射乌头属二萜生物碱对完全弗氏佐剂所致大鼠炎性疼痛的抑制作用（`x
±
s,n=8），其中*表示该组实验数据与正常对照组比较，在统计学上有显著差异（p《0.05），**表示该组实验数据与正常对照组比较，在统计学上有极显著差异（p《0.01），***表示该组实验数据与正常对照组比较，在统计学上有极显著差异（p《0.001）；图6为腹腔注射乌头属二萜生物碱对完全弗氏佐剂引起的炎性疼痛大鼠脊髓强啡肽基因表达的影响（`x
±
s,n=8），其中*表示该组实验数据与正常对照组比较，在统计学上有显著差异（p《0.05），**表示该组实验数据与正常对照组比较，在统计学上有极显著差异（p《0.01）。
具体实施方式
11.下面结合与实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明的技术教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
12.本发明所述具有镇痛作用的乌头属植物二萜生物碱高效细胞筛选方法，通过下列工艺步骤实现：（1）选取小胶质细胞作为筛选细胞，用含10�s的dmem高糖培养基进行培养；（2）将处于生长对数期的细胞消化，制成细胞悬液，血球计数板计数后调整细胞密度，接种于孔板中，置于培养箱中进行培养；（3）贴壁后，弃去细胞上清液，加入含有乌头属二萜生物碱的培养基，继续培养2~8h；
（4）收集细胞上清液及细胞检测强啡肽基因和蛋白的表达，根据强啡肽表达水平筛选出具有镇痛潜力的乌头属二萜生物碱；（5）根据细胞筛选结果，将筛选出的部分乌头属二萜生物碱在动物疼痛模型上验证其镇痛作用。
13.所述步骤（1）中的小胶质细胞系是指hapi小胶质细胞系。
14.所述步骤（2）中所述消化是指在弃去培养液后加入胰蛋白酶（0.25�ta）30~40s，再用移液枪将部分还贴壁的细胞吹下后弃去胰蛋白酶；所述制成细胞悬液是指用移液枪吹打细胞制成细胞悬液。
15.所述步骤（2）中所述调整细胞密度为5
×
105个/ml。
16.所述步骤（3）中乌头属二萜生物碱溶液是指将二萜生物碱粉末溶解在dmso中，再用培养基将浓度稀释到相应浓度，用量为1~30
µ
mol/l。
17.所述步骤（3）中培养时间为2~8h。
18.所述步骤（4）中待测药物样品使强啡肽表达水平比不加待测药样品的正常对照组显著增加（p《0.05），则可判定该样品具有作为镇痛药物的潜力。
19.所述步骤（5）中动物模型是指完全弗氏佐剂所致大鼠炎性疼痛动物模型。
20.本发明实验细胞：hapi小胶质细胞系，购自深圳华拓生物科技有限公司。
21.所用实验试剂：dmem高糖培养基，购自美国hyclone公司；胎牛血清（fetalbovineserum,fbs），购自coring公司；青霉素—链霉素溶液，购自美国hyclone公司；胰蛋白酶消化液，购自美国hyclone公司；pbs磷酸盐缓冲液，购自以色列bi公司；完全弗氏佐剂，购自美国chondrex公司。
22.实施例1乌头属二帖生物碱作用hapi小胶质细胞系和原代小胶质的浓度筛选（rt~pcr法）hapi小胶质细胞培养：用完全培养基（dmem高糖培养基中含10%胎牛血清和1%青霉素~链霉素溶液）置于37℃、含有5%二氧化碳和95%氧气的恒温培养箱中培养。待细胞长至培养瓶底的80%左右，吸走原培养液，用室温平衡过的pbs轻轻润洗2遍后，加入1ml0.25%的胰酶，放入培养箱中消化30s后迅速取出立即加入3ml完全培养基终止消化，再用移液枪轻轻将没消化下的细胞吹下，收集细胞悬液，离心（1000rpm，3min），弃上清，加入新的完全培养基重悬后接种于6孔板中继续培养，隔天进行加药。
