利用嗜热链球菌发酵生产焦性没食子酸的方法与流程

1.本发明属于生物化工领域，涉及一种应用嗜热链球菌发酵生产焦性没食子酸的方法及其产物分离纯化。


背景技术：

2.焦性没食子酸，是工业具有广泛用途的化工试剂及原料，多应用于农药、心脑血管治疗新药、抗肿瘤药、老年痴呆治疗药物、治疗精神障碍药物、化妆品、显影剂、热敏剂、高分子材料的助剂，可以作为辅酶-q10的抗氧化稳定剂，可以作为测定铋及锑，也是煤气、烟道气等气体的除氧剂。又因其在许多领域处于无法替代的地位，市场需求大，有广大的经济效益和社会效益。
3.目前国内年产量无法满足市场需求。并且目前焦性没食子酸主要采用化学法生产，一是没食子酸直接高温脱羧，二是催化剂加热脱羧。第一种方法需要人工翻炒混合，耗费大量劳力，同时产品收率低，质量参差不齐；第二种方法虽然产品收率高、操作简单，但部分催化剂产品无法去除，两种方法都需要较高的设备投入，过程中高浓度的盐酸的使用，产生大量高浓度的盐和高色度的废酸水，造成严重的环境污染和设备腐蚀等问题。
4.微生物转化技术是近年来逐渐被人们所关注的一种环保且高效的新型绿色生产工艺，主要是利用微生物代谢过程中产生的某种或者某一系列的酶对底物的特定部位或者基团进行催化反应生成所需要的产物。由于微生物转化法相比化学法具有反应条件温和、生物量积累快、转化时间短、转化酶表达效率高、同时对设备要求不高，产生极少的污染物，对环境友好的优点，由于酶作为催化剂参与的反应存在专一性强的特点，反应过程中极少产生副产物，使后续的处理方式更加简单，所以微生物转化工艺具有较大应用前途，便于工业化。
5.日本从20世纪60年代开始研究利用微生物转化法生产焦性没食子酸，意大利、印度等国也在近年开展了相关的研究，国内微生物方法生产焦性没食子酸处于初级阶段。
6.单宁酸可在单宁酶的作用下发生降解生成没食子酸，没食子酸可在没食子酸脱羧酶(gad)的作用下发生脱羧反应生成焦性没食子酸。
[0007][0008]
中国林业科学研究院林产化学工业研究所采用植物乳杆菌发酵没食子酸生焦性没食子酸，发酵过程需要摇床、恒温培养箱设备支持，发酵时间较长，后期转化在较为复杂的培养基中进行，增加后期分离纯化难度；为降低成本，减少转化时间，可筛选合适菌株，减
少转化时间，优化转化工艺，改善复杂培养基成分，同时降低成本。


