用于调节烟草植物的生物碱含量的方法与流程

用于调节烟草植物的生物碱含量的方法
发明领域
1.本发明涉及调节植物或其部分或细胞或细胞培养物的生物碱含量的方法。本发明还扩展到调节多肽表达和/或活性的方法，所述多肽调节植物内的生物碱含量。或者，本发明提供了调节基因表达和/或活性的方法，所述基因编码调节植物内的生物碱含量的多肽。本发明还扩展到可以用于调节多肽的构建体。本发明进一步涉及经修饰以实现生物碱含量的调节的植物细胞和植物。本发明还涉及来自此类调节的植物的加工和收获的叶片及其在烟草工业产品(包括可燃吸烟制品)中的用途。
2.背景生物碱是一组天然存在的化合物，其主要含有碱性氮原子，并且由大量各种生物包括细菌、真菌、植物和动物产生。
3.生物碱可以根据碳骨架例如吲哚、异喹啉和吡啶样的相似性进行分类。吡啶衍生物是一类单体生物碱；该类别包括简单的吡啶衍生物、多环缩合和非缩合吡啶衍生物以及倍半萜吡啶衍生物。实例是尼古丁、降烟碱、假氧化尼古丁、新烟碱、米喔斯明和新烟草碱。
4.生物碱的大多数已知的生物学功能与保护相关。神经活性分子诸如咖啡因、可卡因、吗啡和尼古丁，充当针对侵入的捕食者的防御化合物。这些生物碱的累积是监控基因表达、酶活性和生物碱浓度的信号转导级联的结果。植物中的生物碱含量的精细调节涉及负反馈环和降解途径。
5.尼古丁天然存在于几个植物品种中，但在烟草植物中以最高水平发现。栽培烟草产生总干重2-4%的生物碱。尼古丁在野生和栽培烟草属(nicotiana)物种中产生，并且它在针对食草动物和昆虫的植物防御中起重要作用(voelckel等人(2001) oecologia 127(2): 274-280，通过引用并入本文)。其占总生物碱含量的~90%。剩余10%的生物碱库主要由结构上相关的化合物降烟碱、新烟草碱、新烟碱和假氧化尼古丁(pon)构成。
6.烟草中生物碱含量的调节是复杂的。几种因素包括基因型、环境、施肥和农学实践(例如打顶)影响烟草植物中的生物碱水平。尼古丁生物合成的一些关键调节物是充分表征的，例如在该途径中起关键作用的腐胺n-甲基转移酶(pmt)被乙烯应答因子(erf)超家族
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烟草基因组中最大的转录因子家族
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的成员激活(通过引用并入本文的rushton等人(2008) plant physiol. 147(1): 280-295)。诱导生物碱生物合成的其他转录因子属于myc2-样碱性螺旋-环-螺旋(bhlh)家族。myc2-样bhlhs通过gbox-介导的生物碱结构基因的结合和激活直接调节生物碱水平，并且通过erfs的激活间接调节生物碱水平。
7.烟草吡啶生物碱是烟草特异性亚硝胺(tsna)的前体，其在收获后的叶片调制期间形成。在调制烟叶中发现的四种主要tsna是n'-亚硝基降烟碱(nnn)、n'亚硝基新烟草碱(nat)、n'-亚硝基新烟碱(nab)和4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(nnk)。在收获后叶片调制期间，吡啶生物碱和亚硝化物质之间的反应导致形成烟草-特异性亚硝胺(tsna)。pon可能作为tsna nnk的合成中的直接前体发挥功能(bush等人, 2001，其通过引用并入本文)。减少tsnas的产生和积累是非常重要的。尼古丁脱甲基酶基因的cyp82e家族是尼古丁向降烟碱转化的主要调节子之一，并且改变其活性或积累可能导致nnn水平降低。
然而，迄今为止，尚未鉴定出负责产生pon的酶或基因。
8.如实施例中所述的，发明人设法研究负责生物碱和/或tsna前体合成的基因，目的是调节植物中的生物碱含量，例如降低烟草中的tsna含量。
9.发明概述已经令人惊讶地发现，通过调节编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达，可以调节植物的生物碱含量和/或tsna含量或tsna前体含量。如本文所教导的编码含btb/poz nph3结构域蛋白的基因，例如nitab4.5_0000868g0020.2，是栽培烟草中生物碱和tsna前体含量的调节子。具体而言，如本文所教导的基因，例如nitab4.5_0000868g0020.2，是栽培烟草中生物碱含量的调节子。nitab4.5_0000868g0020.2编码根据本发明的含btb/poz nph3结构域的蛋白。nitab4.5_0000651g0020.2、nitab4.5_0009137g0040.2、nitab4.5_0001772g0090.2、nitab4.5_0003312g0050.2、nitab4.5_0003151g0080.2、nitab4.5_0002641g0190.2、nitab4.5_0001876g0030.2、nitab4.5_0000048g0280.2和nitab4.5_0002006g0070.2是根据本发明的nitab4.5_0000868g0020.2的同源物。
10.根据本发明的含btb/poz nph3结构域的蛋白含有称为btb/poz结构域和nph3结构域的保守结构域。
11.根据本发明，可以生产具有调节的生物碱含量以及由烟草工业产品的消费者所追求的商业上期望性状的烟草工业产品。在一些情况下，消费者可能期望具有低水平的生物碱含量，例如低水平的tsna前体的产品。
12.本发明可能在植物分子种植领域中特别有用，其中植物(诸如烟草和其他烟草属物种)用于生产蛋白、肽和代谢物，例如用于生产治疗剂和药物诸如抗生素、病毒样颗粒、或营养药(neutraceuticals)或小分子。在eu提供资金的名为pharmplant的项目中，烟草已用于开发hiv-中和抗体，并且加拿大的medicago inc.已参与基于烟草的平台，用于生产用于流感疫苗制造的病毒样颗粒。
13.因此，根据本发明的植物可以用于分子种植，以减少或消除尼古丁生物碱的存在。低尼古丁植物或根状茎(rootsock)的使用在分子种植中是有益的，并且将减少与纯化相关的下游加工成本。
14.本发明人已经令人惊讶地确定通过调节(例如，降低)编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来调节(例如，降低)植物(例如烟草植物)的生物碱含量的方法。植物(例如烟草植物)的生物碱含量(例如pon、降烟碱、新烟碱、新烟草碱或米喔斯明中的一种或多种的含量)可以通过降低编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来降低或可以通过增加编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来增加。在本发明之前，尚不知晓如本文所述的编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达的调节可用于调节生物碱含量或尤其调节pon含量。
15.在一个方面，本发明提供了调节(例如降低)植物或其部分或细胞的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物。
16.在另一个方面，本发明提供了调节(例如降低)烟草植物或其植物部分或细胞中的烟草特异性亚硝胺(tsna)前体的含量的方法，所述方法包括通过调节至少一种编码含btb/
id no. 18、seq id no. 20、seq id no. 21、seq id no. 23、seq id no. 24、seq id no. 26、seq id no. 27、seq id no. 29、seq id no. 30的功能变体或功能片段或直向同源物，或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的序列。
24.在一个方面，本发明提供了根据本发明的植物或其部分、或者通过根据本发明的方法生产的植物来培育植物的用途。
25.在一个方面，本发明提供了根据本发明的植物或其部分、或者通过根据本发明的方法生产的植物用于生产产品的用途。
26.在一个方面，本发明提供了根据本发明的植物或其部分、或者通过根据本发明的方法生产的植物来种植作物的用途。
27.在一个方面，本发明提供了根据本发明的植物或其部分、或者通过根据本发明的方法生产的植物来生产叶片的用途。
28.在另一个方面，本发明提供了根据本发明的植物的收获的叶片，或可获得自(例如获得自)从根据本发明的繁殖材料繁殖的植物或可获得自(例如获得自)通过根据本发明的用途获得的植物或可获得自(例如获得自)通过根据本发明的方法产生的植物的植物的收获的叶片。
29.适当地，植物的收获的叶片可以是切割的收获的叶片。
30.在另一个方面，本发明提供了加工叶片，优选加工烟草叶片，优选非存活的加工烟草叶片，其：可获得自(例如获得自)从根据本发明的用途可获得(例如获得)的植物；通过加工根据本发明的植物可获得(例如获得)；可获得自从根据本发明的植物繁殖材料繁殖的植物；或通过加工根据本发明的植物的收获的叶片可获得(例如获得)；或可获得自(例如获得自)通过根据本发明的方法生产的植物。
31.适当地，所述叶片可以通过调制、发酵、巴氏灭菌或其组合进行加工，优选地，其中一种或多种选自4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(nnk)、n'-亚硝基降烟碱(nnn)、n'-亚硝基新烟草碱(nat)和n-亚硝基新烟碱(nab)的tsna的含量降低，其中优选地nnk和/或nnn的含量被调节(例如降低)，其中更优选地nnk的含量降低。
32.适当地，加工叶片可以是切割的加工叶片。
33.在一个进一步方面，本发明提供了从植物或其部分制成的调制的烟草材料，其：可获得自(例如获得自)从根据本发明的用途可获得的植物；通过加工根据本发明的植物可获得(例如获得)；可获得自(例如获得自)从根据本发明的植物繁殖材料繁殖的植物；或通过加工根据本发明的植物的收获的叶片可获得(例如获得)；或可获得自(例如获得自)通过根据本发明的方法生产的植物。
34.在另一个方面，本发明提供了烟草掺合物，其包含根据本发明的调制的烟草材料。
35.在另一个方面，本发明提供了烟草工业产品，其由以下进行制备：根据本发明的植物，或根据本发明的其部分，其中所述植物是烟草植物；从根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分；
根据本发明植物的收获的叶片，其中所述植物是烟草植物；根据本发明的加工叶片，其中所述植物是烟草植物；或通过根据本发明的方法生产的植物。
36.适当地，所述烟草工业产品可以是可燃吸烟制品。
37.适当地，所述烟草工业产品可以是无烟烟草产品。
38.适当地，所述烟草产品可以是非可燃气雾剂供应系统，诸如烟草加热设备或气雾剂生成设备。
39.在另一个方面，本发明提供了可燃吸烟制品、非可燃气雾剂供应系统、无烟烟草产品或烟草加热设备，其包括根据本发明的植物或其部分或细胞或其提取物(例如烟草提取物)；或根据本发明的调制的烟草材料；或根据本发明的烟草掺合物。
40.本发明提供了至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的核苷酸序列来选择具有调节的(例如降低的)生物碱含量和/或调节的(例如降低的)烟草特异性亚硝胺(tsna)或tsna前体的含量的植物的用途，优选地其中至少一种含btb/poz nph3结构域的蛋白的序列选自：seq id no. 1、seq id no. 4、seq id no. 7、seq id no. 10、seq id no. 13、seq id no. 16、seq id no. 19、seq id no. 22、seq id no. 25、seq id no. 28，或其功能变体或功能片段或直向同源物，或与seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28具有至少80%同一性的序列；或所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2、seq id no. 3、seq id no. 5、seq id no. 6、seq id no. 8、seq id no. 9、seq id no. 11、seq id no. 12、seq id no. 14、seq id no. 15、seq id no. 17、seq id no. 18、seq id no. 20、seq id no. 21、seq id no. 23、seq id no. 24、seq id no. 26、seq id no. 27、seq id no. 29、seq id no. 30中所示的核苷酸序列，或seq id no. 2、seq id no. 3、seq id no. 5、seq id no. 6、seq id no. 8、seq id no. 9、seq id no. 11、seq id no. 12、seq id no. 14、seq id no. 15、seq id no. 17、seq id no. 18、seq id no. 20、seq id no. 21、seq id no. 23、seq id no. 24、seq id no. 26、seq id no. 27、seq id no. 29、seq id no. 30的功能变体或功能片段或直向同源物，或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的序列。
