一种拟轮枝镰孢菌相关的ZmWAX基因的应用

一种拟轮枝镰孢菌相关的zmwax基因的应用
技术领域
1.本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种拟轮枝镰孢菌相关的zmwax基因的应用。


背景技术：

2.玉米(zea mays l.)是我国最重要的粮食作物之一，也是重要饲料和工业原料。2020年我国玉米种植面积超过4千万公顷，产量超过2.6亿吨，作为我国种植面积最大并且产量最高的作物，玉米生产对我国粮食安全起着举足轻重的作用。然而，在玉米的生长发育过程中，常常会遭受多种病原菌的侵害，拟轮枝镰孢菌(fusarium verticillioides)是其中最著名的病害之一。拟轮枝镰孢菌可以引起很多玉米流行性病害，比如苗枯、茎腐、穗腐和种腐等。在玉米幼苗发育早期，感染拟轮枝镰孢菌会严重影响玉米的发芽率，影响幼苗群体的长势、植株的高度等，严重者造成幼苗枯萎死亡。在玉米发育中期，拟轮枝镰孢菌感染会造成玉米茎秆腐烂枯败，严重者茎秆内部被侵蚀殆尽、植株断裂倒伏。在玉米生殖生长期，拟轮枝镰孢菌会侵染玉米籽粒或者穗轴，造成穗轴和籽粒霉变腐烂，因此严重影响玉米产量。在玉米种子贮藏期，携带拟轮枝镰孢菌的种子会霉变，或者在种子发芽后引起新一轮的幼苗、茎秆或穗子的感染，严重影响仓贮粮食的安全。最重要的是，拟轮枝镰孢菌可产生伏马菌素(fumonisin)，这是一种真菌毒素，与牲畜和人类的多种疾病有关，并被列为可能的致癌物。含伏马菌素的食物或饲料可能导致动物的神经毒性、肝毒性和肾毒性。因此，提高玉米对拟轮枝镰孢菌的抗性能力对于保证玉米的产量和品质、保证我国粮食安全至关重要。
3.虽然施用化学杀菌剂可以在一定程度上控制拟轮枝镰孢菌造成的玉米病害，但是这样同时也带来了很多环境污染问题。因此，挖掘玉米抵抗拟轮枝镰孢菌相关的基因，选育抗病玉米品种，才是解决这一病害问题的根本途径。然而，由于发病环境的复杂性和病情评价体系的不完善性，目前鉴定到的玉米抵抗拟轮枝镰孢菌相关的基因非常有限，有转基因功能验证的更是少之又少。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种拟轮枝镰孢菌相关的zmwax基因的应用，该zmwax基因在玉米植株中过表达，可以提高玉米植株对拟轮枝镰孢菌(fusarium verticillioides)造成的茎腐病和种腐的抵抗能力。
5.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种拟轮枝镰孢菌相关的zmwax基因的应用，所述zmwax基因在玉米植株中过表达，提高所述玉米植株对拟轮枝镰孢菌(fusarium verticillioides)造成的茎腐病和种腐的抵抗能力；所述zmwax基因的全长编码区的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述zmwax基因的全长编码区的氨基酸序列如seq id no:2所示。
6.优选地，所述zmwax基因在玉米植株中过表达的方法为：
7.s1、用bamhi/spei双酶切ptf101.1-3
×
flag载体，在温度为37℃的条件下酶切反应6h，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离，切下11.54kb大小的条带，用dna凝胶回收试剂盒回收产物，得到bamhi/spei双酶切ptf101.1-3
×
flag载体的回收产物；所述酶切反应的体系为：bamhi酶1μl，spei酶1μl，cutsmart buffer 5μl,ptf101.1-3
×
flag载体10μl,灭菌超纯水补至50μl；
8.s2、以玉米自交系b73的cdna文库为模板进行pcr扩增，将扩增产物用1％琼脂糖凝胶分离，切下1884bp大小的条带，用dna凝胶回收试剂盒回收pcr产物，得到pcr回收产物；
9.所述pcr扩增的体系为：2
×
kod mix 10μl，特异性引物f1μl、特异性引物r1μl、玉米自交系b73的cdna文库1μl，灭菌超纯水补至20μl；所述特异性引物f的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述特异性引物r的核苷酸序列如seq id no:4所示；
10.所述pcr扩增的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火10s，68℃延伸40s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
11.s3、用同源重组的方法将zmwax基因的全长编码区连接至ptf101.1-3
×
flag载体的bamhi/spei之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到连接产物，将所述连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，利用质粒提取试剂盒，得到ptf101.1-zmwax载体质粒；