技术实现要素：

[0009]
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种嗜热链球菌发酵单宁酸制备焦性没食子酸的方法。
[0010]
本发明提供一种利用嗜热链球菌发酵单宁酸制备焦性没食子酸的方法，包括以下步骤：将嗜热链球菌划线分离，挑选生长旺盛的典型菌落接入试管斜面保藏培养基培养；将培养好的斜面菌种以无菌操作接入种子培养基中，37℃静止培养16-24h；离心收集细胞，用生理盐水洗涤，再离心，将所得细胞分散于转化培养液中，加入无菌底物单宁酸使终浓度40mg/ml，37℃静置转化培养6h即得。
[0011]
上述转化单宁酸的菌株为嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)菌株编号为atcc baa-250，保藏于美国典型培养物保藏中心，产地美国。
[0012]
上述试管斜面保藏培养基的配置：称取蛋白胨7.5g，酵母膏5g，葡萄糖8.5g，吐温80为0.5ml，琼脂20g，在1l容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，5mol/lnaoh调ph值6.0，121℃灭菌30min，冷却后为试管斜面保藏培养基。
[0013]
上述种子培养基的配置：称取蛋白胨7.5g，酵母膏5g，葡萄糖8.5g，吐温80为0.5ml，在1l容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，5mol/lnaoh调ph值6.0，121℃灭菌30min，冷却后为种子培养基培养基。
[0014]
上述生理盐水的配置：称取0.9gnacl，溶解于少量蒸馏水中，稀释到100ml。121℃灭菌30min，冷却后使用。
[0015]
上述转化培养液的配置：甲液：称取磷酸氢二钠9.465g(无水7.099g),加蒸馏水至1000ml；乙液：称取磷酸二氢钾9.07g(无水6.803g),加蒸馏水至1000m1。甲液乙液7:3混合，用0.5mol/lnaoh调ph7.5,121℃灭菌30min，冷却后为转化培养液。
[0016]
上述单宁酸的制备：称取单宁酸适量溶于水，超声15min溶解，过0.45um无菌滤膜。
[0017]
本发明还提供一种从转化产物分离纯化焦性没食子酸的方法，包括以下内容：转化成功的转化液加入等体积乙酸乙酯，充分混匀萃取2次，乙酸乙酯相40℃经减压蒸发除去溶剂，得乙酸乙酯浸膏，浸膏硅胶柱纯化，氯仿甲醇4：1混合溶剂洗涤，收集含有焦性没食子酸馏分，40℃减压蒸发除去溶剂得焦性没食子酸的纯品。
[0018]
上述硅胶柱纯化过程：乙酸乙酯浸膏与5倍硅胶柱混合均匀后称重，称取50倍上样量的硅胶，将50倍硅胶装柱后用气泵压实，分离样品使用小漏斗小心装于硅胶表面，保持硅胶表面平整，以氯仿：甲醇4:1混合洗脱剂洗脱，洗脱剂大约为柱体积的2-3倍，10-50ml收集一份馏分，馏分进行tlc检测，hplc检测，合并含有焦性没食子酸纯品的馏分，40℃蒸干馏分，得焦性没食子酸纯品。
[0019]
上述tlc检测方法为：取1ml转化液加等体积乙酸乙酯，手动混匀10min左右，离心，取900ul上层萃取液，置于1.5mlep管中，76℃水浴蒸干。在上述1.5mlep管中添加30ul甲醇，超声15min，6000r/min离心5min，取0.8ul样品点薄层。展开剂：氯仿：甲醇4:1，展开距离10cm，显色剂为香草醛浓硫酸乙醇溶液，110℃显色5min，以焦性没食子酸纯品作为对照。
[0020]
上述香草醛浓硫酸乙醇溶液的配置：2ml浓硫酸缓慢加入到20ml无水乙醇中，冷却完成后加入1g香草醛，香草醛完全溶解后使用。
[0021]
上述hplc检测方法为：取1ml转化液加等体积无水乙醇，混匀，超声20min，离心，取上层清液过0.22um滤膜，滤液进行检测。色谱柱：c18,5um 250x 4.6mm，流动相：乙腈：水0.2:0.8，检测波长264nm，检测时间30min。用焦性没食子酸标准品绘制标准曲线。
[0022]
本发明利用嗜热链球菌转化单宁酸生成焦性没食子酸，转化反应在磷酸缓冲液中进行，减少培养基原料的使用，大大降低生产成本，转化反应只需静置培养，设备投入少，利于工业化生产；同时转化液无复杂培养基原料，减低后期分离纯化的难度。