41.在另一个方面，本发明提供了在至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的核苷酸序列中携带可遗传突变的植物的突变体，优选地其中所述基因选自：seq id no. 2、seq id no. 3、seq id no. 5、seq id no. 6、seq id no. 8、seq id no. 9、seq id no. 11、seq id no. 12、seq id no. 14、seq id no. 15、seq id no. 17、seq id no. 18、seq id no. 20、seq id no. 21、seq id no. 23、seq id no. 24、seq id no. 26、seq id no. 27、seq id no. 29、seq id no. 30；或其功能变体或功能片段或直向同源物，或与seq id no.2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的序列；其中所述可遗传突变调节(例如降低)所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达，且其中相对于不携带所述可遗传突变的可比较的植物，突变植物具有调节的(例如降低的)生物碱含量、优选地尼古丁含量，和/或调节的烟草特异性亚硝胺(tsna)或tsna的前体的含量。
42.在另一个方面，本发明提供了根据本发明携带可遗传突变的突变植物的后代或种子。
43.在一个进一步方面，本发明提供了由植物产生的收获的叶片、加工叶片或调制的烟草材料，所述植物在至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的核苷酸序列中包含修饰，其中所述至少一种基因选自：seq id no. 2、seq id no. 3、seq id no. 5、seq id no. 6、seq id no. 8、seq id no. 9、seq id no. 11、seq id no. 12、seq id no. 14、seq id no. 15、seq id no. 17、seq id no. 18、seq id no. 20、seq id no. 21、seq id no. 23、seq id no. 24、seq id no. 26、seq id no. 27、seq id no. 29、seq id no. 30；或；或其功能变体或功能片段或直向同源物，或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的序列；其中所述修饰调节(例如降低)所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达，且其中相对于在所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因中不携带所述修饰的可比较植物，所述植物具有调节的(例如降低的)生物碱含量，优选地尼古丁含量，和/或调节的烟草特异性亚硝胺(tsna)或tsna的前体的含量。
44.本发明提供了如本文中参考说明书和附图所述的方法、叶片、植物、植物繁殖材料、收获的叶片、加工的烟草、烟草产品、用途或其组合。
45.附图简述现在将参考附图仅仅通过实例的方式描述本发明的实施方案，其中：图1显示过表达nitab4.5_0000868g0020.2的5周龄烟草叶片的生物碱含量。生物碱含量相对于对照表示，并且代表通过单因素anova和tukey的多重比较事后检验分析的两个生物学重复。值显示为平均值
±
sem。星号指示p值≤ 0.05的统计显著性。
46.图2显示表达靶向nitab4.5_0000868g0020.2的人工mirna的5周龄烟草叶片的生物碱含量。生物碱含量相对于对照表示，并且包含通过单因素anova和tukey的多重比较事后检验分析的三个生物学重复。值显示为平均值
±
sem。星号指示p值≤0.001的统计显著性。
47.图3显示nitab4.5_0000868g0020.2的氨基酸序列
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seq id no. 1
ꢀ–ꢀ
根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
48.图4显示nitab4.5_0000868g0020.2的编码序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 2
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
49.图5显示nitab4.5_0000868g0020.2的基因组序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 3
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
50.图6显示nitab4.5_0000651g0020.2的氨基酸序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 4
ꢀ–ꢀ
根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
51.图7显示nitab4.5_0000651g0020.2的编码序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 5
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
52.图8显示nitab4.5_0000651g0020.2的基因组序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 6
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
53.图9显示nitab4.5_0009137g0040.2的氨基酸序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 7
ꢀ–ꢀ
根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
54.图10显示nitab4.5_0009137g0040.2的编码序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 8
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
55.图11显示nitab4.5_0009137g0040.2的基因组序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 9
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
56.图12显示nitab4.5_0001772g0090.2的氨基酸序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 10
ꢀ–ꢀ
根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
57.图13显示nitab4.5_0001772g0090.2的编码序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 11
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
58.图14显示nitab4.5_0001772g0090.2的基因组序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 12
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
59.图15显示nitab4.5_0003312g0050.2的氨基酸序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 13
ꢀ–ꢀ
根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
60.图16显示nitab4.5_0003312g0050.2的编码序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 14
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
61.图17显示nitab4.5_0003312g0050.2的基因组序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 15
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
62.图18显示nitab4.5_0003151g0080.2的氨基酸序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 16
ꢀ–ꢀ
根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
63.图19显示nitab4.5_0003151g0080.2的编码序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 17
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
64.图20显示nitab4.5_0003151g0080.2的基因组序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 18
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
65.图21显示nitab4.5_0002641g0190.2的氨基酸序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 19
ꢀ–ꢀ
根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
66.图22显示nitab4.5_0002641g0190.2的编码序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 20
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
67.图23显示nitab4.5_0002641g0190.2的基因组序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 21
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
68.图24显示nitab4.5_0001876g0030.2的氨基酸序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 22
ꢀ–ꢀ
根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
69.图25显示nitab4.5_0001876g0030.2的编码序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 23
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
70.图26显示nitab4.5_0001876g0030.2的基因组序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 24
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
