建立和维持早期胚胎样细胞的培养基和方法

1.本发明涉及建立和维持哺乳动物早期胚胎样细胞的培养基和方法。


背景技术：

2.哺乳动物胚胎发生是一个复杂的细胞分裂和分化过程，导致胚胎的发育。卵母细胞与精子成功受精触发胚胎发生。这个被严格控制的过程从一个受精卵中产生具有不同功能和形态的数十亿细胞。所有有性生殖生物的细胞种类及构成的高度复杂性都始于胚胎发生。最初，单个受精卵分裂形成2个细胞。这2个细胞随后分裂形成4细胞、8细胞和16细胞。经过进一步的增殖和分化，胚胎变成囊胚，囊胚由两个区域组成，分别称为内细胞团(inner cell mass,icm)和滋养外胚层(trophectoderm，te)。至此，胚胎发育阶段被称为着床前阶段(preimplantation stage)。着床后，内细胞团细胞将产生羊膜和所有胎儿组织，而滋养外胚层细胞则会发育成胎盘。因为可以在无伦理争议的情况下容易地获得小鼠胚胎和这些细胞，所以上述发育阶段都已在小鼠模型得到良好研究。evans和kaufman的开创性研究表明，从小鼠囊胚的内细胞团中提取细胞，并在合适的培养条件下体外无限期地维持培养这些细胞是可能的(evans和kaufman，1981)。这些细胞称为小鼠胚胎干细胞(mesc)，是小鼠囊胚的icm的代表细胞。小鼠胚胎干细胞是多能干细胞，但不是全能干细胞，这意味着它们只能分化为胚胎的三个生殖层(外胚层、中胚层和内胚层)，因此可以产生与所有胎儿组织对应的细胞。相反，全能性是指一个细胞形成一个完整的孕体的能力，包括胎儿细胞和胚外(胎盘)细胞，而不是像多能干细胞那样仅仅产生胎儿组织。在小鼠早期胚胎中，早于4细胞期的细胞具有全能性，而在人类中，全能性可能持续到至少8细胞(8c)期(hu，2019)。在evans和kaufman的发现17年后，thomson和他的同事们能够从人的着床前内细胞团中产生人esc(thomson等，1998年)。
3.由于人psc在疾病建模和再生医学方面的巨大潜力，人们做了大量的研究来寻找这些细胞的替代来源，从而不需要使用和破坏人类胚胎。2006年，takahashi和yamanaka发现了一种可规避伦理争议的、从已经分化的体细胞中产生诱导型psc(ipsc)的方法(takahashi和yamanaka，2006)。esc和ipsc非常相似，此处统称为psc。
4.尽管小鼠esc和人esc都来源于着床前囊胚的内细胞团，但两者具有不同的特点。传统培养条件下的人psc处于始发态，类似于着床后上胚层的小鼠上胚层干细胞(episcs)(brons等，2007；tesar等，2007)。始发态人psc的二维培养物集落形态平坦，单细胞传代后存活率低，需要成纤维细胞生长因子2(fgf2)和转化生长因子β1(tgfβ1)/activin a/nodal信号传导，不能实现人-鼠种间嵌合体的形成。相反，小鼠esc处于一种类似着床前内细胞团的原始状态，其特征是二维培养物集落形态呈穹顶状、单细胞传代后存活率高、依赖janus激酶/转录信号转导剂和激活剂3(jak/stat3)信号传导、转录组与着床前内细胞团高度相似和具有人-鼠种间嵌合体能力(nichols和smith，2011；ying等，2008)。而且，小鼠esc比episc具有更高的分化潜力(honda等，2013)。此外，近年来已报道小鼠esc培养物中少部分细胞(约0.5％)显示出类似于小鼠胚胎2细胞(2c)阶段的基因表达特征(macfarlan等，
adenosylhomocysteine hydrolase,sah)抑制剂。
11.在一个或多个实施方案中，所述化学成分确定的培养基进一步补充有选自l-抗坏血酸或其衍生物、jak/stat3信号传导激活剂、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mapk/erk)信号传导抑制剂和端锚聚合酶抑制剂的一种或多种组分；任选地，该培养基还补充有选自activin/nodal信号传导激活剂、rho相关蛋白激酶(rock)抑制剂和胞外基质的一种或多种组分。
12.在一个或多个实施方案中，所述prc/ezh2抑制剂选自3-去氮腺嘌呤a(dznep)和cpi-1205。
13.在一个或多个实施方案中，所述培养基中dznep的终浓度为5至80nm、优选5至50nm。
14.在一个或多个实施方案中，所述培养基中cpi-1205的终浓度为0.5至5mm、优选1至3mm。
15.在一个或多个实施方案中，hdac抑制剂选自曲古抑菌素a(tsa)、丙戊酸(vpa)和丁酸钠(nab)。
16.在一个或多个实施方案中，所述培养基中tsa的终浓度为3至30nm、优选3至25nm。
17.在一个或多个实施方案中，所述培养基中vpa的终浓度为0.25至2mm、优选0.5至1.5mm。
18.在一个或多个实施方案中，所述培养基中nab的终浓度为0.25至2mm、优选0.5至1.5mm。
19.在一个或多个实施方案中，所述培养基中l-抗坏血酸的终浓度为40至70μg/ml。
20.在一个或多个实施方案中，所述培养基中jak/stat3信号传导激活剂的终浓度为10至50ng/ml。
21.在一个或多个实施方案中，jak/stat3信号传导激活剂为lif。
22.在一个或多个实施方案中，所述培养基中pd0325901的终浓度为0.5至3μm。
23.在一个或多个实施方案中，mapk/erk信号转导抑制剂为pd0325901。
24.在一个或多个实施方案中，所述培养基中所述端锚聚合酶抑制剂的终浓度为2至8μm。
25.在一个或多个实施方案中，所述端锚聚合酶抑制剂选自iwr1和xav939。
26.在一个或多个实施方案中，所述activin/nodal信号传导激活剂的终浓度为10至25ng/ml。
27.在一个或多个实施方案中，activin/nodal信号转导激活剂选自activin a和nodal。
28.在一个或多个实施方案中，所述培养基中rock抑制剂的终浓度为0.5至2μm。
29.在一个或多个实施方案中，rock抑制剂选自y27632、thiazovivin和羟基法舒地尔(hydroxyfasudil)。
30.在一个或多个实施方案中，所述培养基中胞外基质的量为0.1至0.5％(v/v)。
31.在一个或多个实施方案中，胞外基质选自matrigel
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、geltrex
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和ecm
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。
32.在一个或多个实施方案中，所述培养基包含终浓度为5至15nm的dznep或终浓度为0.5至3mm的cpi-1205；终浓度为3至10nm的tsa，或终浓度为0.25至1mm的vpa或终浓度为
0.25至1mm的nab；终浓度为40至70μg/ml的l-抗坏血酸；终浓度为10至30ng/ml的lif；终浓度为0.5至1.5μm的pd0325901；以及终浓度为3至6μm的iwr1或xav939；并进一步补充有：
33.(1)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或
34.(2)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或
35.(3)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或
36.(4)终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或
37.(5)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；或终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质。
38.在一个或多个实施方案中，所述培养基包含10nm的dznep或1mm的cpi-1205；5nm的tsa，或0.5mm的vpa，或0.5mm的nab；50μg/ml的l-抗坏血酸；20ng/ml的lif；1μm的pd0325901；和5μm的iwr1或5μm的xav939；并进一步补充有(1)20ng/ml人类activin a或人类nodal，1μm y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和0.2％(v/v)的胞外基质；或(2)20ng/ml的activin a或nodal，以及1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；(3)20ng/ml的activin a或nodal，和0.2％(v/v)的胞外基质；或(4)1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，以及0.2％(v/v)的胞外基质；或(5)20ng/ml的activin a或nodal，或1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，或0.2％(v/v)的胞外基质。
39.在一个或多个实施方案中，所述培养基包含终浓度为40至70nm的dznep或终浓度为2至4mm的cpi-1205；终浓度为10至30nm的tsa，或终浓度为0.5至1.5mm的vpa或终浓度为0.5至1.5mm的nab；终浓度为40至70μg/ml的l-抗坏血酸；终浓度为10至30ng/ml的lif；终浓度为0.5至1.5μm的pd0325901；以及终浓度为3至6μm的iwr1或xav939；并进一步补充有：
40.(1)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或
41.(2)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或
42.(3)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或
43.(4)终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或
44.(5)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；或终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质。
45.在一个或多个实施方案中，所述培养基包含50nm的dznep或3mm的cpi-1205；20nm的tsa，或1mm的vpa，或1mm的nab；50μg/ml的l-抗坏血酸；20ng/ml的lif；1μm的pd0325901；和5μm的iwr1或5μm的xav939；并进一步补充有(1)20ng/mlactivin a或nodal，1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和0.2％(v/v)的胞外基质；或(2)20ng/ml的activin a或nodal，以及1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；(3)20ng/ml的activin a或
nodal，和0.2％(v/v)的胞外基质；或(4)1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，以及0.2％(v/v)的胞外基质；或(5)20ng/ml的activin a或nodal，或1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，或0.2％(v/v)的胞外基质。
46.在一个或多个实施方案中，基础培养基选自dulbecco改良eagle培养基(dmem)、最小必需培养基(mem)、基础培养基eagle(bme)、rpmi1640、f10、f12、α最小必需培养基(αmem)、glasgow最小必需培养基(gmem)、iscove改良dulbecco培养基、神经基础培养基，dmem/f12和高级dmem/f12，以及它们的组合；优选地，所述基础培养基是高级dmem/f12和神经基础培养基的1:1(v/v)的混合物。
47.在一个或多个实施方案中，培养基还补充有选自血清替代物、替代碳源、非必需氨基酸、l-谷氨酰胺或其替代物和抗生素的一种或多种组分。
48.在一个或多个实施方案中，血清替代物选自knockout
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血清替代物(kosr)、n2和b27及其组合；优选地，血清替代物是n2和b27的1:1(w/w)的混合物；替代碳源是丙酮酸盐，例如丙酮酸钠；l-谷氨酰胺或其替代物是glutamax
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补充物，含有0.85％氯化钠中的l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽；和/或抗生素选自青霉素、链霉素或青霉素和链霉素的混合物。
49.在另一方面，本发明公开了一种将灵长类psc转化成着床前内细胞团样细胞(iclc)和/或8细胞胚胎样细胞(8clc)的方法，包括在sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂存在下培养所述灵长类psc。本发明还公开了一种将iclc转化成8clc的方法，包括在sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂存在下培养灵长类所述iclc。
50.在一个或多个实施方案中，所述方法包括在以下条件下培养灵长类psc或iclc：存在sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂，以及选自l-抗坏血酸、jak/stat3信号传导激活剂、mapk/erk信号传导抑制剂和端锚聚合酶抑制剂的一种或多种组分，并且任选地存在选自activin/nodal信号传导激活剂、rock抑制剂和胞外基质的一种或多种组分。
51.在一个或多个实施方案中，所述sah/prc/ezh2抑制剂选自dznep和cpi-1205。
52.在一个或多个实施方案中，所述hdac抑制剂选自tsa、vpa和nab。
53.在一个或多个实施方案中，所述灵长类psc或iclc在终浓度为5至80nm、优选为5至50nm的dznep或终浓度为0.5至5mm、优选为1至3mm的cpi-1205存在下，且在终浓度为3至30nm、优选为3至25nm的tsa，或终浓度为0.25至2mm、优选0.5至1.5mm的vpa，或终浓度为0.25至2mm、优选0.5至1.5mm的丁酸钠的存在下培养。
54.在一个或多个实施方案中，l-抗坏血酸终浓度为40至70μg/ml。
55.在一个或多个实施方案中，jak/stat3信号传导激活剂的终浓度为10至50ng/ml。
56.在一个或多个实施方案中，jak/stat3信号传导激活剂为lif。
57.在一个或多个实施方案中，mapk/erk信号转导抑制剂的终浓度为0.5至3μm。