[0023]
本发明利用嗜热链球菌转化单宁酸生成焦性没食子酸，转化时间只需6h，缩短实验周期，副产物较少，为工业化生产提供借鉴。
具体实施方式
[0024]
参考下列实施例将更容易、全面理解本发明，给出实施例是为了阐明本发明，不是以任何方式限制本发明。
[0025]
实施例1：发酵制备焦性没食子酸
[0026]
(1)培养基的配置
[0027]
a)试管斜面保藏培养基的配置：称取蛋白胨7.5g，酵母膏5g，葡萄糖8.5g，吐温80为0.5ml，琼脂20g，在1l容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，5mol/lnaoh调ph值6.0，121℃灭菌30min，冷却后为试管斜面保藏培养基。
[0028]
b)种子培养基的配置：称取蛋白胨7.5g，酵母膏5g，葡萄糖8.5g，吐温80为0.5ml，在100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，5mol/lnaoh调ph值6.0，121℃灭菌30min，冷却后为种子培养基培养基。
[0029]
c)转化培养液的配置：甲液：称取磷酸氢二钠9.465g(无水7.099g),加蒸馏水至1000ml；乙液：称取磷酸二氢钾9.07g(无水6.803g),加蒸馏水至1000m1。甲液乙液7:3混合，用0.5mol/lnaoh调ph7.5,121℃灭菌30min，冷却后为转化培养液。
[0030]
(2)将嗜热链球菌划线分离，挑选生长旺盛的典型菌落接入试管斜面保藏培养基培养；将培养好的斜面菌种以无菌操作接入100ml种子培养基中，静止培养，培养温度37℃，培养时间16-24h；
[0031]
(3)底物处理：称取单宁酸1g溶于1ml水，超声溶解，过0.45um无菌滤膜。
[0032]
(4)将培养好种子离心收集细胞，用生理盐水洗涤，再离心，将所得细胞分散于100ml转化培养液中，加入无菌单宁酸使终浓度为40mg/ml，37℃静置转化6h，转化液进行tlc检测。
[0033]
(5)定性检测：取1ml转化液加等体积乙酸乙酯，手动混匀10min左右，离心，取900ul上层萃取液，置于1.5mlep管中，76℃水浴蒸干。在上述1.5mlep管中添加30ul甲醇，超声15min，6000r/min离心5min，取0.8ul样品点薄层。展开剂：氯仿：甲醇4:1，展开距离10cm，显色剂为香草醛浓硫酸乙醇溶液，110℃显色5min，以焦性没食子酸纯品作为对照。
[0034]
(6)定量检测：取1ml转化液加等体积无水乙醇，混匀，超声20min，离心，取上层清液过0.22um滤膜，滤液进行检测。色谱柱：c18,5um 250x 4.6mm，流动相：乙腈：水0.2:0.8，检测时间30min，检测波长264nm，焦性没食子酸含量为1mg/ml。
[0035]
(7)硅胶柱纯化：，乙酸乙酯相40℃经减压蒸发除去溶剂，得乙酸乙酯浸膏0.2g，乙酸乙酯浸膏与5倍硅胶柱混合均匀后称重，称取50倍上样量的硅胶，将50倍硅胶装柱后用气
泵压实，分离样品使用小漏斗小心装于硅胶表面，保持硅胶表面平整，以氯仿：甲醇4:1混合洗脱剂洗脱，洗脱剂大约为柱体积的2-3倍，10-50ml收集一份馏分，馏分进行tlc检测，hplc检测，合并含有焦性没食子酸纯品的馏分，40℃蒸干馏分，得焦性没食子酸纯品85mg。
[0036]
实施例2：发酵制备焦性没食子酸(发酵培养温度变化)
[0037]
培养基配置和发酵制备焦性没食子酸的步骤同实施例1，改变条件为发酵培养温度，变为30℃,32℃,35℃,39℃，42℃，单宁酸反应终浓度40mg/ml，静止培养，培养时间6h，焦性没食子酸37℃含量最高为1mg/ml。
[0038]
实施例3：发酵制备焦性没食子酸(底物浓度变化)
[0039]
培养基配置和发酵制备焦性没食子酸的步骤同实施例1，改变条件为底物浓度，变为10mg/ml,70mg/ml,100mg/ml,150mg/ml,250mg/ml，1g/ml；37℃静止培养，培养时间6h，焦性没食子酸含量在底物浓度为1-150mg/ml范围内随底物浓度增加含量增加；150mg/ml-1g/ml底物浓度范围内随底物浓度增加，产物含量减少。