71.图27显示nitab4.5_0000048g0280.2的氨基酸序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 25
ꢀ–ꢀ
根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
72.图28显示nitab4.5_0000048g0280.2的编码序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 26
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
73.图29显示nitab4.5_0000048g0280.2的基因组序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 27
ꢀ–ꢀ
编码根
据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
74.图30显示nitab4.5_0002006g0070.2的氨基酸序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 28
ꢀ–ꢀ
根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
75.图31显示nitab4.5_0002006g0070.2的编码序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 29
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
76.图32显示nitab4.5_0002006g0070.2的基因组序列
ꢀ–ꢀ
seq id no. 30
ꢀ–ꢀ
编码根据本发明来自烟草(nicotiana tabacum)的蛋白。
77.图33显示seq id no. 31，其对应于btb/poz同源二聚化结构域的氨基酸序列(seq id no. 1的残基39-136)。
78.图34显示seq id no. 32，其对应于nph3结构域的氨基酸序列(seq id no. 1的残基218-492)。
79.图35显示nitab4.5_0000868g0020.2的敲除导致生物碱含量的显著降低。显示nitab4.5_0000868g0020.2被敲除的3个tn90株系的生物碱含量。生物碱含量相对于对照表示。结果通过t-检验分析。值显示为平均值
±
sem。星号指示p值≤0.001的统计显著性。
80.图36显示seq id no. 33；nitab4.5_0000842g0110.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的基因组序列。
81.图37显示seq id no. 34；nitab4.5_0000842g0110.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的基因组序列。
82.图38显示seq id no. 35；nitab4.5_0000842g0110.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的基因组序列。
83.图39显示seq id no. 36；nitab4.5_0001620g0100.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的氨基酸序列。
84.图40显示seq id no. 37；nitab4.5_0001620g0100.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的编码序列。
85.图41显示seq id no. 38；nitab4.5_0001620g0100.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的基因组序列。
86.图42显示seq id no. 39；nitab4.5_0001200g0070.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的氨基酸序列。
87.图43显示seq id no. 40；nitab4.5_0001200g0070.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的编码序列。
88.图44显示seq id no. 41；nitab4.5_0001200g0070.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的基因组序列。
89.图45显示seq id no. 42；nitab4.5_0005803g0040.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的氨基酸序列。
90.图46显示seq id no. 43；nitab4.5_0005803g0040.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的编码序列。
91.图47显示seq id no. 44；nitab4.5_0005803g0040.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的基因组序列。
92.序列表
提供了在本说明书自始至终使用的序列标识符的概括和相应的序列表，其中：seq id no. 1对应于nitab4.5_0000868g0020.2的氨基酸序列。
93.seq id no. 2对应于nitab4.5_0000868g0020.2的编码序列。
94.seq id no. 3对应于nitab4.5_0000868g0020.2的基因组序列。
95.seq id no. 4对应于nitab4.5_0000651g0020.2的氨基酸序列。
96.seq id no. 5对应于nitab4.5_0000651g0020.2的编码序列。
97.seq id no. 6对应于nitab4.5_0000651g0020.2的基因组序列。
98.seq id no. 7对应于nitab4.5_0009137g0040.2的氨基酸序列。
99.seq id no. 8对应于nitab4.5_0009137g0040.2的编码序列。
100.seq id no. 9对应于nitab4.5_0009137g0040.2的基因组序列。
101.seq id no. 10对应于nitab4.5_0001772g0090.2的氨基酸序列。
102.seq id no. 11对应于nitab4.5_0001772g0090.2的编码序列。
103.seq id no. 12对应于nitab4.5_0001772g0090.2的基因组序列。
104.seq id no. 13对应于nitab4.5_0003312g0050.2的氨基酸序列。
105.seq id no. 14对应于nitab4.5_0003312g0050.2的编码序列。
106.seq id no. 15对应于nitab4.5_0003312g0050.2的基因组序列。
107.seq id no. 16对应于nitab4.5_0003151g0080.2的氨基酸序列。
108.seq id no. 17对应于nitab4.5_0003151g0080.2的编码序列。
109.seq id no. 18对应于nitab4.5_0003151g0080.2的基因组序列。
110.seq id no. 19对应于nitab4.5_0002641g0190.2的氨基酸序列。
111.seq id no. 20对应于nitab4.5_0002641g0190.2的编码序列。
112.seq id no. 21对应于nitab4.5_0002641g0190.2的基因组序列。
113.seq id no. 22对应于nitab4.5_0001876g0030.2的氨基酸序列。
114.seq id no. 23对应于nitab4.5_0001876g0030.2的编码序列。
115.seq id no. 24对应于nitab4.5_0001876g0030.2的基因组序列。
116.seq id no. 25对应于nitab4.5_0000048g0280.2的氨基酸序列。
117.seq id no. 26对应于nitab4.5_0000048g0280.2的编码序列。
118.seq id no. 27对应于nitab4.5_0000048g0280.2的基因组序列。
119.seq id no. 28对应于nitab4.5_0002006g0070.2的氨基酸序列。
120.seq id no. 29对应于nitab4.5_0002006g0070.2的编码序列。
121.seq id no. 30对应于nitab4.5_0002006g0070.2的基因组序列。
122.seq id no. 31对应于btb/poz同源二聚化结构域的氨基酸序列(seq id no. 1的残基39-136)。
123.seq id no. 32对应于nph3结构域的氨基酸序列(seq id no. 1的残基218-492)。
124.seq id no. 33对应于nitab4.5_0000842g0110.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的氨基酸序列。
125.seq id no. 34对应于nitab4.5_0000842g0110.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的编码序列。
126.seq id no. 35对应于nitab4.5_0000842g0110.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的
相互作用者)的基因组序列。
127.seq id no. 36对应于nitab4.5_0001620g0100.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的氨基酸序列。
128.seq id no. 37对应于nitab4.5_0001620g0100.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的编码序列。
129.seq id no. 38对应于nitab4.5_0001620g0100.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的基因组序列。
130.seq id no. 39对应于nitab4.5_0001200g0070.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的氨基酸序列。
131.seq id no. 40对应于nitab4.5_0001200g0070.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的编码序列。
132.seq id no. 41对应于nitab4.5_0001200g0070.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的基因组序列。
133.seq id no. 42对应于nitab4.5_0005803g0040.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的氨基酸序列。
134.seq id no. 43对应于nitab4.5_0005803g0040.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的编码序列。
135.seq id no. 44对应于nitab4.5_0005803g0040.2 (nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用者)的基因组序列。
136.本文公开的一些序列在核苷酸序列中含有“x”或“n”。“x”或“n”可以是任一核苷酸或一个或多个核苷酸的缺失或插入。例如，在一些情况下，显示一串“x”或“n”。“x”或“n”的数目不一定与该位置处的核苷酸的实际数目相关。序列中可以存在比如“x”或“n”所示更多或更少的核苷酸。
137.详述本发明人已首次显示通过调节植物(例如烟草植物)中至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达，可以调节植物(或加工的植物)的生物碱和/或tsna前体含量。