58.在一个或多个实施方案中，mapk/erk信号转导抑制剂为pd0325901。
59.在一个或多个实施方案中，所述端锚聚合酶抑制剂的终浓度为2至8μm。
60.在一个或多个实施方案中，端锚聚合酶抑制剂选自iwr1和xav939。
61.在一个或多个实施方案中，所述activin/nodal信号传导激活剂的终浓度为10至25ng/ml。
62.在一个或多个实施方案中，所述activin/nodal信号转导激活剂选自activin a和人类nodal。
63.在一个或多个实施方案中，所述rock抑制剂的终浓度为0.5至2μm。
64.在一个或多个实施方案中，所述rock抑制剂选自y27632、thiazovivin和羟基法舒地尔。
65.在一个或多个实施方案中，所述胞外基质的量为0.1至0.5％(v/v)。
66.在一个或多个实施方案中，所述胞外基质选自matrigel
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、geltrex
tm
和ecm
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。
67.在另一方面，本发明进一步公开了一种将灵长类psc转化成iclc的方法，包括在本文所述培养基中培养灵长类psc，以使其向iclc转化，其中，所述培养基的基础培养基选自dulbecco改良eagle培养基(dmem)、最小必需培养基(mem)、基础培养基eagle(bme)、rpmi1640、f10、f12、α最小必需培养基(αmem)、glasgow最小必需培养基(gmem)、iscove改良dulbecco培养基、神经基础培养基，dmem/f12和高级dmem/f12，以及它们的组合；优选地，基础培养基是高级dmem/f12和神经基础培养基的1:1(v/v)的混合物。
68.在另一方面，本发明公开了一种将灵长类psc或iclc转化成8clc的方法，包括在本文所述培养基中培养灵长类psc或iclc，以使灵长类psc向iclc或8clc转化，其中，所述培养基的基础培养基选自dulbecco改良eagle培养基(dmem)、最小必需培养基(mem)、基础培养基eagle(bme)、rpmi1640、f10、f12、α最小必需培养基(αmem)、glasgow最小必需培养基(gmem)、iscove改良dulbecco培养基、神经基础培养基，dmem/f12和高级dmem/f12，以及它们的组合；优选地，基础培养基是高级dmem/f12和神经基础培养基的1:1(v/v)的混合物。
69.在一个或多个实施方案中，灵长类psc选自：
70.(i)esc细胞系和/或ecc细胞系的细胞；
71.(ii)ipsc细胞系的细胞；
72.(iii)体外培养的着床前囊胚的icm的细胞；
73.(iv)体外培养的着床后囊胚的icm的细胞；
74.(v)体外培养的8c阶段至桑椹胚阶段的胚胎的细胞。
75.在一个或多个实施方案中，灵长类psc或iclc在选自以下的一种或多种条件下培养：(i)在饲养细胞上；(ii)在没有饲养层的胞外基质上；(iii)在没有饲养细胞的悬浮液中；(iv)在约37℃的低氧或常氧条件下繁殖；(v)以单细胞每3至4天传代，分裂比为1:4至1:8；(vi)每日更换培养基。
76.在另一方面，本发明提供一种分离的iclc，其具有与相应灵长类着床前内细胞团相近的转录组、转座元件(te)特征、dna甲基化组、染色质开放状态和代谢状态。
77.在一个或多个实施方案中，所述灵长类iclc还具有以下一个或多个特征：
78.1)能够自我更新，并在培养中保持多能性；
79.2)根据核型保持培养中基因组的稳定性；
80.3)能够产生3个生殖层的细胞；
81.4)能够产生原始(primordial)生殖细胞样细胞；
82.5)能够嵌合到小鼠胚胎中，并分化为胚胎和胚胎外组织；
83.6)能够在体外转化至胚胎外细胞命运；以及
84.7)能够在体外形成囊胚样结构。
85.在一个或多个实施方案中，通过本技术所述的用于产生iclc的任何方法来获得所述iclc。
86.在另一方面，本发明提供了一种分离的灵长类8clc，其表达8c胚胎特异性标志基因的水平显著高于iclc和/或始发态psc；优选地，所述细胞具有与相应的灵长类8细胞阶段胚胎相近的转录组、转座元件(te)特征和染色质开放状态。
87.在一个或多个实施方案中，所述8clc还具有以下一个或多个特征：
88.1)根据核型保持培养中基因组的稳定性；
89.2)能够产生3个生殖层的细胞；
90.3)能够产生原始(primordial)生殖细胞样细胞；
91.4)能够嵌合到小鼠胚胎中，并分化为胚胎和胚胎外组织；
92.5)能够在体外转化至胚胎外细胞命运；以及
93.6)能够在体外形成囊胚样结构。
94.在一个或多个实施方案中，通过本技术所述的用于产生8clc的任何方法来获得所述8clc。
95.本发明还提供一种细胞培养物，包含本发明任何实施方案所述的iclc和/或8clc，和培养基；优选地，所述培养基如本发明任何培养基实施方案中所述。
96.本发明还提供了一种试剂盒，包括sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂，和任选的：
97.(1)选自l-抗坏血酸、jak/stat3信号传导激活剂、mapk/erk信号转导抑制剂和端锚聚合酶抑制剂的一种或多种组分；
98.(2)选自activin/nodal信号传导激活剂、rock抑制剂和胞外基质的一种或多种组分；
99.(3)选自基础培养基、血清替代物、替代碳源、非必需氨基酸、l-谷氨酰胺或其替代物和抗生素的一种或多种组分。
100.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包括本发明任何培养基实施方案中所述的培养基。
101.本发明还提供了一种组合物，包括sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂，和任选的：
102.(1)选自l-抗坏血酸、jak/stat3信号传导激活剂、mapk/erk信号转导抑制剂和端锚聚合酶抑制剂的一种或多种组分；和
103.(2)选自activin/nodal信号传导激活剂和rock抑制剂的一种或多种组分。
104.在一个或多个实施方案中，所述组合物含有：3-去氮腺嘌呤a(dznep)或cpi-1205；曲古抑菌素a(tsa)或丙戊酸(vpa)或丁酸钠(nab)；以及任选的l-抗坏血酸，任选lif，任选pd0325901，和任选iwr1或xav939；优选地，组合物中各组分的量足以使得含该组合物的培养基含有：5至15nm、优选10nm的3-去氮腺嘌呤a(dznep)或0.5至2mm、优选1mm的cpi-1205；3至6nm、优选5nm的曲古抑菌素a(tsa)，或0.25至1mm、优选0.5mm的丙戊酸(vpa)，或0.25至1mm、优选0.5mm的丁酸钠(nab)；和任选的40至90μg/ml、优选50μg/ml的l-抗坏血酸，任选的10-30ng/ml、优选20ng/ml的lif，任选的0.5至1.5μm、优选1μm的pd0325901，任选的3至6μm、优选5μm的iwr1或xav939。所述组合物可进一步地包含activin a或nodal，和/或y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和/或胞外基质；优选地，组合物中所述组分的含量使得含该组合物的培养基含有：10至25ng/ml、优选20ng/ml的activin a或nodal，和/或0.5至2μm、优选1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和/或0.1至0.5％(v/v)、优选0.2％(v/v)的胞外基质。
105.在一个或多个实施方案中，所述组合物含有：3-去氮腺嘌呤a(dznep)或cpi-1205；曲古抑菌素a(tsa)或丙戊酸(vpa)或丁酸钠(nab)；和任选的l-抗坏血酸，任选的lif，任选的pd0325901，任选的iwr1或xav939；优选地，组合物中各组分的含量使得该该组合物的培养基含有：40至70nm、优选50nm的3-去氮腺嘌呤a(dznep)或2至4mm、优选3mm的cpi-1205；10至30nm、优选20nm的曲古抑菌素a(tsa)，或0.5至1.5mm、优选1mm的丙戊酸(vpa)，或0.5至1.5mm、优选1mm的丁酸钠(nab)；和任选的40至90μg/ml、优选50μg/ml的l-抗坏血酸，任选的10至30ng/ml、优选20ng/ml的lif，任选的0.5至1.5μm、优选1μm的pd0325901，任选的3至6μm、优选5μm的iwr1或xav939。所述组合物可进一步地包含activin a或nodal，和/或y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和/或胞外基质；优选地，组合物中所述组分的含量使得含该组合物的培养基含有10至25ng/ml、优选20ng/ml的activin a或nodal，和/或0.5至2μm、优选1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和/或0.1至0.5％(v/v)、优选0.2％(v/v)的胞外基质。
106.本发明还提供了一种能促进stella(还称为dppa3和pgc7)表达或提高stella活性的物质在制备试剂、培养基或试剂盒中的用途，该试剂、培养基或试剂盒用于促进灵长类psc向iclc转化、或促进灵长类psc或iclc向8clc转化，以及能促进stella表达或提高stella活性的物质在促进灵长类psc向iclc转化、或促进灵长类psc或iclc向8clc转化中的用途。
107.在一个或多个实施方案中，能促进stella的表达或提高stella活性的物质是sah/prc/ezh2的抑制剂，其包括但不限于3-去氮腺嘌呤a(dznep)和cpi-1205。优选地，所述sah/prc/ezh2的抑制剂，如3-去氮腺嘌呤a(dznep)和cpi-1205，以本文任一实施方案所述的浓度用于所述用途中。
108.本发明还提供一种能促进khdc1l，trim60和/或包括tprx1和rgfx的etchbox家族基因表达，或提高khdc1l，trim60和/或包括tprx1和rgfx的真哺乳亚纲全能细胞同源盒(etchbox)家族蛋白活性的物质在制备试剂、培养基或试剂盒中的用途，所述试剂、培养基或试剂盒用于促进灵长类psc或iclc向8clc转化；和能促进khdc1l，trim60和/或包括tprx1和rgfx的etchbox家族基因表达，或提高khdc1l，trim60和/或包括tprx1和rgfx的etchbox家族蛋白活性的物质在促进灵长类psc和/或iclc向8clc转化中的用途。
109.在一个或多个实施例中，能促进khdc1l，trim60和/或包括tprx1和rgfx的etchbox家族基因表达，或提高khdc1l，trim60和/或包括tprx1和rgfx的etchbox家族蛋白活性的物质是sah/prc/ezh2的抑制剂，其包括但不限于dznep和cpi-1205。优选地，所述sah/prc/ezh2的抑制剂，如3-去氮腺嘌呤a(dznep)和cpi-1205，以本文任一实施方案所述的浓度用于所述用途中。
附图说明
110.图1：(a)显示本文用于产生人类iclc的过程的示意图。简言之，在mtesr培养基中培养的人类psc被转入原始态转化培养基(4cl培养基1)，并生长12天，在第4天和第8天传代。(b)相差显微图像显示了使用4cl培养基1转化的人类psc(左)和iclc(右)的形态。(c)iclc集落的代表性免疫荧光显微成像图。用dapi(左列)进行核复染、抗-klf17(上排、中列)、抗-nanog(中排、中列)或抗-oct4(下排、中列)进行免疫染色。合并图像(右列)。
111.图2：(a)2d散点图，显示h9细胞在使用4cl培养基1中培养前(第0天)和培养后第1、2、3、5、8和12天的umap转化的单细胞rna-seq(single-cell rna-seq)结果。同时整合了已公开的来自胚胎期第3天(e3)、第4天(e4)、第5天(e5)、第6天(e6)和第7天(e7)的人类胚胎的单细胞rna-seq数据(来自e-mtab-3929)。(b)热图显示了在始发态h9、4cl培养基1转化的h9和人类着床前内细胞团细胞(来自gse101571)中，已知的原始态标志基因rna表达(右图)。
112.图3：(a)2d散点图，显示h9细胞在4cl培养基1中培养前(第0天)和培养后第1、2、3、5、8和12天的umap转化的单细胞rna-seq结果中转座元件(te)的表达。还包括已公开的第3天、第4天、第5天、第6天和第7天人类胚胎细胞的单细胞rna-seq数据(来自e-mtab-3929)。(b)热图显示了在始发态h9、4cl培养基1转化的h9和人内细胞团细胞(来自gse101571)中，已知的原始态特异的te的表达水平热图。
113.图4：giemsa染色后染色体的代表图像，说明细胞基因组稳定。染色体核型分析：始发态h9(左上)，在4cl培养基1中培养15代后的h9(右上)、始发态uh10(左下)和在4cl培养基1中培养15代后的uh10(右下)。
114.图5：箱图显示整个基因组(左栏)和所有基因的tss周围2kb处(右栏)的cpg位点dna甲基化。
115.图6：热图显示人类胚胎内细胞团(icm)与经4cl培养基1转化前后的细胞在所选印记控制区域(icr)的cpg位点甲基化水平的比较。
116.图7：(a-d)2d散点图，显示始发态或iclc的单个细胞内klf17、dppa3/stella、dppa5、cd70、pou5f1和thy1基因座开放染色质的umap可视化结果。
117.图8：(a)在始发态人类psc细胞中和向iclc转化(使用4cl培养基1)过程中，差异开放的染色质区域。在始发态hpsc细胞中关闭，在转化成iclc过程中逐渐开放的区域(上图)。在始发态hpsc细胞中开放，在向iclc转化过程中逐渐关闭的区域(下图)。(b)基序(motif)富集分析显示，由始发态hpsc细胞向iclc转化的过程中，在关闭到开放的区域(上)或开放到关闭的区域(下)富集的代表性基序。(c)柱状图显示转化12天后，始发态人类psc细胞和iclc中tfap2c、klf5、sox3和zic3的rna表达。
118.图9：(a)条形图显示，相比始发态hpsc，4cl培养基1转化的iclc中氧化磷酸化(oxphos)相关基因升高。(b)热图显示在始发态细胞、iclc和人类着床前内细胞团(来自gse101571)中所选代谢基因的表达水平。
119.图10：苏木精和伊红染色的衍生自iclc的畸胎瘤组织，显示所有三个生殖层的结构：中胚层(左图)、内胚层(中图)和外胚层(右图)。
120.图11：(a)柱状图显示与h9-iclc相比，tsclc中始发态细胞、内细胞团和tsc标志基因的表达相对h9-iclc的差异。(b)免疫荧光显微镜图像显示已知的tsc标志基因：gata3、tfap2c和krt7的表达。(c)主成分分析比较4cl转化的h9(h9-4cl)、tsclc(h9-tsclc)、胎盘瘤细胞系jeg3和bewo、以及妊娠3个月胎盘细胞(标记为egfr和hlag)的转录组。(d)甲基化图显示elf5启动子区在始发态细胞、iclc和tsclc的cpg甲基化状态。
