一种植物调节开花相关蛋白TaSOD及其编码基因和应用的制作方法

一种植物调节开花相关蛋白tasod及其编码基因和应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种植物调节开花相关蛋白tasod及其编码基因和应用。


背景技术：

2.开花是植物从营养生长进入生殖生长的重要阶段，是一个重要的农艺性状。植物的不同开花时间，决定其适应的不同的气候及生长环境。在外界环境及内源激素及基因的调控影响下，植物可以通过调节开花时间，是延迟或者提前开花，控制营养生长或生殖生长，从而避免逆境对其的伤害，对提高作物产量具有重要意义。
3.小麦是世界广泛种植的一种主要农作物，也是人类的主要口粮来源，目前利用光温敏雄性不育系的二系杂交法已经成为杂交小麦育种的主流方法之一，得到了大面积的推广。光温敏雄性不育系开花期遭遇冷空气，其花粉发生败育，进而完成二系的杂交过程。花粉的败育程度决定杂交小麦的制种纯度。
4.超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)是植物中一种主要的抗氧化酶，在植物应对逆境胁迫及抗衰老中起重要作用。可保护植物免受过量ros的损伤。它可以通过歧化作用将ros催化生成氧分子和过氧化氢：o
2- o
2- h
→
o2 h2o2，过氧化氢又能在过氧化氢酶(cat)和过氧化物酶(pod)的作用下分解为水，从而高效，无害的清除掉植物体内多余ros。
5.目前关于sod在小麦中主要是抗逆功能方面的报道。王鹏等发现光温敏型雄性不育小麦的可育与不育植株花药在不同时期的sod活性和花药中过氧化程度有显著区别，不育花药的sod活性在其育性敏感时期较可育花药有明显的下调趋势，且不育花药的过氧化程度极显著高于可育花药，表明sod的表达可能影响与雄蕊发育。但是sod对开花时间调控的作用尚未报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种调节开花相关蛋白tasod。
7.本发明的再一目的是提供编码上述调节开花相关蛋白tasod的编码基因。
8.本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
9.本发明的另一目的是提供包含上述基因的转基因细胞系。
10.本发明的另一目的提供上述调节开花相关蛋白tasod的应用。
11.本发明所提供的调节开花相关蛋白tasod，来源于小麦光温敏雄性不育系bs366，其蛋白序列如seq id no：1：
12.magkpgslkgvalisgggadsavagalhfvqdpssgytevrgrvsglapglhgfhihafg 60dttngcnstgphfnphnkshgapvdderhvgdlgniqankdgvaeifikdlqislrgphsi 120lgravvvhadsddlgkgghelskstgnagarigcgiigiqpav-164
13.本发明的蛋白由164个氨基酸残基组成，属于铜锌超氧化物歧化酶家族。
14.为了使tasod蛋白便于纯化，可在由seq id no：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
15.表1标签的序列
16.标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tag8wshpqfekc-myc10eqkliseedl
17.根据本发明的tasod编码基因具有如seq id no：2所示核苷酸序列。
18.seq id no：2：
[0019][0020]
含有tasod基因的重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。
[0021]
可用现有的植物表达载体构建含有tasod基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元表达载体系统和可用于植物微弹轰击法的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
[0022]
使用本发明的基因构建植物重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0023]
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0024]
本发明的另一个目的是提供一种促进植物提前开花的方法。
[0025]
所提供的促进植物提前开花的方法，包括将上述含有tasod基因的重组表达载体导入植物细胞中。携带有编码基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、小麦、长穗偃麦草、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。
[0026]
本发明以小麦光温敏雄性不育系bs366为实验材料，得到了调节开花相关的tasod基因，并将其导入拟南芥，显著促进提前开花。本发明的调节开花的相关蛋白及其编码基因对进行植物品种改良，能够缩短作物收成期具有十分重要的理论和实际意义。
附图说明
[0027]
图1显示调节开花相关的tasod基因的cdna克隆，以小麦光温敏雄性不育系bs366为模板，pcr扩增tasod的cdna片段，1,2，bs366的tasod基因片段；m，dl2000 marker(100，250，500，750，1000，2000bp)；
[0028]
图2显示转基因拟南芥t1代株系的pcr鉴定，m：trans2k plus dna marker；1：阴性对照；2～4为转基因拟南芥株系；
[0029]
图3显示转基因拟南芥早花表型，其中，col是野生型拟南芥，oe-1、oe-2为2个tasod转基因拟南芥株系。
具体实施方式
[0030]
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0031]
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
[0032]
实施例1：tasod基因的克隆及序列基序分析
[0033]