138.本发明提供了调节(例如降低)植物或其部分的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节(例如降低)至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物。
139.还提供了调节(例如降低)烟草植物或其植物部分中的烟草特异性亚硝胺(tsna)前体的含量的方法，所述方法包括通过调节(例如降低)至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物。
140.所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因可以选自至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28中所示的氨基酸序列、或其功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28具有至少80%同一性的序列；或者其中所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、27或30中所示的核苷酸序列、或seq id no. 2、
3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、27或30的功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、27或30具有至少80%同一性的核酸序列。
141.适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。在一个实施方案中，至少两种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因被修饰，其选自编码多肽的基因，所述多肽包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28中所示的氨基酸序列、或其功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28具有至少80%同一性的序列；或者其中所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、27或30中所示的核苷酸序列、或seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、27或30的功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、27或30具有至少80%同一性的核酸序列。
142.在一个实施方案中，至少三种、诸如至少四种、诸如至少五种、诸如至少六种、诸如至少七种、诸如至少八种、诸如至少九种、诸如至少十种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因被调节，其中所述基因选自编码多肽的那些，所述多肽包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28中所示的氨基酸序列，或其功能变体或功能片段或直向同源物，或与seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28具有至少80%同一性的序列；或其中所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、27或30中所示的核苷酸序列、或seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、27或30的功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、27或30具有至少80%同一性的核酸序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。在一个方面，所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因编码多肽，所述多肽包含如seq id no. 1中所示的氨基酸序列、或其功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 1具有至少80%同一性的序列；或者其中所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2或3中所示的核苷酸序列、或seq id no. 2或3的功能变体或功能片段或直向同源物；或与seq id no. 2或3具有至少80%同一性的核酸序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
143.在一个方面，至少一种进一步的基因的活性或表达被调节。适当地，选自seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、27或30、或seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、27或30的功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、27或30具有至少80%同一性的核酸序列的至少两种(或至少三种或至少四种或至少五种或至少六种或至少七种或至少八种或至少九种)另外的基因也可以被调节。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
144.编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的“表达”可以指转录、翻译、即蛋白表达的水平。
145.基因产物的水平或量的测量可以通过任何合适的方法来进行，例如修饰植物以及未根据本发明进行修饰的可比较植物之间的mrna转录物水平、蛋白或肽水平和/或植物表型的比较。
146.如本文所定义的术语“可比较产品”将是衍生自植物(例如烟草植物)的产品，所述植物未根据本发明进行修饰，但其中所有其他相关特征是相同的(例如植物物种、生长条件、加工植物如烟草的方法等)。根据本发明的可比较产品可以意指可获得自或得自未根据本发明进行修饰，例如，以调节编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达的植物的植物(例如烟草植物)或其部分，诸如叶片(例如烟草叶片)、收获的叶片(例如收获的烟草叶片)、切割的收获的叶片(例如切割的收获的烟草叶片)、加工叶片(例如加工烟草叶片)、或植物繁殖材料(例如烟草植物繁殖材料)、或包含所述植物或其部分的产品，例如烟草工业产品或其组合。在一个实施方案中，可比较产品是不包含其活性或表达已进行调节的编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的产品。
147.如本文所用的术语“修饰”或“修饰的”意指已改变或变化的植物(例如烟草植物)或核酸序列。本发明包含使用用于植物的遗传修饰或植物的非遗传修饰的技术的植物修饰。此类方法是本领域众所周知的，并且遗传修饰技术的实例包括转化、转基因、同源转基因(cisgenics)和基因编辑方法。非遗传修饰技术的实例包括快中子诱变、化学诱变例如甲磺酸乙酯(ems)诱变和现代种群分析方法。
148.在一个实施方案中，选择具有修饰的编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的天然变体并且将该性状或基因培育至可能具有商业上期望的性状的第二植物中。
149.在一个实施方案中，根据本发明的植物是转基因植物。在一个实施方案中，根据本发明的植物是非转基因植物。
150.如本文所定义的术语“未修饰的植物”将是这样的植物(例如烟草植物)，其未根据本发明进行修饰，以例如调节编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达或修饰至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的核酸序列；并且其中所有其他相关特征是相同的(例如植物物种、生长条件、加工烟草的方法等)。在一个实施方案中，未修饰的植物是不包含其活性或表达已进行调节的编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的植物。在一个实施方案中，未修饰的植物是不包含编码至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的修饰的核酸序列的植物。
151.含btb/poz nph3结构域的蛋白如本文所用的“含btb/poz nph3结构域的蛋白”具有其在本领域中的通常含义，并且是指包含btb/poz结构域和nph3结构域的蛋白。来自烟草的含btb/poz nph3结构域的蛋白的示例性序列显示于seq id no. 1中。
152.如本文所用的“btb/poz结构域”具有其在本领域中的通常含义，并且是指共同的蛋白结构域。btb/poz结构域介导二聚化，诸如同源二聚化。btb/poz蛋白包含一簇α螺旋，其在分子的顶部和底部由短的β折叠侧接。
153.btb也被称为bric a brac、宽-复合物(broad-complex)、tramtrack、br-c、ttk和bab。
154.poz也被称为痘病毒和锌指。
155.所述btb结构域是一种蛋白-蛋白相互作用基序，其参与细胞功能，包括转录调节、
细胞骨架动力学、离子通道组装和门控以及靶向蛋白用于泛素化。btb折叠在结构上是非常保守的。
156.btb/poz结构域的示例性序列在seq id no. 1的氨基酸39-136处列出并且也表示为seq id no. 31。
157.btb/poz结构域可以通过将所讨论的蛋白与seq id no. 31和/或seq id no. 1进行比较来鉴定。
158.适当地，如本文所用的btb/poz结构域可以指seq id no. 31中所示的序列或与其具有至少80%同一性的序列。适当地，如本文所用的btb/poz结构域可以指当与seq id no. 1比对时，对应于seq id no. 1的氨基酸39-156的序列。
159.如本文所用的“nph3结构域”具有其在本领域中的通常含义，并且是指非向光性下胚轴3结构域。所述nph3结构域可以作为非光养性下胚轴1丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶的适配体或支架蛋白发挥功能。
160.所述nph3结构域是蛋白-蛋白相互作用基序。
161.nph3结构域的示例性序列在seq id no. 1的氨基酸218-492处列出并且也表示为seq id no. 32。
162.nph3结构域可以通过将所讨论的蛋白与seq id no. 32和/或seq id no. 1进行比较来鉴定。
163.适当地，如本文所用的nph3结构域可以指seq id no. 32中所示的序列或与其具有至少80%同一性的序列。适当地，如本文所用的nph3结构域可以指当与seq id no. 1比对时，对应于seq id no. 1的氨基酸218-492的序列。
164.可以使用本领域已知的结构域预测软件来鉴定蛋白的氨基酸序列内的结构域。结构域也描述于蛋白数据库、诸如uniprotkb中。
165.不希望受理论束缚，假设调节植物细胞中含btb/poz nph3结构域的蛋白的含量或调节植物中含btb/poz nph3结构域的蛋白的活性、诸如同源二聚化或udp-糖基转移酶活性，将改变产生生物碱和tsna前体(诸如pon)的代谢途径，导致生物碱含量受到调节。
166.在一个实施方案中，含btb/poz nph3结构域的蛋白包含如seq id no. 1所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的序列，或其同源物。所述蛋白包含btb/poz结构域和nph3结构域。适当地，seq id no. 1的同源物可以选自：seq id no. 4、7、10、13、16、19、22、25或28，或与其具有至少80%同一性的序列。适当地，seq id no. 1的同源物可以选自：seq id no. 4、7、10、13、16、19、22、25或28，其中所述序列包含btb/poz结构域和nph3结构域，或与seq id no. 4、7、10、13、16、19、22、25或28具有至少80%同一性且包含btb/poz结构域和nph3结构域的序列。