121.图12：(a)表中显示了用始发态细胞、4cl培养基或e4cl培养基转化后的细胞进行的囊胚注射的数量，以及标记的细胞整合进内细胞团(icm)和/或滋养外胚层的胚胎的数量。(b)显微图像显示注射了dsred标记的始发态人类psc或iclc的小鼠囊胚的相差(左)和
红色荧光成像(右)。(c)用抗oct4、抗cdx2或dapi染色的注射和未注射胚胎的免疫荧光。
122.图13：(a)图像显示小鼠e10.5胚胎(左)、胎盘(中)和卵黄囊(右)的相差(上)和红色荧光成像(下)。(b)免疫荧光图像显示小鼠e10.5胚胎中gata6(红色)和人细胞核抗原(human nuclei,hn)(绿色)的表达，核复染dapi(蓝色)。(c)免疫荧光图像显示在e10.5胎盘组织切片中dsred(红色)和gata3(绿色)的表达，核复染dapi(蓝色)。
123.图14：(a)显微图像显示由iclc自发形成的类囊胚的相差成像。(b)用抗oct4(红色)和抗gata3(绿色)、核复染dapi(蓝色)的荧光成像。
124.图15：柱状图显示经过4cl培养基1向iclc转化过程中，h9、h1、hues1和wibr3人esc细胞系中的icm和始发态标志基因的表达水平。
125.图16：rt-qpcr数据的柱状图，显示在使用4cl培养基1在geltrex
tm
包被培养皿上转化的iclc中，着床前上胚层标志基因klf17、dnmt3l、dppa5、stella、tfcp2l1、klf4、mael和rex1被显著诱导。
126.图17：rt-qpcr数据的柱状图，显示在使用4cl培养基1悬浮培养转化的iclc中，着床前上胚层标志基因klf17、dnmt3l、dppa5、stella、tfcp2l1、klf4、mael和rex1被显著诱导。柱状图中每个基因的左柱表示在饲养层上培养，右柱表示悬浮培养。
127.图18：(a-c)是rt-qpcr数据的柱状图，显示在分别使用4cl培养基2、4cl培养基3、4cl培养基4转化的iclc中，着床前icm标志基因klf17、dnmt3l、dppa5、stella、tfcp2l1、klf4、mael和rex1被显著诱导。
128.图19：(a)示意图显示了两种生成8clc的方法。简言之，始发态人类psc培养基(如mtesr1培养基)替换成e4cl培养基或4cl培养基。然后，细胞要么直接在e4cl中持续生长，要么在4cl培养基中两次传代后再换成e4cl。(b)柱状图显示了h9始发态细胞和h9-e4cl细胞中8细胞胚胎(8c)标志基因的表达水平。(c)柱状图显示了h9-e4cl细胞和h9-4cl细胞中8c标志基因的表达水平。(d)两种方法诱导的8c特异性基因表达水平相似。(e)免疫荧光显微成像显示在始发态h9、h9-4cl和h9-e4cl中zscan4的表达(绿色)，dapi核复染(蓝色)。
129.图20：(a)2d散点图，显示h9细胞使用e4cl培养基培养前(第0天)和培养后第1、2、3和5的umap转化的单细胞rna-seq结果。其中整合了已公开的e3、e4、e5、e6和e7人类胚胎细胞的单细胞rna-seq基因表达数据(来自e-mtab-3929)。(b)热图显示了在始发态h9，e4cl转化的h9和人类8c细胞(来自e-mtab-3929)中，已知的8c标志基因的表达水平。
130.图21：(a)2d散点图，显示h9细胞在使用e4cl培养基培养前(第0天)和培养后第1、2、3和5的umap转化的单细胞rna-seq中te的表达。还包括已公开的第3天、第4天、第5天、第6天和第7天人类胚胎细胞的单细胞rna-seq数据(来自e-mtab-3929)。(b)热图显示了在始发态h9、e4cl转化的h9和人8c细胞(来自e-mtab-3929)中，已知的原始态特异te的rna表达水平。
131.图22：giemsa染色后染色体的代表图像，说明h9(左上)，e4cl-h9(右上)、始发态uh10(左下)和e4cl-uh10(右下)具有正常核型。
132.图23：箱图显示全基因组范围内(左图)和每个基因的tss周围2kb的区域中(右图)的cpg位点甲基化水平。
133.图24：热图显示人类胚胎内细胞团(icm，gse101571)和8clc中所选icr的cpg位点甲基化水平。
134.图25：在始发态人类psc细胞中和向8clc转化过程中，差异开放的染色质区域。在始发态细胞中关闭，在原始态向8clc转化过程中逐渐开放的区域(上图)。在始发态细胞中开放，在原始态向8clc转化中逐渐关闭的区域(下图)。
135.图26：热图显示在始发态h9、h9-8clc和人类8c胚胎细胞(来自e-mtab-3929)中，所选的代谢基因的表达。
136.图27：苏木精和伊红染色的衍生自8clc的畸胎瘤组织，显示所有三个生殖层的结构：中胚层(左图)、内胚层(中图)和外胚层(右图)。
137.图28：柱状图显示与未分化的8clc相比，8clc转化的tsclc中多个tsc标志基因如gata3、cga、elf5、tp63、krt18、krt8、psg6和ccr7被显著诱导。
138.图29：(a)显微图像显示注射了dsred标记的始发态人类psc或8clc的小鼠囊胚的相差(左)和红色荧光成像(右)。(b)用抗oct4、抗cdx2或dapi染色的胚胎的免疫荧光。
139.图30：(a)显微图像显示e10.5小鼠胚胎(左)、胎盘(中)和卵黄囊(右)的相差(上)或红色荧光成像(下)。(b)免疫荧光图像显示小鼠胚胎中gata6(红色)和hn(绿色)的表达或核复染dapi(蓝色)。(c)免疫荧光图像显示在小鼠胎盘组织切片中dsred(红色)和krt7(绿色)的表达，核复染dapi(蓝色)。
140.图31：(a)显微图像显示由8clc自发形成类囊胚的相差成像。(b)用抗oct4(红色)抗gata3(绿色)抗体和核复染dapi(蓝色)染色的自发形成类囊胚的免疫荧光图像。
141.图32：rt-qpcr数据的柱状图，显示在使用e4cl培养基悬浮培养转化的8clc中，8c标志基因zscan4、argfx、tprx1、znf280a和zscan5b被显著诱导。柱状图中每个基因的左柱表示在饲养层上培养，右柱表示悬浮培养。
142.图33：rt-qpcr数据的柱状图，显示从多种hpsc系转化的8clc中，8c标志基因zscan4、argfx、tprx1、znf280a、zscan5b、duxa、duxb和mbd3l2被显著诱导。图中显示这些基因在始发态的hn10和uh10中的表达量极低(基本看不到柱)。
143.图34：rt-qpcr数据的柱状图，显示由4cl培养基1转化的iclc中，着床前icm标志基因klf17、dnmt3l、dppa5、stella、tfcp2l1、klf4、mael和rex1的表达水平在正常氧条件下与低氧条件相当。
144.图35：rt-qpcr数据的柱状图，显示与在血清/lif培养基和其他本领域已知的原始转化培养基中培养的小鼠esc相比，在从多种小鼠esc系转化的2细胞胚胎(2c)样细胞中，小鼠2c标志基因zscan4、zscan4b、zscan4c、zscan4d、dux、tcstv1、tcstv3、gm4340、zfp352和dub1被显著诱导。对于上图的每一基因的5根柱，从左到右依次为e14血清 lif、e14 4cl、e14 5ilaf、r14 pxgl和e14 e4cl；对于下图的每一基因的5根柱，从左到右依次为mervl-gfp血清 lif、mervl-gfp 4cl、mervl-gfp 5ilaf、mervl-gfp pxgl和mervl-gfp e4cl。
145.图36：rt-qpcr数据的柱状图，表明与始发态人类psc细胞相比，在使用添加有不同剂量pd0325901、dznep或tsa的4cl培养基转化的iclc中，着床前icm标志基因klf17、dnmt3l、dppa5、stella、tfcp2l1、klf4、mael和rex1被显著诱导。对于右图的每一基因的5根柱，从左到右依次dznep-0nm、dznep-5nm、dznep-10nm、dznep-20nm和dznep-50nm。
146.图37：(a)rt qpcr数据柱状图，显示针对tprx1、khdc1l和trim60的shrna敲降效率。(b)rt-qpcr数据柱状图，显示在iclc向8clc的转化过程中，tprx1、khdc1l和trim60的敲降抑制了8c特异基因的诱导。
具体实施方式
147.目前产生和维持原始态人类psc的方法(chan，goke等，2013年；takashima，guo等，2014年；theunissen，powell等，2014)赋予了人类psc一些小鼠esc的特征，这些特征与小鼠着床前icm相当。使用当前方法衍生的原始态人psc是有问题的，例如时间长、产生不同水平的原始态特异基因，原始态的诱导依赖于转基因、基因组不稳定、印记丢失、多谱系分化能力低下和缺乏异种嵌合能力。这些研究均未报道产生接近8c期的细胞。
148.为了克服上述问题，发明人首先对一组抑制剂进行了筛选，这些抑制剂针对的是与人类着床前内细胞团发育相关的表观遗传调控因子和多种信号通路，并发现三种基本调节剂(jak/stat3激活剂，mapk/erk抑制剂和端锚聚合酶抑制剂)能激活控制灵长类psc的着床前内细胞团样状态的分子网络。发明人还发现，sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂使培养所得的细胞的表观遗传状态和转录组状态更接近人类着床前内细胞团，它们将传统灵长类psc转化为iclc，后者具有如背景技术部分所述的人类着床前内细胞团的所有主要特征。
149.因此，本技术提供了多种方法和化学组分明确的培养基，以促进灵长类iclc的稳健产生。本文所述的方法可应用于许多人类和非人类灵长类psc系，所述多能干细胞系处于始发态，如ssea-3、ssea-4、tra-1-81和tra-1-60等多能表面标志基因的表达所验证的，或处于着床前icm样状态，如dnmt3l、stella3、dppa5和klf17等基因的表达所验证的。本技术中可使用的灵长类psc系包括但不限于传统灵长类psc和icm样psc。本文所述的方法也可用于从灵长类着床前内细胞团中分离iclc。所述的方法无需转基因，灵长类psc可以在大约2周内在一种培养条件下转化为iclc。
150.据我们所知，目前还没有体外诱导灵长类8clc的方法。为了实现这一点，发明人进一步优化了诱导iclc的配方，并且发现，仅增加培养基中sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂的剂量，即可使始发态人psc和/或iclc转化为8clc。因此，本技术提供化学组分明确的培养基，其促进灵长类8细胞胚胎样细胞(8clc)的产生。本文所述的方法可应用于许多人类和非人类灵长类psc系，所述多能干细胞系处于始发态，如ssea-3、ssea-4、tra-1-81和tra-1-60等多能表面标志基因的表达所验证的，或处于着床前icm样状态，如dnmt3l、stella3、dppa5和klf17等基因的表达所验证的。本技术中可使用的灵长类psc系包括但不限于始发的灵长类psc和icm样psc。本文所述的方法也可用于从灵长类8细胞胚胎中分离8clc。所述的方法无需转基因，在大约1周内在一种培养条件下转化为8clc。
151.下面将描述本发明的详细内容。应当理解，在各种实施方式中描述的特征可以彼此组合以形成优选的技术方案，这些方案也在本技术的范围内。
152.i.术语
153.除非另有规定，否则本文使用的所有术语具有本领域技术人员通常理解的含义。为了便于理解本发明，本文中使用的一些术语定义如下。
154.除非上下文另有明确规定，否则说明书和权利要求书中使用的单数“一个”、“一种”和“这个”包括复数引用。例如，术语“(一个)细胞”包括多个细胞，包括它们的混合物。
155.所有数字指标，如ph、温度、时间、浓度和分子量(包括范围)都是近似值。需要理解的是，尽管并非总是明确说明，但所有数字指标前面都有“约”一词。还应理解，尽管并非总是明确描述，但本文所述试剂只是示例，其等效物在本领域已知。
156.本文使用的术语“基础培养基”是指任何能够支持细胞生长的培养基。基础培养基
提供标准无机盐，如锌、铁、镁、钙和钾，以及维生素、葡萄糖、缓冲系统和关键氨基酸。本技术中可使用的基本培养基包括但不限于dulbecco改良eagle培养基(dmem)、最小必需培养基(mem)、基础培养基eagle(bme)、rpmi1640、f10、f12、α最小必需培养基(αmem)、glasgow最小必需培养基(gmem)、iscove改良dulbecco培养基、神经基础培养基和dmem/f12。本领域技术人员知晓如何选择适合所培养细胞的基础培养基。在优选实施方案中，在本技术中使用的基础培养基是dmem/f12和神经基础培养基的1:1(w/w)混合物。
157.术语“无血清”是指不存在任何物种的任何血清，包括但不限于不存在胎牛血清、小牛血清、人血清等，或其组合。
158.本文所用术语“血清替代物”是指在基础培养基中用于部分或完全替代血清以支持细胞生存和生长的添加剂。血清替代物一般包括胰岛素、金属蛋白、微量元素、维生素等。这些因子通常不包含在基础培养基中，而由常用于培养细胞的血清提供。血清替代物包括至少一种或多种下述支持细胞生长的组分：一种或多种胰岛素和胰岛素替代品、一种或多种金属蛋白和金属蛋白替代品、一种或多种微量元素、一种或多种维生素、一种或多种氨基酸、一种或多种激素和激素类化合物、血清白蛋白或血清白蛋白替代品，以及一种或多种脂质等。本领域已知多种商业血清替代物，包括本领域技术人员容易获得的kosr、n2、b27、胰岛素转铁蛋白硒补充物(its)、g5等。这些替代物都有明确的组成，因此每种组分的浓度可以根据它们各自在培养基中的比例来确定。
159.本领域技术人员可以根据现有技术、要培养的细胞类型等方面方便地配置血清替代物。优选地，本文使用的血清替代物是通过将kosr、n2和/或b27按一定比例混合而获得的混合添加剂。更优选地，本文中使用的血清替代物是n2和b27的1:1(w/w)混合物。
160.本文所称“灵长类”或“灵长类动物”，是指属于灵长目(primate)的动物。灵长动物包括人和非人灵长动物。非人灵长动物包括原猴亚目(prosimian)和猿亚目(simiae)的动物。特定的非人灵长动物包括但不限于猕猴、狐猴、长臂猿、猩猩和狒狒。
161.本文所用的“多能干细胞”(psc)是指原肠胚形成前随时从胚胎中获得的多能细胞和体细胞重编程产生的ipsc。根据其来源和培养方法，psc可能处于不同状态，其中包括始发的psc、原始态psc、扩展psc和延展psc(gafni等，2013；gao等，2019；takashima等，2014；theunissen等，2014；yang等，2017)。psc特征是能够在适当的条件下产生不同细胞类型的后代，它们是三个生殖层(内胚层，中胚层和外胚层)的衍生物。这些可根据本领域标准的技术测试确定，例如6至12周龄scid小鼠形成畸胎瘤的能力，并且还可在合适条件下产生胎盘的不同细胞类型。当群体中相当大比例的干细胞及其衍生物显示出未分化细胞的形态特征，从而区别于胚胎或成体来源的分化细胞，psc培养物被描述为“未分化的”。应理解所述群内未分化细胞的集落可被邻近分化细胞环绕。
162.本技术可使用各种类型的干细胞。特别适用于本技术的是灵长类多能干细胞。非限制性的例子是esc和ipsc的原代培养物或已建立的系。任何非灵长类哺乳动物的多能干细胞也可用于本技术。