12.所述连接反应的体系为：2
×
hieffclone enzyme premix 5μl，s1中得到的bamhi/spei双酶切ptf101.1-3
×
flag载体的回收产物2μl，s2中得到的pcr回收产物1μl,灭菌超纯水补至10μl；
13.所述zmwax基因的全长编码区的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述zmwax基因的全长编码区的氨基酸序列如seq id no:2所示；
14.s4、转基因植株的获得：将s3中得到的ptf101.1-zmwax载体质粒导入农杆菌eha105后，得到重组农杆菌，侵染玉米自交系b104的幼胚，将侵染后的幼胚诱导愈伤组织，再在含有草丁膦除草剂的培养基上分化出植株，得到转基因植株；
15.s5、转基因阳性植株的鉴定：利用载体框架上的引物ubi-f和基因上的引物zmwax-r对s4中得到的转基因植株的基因组dna进行pcr扩增，扩增产物用1％琼脂糖凝胶分离，出现750bp大小的条带的转基因植株为阳性转基因植株；
16.所述pcr扩增的体系为：2
×
kod mix 10μl，引物ubi-f 1μl、引物zmwax-r 1μl、s4中得到的转基因植株的基因组dna 1μl，灭菌超纯水补至20μl；
17.所述pcr扩增的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火10s，68℃延伸20s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
18.所述引物ubi-f的核苷酸序列如seq id no:5所示，所述引物zmw ax-r的核苷酸序列如seq id no:6所示；
19.s6、鉴定阳性转基因植株中zmwax的表达量：
20.s601、第一链cdna的合成：提取s5中得到的阳性转基因植株的总rna，测量所述总rna的浓度，取1μg的所述总rna用1μl的dnase i在37℃的条件下消化处理30min，然后在70℃的条件下加热10min，之后放置冰上，依照promega反转录试剂盒的用量加入反转录所需试剂，42℃孵育1h，95℃变性5min后，将反应体系置于冰上，加入四倍体积的灭菌超纯水，得到第一链cdna；
21.s602、qrt-pcr检测分析：
22.以s601中得到的第一链cdna为模板进行pcr扩增；
23.所述pcr扩增的体系为：s601中得到的第一链cdna 2μl、sybr green master i酶预混液10μl、zmwax q-f引物1μl、zmwax q-r引物1μl、灭菌超纯水补至20μl；
24.所述pcr扩增的程序为：94℃5min；94℃5s；55℃15s；72℃10s；45个循环；
25.所述zmwax q-f的核苷酸序列如seq id no:7所示，所述引物z mwax q-r的核苷酸序列如seq id no:8所示；
26.并以玉米基因ef1a作为内参，所述玉米基因ef1a所使用的引物为ef1a q-f和ef1a q-r；
27.所述ef1a q-f的核苷酸序列如seq id no:9所示，所述引物ef1a q-r的核苷酸序列如seq id no:10所示；
28.计算s5中得到的阳性转基因植株中zmwax基因的相对表达值，相对表达值》1，且与转化受体材料有显著性差异(p《0.01，t’student test)，为zmwax基因过表达转基因玉米植株。
29.本发明与现有技术相比具有以下优点：
30.本发明的zmwax基因在玉米植株中过表达，可以提高玉米植株对拟轮枝镰孢菌(fusarium verticillioides)造成的茎腐病和种腐的抵抗能力。
31.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
32.图1是本发明的实施例1的阳性转基因植株的电泳图。
33.图2是本发明的实施例1的zmwax基因过表达转基因玉米植株的相对表达值图。
34.图3是本发明的实施例1的zmwax oe#2和zmwax oe#3通过对玉米茎秆接种拟轮枝镰孢菌对茎腐抵抗能力图。
35.图4是本发明的实施例1的zmwax oe#2和zmwax oe#3通过对玉米种子接种拟轮枝镰孢菌对种腐抵抗能力图。
具体实施方式
36.实施例1
37.本实施例的拟轮枝镰孢菌相关的zmwax基因的应用，所述zmwax基因在玉米植株中过表达，提高所述玉米植株对拟轮枝镰孢菌(fusarium verticillioides)造成的茎腐病和种腐的抵抗能力；所述zmwax基因的全长编码区的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述zmwax基因的全长编码区的氨基酸序列如seq id no:2所示。
38.所述zmwax基因在玉米植株中过表达的方法为：
39.s1、用bamhi/spei双酶切ptf101.1-3