167.在一个实施方案中，含btb/poz nph3结构域的蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列，或与其具有至少80%同一性(优选地与其具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性)的序列。在一个实施方案中，含btb/poz nph3结构域的蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列，或与其具有至少80%同一性(优选地与其具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性)且包含btb/poz结构域和nph3结构域的序列。
168.适当地，根据本发明的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含如seq id no. 1所示的氨基酸序列，或与其具有至少80%同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
169.适当地，根据本发明的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含如seq id no. 4所示的氨基酸序列，或与其具有至少80%同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
170.适当地，根据本发明的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含如seq id no. 7所示的氨基酸序列，或与其具有至少80%同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
171.适当地，根据本发明的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含如seq id no. 10所示的氨基酸序列，或与其具有至少80%同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
172.适当地，根据本发明的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含如seq id no. 13所示的氨基酸序列，或与其具有至少80%同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
173.适当地，根据本发明的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含如seq id no. 16所示的氨基酸序列，或与其具有至少80%同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
174.适当地，根据本发明的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含如seq id no. 19所示的氨基酸序列，或与其具有至少80%同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
175.适当地，根据本发明的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含如seq id no. 22所示的氨基酸序列，或与其具有至少80%同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/
poz结构域和nph3结构域。
176.适当地，根据本发明的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含如seq id no. 25所示的氨基酸序列，或与其具有至少80%同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
177.适当地，根据本发明的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含如seq id no. 28所示的氨基酸序列，或与其具有至少80%同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
178.在一个实施方案中，根据本发明的含btb/poz nph3结构域的蛋白包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28。
179.适当地，所述蛋白可以来自烟草。
180.在一个实施方案中，含至少一个btb/poz nph3结构域的蛋白由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30所示的序列；或与其具有至少80%序列同一性的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
181.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 2所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
182.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 3所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
183.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 5所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
184.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 6所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
185.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 8所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
186.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 9所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
187.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 11所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
188.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 12所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
189.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 14所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
190.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 15所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
191.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 17所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
192.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 18所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/
或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
193.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 20所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
194.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 21所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
195.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 23所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
196.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 24所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
197.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 26所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
198.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 27所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
199.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 29所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
200.适当地，用于根据本发明使用的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)包含如seq id no. 30所示的序列，或与其具有至少80%序列同一性(与其具有优选地至少85%、优选地至少90%、优选地至少93%、优选地至少95%、至少96%、
至少97%、至少98%或至少99%同一性)的序列。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
201.在一个实施方案中，含至少一个btb/poz nph3结构域的蛋白由多核苷酸序列编码，其中基因(突变前)选自：seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30。
202.适当地，用于根据本发明使用的蛋白可以由来自烟草的多核苷酸序列编码。
203.在一个方面，本发明提供了降低植物或其部分或细胞(例如植物细胞)的生物碱含量的方法，所述方法包括通过降低或抑制至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物。
204.在一个方面，本发明提供了降低植物或其部分或植物细胞的生物碱含量的方法，所述方法包括通过降低或抑制至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的序列，或其中所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30中所示的核苷酸序列、或seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30的功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的核酸序列。适当地，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
205.在一个方面，本发明提供了降低植物或其部分(例如叶片)中的烟草特异性亚硝胺(tsna)前体的含量的方法，所述方法包括通过降低或抑制至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物。
206.在一个方面，本发明提供了降低植物或其部分(例如叶片)中的烟草特异性亚硝胺(tsna)前体的含量的方法，所述方法包括通过降低或抑制至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的序列，或其中所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30中所示的核苷酸序列、或seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30的功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的核酸序列。适当地，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