163.在一个或多个实施方案中，可在本技术中使用的灵长类psc可选自：
164.(i)来自esc系和/或ecc系的细胞；
165.(ii)ipsc系的细胞；
166.(iii)体外培养的着床前囊胚的icm的细胞；
167.(iv)体外培养的着床后囊胚的icm的细胞；和
168.(v)体外培养的8细胞阶段至桑椹胚阶段的胚胎的细胞。
169.非限制性psc包括但不限于本领域的任何已建立细胞系，例如人esc系，例如h1(雄性)、h9(雌性)、hn10(雌性)、hues1(雌性)和wibr3(雌性)；人类ipsc系，例如cbc14(雌性)、c11(雌性)、phoenix(雌性)、dips 1016seva(雄性)、stips o-xx1(雌性)和uh10(雄性)。
170.ii.培养基
171.本文公开的培养基为化学组分明确的培养基，其可有效地将灵长类psc从始发态转化为着床前内细胞团样状态，从而在2周内产生着床前内细胞团样细胞(iclc)，而无需挑选集落。本技术的培养基亦可于约1周内将灵长类psc从始发态和/或着床前内细胞团样状态转变为8细胞胚胎样状态，产生8细胞胚胎样细胞(8clc)。因此，这种培养基在本技术中也可以称为“转化培养基”。在一些实施方案中，本技术的培养基还可支持着床前内细胞团样状态的细胞的产生、传代和/或复苏后的存活、自我更新和增殖。在一些其它实施方案中，本技术的培养基也可支持着床前内细胞团样状态的细胞在胞外基质上传代和/或复苏后的存活、自我更新和增殖，而不需要饲养细胞或条件化培养基。在一些实施方案中，本技术的培养基也可支持着床前内细胞团样状态的悬浮细胞的传代和/或复苏后的存活、自我更新和增殖，而不需要饲养细胞或条件化培养基。在一些其他实施方案中，本技术的培养基还可支持着床前内细胞团样状态的细胞在饲养细胞上的传代和/或复苏后的存活、自我更新和增殖。优选地，本技术的化学成分明确培养基为无血清培养基。
172.本技术的培养基含有基础培养基，并补充有prc和/或ezh2抑制剂和hdac抑制剂，以及任选的选自l-抗坏血酸、jak/stat3信号传导激活剂、mapk/erk信号转导抑制剂和端锚聚合酶抑制剂的一种或多种组分。所述基础培养基能够支持细胞生长，特别是能够支持人和非人灵长类动物的psc的生长。优选地，本技术中使用的基础培养基是高级dmem/f12和神经基础培养基的1:1(v/v)混合物。应理解，sah的抑制剂同样能实现抑制prc和ezh2的效果。因此，在一些实施方案中，prc和/或ezh2抑制剂是sah抑制剂。在本技术中，术语“sah/prc/ezh2抑制剂”指代sah、prc和/或ezh2的抑制剂。
173.在所述培养条件下，sah/prc/ezh2抑制剂的存在对于诱导多种调节因子(包括stella、dnmt3l和mael)至关重要，这些调节因子控制着人类的原始态分子网络。stella是一种dna甲基化调节剂。它在体细胞中的异位过度表达可通过干扰dna甲基化调节因子uhrf1的功能而诱导dna的全面去甲基化。stella缺失引起的uhrf1功能障碍会导致卵子发生过程中异常dna甲基化的积累(li等，2018)。stella的诱导具有剂量依赖性。发明人进一步揭示了stella的功能作用，发现stella敲除阻碍了iclc和8clc的诱导。在始发态psc向iclc转化的过程中，stella缺失引起包括klf17、dppa5、dnmt3l、tfcp2l1和mael在内的着床前icm标记未能被诱导。在始发态psc和iclc转化为8clc的过程中，在stella缺失的情况下，包括tprx1、trim60、khdc1l、ypel2、alpg、znf280f、fam151a和ccna1在内的8c标记未能被诱导。如本技术所证明的，在使用4cl或e4cl培养基进行转化的过程中，与野生型相比，stella基因敲除细胞的整体dna甲基化水平显著升高。因此，在向iclc和8clc转化的过程中，stella是dna受控去甲基化的必要条件。总之，本技术发现，sah/prc/ezh2抑制剂可通过重置组蛋白修饰和dna甲基化状态来促进iclc和8clc的诱导。
174.任何可作为sah/prc/ezh2抑制剂的物质都可用于本技术的培养基中，包括但不限
于dznep(cas号：102052-95-9，为sah抑制剂)和cpi-1205(cas号：1621862-70-1，为prc/ezh2抑制剂)。本技术培养基中，sah/prc/ezh2抑制剂可单独使用或组合使用，通常以其各自的常规量使用，且其用量不会导致细胞死亡。例如，培养基中dznep的终浓度可为5至80nm、优选5至50nm，cpi-1205的终浓度可为0.5至5mm、优选1至3mm。在一个或多个实施方案中，sah/prc/ezh2抑制剂是prc抑制剂。
175.可作为hdac抑制剂的任何物质均可用于本技术的培养基中，包括但不限于曲古抑菌素a(tsa)、丙戊酸(vpa)和丁酸钠(nab)。本技术培养基中，hdac抑制剂可单独使用或组合使用，通常以其各自的常规量使用，且其用量不会导致细胞死亡。例如，培养基中tsa的终浓度可为3至30nm、优选为3至25nm，vpa的终浓度可为0.25至2mm、优选0.5至1.5mm，并且nab的终浓度可为0.25至2mm、优选0.5至1.5mm。
176.本发明人还发现，当sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂两者以相对高的浓度使用时，通过本技术的培养基可将始发态psc和/或iclc转化成8clc。具体而言，在一些实施方案中，为了产生8clc，当各自单独使用时，dznep可为40nm或更高、如40-80nm，优选约50nm；cpi-1205可为2mm或更高、如2-5mm，优选约3mm；tsa可为10nm或更高、如10-30nm，优选约20nm；vpa可为1mm或更高、如1-2mm，优选约1.5mm；和nab可为1mm或更高、如1-2mm，优选约1.5mm。应理解，当使用两种或多种sah/prc/ezh2抑制剂或两种或多种hdac抑制剂时，应将每种sah/prc/ezh2抑制剂或每种hdac抑制剂的终浓度降低至足以通过这些sah/prc/ezh2抑制剂或hdac抑制剂的组合来诱导8clc的量。这些量可以由本领域的技术人员基于本技术的公开和本领域的常规知识容易地确定。
177.此外，还应了解过量的sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂可能导致细胞死亡。因此，为了在尽可能减少细胞死亡的同时诱导iclc，可以在较低浓度下使用sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂中之一或两者。具体而言，当各自单独使用时，dznep的终浓度可为5至15nm、优选约10nm，cpi-1205的终浓度可为0.5至3mm、优选约1mm，tsa的终浓度可为3至10nm、优选4至6nm、更优选约5nm，vpa的终浓度可为0.25至1mm，优选0.5mm，和nab的终浓度可为0.25至1mm、优选0.5mm。在一些实施方案中，sah/prc/ezh2抑制剂以相对较高的浓度范围内使用，如dznep的终浓度可为5至80nm、优选5至50nm，cpi-1205的终浓度可为0.5至5mm、优选1至3mm，而hdac抑制剂则在相对较低的浓度范围内使用，如tsa的终浓度可为3至10nm、优选4至6nm，vpa的终浓度可为0.25至0.5mm，nab的终浓度可为0.25至0.5mm。在一些实施方案中，sah/prc/ezh2抑制剂以相对较低的浓度范围内使用，如dznep的终浓度可为5至15nm，cpi-1205的终浓度可为0.5至2mm，而hdac抑制剂则在相对较高的浓度范围内使用，如tsa的终浓度可为3至30nm、优选为3至25nm，vpa的终浓度可为0.25至2mm，nab的终浓度可为0.25至2mm。这类培养基可将灵长类pscs转化成iclc。
178.如申请号cn 200910041331.9所述，l-抗坏血酸被发现能通过增强含jumonji结构域的组蛋白去甲基化酶来改善从体细胞产生和维持小鼠ipsc(类似小鼠esc)，该申请的内容通过引用并入本文。因此，发明人假设l-抗坏血酸对灵长类着床前内细胞团样状态的形成也有类似的作用。通过适当的测试，发明人发现，当以40至70μg/ml的终浓度使用时，l-抗坏血酸可潜在地提高内细胞团特定基因(如dnmt3l、stella、dppa5和klf17)的表达水平。在优选实施方案中，l-抗坏血酸以约50μg/ml的终浓度使用。
179.本技术中也可使用l-抗坏血酸衍生物，其是指与l-抗坏血酸具有类似结构和抗氧
化活性的类似化合物。这些衍生物在保持l-抗坏血酸的生物活性的同时，更稳定或更容易被细胞吸收。l-抗坏血酸衍生物包括但不限于l-抗坏血酸磷酸酯和l-抗坏血酸有机酯，如l-抗坏血酸棕榈酸酯。所述培养基中l-抗坏血酸衍生物的量不受限制，但通常应足以产生如上所述的足够量的l-抗坏血酸。
180.本技术培养基可含有janus激酶(jak)/信号转导与转录激活剂3(stat3)(即jak/stat3)信号传导的一种或多种激活剂，其可协同诱导本技术的早期胚胎特异基因子集。可以使用任何已知的jak/stat3激活剂，特别地，优选那些通常用于干细胞培养的激活剂。其中一种jak/stat3激活剂是lif。本文所用的lif是指白血病抑制因子，它是一种通常添加用以培养干细胞的生长因子。优选的lif是人类lif。jak/stat3激活剂的量是可用于干细胞培养中的常用量，示例性的终浓度通常可为10至50ng/ml。例如，对于lif，尤其是人类lif，其在本技术培养基中的终浓度可为10至50ng/ml、优选10至30ng/ml、更优选约20ng/ml。
181.本技术培养基可含有丝裂原活化蛋白激酶(mapk)/细胞外信号调节激酶(erk)(即mapk/erk)信号传导的一种或多种抑制剂，其有助于与本技术培养基中的其他组分协同减少dna甲基化。可以使用任何已知的mapk/erk抑制剂，特别地，优选那些通常用于干细胞培养的抑制剂。其中一种mapk/erk抑制剂是pd0325901(cas号：391210-10-9)。mapk/erk抑制剂的量是可用于干细胞培养中的常用量，示例性的终浓度范围可为0.5至3μm、优选0.5至1.5μm。例如，对于pd0325901，其在本技术培养基中的终浓度可为0.5至3μm、优选0.5至1.5μm、更优选约1μm。
182.本技术的培养基可含有一种或多种端锚聚合酶抑制剂，其抑制规范wnt信号传导。可以使用任何已知的端锚聚合酶抑制剂，尤其优选的是通常用于干细胞培养的端锚聚合酶抑制剂，包括但不限于iwr1(cas号：1127442-82-3)和xav939(cas号：284028-89-3)。端锚聚合酶抑制剂的量是可用于干细胞培养中的常用量，示例性的终浓度范围可为2至8μm、优选3至6μm。例如，对于iwr1和xav939，其在本技术培养基中的终浓度可为2至8μm、优选3至6μm、更优选约5μm。可组合使用两种或多种端锚聚合酶抑制剂，且每种抑制剂的量减少。
183.在一个或多个优选实施方案中，本技术培养基包含终浓度为5至15nm的dznep或终浓度为0.5至2mm的cpi-1205；终浓度为3至30nm的tsa、或终浓度为0.25至2mm的vpa、或终浓度为0.25至2mm的nab，优选终浓度为3至10nm的tsa，或终浓度为0.25至1mm的vpa，或终浓度为0.25至1mm的nab；终浓度为40至70μg/ml的l-抗坏血酸；终浓度为10ng/ml至30ng/ml的lif；终浓度为0.5至1.5μm的pd0325901；以及终浓度为3至6μm的iwr1或xav939。在一个或多个优选实施方案中，本技术培养基包含终浓度为5至80nm、优选5至50nm的dznep或终浓度为0.5至5mm、优选0.5至3mm的cpi-1205；终浓度为3至10nm的tsa，或终浓度为0.25至0.5mm的vpa，或终浓度为0.25至0.5mm的nab；终浓度为40至70μg/ml的l-抗坏血酸；终浓度为10ng/ml至30ng/ml的lif；终浓度为0.5至1.5μm的pd0325901；以及终浓度为3至6μm的iwr1或xav939。更优选地，本技术的培养基包括10nm的dznep或1mm的cpi-1205；5nm的tsa或0.5mm的vpa或0.5mm的nab；50μg/ml的l-抗坏血酸；20ng/ml的lif；1μm的pd0325901；和5μm的iwr1或5μm的xav939。这些培养基优选用于将灵长类psc转化成iclc。
184.在一个或多个优选实施方案中，本技术培养基包含终浓度为40至70nm的dznep或终浓度为2至4mm的cpi-1205；终浓度为10至30nm的tsa，或终浓度为0.5至1.5mm的vpa或终浓度为0.5至1.5mm的nab；终浓度为40-70μg/ml的l-抗坏血酸；终浓度为10ng/ml至30ng/ml
的lif；终浓度为0.5至1.5μm的pd0325901；以及终浓度为3至6μm的iwr1或xav939。更优选地，本技术的培养基包括50nm的dznep或3mm cpi-1205；20nm tsa或1mm vpa或1mm nab；50μg/ml l-抗坏血酸；20ng/ml的lif；1μm的pd0325901；和5μm的iwr1或5μm的xav939。这些培养基优选用于将灵长类psc或iclc转化成8clc。
185.本技术培养基可进一步包含选自胞外基质、activin/nodal信号传导激活剂和rock抑制剂的至少一种或多种添加剂。
186.与始发态人类psc相比，用本文所述方法得到的iclc和8clc中nodal(activin/nodal信号通路激活剂)的表达水平增加。这一观察结果表明，activin/nodal信号传导在转化过程和自我更新过程中是内生/自动激活的。因此，在本技术的一些实施方案中，培养基还包括activin/nodal信号传导激活剂，以加速转化过程。任何已知的activin/nodal信号传导激活剂均可添加到本技术的培养基中，其包括但不限于人类activin a和人类nodal，它们的氨基酸序列本领域周知。人类activin a或人类nodal可存在于本技术培养基中，其终浓度为10至25ng/ml，优选约20ng/ml。也可使用人类activin a与人类nodal的组合。通常，培养基中人类activin a和人类nodal的总浓度为10至25ng/ml，优选约20ng/ml。
187.转化为iclc和/或8clc后，在作为单个细胞传代后，不再需要抑制rock信号传导。但是补充低浓度的rock抑制剂可提高iclc和8clc的产量，有利于规模化培养。因此，在本发明的一些实施方案中，培养基还包括rock抑制剂。任何已知的rock抑制剂均可用于本技术的培养基中，包括但不限于y27632(cas号：146986-50-7)、thiazovivin(cas号：1226056-71-8)和羟基法舒地尔(cas号：105628-72-6)。rock抑制剂的终浓度可为0.5至2μm、优选约1μm。可组合使用两种或多种rock抑制剂，其在培养基中的总浓度为0.5至2μm，优选约1μm。
188.发明人发现，在本技术的培养基中培养psc时，psc可以在无饲养细胞的悬浮培养基中转化和维持，转化后的细胞可以自我更新并作为球形集落繁殖。因此，在本技术的一些实施方案中，所描述的方法、培养条件和培养基是无饲养层的。