×
flag载体，在温度为37℃的条件下酶切反应6h，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离，切下11.54kb大小的条带，用dna凝胶回收试剂盒回收产物，得到bamhi/spei双酶切ptf101.1-3
×
flag载体的回收产物；所述酶切反应的体系为：bamhi酶1μl，spei酶1μl，cutsmart buffer 5μl,ptf101.1-3
×
flag载体10μl,灭菌超纯水补至50μl；
40.s2、以玉米自交系b73的cdna文库为模板进行pcr扩增，将扩增产物用1％琼脂糖凝
胶分离，切下1884bp大小的条带，用dna凝胶回收试剂盒回收pcr产物，得到pcr回收产物；
41.所述pcr扩增的体系为：2
×
kod mix 10μl，特异性引物f1μl、特异性引物r1μl、玉米自交系b73的cdna文库1μl，灭菌超纯水补至20μl；所述特异性引物f的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述特异性引物r的核苷酸序列如seq id no:4所示；
42.所述pcr扩增的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火10s，68℃延伸40s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
43.s3、用同源重组的方法将zmwax基因的全长编码区连接至ptf101.1-3
×
flag载体的bamhi/spei之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到连接产物，将所述连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，利用质粒提取试剂盒，得到ptf101.1-zmwax载体质粒；
44.所述连接反应的体系为：2
×
hieffclone enzyme premix 5μl，s1中得到的bamhi/spei双酶切ptf101.1-3
×
flag载体的回收产物2μl，s2中得到的pcr回收产物1μl,灭菌超纯水补至10μl；
45.所述zmwax基因的全长编码区的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述zmwax基因的全长编码区的氨基酸序列如seq id no:2所示；
46.s4、转基因植株的获得：将s3中得到的ptf101.1-zmwax载体质粒导入农杆菌eha105后，得到重组农杆菌，侵染玉米自交系b104的幼胚，将侵染后的幼胚诱导愈伤组织，再在含有草丁膦除草剂的培养基上分化出植株，得到转基因植株；
47.s5、转基因阳性植株的鉴定：利用载体框架上的引物ubi-f和基因上的引物zmwax-r对s4中得到的转基因植株的基因组dna进行pcr扩增，扩增产物用1％琼脂糖凝胶分离，出现750bp大小的条带的转基因植株为阳性转基因植株；阳性转基因植株的鉴定结果如图1所示，图1中利用非转基因的玉米自交系b104的基因组dna作为负对照，即图1中的b104自交系(负对照)，以ptf101.1-zmwax质粒模板作为正对照，鉴定6种株系的转基因植株(分别记作zmwax oe#1～zmwax oe#6)，由图1可知，zmwax oe#2～zmwax oe#6共5种株系出现750bp大小的条带，为阳性转基因植株；
48.所述pcr扩增的体系为：2
×
kod mix 10μl，引物ubi-f 1μl、引物zmwax-r 1μl、s4中得到的转基因植株的基因组dna 1μl，灭菌超纯水补至20μl；
49.所述pcr扩增的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火10s，68℃延伸20s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
50.所述引物ubi-f的核苷酸序列如seq id no:5所示，所述引物zmw ax-r的核苷酸序列如seq id no:6所示；
51.s6、鉴定阳性转基因植株中zmwax的表达量：
52.s601、第一链cdna的合成：以非转基因的玉米自交系b104作为对照，分别提取s5中得到的阳性转基因植株的总rna(zmwax oe#2～zmwax oe#6)；
53.总rna的提取采用trizol提取法：取样前用酒精灯火焰灼烧取样所需的镊子、剪刀、刀片，将用于rna提取的材料取下放入锡箔纸包好后迅速投入液氮中速冻，不立即提取rna的样品可以转移到-80℃超低温冰箱中备用。取适量组织在研钵中充分研磨至粉末状，加入1ml trizol提取液快速转动研钵棒使trizol充分盖住植物组织，待融化后用研钵棒充分研磨混合液至澄清透明，转移研磨液至rnase-free的1.5ml离心管中，室温静置5min，4℃，12000rpm离心5min，转移上清至新的离心管中，加入五分之一体积的氯仿，剧烈振荡15s