207.在一个方面，本发明提供了降低加工叶片、诸如调制叶片中的tsna的含量的方法，所述方法包括：通过降低或抑制至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰植物；从所述植物收获叶片；
和调制所述收获的叶片。
208.适当地，降低加工叶片中的tsna的含量的方法可以包括：通过降低或抑制至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的序列，或其中所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30中所示的核苷酸序列、或seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30的功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的核酸序列。适当地，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
209.如本文所用的术语“降低”或“抑制”(例如抑制编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达)意指与可比较产品中该基因的活性或表达相比，编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达更低或降低。
210.在一个方面，本发明提供了增加植物或其部分或细胞(例如植物细胞)的生物碱含量的方法，所述方法包括通过增加或增强至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物。
211.在一个方面，本发明提供了增加植物或其部分或植物细胞的生物碱含量的方法，所述方法包括通过增加或增强至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的序列，或其中所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30中所示的核苷酸序列、或seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30的功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的核酸序列。适当地，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含btb/poz结构域和/或nph3结构域。适当地，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含btb/poz结构域和nph3结构域。
212.在一个方面，本发明提供了增加植物或其部分(例如叶片)中的烟草特异性亚硝胺(tsna)前体的含量的方法，所述方法包括通过增加或增强至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物。
213.在一个方面，本发明提供了增加植物或其部分(例如叶片)中的烟草特异性亚硝胺(tsna)前体的含量的方法，所述方法包括通过增加或增强至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的序列，或其中所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30中所示的核苷酸序列、或seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、
23、24、26、27、29或30的功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的核酸序列。
214.如本文所用的术语“增加”或“增强”(例如增加编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达)意指与可比较产品中该基因的活性或表达相比，编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达更高或增加。
215.根据本发明，编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达被调节。
216.在一个方面，本发明提供了调节(即增加或降低)植物或其部分或细胞(例如植物细胞)的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节(即增加或降低)至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性来修饰所述植物。
217.术语“活性”是指由至少一种基因编码的含btb/poz nph3结构域的蛋白的任何功能。活性的实例包括含btb/poz nph3结构域的蛋白的蛋白：蛋白相互作用的形成、酶促活性或定位。
218.适当地，所述活性可以是含btb/poz nph3结构域的蛋白与另一种分子或多种分子相互作用的能力。在一些实施方案中，本发明提供了调节(即增加或降低)植物或其部分或细胞(例如植物细胞)的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节(即增加或降低)含btb/poz nph3结构域的蛋白与另一种分子相互作用的能力来修饰所述植物。
219.适当地，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白与其他分子相互作用的能力可以是结合其他分子的能力。其他分子可以是蛋白，诸如另一含btb/poz nph3结构域的蛋白。适当地，其他分子是多于一种分子，诸如一种或多种分子，诸如两种或更多种分子，诸如三种或更多种分子。当其他分子是多于一种分子时，其他分子可以是相同的分子或可以是不同的分子。
220.适当地，所述活性可以是含btb/poz nph3结构域的蛋白同源二聚化的能力。在一些实施方案中，本发明提供了调节(即增加或降低)植物或其部分或细胞(例如植物细胞)的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节(即增加或降低)含btb/poz nph3结构域的蛋白同源二聚化的能力来修饰所述植物。
221.适当地，所述活性可以是含btb/poz nph3结构域的蛋白作为udp-糖基转移酶发挥功能的能力。在一些实施方案中，本发明提供了调节(即增加或降低)植物或其部分或细胞(例如植物细胞)的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节(即增加或降低)含btb/poz nph3结构域的蛋白作为udp-糖基转移酶发挥功能的能力来修饰所述植物。
222.编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性的调节可能需要增加或降低含btb/poz nph3结构域的蛋白的活性。
223.增加含btb/poz nph3结构域的蛋白的活性是指与未根据本发明修饰的植物中的含btb/poz nph3结构域的蛋白相比，增强或改善含btb/poz nph3结构域的蛋白实施特定功能的能力。
224.降低含btb/poz nph3结构域的蛋白的活性是指与未根据本发明修饰的植物中的含btb/poz nph3结构域的蛋白相比，降低、抑制或破坏含btb/poz nph3结构域的蛋白实施特定功能的能力。含btb/poz nph3结构域的蛋白的活性可以降低至使得该活性被阻止或消除的程度。
225.在一些实施方案中，与未根据本发明修饰的植物(例如烟草植物)中的编码含btb/
poz nph3结构域的蛋白的基因的活性相比，含btb/poz nph3结构域的蛋白的活性可以被调节(即增加或降低)至少约10%、20%、30%或40%，适当地至少约50%、60%、70%，更适当地至少约80%、90%、95%或100%。
226.在一些实施方案中，与未修饰的含btb/poz nph3结构域的蛋白相比，调节的含btb/poz nph3结构域的蛋白表现出增加或降低的活性。与未修饰的含btb/poz nph3结构域的蛋白相比，调节的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以表现出至少约1%、至少约3%、至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%或至少约90%增加或减少的活性。
227.用于测量蛋白活性的技术是本领域中已知的。例如，已知用于测量蛋白的酶促活性的测定法，并且可以使用显微技术来鉴定蛋白的定位。
228.具体而言，可以使用本领域中已知的技术测量含btb/poz nph3结构域的蛋白结合另一分子的能力。此类技术的实例包括免疫沉淀、等温量热法、表面等离子共振和微层热泳。例如，可以通过使用调节或突变的含btb/poz nph3结构域的蛋白和相应的未修饰或未突变的含btb/poz nph3结构域的蛋白进行免疫共沉淀实验来确定调节或突变的含btb/poz nph3结构域的蛋白结合其他分子的能力。如果含btb/poz nph3结构域的蛋白的调节或突变降低、抑制或消除含btb/poz nph3结构域的蛋白结合其他分子的能力，则免疫共沉淀将显示调节或突变的含btb/poz nph3结构域的蛋白结合较少的其他分子。
229.含btb/poz nph3结构域的蛋白二聚化的能力可以使用本领域已知的技术测量。此类技术的实例包括诸如天然条件下的凝胶电泳、大小排阻色谱法、扩散核磁共振(nmr)或分析型超离心等的技术。根据本发明，含btb/poz nph3结构域的蛋白的活性或表达被调节。
230.在一个方面，本发明提供了调节(即增加或降低)植物或其部分或细胞(例如植物细胞)的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节(即增加或降低)至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的表达来修饰所述植物。
231.基因的“表达”是指基因中编码的信息转化为功能的程度。基因的表达水平可以等同于细胞或生物体中存在的该基因的产物的量。调节(即增加或减少)基因表达的修饰是与未修饰的植物或细胞相比增加该基因产物在植物或细胞中的量的修饰。
232.在一些实施方案中，与未根据本发明修饰的植物(例如烟草植物)中编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的表达相比，含btb/poz nph3结构域的蛋白的表达被调节(即增加或减少)。
233.在一些实施方案中，与未根据本发明修饰的植物(例如烟草植物)中的编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的表达相比，含btb/poz nph3结构域的蛋白的表达可以被调节(即增加或降低)至少约10%、20%、30%或40%，适当地至少约50%、60%、70%，更适当地至少约80%、90%、95%或100%。
234.在一些实施方案中，与未修饰的含btb/poz nph3结构域的蛋白相比，调节的含btb/poz nph3结构域的蛋白表现出增加或降低的表达。与未修饰的含btb/poz nph3结构域的蛋白相比，调节的含btb/poz nph3结构域的蛋白可以表现出至少约1%、至少约3%、至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%或至少约90%增加或减少的表达。
235.通常，基因被转录为mrna，所述mrna被翻译为蛋白，最终的基因产物。蛋白可以隔
离在细胞储存中和/或降解。基因的表达可以通过调节任何或所有这些步骤来调节。因此，在一些实施方案中，所述修饰以下列方式之一调节至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的表达：调节来自至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的转录；调节来自至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的mrna的翻译；调节含btb/poz nph3结构域的蛋白从细胞内储存的释放；和/或调节含btb/poz nph3结构域的蛋白的降解速率。