189.在一些其它实施方案中，发明人发现在转化和维持期间，提供额外的细胞基质将促进细胞集落呈球体状。在此条件下，90％以上的psc在转化过程中可转变为半球形集落，表达dnmt3l和klf17等内细胞团标记。因此，在一些实施方案中，在培养基中使用胞外基质来培养iclc和8clc。胞外基质是从engelbreth-holm-swarm小鼠肉瘤(matrigel
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或geltrex
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或ecm
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)中提取的可溶解基底膜制剂，或者是包含人类基质蛋白胶原蛋白iv和至少一种选自纤维连接蛋白、层粘连蛋白和维生素c的组分的基质。胞外基质通常以0.1％至0.5％(v/v)的量存在于本技术的培养基中。如有必要，可使用不同种类的胞外基质的组合，它们在培养基中的总量也应在0.1％至0.5％(v/v)范围内。优选地，胞外基质通常以0.2％(v/v)的量存在于本技术的培养基中。
190.因此，在一个或多个优选实施方案中，本技术培养基包含：
191.(a)终浓度为5至15nm的dznep或终浓度为0.5至2mm的cpi-1205，以及终浓度为3至30nm的tsa、或终浓度为0.25至2mm的vpa、或终浓度为0.25至2mm的nab，优选终浓度为3至10nm的tsa，或终浓度为0.25至1mm的vpa，或终浓度为0.25至1mm的nab；或者，终浓度为5至80nm、优选5至50nm的dznep或终浓度为0.5至5mm、优选0.5至3mm的cpi-1205，以及终浓度为3至10nm的tsa、或终浓度为0.25至0.5mm的vpa、或终浓度为0.25至0.5mm的nab；
192.(b)终浓度为40至70μg/ml的l-抗坏血酸；
193.(c)终浓度为10至30ng/ml的人类lif；
194.(d)终浓度为0.5至1.5μm的pd0325901；
195.(e)终浓度为3至6μm的iwr1或xav939；
196.并进一步补充有：
197.(1)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或
198.(2)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或
199.(3)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或
200.(4)终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或
201.(5)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；或终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质。这些培养基优选用于将灵长类psc转化成iclc。
202.更优选地，本技术培养基包含10nm的dznep或1mm的cpi-1205；5nm的tsa，或0.5mm的vpa，或0.5mm的nab；50μg/ml的l-抗坏血酸；20ng/ml的lif；1μm的pd0325901；和5μm的iwr1或5μm的xav939；并进一步补充有(1)20ng/ml的activin a或nodal，1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和0.2％(v/v)的胞外基质；或(2)20ng/ml的activin a或nodal，以及1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；(3)20ng/ml的activin a或nodal，和0.2％(v/v)的胞外基质；或(4)1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，以及0.2％(v/v)的胞外基质；或(5)20ng/ml的activin a或nodal，或1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，或0.2％(v/v)的胞外基质。这些培养基优选用于将灵长类psc转化成iclc。
203.在一个或多个优选实施方案中，本技术培养基包含终浓度为40至70nm的dznep或终浓度为2至4mm的cpi-1205；终浓度为10至30nm的tsa，或终浓度为0.5至1.5mm的vpa，或终浓度为0.5至1.5mm的nab；终浓度为40至70μg/ml的l-抗坏血酸；终浓度为10至30ng/ml的lif；终浓度为0.5至1.5μm的pd0325901；以及终浓度为3至6μm的iwr1或xav939；并进一步补充有：
204.(1)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或
205.(2)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或
206.(3)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或
207.(4)终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或
208.(5)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；或终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质。这些培养基优选用于将灵长类psc或iclc转化成8clc。
209.更优选地，本技术培养基包含50nm的dznep或3mm的cpi-1205；20nm的tsa，或1mm的vpa，或1mm的nab；50μg/ml的l-抗坏血酸；20ng/ml的lif；1μm的pd0325901；和5μm的iwr1或5μm的xav939；并进一步补充有(1)20ng/ml的activin a或nodal，1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和0.2％(v/v)的胞外基质；或(2)20ng/ml的activin a或nodal，以及1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；(3)20ng/ml的activin a或nodal，和0.2％(v/v)的胞外基质；或(4)1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，以及0.2％(v/v)的胞外基质；或(5)20ng/ml的activin a或nodal，或1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，或0.2％(v/v)的胞外基质。这些培养基优选用于将灵长类psc或iclc转化成8clc。
210.除上述组分外，本技术培养基还可包含通常用在培养干细胞的培养基中的其他添加剂，包括但不限于血清替代物，如n2和/或b27；替代碳源，如丙酮酸，如丙酮酸钠；非必需氨基酸；l-谷氨酰胺或其替代品，如在0.85％氯化钠中含有l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽的glutamax
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补充剂；和抗生素，如青霉素、链霉素或青霉素和链霉素的混合物。这些添加剂的量可以是用于细胞培养，特别是干细胞培养的常用量。
211.iii.试剂盒和组合物
212.本文还公开了一种试剂盒，其包含本技术培养基，或含有用于配制培养基的本技术培养基的全部或部分组分。
213.在一些实施方案中，本技术的试剂盒包含随时可用的培养基，其组分如上述任何培养基实施方案所述。在一些实施方案中，本技术的试剂盒包含本技术任何实施方案中所述的用于使灵长类psc向iclc转化的转化培养基，和/或本技术任何实施方案中所述的用于使灵长类psc或iclc向8clc转化的转化培养基。
214.在其他实施方案中，本技术的试剂盒至少包含sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂，其可单独包装或作为混合物提供在一个容器。所述试剂盒还可包含选自l-抗坏血酸、jak/stat3信号传导激活剂、mapk/erk信号传导抑制剂和端锚聚合酶抑制剂的一个或多个组分，当存在时，所述组分可单独包装或以任何组分组合的混合物形式提供。优选地，所述试剂盒可包含sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂，以及l-抗坏血酸、jak/stat3信号传导激活剂、mapk/erk信号传导抑制剂和端锚聚合酶抑制剂。此外，所述试剂盒还可包含选自activin/nodal信号传导激活剂和rock抑制剂的一种或多种组分。试剂盒还可包含常规的胞外基质，如matrigel
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、geltrex
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。优选地，所述试剂盒还包含基础培养基，例如本文所述的任意一种或多种基础培养基，如dmem/f12(1:1)和/或神经基础培养基，以及已知用于干细胞培养的其他成分，例如血清替代物，例如n2和/或b27，替代碳源，例如丙酮酸盐，例如丙酮酸钠，非必需氨基酸，l-谷氨酰胺或其替代物，比如含有l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽的0.85％氯化钠溶液的glutamax
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补充物，和抗生素。所有这些成分的量应足以配制本技术的培养基。
215.所述试剂盒还可包含说明书，其中可含有关于培养基的配方及其使用的文本。
216.在一些实施方案中，本文还提供了包含hmt抑制剂和hdac抑制剂的组合物。所述组合物还可包含选自l-抗坏血酸、jak/stat3信号传导激活剂、mapk/erk信号转导抑制剂和端锚聚合酶抑制剂的一种或多种组分。此外，所述组合物还可包含选自activin/nodal信号传导激活剂和rock抑制剂的一种或多种组分。在优选实施方案中，所述组合物包括sah/prc/ezh2抑制剂、hdac抑制剂、l-抗坏血酸、jak/stat3信号转导激活剂、mapk/erk信号转导抑制
剂和端锚聚合酶抑制剂，以及任选的activin/nodal信号传导激活剂和任选的rock抑制剂。应当理解，组合物中各组分的量应使得当使用该组合物配制培养基时，所得培养基中各组分的终浓度在本发明任一实施方案所述的各培养基的相应组分的浓度范围内；更优选地，当使用所述组合物配制培养基时，所得培养基为本技术任一实施方案所述的培养基。
217.在一个或多个优选实施方案中，本技术组合物含有曲古抑菌素a(tsa)、丙戊酸(vpa)或丁酸钠(nab)，以及3-去氮腺嘌呤a(dznep)或cpi-1205，以及任选的l-抗坏血酸，任选的lif，任选的pd0325901，和任选的iwr1或xav939；优选地，组合物中各成分的存在量应使得，当使用该组合物配制培养基时，该培养基含有5至15nm、优选10nm的dznep或0.5至2.0mm、优选1mm的cpi-1205，含有3至6nm、优选5nm的曲古抑菌素a(tsa)，或0.25至1mm、优选0.5mm的丙戊酸(vpa)，或0.25至1mm、优选0.5mm的丁酸钠(nab)，和任选的40至90μg/ml、优选50μg/ml的l-抗坏血酸，任选的10至30ng/ml、优选20ng/ml的lif，任选的0.8至1.5μm、优选1μm的pd0325901，任选的3至6μm、优选5μm的iwr1或xav939。进一步地，该组合物中还可含有activin a或nodal，y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和胞外基质中的一种或多种；优选地，其各自的存在量应使得当使用该组合物配制培养基时，所得培养基包含10至25ng/ml、优选20ng/ml的activin a或nodal，和/或0.5至2μm、优选1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和/或0.1至0.5％(v/v)、优选0.2％(v/v)的胞外基质。
218.在一个或多个实施方案中，本技术组合物含有3-去氮腺嘌呤a或cpi-1205，以及曲古抑菌素a(tsa)、丙戊酸(vpa)或丁酸钠(nab)，以及任选的l-抗坏血酸，任选的人类lif，任选的pd0325901，和任选的iwr1或xav939；优选地，组合物中各成分的存在量应使得，当使用该组合物配制培养基时，该培养基含有40至70nm、优选50nm的3-去氮腺嘌呤a(dznep)或2至4mm、优选3mm的cpi-1205，10至30nm、优选20nm的曲古抑菌素a(tsa)，或0.5至1.5mm、优选1mm的丙戊酸(vpa)，或0.5至1.5mm、优选1mm的丁酸钠(nab)，和任选的40至90μg/ml、优选50μg/ml的l-抗坏血酸，任选的10至30ng/ml、优选20ng/ml的lif，任选的0.8至1.5μm、优选1μm的pd0325901，任选的3至6μm、优选5μm的iwr1或xav939。进一步地，该组合物中还可含有activin a或nodal，y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和胞外基质中的一种或多种；优选地，其各自的存在量应使得当使用该组合物配制培养基时，该培养基包含10至25ng/ml、优选20ng/ml的activin a或nodal，和/或0.5至2μm、优选1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和/或0.1至0.5％(v/v)、优选0.2％(v/v)的胞外基质。
219.在一些实施方案中，试剂盒可包括上述组合物。
220.本技术的试剂盒可进一步包括用于维持psc的培养基，例如mtesr1或e8培养基，和/或用于类囊胚形成的培养基，例如补充有8至15μm的y27632或不含y27632的rem培养基(rem是一种改良的重建胚胎培养基(zhang shaopeng等2019))。所述试剂盒通常还可包含用于干细胞培养的试剂。此类试剂包括但不限于pbs、edta溶液和/或tryple:0.5mm edta(1:1)。所述试剂盒还可包含饲养细胞和/或胞外基质。
221.iv.方法和用途
222.本技术的培养基可用于重编程灵长类体细胞为iclc，将灵长类psc转化为iclc，并使灵长类psc或iclc转化成8-细胞样状态细胞(8clc)。