后室温静置5min，4℃，12000rpm离心15min，转移上清至新的离心管中，加入等体积异丙醇，轻柔混合后室温静置10min，4℃，12000rpm离心10min后弃去上清液，用75％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心5min弃去乙醇，用枪头小心吸取残留乙醇，室温干燥5min至rna边缘呈现透明状态，加入30μl的depc水待反转录；
54.测量所述总rna的浓度，取1μg的所述总rna用1μl的dnase i在37℃的条件下消化处理30min，然后在70℃的条件下加热10min，之后放置冰上，依照promega反转录试剂盒的用量加入反转录所需试剂，42℃孵育1h，95℃变性5min后，将反应体系置于冰上，加入四倍体积的灭菌超纯水，得到第一链cdna；
55.s602、qrt-pcr检测分析：
56.以s601中得到的第一链cdna为模板进行pcr扩增；
57.所述pcr扩增的体系为：s601中得到的第一链cdna 2μl、sybr green master i酶预混液10μl、zmwax q-f引物1μl、zmwax q-r引物1μl、灭菌超纯水补至20μl；
58.所述pcr扩增的程序为：94℃5min；94℃5s；55℃15s；72℃10s；45个循环；
59.所述zmwax q-f的核苷酸序列如seq id no:7所示，所述引物z mwax q-r的核苷酸序列如seq id no:8所示；
60.并以玉米基因ef1a作为内参，所述玉米基因ef1a所使用的引物为ef1a q-f和ef1a q-r；
61.所述ef1a q-f的核苷酸序列如seq id no:9所示，所述引物ef1a q-r的核苷酸序列如seq id no:10所示；
62.从s5中得到的阳性转基因植株中选取zmwax oe#2和zmwax oe#3提取rna，反转录cdna，并进行实时定量pcr检测zmwax表达水平如图2所示，zmwax oe#2和zmwax oe#3的zmwax基因的表达量较高，相对表达值分别为6和10，为zmwax基因过表达转基因玉米植株，zmwax oe#2和zmwax oe#3转基因植株中，zmwax基因的表达值相比于野生型玉米自交系b104分别上升了6和10倍。相对表达值》1，且与转化受体材料(b104玉米自交系)有显著性差异(p《0.01，t’student test)，为zmwax基因过表达转基因玉米植株。
63.将得到的zmwax oe#2和zmwax oe#3对拟轮枝镰孢菌造成的茎腐和种腐的抵抗能力试验：
64.(1)通过对茎秆接种拟轮枝镰孢菌(fusarium verticillioides)和接种水，发现zmwax oe#2和zmwax oe#3在接种拟轮枝镰孢菌后茎秆腐烂霉变的程度明显低于b104(图3)；在接水对照组中，zmwax oe#2、zmwax oe#3和b104的茎秆均未发生明显霉变腐烂现象。说明过量表达zmwax基因可提高玉米对拟轮枝镰孢菌侵染造成的茎腐病的抵抗能力。茎秆接菌的具体方法为：采用茎基部接菌法，在抽雄期对玉米的基部第二节注射拟轮枝镰孢菌，孢子液浓度为5
×
106个/ml，注射结束用医用胶带缠住伤口防止其它外部病菌或昆虫危害。玉米成熟期劈开茎秆调查霉变表型并拍照。
65.(2)通过对玉米种子接种拟轮枝镰孢菌(fusarium verticillioides)接种水，发现zmwax oe#2和zmwax oe#3在接种拟轮枝镰孢菌后种子腐烂霉变的程度明显低于b104(图4a)，病情等级也显著低于b104(图4b)；在接水对照组中，zmwax oe#2、zmwax oe#3和b104的种子均未发生明显霉变腐烂现象。说明过量表达zmwax基因可提高玉米对拟轮枝镰孢菌侵染造成的种腐病的抵抗能力。种子接菌的具体方法为：挑选整齐一致饱满的晒干种子，先用
75％的酒精表面消毒30秒，然后用3％的次氯酸钠灭菌15分钟，用无菌水洗3-4次，然后将种子接入准备好的孢子液(浓度为1
×
105个孢子/ml)中，放28℃培养箱黑暗浸泡36h。然后倒掉菌液，用75％的酒精洗去种子表面的菌丝，再用无菌水洗3-4次。最后将种子放在铺入湿滤纸的培养皿中，每皿接10粒种子，每个材料重复6次。观察发病情况。
66.表1是本发明的实施例1的zmwax oe#2和zmwax oe#3玉米种子接种拟轮枝镰孢菌对种腐抵抗能力的发病等级指标统计标准。
67.表1种子发病分级标准
[0068][0069]
*注：每皿10粒种子，nds表示发病种子数量，ia表示单粒种子发病面积占单粒种子总面积比例。
[0070]
综上所述，zmwax基因在玉米植株中过表达，可以提高所述玉米植株对拟轮枝镰孢菌fusarium verticillioides造成的茎腐病和种腐的抵抗能力。
[0071]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。