236.编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的特定基因的表达可以通过测量基因的转录和/或翻译进行测量。用于测量转录的方法是本领域众所周知的，并且尤其包括northern印迹、rna-seq、原位杂交、dna微阵列和rt-pcr。或者，可以通过测量基因产物例如由所述基因编码的蛋白的水平，来间接测量基因的表达。例如，含btb/poz nph3结构域的蛋白的表达可以通过使用对含btb/poz nph3结构域的蛋白特异性的抗体(例如对btb/poz、nph3结构域特异性的抗体)通过western印迹测量蛋白的存在来确定。
237.修饰可以以调节至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达的任何方式修饰所述植物或细胞。调节基因的活性或表达的植物和细胞的修饰类型以及实现这些修饰的技术是本领域中已知的。
238.在一些实施方案中，本发明提供了降低植物或其部分或细胞(例如植物细胞)的生物碱含量的方法，所述方法包括通过降低或抑制至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物。
239.在一些实施方案中，本发明提供了降低烟草植物或其植物部分中的烟草特异性亚硝胺(tsna)或tsna的前体的含量的方法，所述方法包括通过降低至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物或细胞培养物。
240.本领域已知的用于降低或抑制基因的活性或表达的任何方法均可用于根据本发明的方法中。
241.适当地，编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达可以被减少、部分失活、抑制、消除、敲除或丧失，使得编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的蛋白活性、表达或功能是检测不到的。
242.在一个方面，至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因被敲除。换言之，编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因已被致使完全无效。
243.例如，本方法可以包括：
●ꢀ
在编码蛋白的核酸序列中提供突变，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；
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在调节区(例如启动子或增强子)中提供有助于控制蛋白的表达的突变，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；
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提供反义rna、sirna或mirna，其减少编码蛋白的核酸序列的水平，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
244.上述方法各自导致以下的活性或表达的减少或阻止：包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的蛋白，或者其中至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30中所示的核苷酸序列、或者seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30的功能变体或功能片段或直向同源物、或者与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的核酸序列。
245.如本文所用，术语“突变”包括天然遗传变体或工程改造变体。具体而言，术语“突变”是指与如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的序列，或者与其具有至少80%(优选至少85%、优选至少90%、优选至少93%、优选至少95%、优选至少98%、优选至少99%)序列同一性的氨基酸序列相比，编码氨基酸序列的核苷酸序列或氨基酸序列中的变异。
246.在一个实施方案中，突变降低植物的生物碱含量。在另一个实施方案中，所述突变降低植物或其部分或叶片、诸如收获或加工的叶片中至少一种tsna前体的含量。在一个实施方案中，所述突变降低一种或多种选自nnk、nnn、nat、nab的tsna的含量，优选地，加工的叶片中nnk含量降低。适当地，相对于可比较产品，tsna含量降低。
247.在一个实施方案中，根据本发明的方法可以包括向植物或其部分或植物细胞提供核酸序列，其中所述核酸导致至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达的降低或消除。
248.在一个实施方案中，根据本发明的方法可以包括向植物或其部分或植物细胞提供核酸序列，其中所述核酸导致至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的核酸序列的修饰。
249.适当地，可以将所述核酸序列引入植物或其部分或细胞。适当地，可以修饰植物或其部分或细胞中的内源核酸序列，以编码根据本发明的多肽(例如，通过基因编辑)。例如，可以修饰内源核苷酸序列以减少至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达。
250.在一个优选实施方案中，每个拷贝的编码包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的序列或与其具有至少80%序列同一性的序列的蛋白的核酸序列或其中所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30中所示的核苷酸序列、或seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30的功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的核酸序列(其存在于植物中)被修饰，例如如本文所定义突变(例如，植物中编码所述蛋白的基因的每个基因组拷贝被突变)。例如，烟草的异源四倍体基因组中的每个拷贝的基因都可能被突变。
251.在一个优选实施方案中，本文所述的含btb/poz nph3结构域的蛋白的一些或全部同源物被修饰，例如被抑制或突变。适当地，seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28或与其具有至少80%序列同一性的相应序列中的一些或全部被修饰，例如被抑制或突变。
252.在一些实施方案中，根据本发明的植物或植物细胞是纯合的。适当地，植物或植物细胞对于修饰例如抑制或突变可以是纯合的。
253.在一些实施方案中，根据本发明的植物或植物细胞仅表达编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的修饰的例如突变的核酸。换言之，在一些实施方案中，在根据本发明的植物中不存在内源性(或内源性和功能性蛋白)。换言之，如果存在任何内源性蛋白，则它优选为无活性形式。
254.在一个实施方案中，本方法可以包括在如seq id no.2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30所示的核酸序列或与其具有至少80%同一性的核酸序列中提供突变。
255.所述突变可以改变植物基因组，使得编码包含如seq id no.1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的蛋白的核酸序列被完全或部分缺失或以其他方式修饰以抑制或消除含btb/poz nph3结构域的蛋白同源二聚化的能力。在一些实施方案中，所述突变不改变蛋白的水平或表达，但降低、抑制或消除含btb/poz nph3结构域的蛋白白同源二聚化的能力。表述“抑制或消除”意指含btb/poz nph3结构域的蛋白主要以单体形式存在。
256.适当地，所述突变可以在含btb/poz nph3结构域的蛋白的btb/poz结构域中。适当地，所述突变可以在含btb/poz nph3结构域的蛋白的nph3结构域中。适当地，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白可以包含多个突变，每个突变在不同的结构域中。在一些实施方案中，所述btb/poz结构域中的突变改变含btb/poz nph3结构域的蛋白同源二聚化的能力。适当地，所述突变可以防止或减少同源二聚化。适当地，所述btb/poz结构域中的突变防止或减少同源二聚化并降低含btb/poz noh3结构域的蛋白的活性。
257.所述突变可以在含btb/poz nph3结构域的蛋白的一个或多个结构域中，诸如在btb/poz结构域和/或nph3结构域中。在一些实施方案中，含btb/poz nph3结构域的蛋白的一个或多个结构域，诸如在btb/poz结构域和/或nph3结构域中，可以被突变，由此改变btb/poz nph3同源二聚化的能力。在一些实施方案中，从含btb/poz nph3结构域的蛋白中缺失一个或多个结构域，诸如btb/poz结构域和/或nph3结构域。
258.突变可以中断编码蛋白的核酸序列，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
259.中断可以导致核酸序列不被转录和/或翻译。
260.可以例如通过缺失或以其他方式修饰核酸序列的atg起始密码子来中断核酸序列，使得蛋白的翻译被减少或阻止。
261.核酸序列可以包含减少或阻止蛋白表达或者影响蛋白运输的一种或多种核苷酸变化。例如，可以通过在开放阅读框中引入一个或多个提前终止密码子、移框、剪接突变或非耐受的氨基酸取代，来减少或阻止蛋白的表达。
262.提前终止密码子是指这样的突变，其将终止密码子引入开放阅读框内，并且阻止整个氨基酸序列的翻译。提前终止密码子可以是tag(“琥珀”)、taa(“赭石”)或tga(“蛋白石”或“棕土”)密码子。
263.移框突变(也称为读框错误(framing error)或读框移位)是由核酸序列中不能被三除尽的多个核苷酸的插入/缺失(插入或缺失)引起的突变。由于通过密码子的基因表达的三联体特性，插入或缺失可以改变阅读框，从而导致与原始完全不同的翻译。移框突变将经常引起突变后的密码子读取，以编码不同的氨基酸。移框突变将通常导致提前终止密码
子的引入。
264.剪接突变在特异性位点处插入、缺失或改变许多核苷酸，在前体信使rna加工为成熟信使rna的过程中，在所述特异性位点处发生剪接。剪接位点的缺失导致一个或多个内含子保留在成熟mrna中，并且可能导致异常蛋白的产生。
265.非耐受的氨基酸取代是指引起蛋白中的非同义氨基酸取代的突变，其导致蛋白的降低或除去的功能。
266.本领域已知的用于提供核酸序列中的突变的任何方法都可以用于根据本发明的方法中。例如，可以使用同源重组，其中产生其中一种或多种相关的核酸序列突变的载体，并且用于转化植物或植物细胞。然后可以选择表达突变的序列的重组植物或植物细胞。
267.在一个实施方案中，突变在蛋白中引入非耐受的氨基酸取代，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列、或者与其具有至少80%序列同一性的序列。
268.在一些实施方案中，所述btb/poz结构域可以含有降低至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的表达的突变。
269.在一些实施方案中，所述nph3结构域可以含有降低至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的表达的突变。
270.所述突变可以是缺失、剪接突变体或编码非耐受氨基酸取代的密码子。
271.在一个实施方案中，编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的核酸序列可以被完全或部分缺失。缺失可以是连续的，或者可以包含序列的多个区段。缺失优选去除足够量的核苷酸序列，使得核酸序列不再编码功能性含btb/poz nph3结构域的蛋白。当与可比较的未修饰植物的对应基因组相比较时，缺失可以是全部的，在所述情况下核酸序列的编码部分的100%不存在。缺失可以例如去除核酸序列的编码部分的至少50、60、70、80或90%。适当地，蛋白的至少一部分可以是缺失的。缺失可以例如去除蛋白的编码部分的至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%。
272.缺失可以去除btb/poz结构域的至少一部分。缺失可以例如去除btb/poz结构域的至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%。适当地，缺失可以去除btb/poz结构域的至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个氨基酸。适当地，缺失可以去除btb/poz结构域的至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个氨基酸。