取小麦光温敏雄性不育系bs366的叶片，用trizol法提取花药的总rna。用superscript ii(购自invitrogen公司)反转录酶反转录获得到cdna。根据tasod基因编码区序列设计引物p1和p2。以反转录得到的cdna为模板，用引物p1和p2进行pcr扩增。引物p1和p2的序列如下：
[0034]
p1：5
’‑
atggcagggaaacccggca-3’[0035]
p2：5
’‑
tcaaaatgtatgatcttcaacgatatc-3’。
[0036]
对pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为600bp左右的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(tiangen)回收该片段。将该回收片段与pgem-t easy(购自promega公司)连接，参照cohen等的方法(proc natl acad sci，69:2110)，将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，根据pgem-t easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的t7和sp6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的tasod基因的开放阅读框(orf)为seq id no:2。将含序列seq id no:2所示tasod基因的重组载体命名为pbi29a-tasod，其cdna克隆结果如图1所示。
[0037]
tasod基因序列所编码的氨基酸序列在genbank上进行比对，发现克隆的tasod基因与现有的中国春公布的tasod在第468位碱基后缺失了53个碱基，导致后续密码子发生错
位，蛋白序列发生改变且提前终止，其在氨基酸水平、蛋白水平上与小麦tasod比对率为73％，证明为新基因。
[0038]
实施例2：用tasod基因培育早花转基因植物
[0039]
1、重组表达载体的构建
[0040]
pbi29a-tasod双子叶植物重组表达载体的构建
[0041]
以小麦光温敏雄性不育系bs366叶片的总rna反转录得到的cdna为模板，用含有saci和spei接头序列的特异引物进行pcr扩增；然后saci和spei双酶切pcr产物，回收，将酶切产物正向插入载体pbi121的camv 29a启动子之后的saci和spei酶切位点之间，得到重组载体pbi29a-tasod。
[0042]
引物序列如下：
[0043]
tasod[saci]：5
’–
tccgagctctcaatcaatgtcagcgtgcac-3’[0044]
tasod[spei]：5
’–
cggactagt atg ccg gtg ctg gcg atg-3’。
[0045]
2、转基因拟南芥的获得和鉴定
[0046]
转基因拟南芥的获得
[0047]
(1)将上述构建的重组表达载体pbi29a-tasod用冻融法转化根癌农杆菌c
38
c1，在超净工作台中，将1ml上述菌液加在200ml yep培养基(含抗生素100μg ml-1kan和50μg ml-1rif)中，28℃、220rpm振荡培养过夜，培养至od600＝1.0。4000rpm离心15min，收集菌体，在一个开口的大器皿用花浸润培养基[1/2ms 5％蔗糖 0.03％表面活性剂(silwet l-77)，ph5.8]稀释菌体，使其od600＝0.8左右，待用。
[0048]
(2)选择处于盛花期的拟南芥健壮植株，把荚果和已经开放的花剪去，将待转化的拟南芥植株平放，让花蕾完全浸入农杆菌悬浮液中1min，再将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净。将处理过的拟南芥用塑料盖盖上，暗培养24h后放于23～25℃的光照条件下使其正常生长。1周后可再浸染一次。3～4周后，待拟南芥荚果开始转黄后，将其剪下放于培养皿内干燥，当拟南芥荚果大部分转黄后，即可收取全部种子存于1.5ml的离心管中(可在管内放适当的硅胶以便干燥)。待种子完全干燥后，放于1.5ml新离心管中4℃短期保存，如需要可放于-20℃冰箱内长期保存。
[0049]
(3)在超净工作台上取部分拟南芥种子(200～300粒)到一个灭菌的1.5ml离心管中，先用70％的酒精处理种子2次，每次30s；再用无水乙醇悬浮种子，然后倒到一灭菌的滤纸上；待无水乙醇挥发掉后，将种子均匀地播在种子萌发培养基(1/2ms 30g l-1
蔗糖 5～6g l-1
琼脂 100μg ml-1
kan，ph5.8)上；用parafilm将培养皿封好并置于4℃处理24h，然后放到16h光照/8h黑暗条件下培养7～10d即可移栽至营养钵中，置于培养室培养3～4周后进行下一步的鉴定。用含100mg/l卡那霉素的ms培养基进行2轮筛选，每轮筛选10-15天，得到阳性转基因植株。
[0050]
将筛选得到的阳性转基因植株用pcr做进一步鉴定筛选，pcr所用的一对引物为p3和p4。
[0051]
p3：5
’‑
tccgagctctcaatcaatgtcagcgtgcac-3’[0052]
p4：5
’‑
cggactagt atg ccg gtg ctg gcg atg-3’。
[0053]
对pbi29a-tasod转基因拟南芥进行pcr鉴定，阳性转基因植株经pcr扩增可获得600bp左右条带，如图2所示。
[0054]
同时将pbi121空载体导入拟南芥col，方法同上，作为对照，获得3个株系的转基因拟南芥(筛选获得的转基因拟南芥用t0代表示)。
[0055]
转tasod基因植株早花表型鉴定
[0056]
t3代pbi29a-tasod转基因植株与空白对照植株在开花时间表现出明显的不同，如图3所示，可以看出，转tasod基因的拟南芥植株的开花时间明显早于野生型拟南芥，通过观察并记录野生型拟南芥和不同株系转基因拟南芥在抽薹高度、花蕾数量、莲座叶数量和抽薹个数的情况，结果如表2所示，转tasod基因的拟南芥植株的抽薹高度、花蕾数量、果荚个数、莲座叶数量和抽薹个数均高于野生型拟南芥，说明tasod具有促进植物提早开花的功能。
[0057]
表2早花表型统计
[0058][0059]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制。