23.原代小胶质细胞培养：取新生1天的wistar大鼠，放入灭好菌的烧杯中（加75%酒精）消毒，依次清洗3次，取出大脑皮层，并在预冷过的无血清培养基中剥离血管膜。已去膜的大脑皮层放入培养皿中（放有预冷过的无血清培养基），可先放于4℃冰箱等待下一步操作。
24.脑组织于0.05%胰酶消化液中用组织剪将其剪碎后放入37℃、含有5%二氧化碳和95%氧气的恒温培养箱中消化约10min，期间晃动两次助于消化。消化结束，加入等体积完全培养基（dmem高糖培养基中含10%胎牛血清和1%青霉素~链霉素溶液）终止消化。吸至50ml离心管中，离心（1000rpm,10min），离心结束后去掉上清，加入10ml培养基重悬沉淀，依次用70
µ
m和40
µ
m细胞滤网过滤。将过滤出的细胞液接种于提前用多聚赖氨酸包被好的细胞培养瓶中，置于37℃、含有5%二氧化碳和95%氧气的恒温培养箱中培养，第三天轻轻换液。第十天左右，取出培养瓶，在显微镜下观察小胶质细胞生长情况，显微镜下可见混合胶质细胞出现细
胞分层现象，即底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的星型胶质细胞，小胶质细胞明显偏小呈类圆形、折光性强，附着于行星型胶质细胞表面生长。用无菌封口膜将培养瓶瓶口封住，在37℃恒温摇床上，260r/min，震摇6h左右，收集摇下来的小胶质细胞，离心（1000rpm,7min），去上清，加入新的完全培养基重悬细胞后种入6孔板中，隔天进行加药。
25.称取1mg的乌头属二萜生物碱—草乌甲素溶于156
µ
l的dmso中，配为10mmol/l的二萜生物碱母液，将母液用完全培养基分别稀释为1
µ
mol/l、10
µ
mol/l，分别作用于hapi小胶质细胞系和原代小胶质细胞2h，收集细胞，检测强啡肽基因表达。
26.图1示出了乌头属二帖生物碱对hapi小胶质细胞的强啡肽基因的作用关系。结果表明，当乌头属二帖生物碱浓度为1
µ
mol/l时，hapi小胶质细胞的强啡肽基因表达显著升高（*p《0.05），当浓度增至10
µ
mol/l时，原代小胶质细胞和hapi细胞强啡肽基因表达均显著升高（*p《0.05），且hapi细胞强啡肽基因的升高与浓度呈正比。从强啡肽基因表达情况来看，选定1
µ
mol/l乌头属二萜生物碱作用hapi小胶质细胞系、10
µ
mol/l乌头属二萜生物碱作用原代小胶质细胞。
27.实施例2乌头属二帖生物碱对hapi小胶质细胞系和原代小胶质的作用时间筛选（rt~pcr法）hapi小胶质细胞系和原代小胶质细胞培养参照实施例1，将细胞种于六孔板后，隔天给药。称取1mg的乌头属二萜生物碱—草乌甲素溶于156
µ
l的dmso中，配为10mmol/l的二萜生物碱母液，将母液用完全培养基分别稀释为1
µ
mol/l、10
µ
mol/l。分别用1
µ
mol/l作用hapi小胶质细胞系、10
µ
mol/l作用原代小胶质细胞1h、2h、4h，收集细胞，检测强啡肽基因表达量。
28.图2示出了草乌甲素对hapi小胶质细胞系和原代小胶质细胞的作用情况。结果表明草乌甲素作用hapi小胶质细胞系和原代小胶质细胞1h时对强啡肽基因表达无影响，当作用2h、4h时，强啡肽基因表达显著升高（*p《0.05），且表达量和时间成正比关系。表明hapi小胶质细胞系和原代小胶质细胞强啡肽表达行为一致，都能进行乌头属二帖生物碱镇痛作用的筛选，但由于原代小胶质细胞需直接从动物获取，具有培养难度大，细胞量少等问题，所以，确定了hapi小胶质细胞系作为筛选细胞。且考虑实验方便性，选定药物作用时间为2h。