223.因此，本技术的一个方面公开了一种将灵长类体细胞重编程为iclc的方法，包括在包含sah/prc/ezh2抑制剂、hdac抑制剂、l-抗坏血酸、jak/stat3信号传导激活剂、mapk/
erk信号传导抑制剂和端锚聚合酶抑制剂、任选的activin/nodal信号传导激活剂和任选的rock抑制剂、含或不含胞外基质的转化培养基中培养所述体细胞。得到的iclc可用于将iclc转换为8clc的方法中。优选地，转化换培养基如本技术的任何实施方式中所述。
224.本技术的另一方面公开了一种使灵长类psc转化成着床前内细胞团样细胞(iclc)或使灵长类psc或iclc转化成8-细胞样状态细胞(8clc)的方法，包括在包含sah/prc/ezh2抑制剂、hdac抑制剂、l-抗坏血酸和jak/stat3信号传导激活剂、mapk/erk信号传导抑制剂和端锚聚合酶抑制剂、任选的activin/nodal信号传导激活剂和任选的rock抑制剂、含或不含胞外基质的转化培养基中培养所述灵长类psc或所述iclc。在优选实施方案中，转化培养基是如上述任何实施方案中定义的培养基。
225.在一个或多个优选实施方案中，所述方法是使灵长类psc转化成着床前内细胞团样细胞(iclc)的方法，并且转化培养基是如上述任何实施方案中所定义的具有相对较低浓度的sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂的培养基。
226.在一些其他优选实施方案中，所述方法是使灵长类psc或iclc转化成8细胞胚胎样状态细胞(8clc)的方法，并且转化培养基是如上述任何实施方案中所定义的具有相对较高浓度的hmt抑制剂和hdac抑制剂的培养基。
227.常规干细胞培养条件可用于将psc转化为iclc或8clc。例如，单一始发态psc可任选地补充有5至15μm的rock抑制剂(如y27632)的常规培养基中，所述常规培养基可以是例如mtesr1或e8。培养一段时间例如24小时后，将培养基切换为本技术的培养基，继续培养细胞，直到产生所需的iclc或8clc。在培养期间，培养基可根据需要进行更新，优选每天更新。传代时，可用常规方法将细胞分离成单个细胞，然后加到本技术培养基中再次培养，直到形成iclc或8clc。优选地，每3至4天将细胞以单个细胞传代，分裂比为1:4至1:8，优选1:6至1:8；通常，细胞在大约2周内从始发态psc转化为iclc，在约1周后从始发态psc转化为8clc，并且，用含有较高浓度的sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂的培养基培养iclc后，细胞在3至5天内由iclc转化为8clc。应理解的是，用于转化得到8clc的iclc可以是采用本文所述的方法由灵长类动物psc转化成的iclc，也可以是本领域已知的iclc或采用本领域已知的方法制备得到的iclc。
228.一般来说，细胞可以在37℃的常氧条件(5％co2)或低氧条件(5％co2和5％o2)下培养。对培养时间没有特定的限制，这可以由本领域的技术人员基于本公开和本领域的常规技术容易地确定。添加/铺板浓度可由本领域技术人员根据本领域公知常识和实际生产条件确定。
229.在本技术的一些实施方案中，细胞可在选自以下的一个或多个条件下培养：(i)在饲养细胞上；(ii)在没有饲养层的细胞外基质上；(iii)在没有饲养细胞的悬浮液中；(iv)在约37℃的低氧或常氧条件下繁殖；(v)以单细胞每3至4天传代，分裂比为1:4至1:8；(vi)每日更换培养基。
230.在一些实施方案中，为了使灵长类psc向iclc转化，将单一的始发态灵长类psc加至补充有5至15μm的rock抑制剂(如y27632)的mtesr1或e8培养基的饲养层上培养一段时间例如24小时，然后将mtesr1或e8培养基替换为本文所述的含相对较低浓度的sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂的转化培养基中，并在约37℃的低氧或常氧条件下培养细胞，每天更新培养基。在培养过程中，细胞每3至4天传代一次，分裂率为1:4至1:8，直到获得iclc。在一
些实施方案中，如上文所述培养单一的始发态灵长类psc，但将细胞加至胞外基质(例如geltrex
tm
)包被后的培养皿上，而不是在饲养细胞上。
231.在一些实施方案中，为了使灵长类psc向iclc转化，使用补充有5至15μm的rock抑制剂(如y27632)的mtesr1或e8培养基将单一的始发态灵长类psc加至板中培养一段时间例如24小时，然后将mtesr1或e8培养基替换为含相对较低浓度的sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂的转化培养基中，并在约37℃的低氧条件下培养细胞；形成小球后将小球移入烧瓶悬浮培养，每天更新培养基；每4至5天以单细胞传代，分裂比为1:4至1:8，直至获得iclc。
232.在一些实施方案中，为了将灵长类psc转化为8clc，将单一的始发态灵长类psc加到补充有5至15μm的rock抑制剂(如y27632)的mtesr1或e8培养基的饲养层上培养一段时间，例如24小时，然后将培养基替换为本文所述的含相对较高浓度的sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂的转化培养基中，并在常氧或低氧条件下培养细胞；每3至4天以单细胞传代，分裂比为1:4至1:8。
233.在一些实施方案中，为了把iclc转化为8clc，从iclc中分离单细胞并在饲养层上用具有相对较低浓度的sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂的本技术转化培养基培养一段时间内(例如24小时)，然后将培养基替换为本文所述的具有较高浓度sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂的本技术转化培养基，在不传代的情况下培养3至5天，每天更新培养基。
234.在一些实施方案中，为了把iclc转化为8clc，从iclc中分离单细胞并悬浮在具有相对较低浓度的sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂的本技术转化培养基中一段时间，该转化培养基额外补充有5至15μm rock抑制剂(如y27632)；形成小团聚体后，将培养基替换为具有较高浓度sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂但不额外添加rock抑制剂(如y27632)的本技术转化培养基中进行转化数天，不传代，每天更新培养基。
235.本技术还提供本技术的任何实施方案中所述的任何转化培养基在使灵长类体细胞重编程为iclc、使灵长类psc向iclc转化、或使灵长类psc或iclc向8clc转化中的用途，或在制备用于使灵长类体细胞重编程为iclc、用于使灵长类psc向iclc转化或用于使灵长类psc或iclc向8clc转化的培养基或试剂盒中的用途。
236.在一些实施方案中，本技术还包括sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂在制备用于使灵长类体细胞重编程为iclc、使灵长类psc向iclc转化或使灵长类psc或iclc向8clc转化的培养基或试剂盒中的用途。优选地，培养基或试剂盒可进一步包括选自l-抗坏血酸、jak/stat3信号传导激活剂、mapk/erk信号传导抑制剂和端锚聚合酶抑制剂的一种或多种组分，以及任选的activin/nodal信号传导激活剂和任选的rock抑制剂(如y27632)，和任选的胞外基质。
237.在一些实施方案中，将灵长类psc转化为iclc和将灵长类psc或iclc转换为8clc的方法可包括一个基因工程改造步骤，该步骤通过敲降和/或敲除细胞中的一个或多个相关基因来降低psc的sah、prc和/或ezh2，和/或hdac的活性，然后用本技术的培养基培养改造后的psc。优选地，为了减少psc的sah、prc和/或ezh2的活性，任何sah、prc和ezh2调节子的表达都可以通过敲降(如sirna技术)，或者敲除(如crispr/cas9技术)来降低。同样，hdac调节子的表达可以通过上述相同的方式被降低。psc被改造后，根据上述方法，可以用本技术的培养基培养。在一些实施例中，当psc的sah、prc和/或ezh2的活性因改造而降低时，用于培养上述改造后的psc的培养基可能含有也可能不包含sah/prc/ezh2抑制剂。同样，如果
psc的hdac活性因改造而降低时，培养基可能含有也可能不包含hdac抑制剂。在sah、prc和/或ezh2的活性和hdac活性因改造而都降低的情况下，培养基可能既不含有sah/prc/ezh2抑制剂，也不含有hdac抑制剂，也可能含有sah/prc/ezh2抑制剂或hdac抑制剂。
238.因此，在一些实施例中，本技术进一步提供既不包括sah/prc/ezh2抑制剂，也不包括sah/prc/ezh2抑制剂或hdac抑制剂，或含有sah/prc/ezh2抑制剂或hdac抑制剂的培养基，该培养基其余成分与本技术第二部分中所述培养基的成分和用量相同。在一些实施例中，培养基可能含有利用脂质体转染的试剂。例如，在上述方法中，在含有包裹了靶向sah、prc和/或ezh2调节子的shrna的载体的脂质体的培养基中培养灵长类psc，除所述载体和脂质体外，该培养基还含有第ii部分针对本发明所述培养基所描述的其他成分，且该培养基可能含有也可能不包含sah/prc/e2抑制剂。
239.v.stella的生物学功能
240.stella是由stella编码的一种dna甲基化调控蛋白。它在体细胞中的外源过度表达可通过干扰dna甲基化调节因子uhrf1的功能而诱导dna的广泛去甲基化。在卵子发生过程中，由于stella缺失导致uhrf1功能异常，进一步导致dna甲基化异常的积累(li等,2018)。同时也有文献记载，stella通过保护特定位点的5mc免受tet3介导转化为5hmc来维持母体印记(nakamura等，2012年)。
241.在本技术中，发明人首次发现，stella敲除阻碍了iclc和8clc的诱导。因此，在转化过程中，stella是dna受控去甲基化所必需的。发明人还发现，可通过添加sah/prc/ezh2抑制剂激活stella表达来重置组蛋白修饰和dna甲基化状态，从而促进iclc和8clc的诱导。
242.因此，在一些实施方案中，本发明还包含一种能促进stella表达或提高stella活性的物质在制备试剂、培养基或试剂盒中的用途，该试剂、培养基或试剂盒用于促进灵长类psc向iclc转化、或促进灵长类psc或iclc向8clc转化，以及能促进stella表达或提高stella活性的物质在促进灵长类psc向iclc转化、或促进灵长类psc或iclc向8clc转化中的用途。
243.本发明还提供促进灵长类psc向iclc转化或灵长类psc或iclc向8clc转化的方法，所述方法包括在有效量的能促进stella表达或提高stella活性的物质存在下培养灵长类psc。本领域技术人员基于本技术的公开和现有技术的指导，可以容易地确定所述物质的有效量。
244.在一些优选实施方案中，能促进stella的表达或提高stella活性的物质是sah/prc/ezh2的抑制剂，其包括但不限于3-去氮腺嘌呤a(dznep)和cpi-1205。sah/prc/ezh2抑制剂可单独使用或组合使用，通常以其各自的常规量使用，不会导致细胞死亡。例如，培养基中dznep的终浓度可为5至80nm、优选5至50nm，并且cpi-1205的终浓度可为0.5至5mm、优选1至3mm。在一个或多个实施方案中，sah/prc/ezh2抑制剂常称为prc抑制剂。
245.在一些更优选的实施方案中，促进灵长类psc向iclc转化的方法包括在5至15nm、优选10nm的3-去氮腺嘌呤a或0.5至2.0mm、优选1mm的cpi-1205存在下培养灵长类psc。在一些其他优选的实施方案中，促进灵长类psc或iclc向8clc转化的方法包括在40至70nm、优选50nm的3-去氮腺嘌呤a或2至4mm、优选3mm的cpi-1205存在下培养灵长类psc。本发明还提供sah/prc/ezh2抑制剂，其用于促进灵长类psc向iclc转化或灵长类psc或iclc向8clc转化。
246.vi.细胞
247.本技术还提供分离的灵长类着床前内细胞团样细胞(iclc)。本技术的iclc具有接近人类着床前内细胞团的转录组、接近人类着床前内细胞团的转座元件特征、接近人类着床前内细胞团的dna甲基化组、接近人类着床前内细胞团的染色质开放状态、接近人类着床前内细胞团的代谢状态。
248.本文中，所述“接近”指基本上相同，或不存在实质性差异，本领域技术人员根据本领域公知技术，能确认，即便可能存在一些微小的差异，但本技术的细胞，包括来自本技术所述iclc和8clc的细胞与天然的iclc细胞或8clc细胞实质上相同。
249.优选地，本技术的iclc中显著诱导了着床前icm标志基因klf17、dnmt3l、dppa5、stella、tfcp2l1、mael和rex1。更优选地，本技术iclc的所述着床前icm标志基因中，至少一种标志基因的表达水平为始发态人psc中相应的着床前icm标志基因表达水平的10倍以上；优选上述所有标志基因的表达水平均为始发态人psc中相应的着床前icm标志基因表达水平的10倍以上。
250.优选地，本技术的iclc还具有以下一种或多种特征：
251.1)能够自我更新，并在培养中保持多能性；
252.2)根据核型保持培养中基因组的稳定性；
253.3)能够产生3个生殖层的细胞；
254.4)能够产生原始(primordial)生殖细胞样细胞；
255.5)能够嵌合到小鼠胚胎中，并分化为胚胎和胚胎外组织；
256.6)能够在体外转化至胚胎外细胞命运；以及
257.7)能够在体外形成囊胚样结构。
258.这种iclc可通过利用本技术任何实施方案所述的任何方法培养灵长类psc来获得。因此，在一些实施方案中，本技术还包括通过本文所述的任何方法获得的细胞，尤其是iclc。
259.本技术还提供分离的8clc，其表达8细胞(8c)状态特异性标志基因的水平远高于着床前内细胞团样状态或始发态的细胞。在一些实施方案中，所述8细胞状态特异性标志基因包括zscan4、tprx1、zim3、zscan5b、znf280a和argfx。优选地，所述特异性标志基因中，至少一种特异性标志基因的表达水平为始发态psc或iclc中相应的8-细胞特异性标志基因表达水平的5倍以上。优选地，所有上述特异性标志基因的表达水平为始发态psc或iclc中相应的8-细胞特异性标志基因表达水平的5倍以上。
260.优选地，本技术的分离的8clc具有接近人类8细胞胚胎的转录组、转座元件特征、和染色质开放状态。更优选地，本技术的8clc还具有以下一种或多种特征：
261.1)根据核型保持培养中基因组的稳定性；
262.2)能够产生3个生殖层的细胞；
263.3)能够产生原始(primordial)生殖细胞样细胞；
264.4)能够嵌合到小鼠胚胎中，并分化为胚胎和胚胎外组织；
265.5)能够在体外转化至胚胎外细胞命运；以及
266.6)能够在体外形成囊胚样结构。
267.通过使用本技术的转化培养基对体细胞进行体细胞重编程而获得的iclc也在本技术范围内。
