利用嗜热链球菌发酵生产焦性没食子酸的方法与流程

技术特征：
1.一种利用嗜热链球菌发酵单宁酸制备焦性没食子酸的方法，包括以下步骤：将嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)分离，挑选生长旺盛的典型菌落接入试管斜面保藏培养基培养；将培养好的斜面菌种以无菌操作接入种子培养基中，37℃静止培养16-24h；离心收集细胞，用生理盐水洗涤，再离心，将所得细胞分散于转化培养液中，加入无菌底物单宁酸使终浓度40mg/ml，37℃静置转化培养6h即得。2.如权利要求1所述的方法，所述试管斜面保藏培养基的配置：称取蛋白胨7.5g，酵母膏5g，葡萄糖8.5g，吐温80为0.5ml，琼脂20g，在1l容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，5mol/lnaoh调ph值6.0，121℃灭菌30min，冷却后为试管斜面保藏培养基。3.如权利要求1所述的方法，所述种子培养基的配置：称取蛋白胨7.5g，酵母膏5g，葡萄糖8.5g，吐温80为0.5ml，在1l容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，5mol/lnaoh调ph值6.0，121℃灭菌30min，冷却后为种子培养基培养基。4.如权利要求1所述的方法，所述转化培养液的配置：甲液：称取磷酸氢二钠9.465g(无水7.099g),加蒸馏水至1000ml；乙液：称取磷酸二氢钾9.07g(无水6.803g),加蒸馏水至1000m1。甲液乙液7:3混合，用0.5mol/lnaoh调ph7.5,121℃灭菌30min，冷却后为转化培养液。5.如权利要求1所述的方法，所述单宁酸溶液的制备：称取单宁酸适量溶于水，超声15min溶解，过0.45um无菌滤膜。6.一种从转化产物分离纯化焦性没食子酸的方法，包括以下内容：转化成功的转化液加入等体积乙酸乙酯，充分混匀萃取2次，乙酸乙酯相40℃经减压蒸发除去溶剂，得乙酸乙酯浸膏，浸膏硅胶柱纯化，氯仿甲醇4：1混合溶剂洗涤，10-50ml收集一份馏分，馏分进行tlc、hplc检测，纯品收集含有焦性没食子酸馏分进行合并，40℃减压蒸发除去溶剂得焦性没食子酸的纯品。7.如权利要求7所述的方法，所述tlc检测方法为：取1ml转化液加等体积乙酸乙酯，手动混匀10min左右，离心，取900ul上层萃取液，置于1.5mlep管中，76℃水浴蒸干。在上述1.5mlep管中添加30ul甲醇，超声15min，6000r/min离心5min，取0.8ul样品点薄层。展开剂：氯仿：甲醇4:1，展开距离10cm，显色剂为香草醛浓硫酸乙醇溶液，110℃显色5min，以焦性没食子酸纯品作为对照。8.如权利要求7所述的方法，所述hplc检测方法为：取1ml转化液加等体积无水乙醇，混匀，超声20min，离心，取上层清液过0.22um滤膜，滤液进行检测。色谱柱：c18,5um250x4.6mm，流动相：乙腈：水0.2:0.8，检测波长264nm，检测时间30min。用焦性没食子酸标准品绘制标准曲线。

技术总结
本发明属于微生物发酵工程领域，主要介绍嗜热链球菌生产焦性没食子酸方法。将嗜热链球菌，接入培养基，培养基组成和含量为：蛋白胨7.5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖8.5g/L，吐温80为0.5ml/L，pH值6.0-7.0,37℃培养16-24h后，离心收集细胞，用生理盐水洗涤，再离心，将所得细胞分散于转化培养液中，加入无菌底物单宁酸使终浓度40mg/ml，37℃静置转化6h。转化液经乙酸乙酯萃取，浓缩得浸膏，浸膏经硅胶柱纯化，得到焦性没食子酸。本发明利用兼性厌氧菌进行转化，不需要厌氧环境，过程反应条件温和，操作简单，重现性好，成本低，时间短，对设备环境友好等特点。点。


技术研发人员：马宁 胡海峰 田勋 乔晓利 王志娟 吴永威
受保护的技术使用者：中国医药工业研究总院
技术研发日：2020.10.26
技术公布日：2022/5/16