29.实施例3乌头属二萜生物碱对hapi小胶质细胞系强啡肽蛋白及creb、p~creb蛋白的影响（westernblot法）hapi细胞用完全培养基（dmem高糖培养基中含10%胎牛血清和1%青霉素~链霉素溶液）置于37℃、含有5%二氧化碳和95%氧气的恒温培养箱中培养。待细胞长至培养瓶底的80%左右，吸走原培养液，用室温平衡过的pbs轻轻润洗2遍后，加入1ml0.25%的胰酶，放入培养箱中消化30s后迅速取出立即加入3ml完全培养基终止消化，再用移液枪轻轻将没消化下的细胞吹下，收集细胞悬液，离心（1000rpm，3min），弃上清，加入新的完全培养基重悬后接种于6孔板中继续培养，隔天进行加药。
30.称取1mg的乌头属二萜生物碱—草乌甲素溶于dmso中，配为浓度为10mmol/l的母液，将母液用完全培养基稀释为1
µ
mol/l，作用细胞2h后，收集细胞检测强啡肽蛋白及creb、p~creb蛋白表达。
31.图3示出了乌头属二萜生物碱—草乌甲素对hapi小胶质细胞系的影响关系。结果表明乌头属二萜生物碱—草乌甲素使hapi小胶质细胞系的强啡肽蛋白及creb、p~creb蛋白表达增加。
32.实施例4乌头属二萜生物碱在hapi小胶质细胞系上的活性筛选（rt~pcr法）hapi细胞用完全培养基（dmem高糖培养基中含10%胎牛血清和1%青霉素~链霉素溶液）置于37℃、含有5%二氧化碳和95%氧气的恒温培养箱中培养。待细胞长至培养瓶底的80%左右，吸走原培养液，用室温平衡过的pbs轻轻润洗2遍后，加入1ml0.25%的胰酶，放入培养箱中消化30s后迅速取出立即加入3ml完全培养基终止消化，再用移液枪轻轻将没消化下的细胞吹下，收集细胞悬液，离心（1000rpm，3min），弃上清，加入新的完全培养基重悬后接种于6孔板中继续培养，隔天进行加药。
33.称取1mg的乌头属二萜生物碱—草乌甲素、乌头碱、滇乌碱溶于dmso中，配为浓度为10mmol/l的母液，将母液用完全培养基稀释为1
µ
mol/l，作用细胞2h后，收集细胞检测强啡肽基因表达。
34.图4示出了草乌甲素、乌头碱、滇乌碱对hapi小胶质细胞系的影响关系。结果表明草乌甲素、乌头碱、滇乌碱均能显著升高hapi小胶质细胞系的强啡肽基因表达水平（**p《0.01，*p《0.05），表明均具有潜在的镇痛活性。
35.实施例5乌头属二萜生物碱对完全弗氏佐剂所致大鼠炎性疼痛的抑制作用雄性wistar大鼠(体重160~180g)，动物适应环境3天。向左后肢足趾内注射完全弗氏佐剂cfa30
µ
l(分枝杆菌浓度：10mg
·
ml~1)。注射cfa第一天，将大鼠随机分为4组(每组8只)：分别腹腔注射溶剂、草乌甲素（59
µ
g/kg）、滇乌碱（21
µ
g/kg）、乌头碱组（21
µ
g/kg）。在给药第1、3、5、7天测定各组大鼠双侧足机械性痛阈值和热辐射痛阈值。
36.图5示出了给药组与溶剂对照组相比情况。实验结果表明，给药组与溶剂对照组相比，给药第3天后，各给药组能显著增加大鼠患侧足机械性痛阈值（***p《0.001，**p《0.01，*p《0.05），并能不同程度增加热辐射痛阈值，到第7天时显著增加（*p《0.05），而对对侧脚的痛阈值没有大的影响。表明腹腔注射草乌甲素、乌头碱、滇乌碱对cfa引起的炎性疼痛有较好的抑制作用。
37.实施例6乌头属二萜生物碱对完全弗氏佐剂引起炎性疼痛的大鼠脊髓强啡肽基因的影响（rt~pcr法）机械痛阈值及热辐射痛阈值测定完成后将大鼠处死，取脊髓腰膨大组织检测脊髓强啡肽基因表达情况。
38.图6示出了乌头属二萜生物碱对脊髓强啡肽基因的影响。腹腔注射乌头属二萜生物碱能增加脊髓强啡肽基因的表达（*p《0.05），与hapi小胶质细胞系上的结果保持一致。表明细胞与动物实验结果相互验证，明确了本发明涉及的一种乌头属植物二萜生物碱镇痛药效的细胞筛选方法可行。