268.本技术还提供包含本技术细胞，尤其是本技术的iclc和/或8clc的细胞培养物。细胞培养物中还可包含本技术任何实施方式中所述的培养基。
269.在下述非限制性实施例中描述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明目的，而不是用于以各种方式限制本发明的范围。在本技术的精神范围内，可以作出各种变更和修改。除另有说明，所涉及的技术是本领域技术人员公知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。
270.实施例1
271.材料和方法
272.4cl基础培养基
273.神经基础培养基(gibco公司)和高级dmem/f12(gibco公司)的1:1混合物，补充有n2补充物(1x，gibco公司)、b27补充物(1x，gibco公司)(可使用自制n2和b27)、丙酮酸钠(1x，hyclone公司)、非必需氨基酸(neaa)(gibco公司)、谷氨酰胺酶
tm
(1x，gibco公司)和青霉素-链霉素(1x，gibco公司)。
274.4cl补充物
275.4cl培养基1为在4cl基础培养基的中补充：
276.sah/prc/ezh2抑制剂(10nm dznep)、hdac抑制剂(5nm tsa)、l-抗坏血酸(50μg/ml)、jak/stat3激活剂(20ng/ml人类lif)、mapk/erk抑制剂(1μm pd0325901)、端锚聚合酶抑制剂(5μm iwr)、activin a/nodal激活剂(20ng/ml人类activin a)、细胞外基质(0.2％(v/v)geltrex
tm
)、rock抑制剂(1μm y27632)。表1列出了所有4cl补充物的商标和目录号。
277.表1
[0278][0279]
rem培养基
[0280]
高级dmem f12(gibco公司)和rpmi 1460(gibco公司)的1:1混合物，补充有17.5％胎牛血清(natocor公司)、1x glutmax
tm
(gibco公司)、1x neaa(gibco公司)、1x丙酮酸钠(hyclone公司)和1x青霉素链霉素(gibco公司)。rem是一种改良的重建胚胎培养基(zhang shaopeng等2019)。
[0281]
细胞
[0282]
h9人esc系
[0283]
方法
[0284]
1)始发态人psc的维持
[0285]
所有提供的人psc常规保存在matrigel
tm
或geltrex
tm
涂敷板上mtesr1或e8培养基中。一般每4至5天用0.5mm edta传代细胞。传代时用pbs洗涤细胞一次，并用0.5mm edta处理5min。然后，去除edta，用带有mtesr1或e8培养基的pasteur吸管将细胞分离成小块。在常氧条件下(37℃、5％co2)于培养箱中培养人psc。
[0286]
2)在饲养层上向iclc转化
[0287]
在转化开始前一天，用pbs清洗一次始发态人psc，并将其分离成单细胞，并以1000至1500个细胞每cm2的密度加至补充有10μm y27632的mtesr1或e8培养基的饲养层上。24小时后，将培养基换成4cl培养基1。每24小时用相同培养基更新一次培养基。在24至48小时内集落变为圆形和半球形。细胞每3至4天传代。传代时，使用tryple:0.5mm edta(1:1)将细胞
分离成单细胞，并以1000至1500个细胞每cm2的密度加至饲养层上(饲养层接种在geltrex
tm
/matrigel
tm
包被后的培养皿上)(图1)。iclc的诱导和维持可在低氧(37℃、5％co2、5％o2)或常氧(37℃、5％co2、21％o2)条件下进行(图34)，优选低氧条件。
[0288]
3)囊胚样结构(还称为类囊胚)形成
[0289]
将始发态人psc或iclc消化成单细胞，并用40μm的过滤器过滤。使用血球计数板对细胞进行计数。将24孔板的孔涂上200μl融化的geltrex，置于37℃的培养箱中7分钟，形成半固态基质。每孔中，在500μl的补充有10μm y27632的rem培养基中均匀地重悬30000个细胞用于形成类囊胚，并。然后，将细胞混合物接种到半固体geltrex
tm
上，放回培养箱，37℃、5％co2孵育。24小时后，用添加4％(v/v)geltrex
tm
并且无y27632的rem培养基替换培养基。培养基每日更新，37℃低氧(5％co2，5％o2)培养细胞。
[0290]
实验结果
[0291]
图1(a)是从始发态人psc中诱导iclc的示意图。图1(b)所示为在相差显微镜下，始发态人psc(左图)和iclc(右图)的集落形态。平坦的始发态人psc在转化后成为半球形iclc。图1(c)是rt-qpcr和免疫染色结果，表明与始发态人psc细胞相比，iclc中着床前icm标志基因klf17、dnmt3l、dppa5、stella、tfcp2l1、klf4、mael和rex1显著上调了。图1(d)显示常氧与低氧条件下诱导的iclc的着床前icm标志基因表达水平相似。为了在单细胞水平上表征iclc的基因表达特征，发明人将单细胞rna-seq(scrna-seq)应用于处于始发态的细胞(primed-d0)以及在4cl培养基1中培养后的第1、2、3、5、8和12天的细胞(4cl-d1/2/3/5/8/12)。图2(a)是不同时间点的细胞的umap分析的2d散点图，以及胚胎期第3、4、5、6和7天(e3/4/5/6/7)的体内人类胚胎scrna seq公开数据(来自e-mtab-3929)。该图说明常规人psc在4cl培养基中逐渐获得与人胚胎期第5天细胞(对应于着床前早期囊胚)相似的基因表达特征。图2(b)是使用始发态人psc、iclc和公开的人着床前内细胞团细胞(来自gse101571)的批量rna-seq的热图，显示iclc中已知内细胞团标志基因的表达水平上调至内细胞团细胞的水平。本领域已知，人类胚胎从8细胞(8c)到着床前icm阶段中，诸如sva_d的te亚组被特异性激活。为了研究iclc中激活的转座元件(te)，发明人从图2(a)中提到的scrna-seq数据中提取了te特征。图3(a)是umap分析的2d散点图，用于分析处于始发态(primed-d0)和在4cl培养基1培养第1、2、3、5、8和12(d1/2/3/5/8)天的细胞以及胚胎期第3、4、5、6、7天(e3/4/5/6/7)的人胚胎细胞(来自e-mtab-3929)中的te表达特征。4cl培养基中的人psc逐渐具有与胚胎期第4天(桑椹胚期)和第5天(囊胚期)的人类胚胎细胞相似的te图谱。图3(b)进一步说明iclc中多个te亚组的表达水平被诱导至人着床前胚胎(来自gse101571)的表达水平。
[0292]
图4说明了iclc在长时间培养后保持正常的核型(在第15代时测试，大约60天)。图中显示了一个雌性人esc系(h9)和一个雄性人ipsc系(uh10)。这些结果表明，由4cl培养基1得到的iclc获得了着床前icm样基因表达特征，并在长期培养中保持了稳定的基因组。
[0293]
在表观遗传学状态中，着床前icm基因组的甲基化程度较低，染色质较着床后icm更开放。为了确定4cl培养基1对dna甲基化状态的影响，发明人对iclc和始发态人psc进行了简化亚硫酸氢盐测序(reduced representation bisulphite sequencing，rrbs)。图5的箱图显示了iclc的全基因组cpg甲基化水平(左上)与始发态人psc相比显著降低，而tss的甲基化水平只存在轻微差异(右上)。值得注意的是，全基因组dna甲基化水平的降低在敲除
stella后被阻碍(左下)。图6显示，iclc的印记状态维持与icm相似。
[0294]
为了确定iclc的染色质开放状态，发明人进行了单细胞atac-seq(scatac-seq)和批量atac-seq。图7(a)显示了在单细胞水平上，始发态人psc和iclc染色质可及性发生清晰分离。图7(b)显示着床前icm特异基因的基因座，如klf17、stella、dppa5、cd70在iclc中基本开放。图7(c)显示了在始发态人psc和iclc中，如pou5f1的共有性多能基因保持着类似的染色质开放状态，而着床后特异性基因关闭，如thy1(图7，d)。图8中的时程批量atac-seq显示了在始发态人psc转化为iclc过程中染色质可及性的逐步变化。在始发态人psc中关闭的着床前特异性基因座(如tfap2c、klf5和tfe3)在转化过程中逐渐开放，而在始发态人psc中开放的着床后特异性基因座(如zic3和foxa2)则逐渐关闭(图8，a)。基序富集分析显示，从关闭到开放的区域可能由着床前icm特异性转录因子如dux、tfap2c和klf5结合(图8，b图，上图)，而从开放到闭合的区域可能由着床后相关转录因子如sox3、nkx6.1和neurod1结合(图8，b图，下图)。图8(c)显示了基因表达与染色质可及性的相关性。这些结果表明，4cl培养基1成功地将表观遗传状况重置为着床前icm的表观遗传状况。
[0295]
发明人进一步研究了在4cl培养基1中诱导的iclc的代谢状态。着床前icm主要依赖于氧化磷酸化(oxphos)作为其能量来源，而着床后则主要取决于糖酵解。图9显示了iclc中与氧化磷酸化相关的基因的表达水平相比激发的人psc显著上调。这些结果表明氧化磷酸化在iclc中被激活。
[0296]
为了确定iclc的分化潜能，发明人用裸鼠作为受体动物进行畸胎瘤形成试验。图10所示为皮下注射100万个iclc后2个月形成的典型畸胎瘤组织的苏木精和伊红染色图像。表明存在所有三个生殖层的细胞：中胚层(左图)、内胚层(中图)和外胚层(右图)。本领域已知人类iclc能够产生滋养外胚层。因此，发明人使用先前公布的方法把iclc转化成滋养层干细胞样细胞(tsclc)。如图11(a)所示，与未分化的iclc相比，tsclc中多个滋养层干细胞(tsc)标志基因如gata3、cga、elf5、tp63、krt18、krt8、psg6和ccr7显著升高。图11(b)的免疫荧光显微图像显示已知的tsc标志基因：gata3、tfap2c和krt7的表达。图11(c)是主成分分析(pca)的散点图，显示与iclc和胎盘细胞(egfr和hlag)相比，iclc衍生的tsclc的转录组更接近人胎盘绒毛膜癌细胞系jeg3和bewo。图11(d)显示了iclc衍生的tsclc和其他细胞类型的elf5启动子区的dna甲基化状态。这些结果表明，iclc获得了相当于人类着床前胚胎的发育潜能。
[0297]
出于伦理考虑，iclc的发展潜能不能用人类胚胎来测试。因此，发明人通过将iclc与小鼠8c期卵裂球汇集来进行跨物种嵌合体实验。在体外培养24小时后检查发现，人类iclc成功地整合到大多数小鼠胚胎中并形成嵌合体囊胚(图12，a-c)。在这个阶段，人类的iclc定位在嵌合囊胚的内细胞团和滋养外胚层部分。图12(a)是使用dsred标记的始发态人psc和dsred标记的iclc在囊胚期进行嵌合体分析的总结。图12(b)为代表性图像，显示了小鼠8c卵裂球与dsred标记的始发态人psc(上)或dsred标记的iclc(下)汇集而发育的囊胚的相差(左)或红色荧光成像(右)。图12(c)为嵌合囊胚的免疫荧光染色，用抗oct4(内细胞团，绿色)、抗cdx2(滋养外胚层，灰色)染色，红色信号来自整合的dsred标记的iclc，dapi(蓝色)作为核染色。当这些嵌合体囊胚被移植到假孕小鼠的子宫中并继续发育到胚胎期10.5天(e10.5)时，人类细胞可以与小鼠胚胎一起发育，分化为不同的组织，包括胚胎组织、胎盘和卵黄囊，如图13的显微图像所示。图13(a)的代表图像显示e10.5嵌合胚胎(左)、胎盘(中)
或卵黄囊(右)的相差(上)或红色荧光成像(下)。图13(b)为免疫荧光图像，显示hn(绿色)染色的人细胞分化为gata6阳性的内胚层组织(红色)。图13(c)是免疫荧光图像，显示用dsred标记的人细胞(红色)分化成以gata3标记的胎盘组织(绿色)。综上所述，这些结果表明，iclc能够有效地整合到小鼠囊胚中，并在体内嵌合小鼠e10.5胚胎和胚外组织。
[0298]
最近，由小鼠扩展的多能干细胞产生了囊胚样结构(称为类囊胚)(li等，2019年)。然而，这种使用人类细胞的模型还没有得到很好的研究。当将iclc应用于富含细胞外基质的培养基中时，发明人观察到囊胚样结构仅由iclc发育而来，而不由始发态人psc发育得到(图14，a-b)。图14(a)显示了在rem培养基中由iclc产生的类囊胚的形态。图14(b)用抗oct4(内细胞团，红色)、抗gata3(滋养外胚层，绿色)抗体或核复染dapi(蓝色)染色的自发形成类囊胚的免疫荧光图像。
[0299]
实施例2
[0300]
材料和方法
[0301]
4cl基础培养基
[0302]
与实施例1相同。
[0303]
4cl补充物
[0304]
与实施例1相同。
[0305]
细胞
[0306]
人类esc系：h1(雄性)、hn10(雌性)、hues1(雄性)和wibr3(雌性)；人类ipsc系：cbc14(发明人制成，雌性)、c11(发明人制成，雌性)、phoenix(ulrich martin实验室馈赠，雌性)、dips 1016seva(购自哈佛干细胞研究所，雄性)，stips o-xx1(购自哈佛干细胞研究所，雌性)，uh10(雄性)。
[0307]
方法
[0308]
使用与实施例1相同的方法。
[0309]
实验结果
[0310]
图15是rt-qpcr数据的柱状图，显示从多种始发态人psc系转化的iclc中，着床前icm标志基因klf17、dnmt3l、dppa5、stella、tfcp2l1、klf4、mael和rex1被显著诱导。证明4cl培养基1诱导人psc具有广泛适用性。
[0311]
实施例3
[0312]
材料和方法
[0313]
4cl基础培养基
[0314]
与实施例1相同。
[0315]
4cl补充物
[0316]
与实施例1相同。
[0317]
细胞
[0318]
h9人esc系。
[0319]
方法
[0320]
使用与实施例1相同的方法，除了将细胞加在含1％(v/v)geltrex
tm
的dmem-f12包被后的培养皿上，而非饲养细胞上。
[0321]
实验结果
[0322]
图16的rt-qpcr数据的柱状图，显示在使用4cl培养基1的geltrex
tm
包被的培养皿上转化的iclc中，着床前icm标志基因klf17、dnmt3l、dppa5、stella、tfcp2l1、klf4、mael和rex1被显著诱导，与饲养层上的iclc相似。说明4cl培养基1在没有饲养细胞的情况下也是有效的。
[0323]
实施例4
[0324]
材料和方法
[0325]
4cl基础培养基
[0326]
与实施例1相同。
[0327]
4cl补充物
[0328]
与实施例1相同。
[0329]
细胞
[0330]
h9人esc系。
[0331]
方法
[0332]
按照与实施例1相同的方法培养始发态人psc。在转化开始前一天，将始发态人psc细胞分离成单细胞，并用补充有10μm y27632的mtesr1或e8培养基以60,000细胞/孔加到aggrewell
tm
800板中。24小时后，将培养基改为4cl培养基1，然后转为低氧培养。细胞在3天内形成小球。然后将这些小球重悬并转移到低吸附培养瓶(greiner bio one，658190)中进行悬浮培养。每天更新培养基。细胞每4～5天传代。传代时，使用tryple:0.5mm edta(1:1)将细胞分离成单细胞，并以150,000个细胞/ml的密度在4cl培养基1中重悬。然后将重悬细胞加入吸附培养瓶(greiner bio one，658190)中进行悬浮培养。细胞在24小时内形成小聚集体。通常，细胞在开始后大约3周内转化为iclc。
[0333]
实验结果
[0334]
图17是rt-qpcr数据的柱状图，显示在使用4cl培养基1悬浮转化的iclc中，着床前icm标志基因klf17、dnmt3l、dppa5、stella、tfcp2l1、klf4、mael和rex1被显著诱导。说明4cl培养基1对悬浮培养一样有效。
[0335]
实施例5
[0336]
材料和方法
[0337]
4cl基础培养基
[0338]
与实施例1相同。
[0339]
4cl补充物
[0340]
4cl培养基2(减去胞外基质)为在4cl基础培养基的中补充：
[0341]
sah/prc/ezh2抑制剂(10nm dznep)、hdac抑制剂(5nm tsa)、l-抗坏血酸(50μg/ml)、jak/stat3激活剂(20ng/ml人类lif)、mapk/erk抑制剂(1μm pd0325901)、端锚聚合酶抑制剂(5μm iwr1)、activin a/nodal激活剂(20ng/ml人类activin a)、和rock抑制剂(1μm y27632)。
[0342]
4cl培养基3(减去rock抑制剂)为在4cl基础培养基的中补充：
[0343]
sah/prc/ezh2抑制剂(10nm dznep)、hdac抑制剂(5nm tsa)、l-抗坏血酸(50μg/ml)、jak/stat3激活剂(20ng/ml人类lif)、mapk/erk抑制剂(1μm pd0325901)、端锚聚合酶抑制剂(5μm iwr)、activin a/nodal激活剂(20ng/ml人类activin a)、细胞外基质(0.2％
(v/v)geltrex
tm
或matrigel
tm
)。
[0344]
4cl培养基4(减去activin/nodal激活剂)为在4cl基础培养基中补充：
[0345]
sah/prc/ezh2抑制剂(10nm dznep)、hdac抑制剂(5nm tsa)、l-抗坏血酸(50μg/ml)、jak/stat3激活剂(20ng/ml人类lif)、mapk/erk抑制剂(1μm pd0325901)、端锚聚合酶抑制剂(5μm iwr1)、细胞外基质(0.2％(v/v)geltrex
tm
)、和rock抑制剂(1μm y27632)。
[0346]
细胞
[0347]
h9人esc系。
[0348]
方法
[0349]
使用与实施例1相同的方法。
[0350]
实验结果
[0351]
图18(a-c)是rt-qpcr数据的柱状图，显示在分别使用4cl培养基2、4cl培养基3、4cl培养基4转化的iclc中，着床前icm标志基因klf17、dnmt3l、dppa5、stella、tfcp2l1、klf4、mael和rex1被显著诱导。这些结果表明，不含geltrex
tm
、rock抑制剂或activin/nodal激活剂的4cl培养基也是有效的。
[0352]
实施例6
[0353]
材料和方法
[0354]
4cl基础培养基
[0355]
与实施例1相同。
[0356]
e4cl补充物
[0357]
e4cl培养基为在4cl基础培养基的中补充：
[0358]
sah/prc/ezh2抑制剂(50nm dznep或3mm cpi-1205)、hdac抑制剂(20nm tsa或1mm vpa或1mm nab)、l-抗坏血酸(50μg/ml)、jak/stat3激活剂(20ng/ml人类lif)、mapk/erk抑制剂(1μm pd0325901)、端锚聚合酶抑制剂(5μm iwr1或5μm xav939)、activin a/nodal激活剂(20ng/ml人类activin a或20ng/ml人类nodal)、rock抑制剂(1μm y27632或1μm thiazovivin或1μm羟基法舒地尔)和细胞外基质(0.2％(v/v)geltrex
tm
或matrigel
tm
)。
[0359]
细胞
[0360]
h9、h1、uh10人esc系。
[0361]
方法
[0362]
1)从始发态人psc转换为8clc
[0363]
按照与实施例1相同的方法培养始发态人psc。在转化开始前一天，将始发态人psc细胞分离成单细胞，并用补充有10μm y27632的mtesr1或e8培养基以2,000至3,000细胞/cm2加到饲养层上。24小时后，将培养基改为e4cl培养基，在37℃、5％co2、低氧或常氧条件下培养细胞。每天更新培养基。细胞每3～4天传代。传代时，使用tryple:0.5mm edta(1:1)将细胞分离成单细胞，并以2000至3000个细胞/cm2的密度加至饲养层涂敷的板上。通常，细胞在大约一周内转化为8clc。
[0364]
2)从iclc转换为8clc
[0365]
在转化开始前一天，iclc被分离成单细胞，并用4cl培养基1以2000-3000个细胞/cm2加载饲养层上。24小时后，将培养基换为e4cl培养基。每天更新培养基。细胞在3～5天内转化为8clc，无需传代。
[0366]
3)类囊胚形成
[0367]
使用与实施例1相同的方法。
[0368]
实验结果
[0369]
图19(a)是两种方式诱导8clc的示意图，一种是从始发态人psc直接诱导，另一种是从iclc诱导。图19(b-c)是rt-qpcr数据的柱状图，显示在从始发态人psc(图19，b)或iclc(图19，c)转化的8clc，人8c特异性标志基因zscan4、tprx1、zim3、zscan5b、znf280a和argfx被显著诱导。8c特异基因的诱导水平在两种转化方式中是相似的(图19，d)。图19(e)为免疫荧光图像，显示8clc中zscan4的表达。为了在单细胞水平上表征8clc的基因表达特征，对处于始发态细胞(primed-d0)和在e4cl培养基中培养iclc后的第1、2、3和5天的细胞(e4cl-d1/2/3/5)进行scrna-seq。图20(a)是不同时间点的细胞的umap分析的2d散点图，以及胚胎期第3、4、5、6和7天(e3/4/5/6/7，左图)的体内人类胚胎scrna-seq公开数据(来自e-mtab-3929)。表明e4cl培养基中的细胞逐渐获得与胚胎期第3天(8c期)和第4天(桑椹胚期)的人类胚胎细胞相似的基因表达特征。图20(b)显示8clc中人类8c期特异性标志基因的表达水平上调至人类8c期胚胎(gse101571)的表达水平。综上所述，这些结果表明e4cl培养基获得的8clc获得了人体内桑椹胚和8c期胚胎样基因表达特征。
[0370]
为了研究8clc中激活的te，发明人从图20(a)中提到的scrna-seq数据中提取了te特征。图21(a)是umap分析的2d散点图，用于分析处于始发态(primed-d0)和在e4cl培养基培养第1、2、3和5(d1/2/3/5)天的细胞以及胚胎期第3、4、5、6、7天(e3/4/5/6/7)的人胚胎细胞(来自e-mtab-3929)中的te表达。表明e4cl培养基中的细胞逐渐获得与胚胎期第3天(8c期)和第4天(桑椹胚期)的人类胚胎细胞相似的te基因表达特征。图21(b)进一步说明8clc中多个te亚组的表达水平被诱导至人8c期胚胎(来自gse gse101571)的表达水平。图22说明8clc保持正常的核型。图中显示了一个雌性人esc系(h9)和一个雄性人ipsc系(uh10)。这些结果表明，由4cl培养基1获得的iclc获得了人8c标志基因表达和te特征，并保持了稳定的基因组。
[0371]
为了确定8clc的dna甲基化状态，对8clc和始发态人psc进行rrbs。图23的箱图显示了8clc的全基因组cpg甲基化水平(左上)与始发态人psc相比显著降低，而tss的甲基化状态显示出轻微差异(右上)。值得注意的是，全基因组dna甲基化水平的降低在敲除stella后被阻碍(左下)。图24显示了8clc的印迹状态与体内人类胚胎dna甲基化数据(来自gse gse101571)的比较。除了dna甲基化，染色质的可及性也发生了变化。
[0372]
图25中的批量atac-seq显示了始发态人psc和8clc之间染色质可及性的差异。在始发态人psc中关闭的8c特异性基因座在8clc中开放，而在始发态人psc中开放的着床后特异性基因座在关闭。这些结果表明，4cl培养基1成功地将表观遗传状况重置为8c样状态。
[0373]
发明人进一步研究了在e4cl培养基中诱导的8clc的代谢状态。人8c期胚胎主要依赖于氧化磷酸化(oxphos)作为能量来源，而着床后主要依赖于糖酵解。图26显示了8clc中与氧化磷酸化相关的基因的表达水平相比激发的人psc显著上调。这些结果表明氧化磷酸化在8clc中被激活。
[0374]
为了确定8clc的分化潜能，发明人用裸鼠作为受体动物进行畸胎瘤形成试验。图27是注射100万个8clc后8周形成的畸胎瘤组织的苏木精和伊红染色图像。表明存在代表所有三个生殖层的结构：中胚层(左图)、内胚层(中图)和外胚层(右图)。发明人还使用先前公
布的方案用8clc诱导滋养层干细胞样细胞(tsclc)。如图28所示，与未分化的8clc相比，tsclc中多个tsc标志基因如gata3、cga、krt18、krt8、psg6和ccr7显著升高。这些结果表明8clc具有胚胎和胚外发育潜能。
[0375]
出于伦理考虑，不能用人类胚胎来测试发展潜能。因此，发明人通过将8clc与小鼠8c期卵裂球汇集来进行跨物种嵌合体实验。在体外培养24小时后检查发现，人类8clc成功地整合到大多数小鼠胚胎中并形成嵌合体囊胚。在这个阶段，人类的8clc定位在嵌合囊胚的内细胞团和滋养外胚层部分。图29(a)为代表性图像，显示了小鼠8c卵裂球与dsred标记的始发态人psc(上)或dsred标记的8clc(下)汇集而发育的囊胚的相差(左)或红色荧光成像(右)。图29(b)为嵌合囊胚的免疫荧光染色，用抗oct4(内细胞团，绿色)、抗cdx2(滋养外胚层，灰色)染色，红色信号来自整合的dsred标记的8clc，dapi(蓝色)作为核染色。当这些嵌合体囊胚被移植到假孕小鼠的子宫中并继续发育到胚胎期10.5天(e10.5)时，人类细胞可以与小鼠胚胎一起发育，嵌合不同的组织，包括胚胎组织、胚外胎盘和卵黄囊，如图30的显微图像所示。图30(a)的代表图像显示e10.5嵌合胚胎(左)、胎盘(中)或卵黄囊(右)的相差(上)或红色荧光成像(下)。图30(b)为免疫荧光图像，显示hn(绿色)染色的人细胞分化为gata6阳性的内胚层组织(红色)。图30(c)是免疫荧光图像，显示用dsred标记的人细胞(红色)分化成以gata3标记的胎盘组织(绿色)。综上所述，这些结果表明，8clc能够牢固地整合到小鼠囊胚中，并在体内贡献于小鼠e10.5胚胎和胚外组织。
[0376]
为了确定8clc的囊胚样结构形成潜力，将8clc应用于富含基质的培养基中，并观察到在5天内形成的囊胚样结构，而始发态人psc则无法形成(图31，a)。用抗oct4(内细胞团，红色)、抗gata3(滋养外胚层，绿色)抗体或核复染dapi(蓝色)染色的自发形成类囊胚的免疫荧光图像如图31(b)所示。
[0377]
本发明的8clc可用作对8c调节子进行功能性研究的有力的模型。在发明人的先导性研究中，发明人鉴定了3个新的控制8c状态的潜在调节子，分别为tprx1、khdc1l和trim60。图37显示，iclc转化成8clc的过程中，敲低tprx1、khdc1l或trim60能抑制8c特异性基因的诱导。
[0378]
实施例7
[0379]
材料和方法
[0380]
4cl基础培养基
[0381]
与实施例1相同。
[0382]
e4cl补充物
[0383]
与实施例6相同。
[0384]
细胞
[0385]
h9人esc系。
[0386]
方法
[0387]
从悬浮培养的iclc转换为悬浮培养的8clc
[0388]
按照与实施例1相同的方法培养iclc。在转化开始前一天，将iclc分离成单细胞，并以300000个细胞/ml的密度在4cl培养基1中重悬。然后将细胞悬液加入低吸附培养瓶(greiner bio one，658190)中进行悬浮培养。24小时后，细胞形成小聚集体，培养基转为e4cl培养基。每天更新培养基，细胞在3到5天内转化为8clc，无需传代。
[0389]
实验结果
[0390]
图32是rt-qpcr数据的柱状图，显示在使用e4cl培养基悬浮转化的8clc中，8c标志基因zscan4、argfx、tprx1、znf280a和zscan5b被显著诱导。说明e4cl培养基对悬浮培养一样有效。
[0391]
实施例8
[0392]
材料和方法
[0393]
4cl基础培养基
[0394]
与实施例1相同。
[0395]
e4cl补充物
[0396]
与实施例6相同。
[0397]
细胞
[0398]
人esc系：hn10和uh10
[0399]
方法
[0400]
与实施例6相同。
[0401]
实验结果
[0402]
图33是rt-qpcr数据的柱状图，显示从多种人psc系转化的8clc中，8c标志基因zscan4、argfx、tprx1、znf280a、zscan5b、duxa、duxb、mbd3l2、stella、klf17和khdc1l被显著诱导。表明e4cl培养基诱导8clc具有广泛的适用性。
[0403]
实施例9
[0404]
材料和方法
[0405]
4cl基础培养基
[0406]
与实施例1相同。
[0407]
e4cl补充物
[0408]
与实施例6相同。
[0409]
细胞
[0410]
小鼠esc系：e14和mervl-gfp
[0411]
方法
[0412]
在转化开始前一天，在血清 lif条件下培养的小鼠esc被分离成单细胞，并用血清 lif培养基放至饲养层上。24小时后，将培养基换为e4cl培养基。每天更新培养基。细胞在3天内转化为小鼠2-细胞(2c)样状态，无需传代。
[0413]
实验结果
[0414]
图35显示，在从多个小鼠esc系转化的2c样细胞中，2c标志基因例如zscan4、zscan4b、zscan4c、zscan4d、dux、tcstv1、tcstv3、gm4340、zfp352和dub1被显著诱导。表明e4cl培养基也能诱导小鼠2c样状态，并且有广泛适用性。
[0415]
实施例10
[0416]
材料和方法
[0417]
4cl基础培养基
[0418]
与实施例1相同。
[0419]
4cl补充物
[0420]
成分与实施例1相同，在保持其他成分浓度与实施例1一致的情况下，其中pd0325901、dznep或tsa还分别使用了不同的浓度：0.5μm的pd0325901，20nm的tsa，5、20或50nm的dznep。
[0421]
细胞
[0422]
h9人esc系。
[0423]
方法
[0424]
与实施例1相同。
[0425]
实验结果
[0426]
图36表明与始发态人psc细胞相比，在使用添加有不同剂量pd0325901、dznep或tsa的4cl培养基1转化的iclc中，着床前icm标志基因klf17、dnmt3l、dppa5、stella、tfcp2l1、klf4、mael和rex1被显著诱导。
[0427]
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