273.缺失可以去除nph3结构域的至少一部分。缺失可以例如去除nph3结构域的至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%。适当地，缺失可以去除nph3结构域的至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个氨基酸。适当地，缺失可以去除nph3结构域的至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个氨基酸。
274.用于缺失植物中的核酸序列的方法是本领域已知的。例如，可以使用同源重组，其中产生其中一种或多种相关的核酸序列失去的载体，并且用于转化植物或植物细胞。然后可以选择表达新序列部分的重组植物或植物细胞。
275.根据众所周知的组织培养方法，诸如通过在供应有必需生长因子诸如氨基酸、植物激素、维生素等的合适培养基中培养细胞，可以生长且维持用如本文所述的载体转化的
植物细胞。
276.可以使用靶向诱变方法(也称为靶向核苷酸交换(targeted nucleotide exchange)(tne)或寡核苷酸定向诱变(oligo-directed mutagenesis)(odm))来进行核酸序列的修饰。靶向诱变方法包括但不限于采用锌指核酸酶、talens(参见wo2011/072246和wo2010/079430)、cas9-样、cas9/crrna/tracrrna、cas9/grna或其他crispr系统(参见wo 2014/071006和wo2014/093622)、大范围核酸酶(参见wo2007/047859和wo2009/059195)的那些，或采用诱变寡核苷酸的靶向诱变方法，其可能含有进入植物原生质体内的与基因具有序列互补性的用于增强诱变的化学修饰的核苷酸(例如keybase
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或talens)。
277.或者，诱变系统诸如tilling(靶向诱导基因组局部突变(targeting induced local lesions in genomics)；mccallum等人 (2000) nat. biotech. 18:455, 和mccallum等人 (2000) plant physiol. 123, 439-442，两者均通过引用并入本文)，可以用于生成包含编码具有突变的蛋白的基因的植物株系。tilling使用传统的化学诱变(例如产生随机突变的甲磺酸乙酯(ems)诱变)，随后为突变的高通量筛选。因此，可以获得包含具有期望的突变的基因的植物、种子、细胞和组织。
278.所述方法可以包括以下步骤：诱变植物种子(例如ems诱变)，植物个体或dna的合并，目标区域的pcr扩增，异源双链体形成和高通量检测，突变植物的鉴定，突变pcr产物的测序。应理解，其他诱变和选择方法可以同等地用于生成此类修饰的植物。种子可以例如进行辐射或化学处理，并且可以针对修饰的表型筛选植物。
279.快中子缺失诱变可以在反向遗传学意义上(即，利用pcr)使用以鉴定在内源基因中携带缺失的植物株系。参见例如ohshima等人(1998)virology 213:472-481；okubara等人(1994)genetics 137:867-874；以及quesada等人(2000)genetics 154:421-4315，其通过引用并入本文。
280.在另一种方法中，由于基因倒置和重复基因座的重组，显性突变体可以用于触发rna沉默。参见例如kusaba等人(2003)plant cell 15:1455-1467(通过引用并入本文)。
281.通过分子方法，诸如dna中存在的一种或多种突变，并且通过修饰的表型特征，可以将修饰的植物与未修饰的植物，即野生型植物区分开。修饰的植物对于修饰可以是纯合的或杂合的。优选地，修饰的植物对于修饰是纯合的。
282.在一个实施方案中，减少或阻止蛋白活性或表达的方法不包括用化学品(例如农用化学品)处理植物，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
283.减少或阻止表达的其他方式对于本领域技术人员将是显而易见的，并且包括病毒诱导的基因沉默(vigs)、微小rna沉默、rnai、反义、tdna插入、或显性失活构建体(或反效等位基因突变(antimorphic mutation))的使用。
284.在一个实施方案中，编码蛋白的基因的表达可以通过病毒诱导的基因沉默得到减少或消除，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
285.在一个实施方案中，编码蛋白的基因的表达可以通过微小rnas得到减少或消除，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
286.在一个实施方案中，编码蛋白的基因的表达可以通过rnai得到减少或消除，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
287.在一个实施方案中，编码蛋白的基因的表达可以通过反义抑制得到减少或消除，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
288.在一个实施方案中，编码蛋白的基因的表达可以通过有义抑制得到减少或消除，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
289.在一个实施方案中，编码蛋白的基因的表达可以通过tdna插入得到减少或消除，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
290.在一个实施方案中，编码蛋白的基因的表达可以通过显性阴性构建体(或反效等位基因突变)得到减少或消除，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
291.在一个实施方案中，编码蛋白的基因的表达可以通过基于靶向诱变的系统得到减少或消除，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
292.在一个实施方案中，编码蛋白的基因的表达可以通过基于crispr的系统得到减少或消除，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
293.在一个实施方案中，编码蛋白的基因的表达可以通过锌指核酸酶、talens、大范围核酸酶、诱变寡核苷酸或tilling得到减少或消除，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
294.在一些实施方案中，本发明提供了增加植物或其部分或细胞(例如植物细胞)的生物碱含量的方法，所述方法包括通过增加或增强至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物。
295.本领域已知的用于增加或增强基因的活性或表达的任何方法均可用于根据本发明的方法中。
296.在一些实施方案中，所述方法可以包括过表达至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因。适当地，所述方法可以包括在植物或细胞中表达一个或多个额外拷贝的至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因。适当地，所述方法可以包括修饰内源拷贝的至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因，使得其表达增加。所述方法可以包括突变至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的编码序列。所述方法可以包括突变调节至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的表达的调节序列。
297.适当地，所述方法可以包括用基因构建体转化植物(例如烟草植物)的细胞，所述基因构建体编码至少一种含btb/poz nph3结构域的蛋白，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28中所示的氨基酸序列，或其功能变体或功能片段或直向同源物，或与seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28具有至少80%
同一性的序列；或其中所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30中所示的核苷酸序列、或seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30的功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的核酸序列；或其包含编码蛋白的核苷酸序列，所述蛋白能够促进或增强至少一种内源性含btb/poz nph3结构域的蛋白。应理解，这些选项中的每一个将导致由至少一种含btb/poz nph3结构域的蛋白编码的多肽的活性和表达增加。所述方法可以包括从转化细胞再生植物。提供了能够增加由至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因编码的多肽的活性和/或表达的基因构建体用于增加用所述构建体转化的植物或其部分或细胞中的生物碱含量(例如尼古丁含量)的用途。
298.所述基因构建体可以编码多肽，所述多肽包含氨基酸seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28，或其功能变体或功能片段或直向同源物，或与seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28具有至少80%同一性的序列；或其中所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30中所示的核苷酸序列、或seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30的功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的核酸序列。
299.在另一个实施方案中，本发明涉及增加植物或其部分或细胞的生物碱含量的方法，其包括通过增加至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性来修饰所述植物或细胞。
300.在一个实施方案中，至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性可以通过将突变引入(或提供)到至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因来增加。
301.适当地，至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性可以通过将突变引入至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因来增加，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28中所示的氨基酸序列；或其功能变体或功能片段或直向同源物，或与seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28具有至少80%同一性的序列；或其中所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30中所示的核苷酸序列、或seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30的功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的核酸序列。
302.在一些实施方案中，通过以下之一增加至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达且由此增加生物碱含量的修饰：调节来自至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的转录；调节来自至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的mrna的翻译；调节含btb/poz nph3结构域的蛋白从细胞内储存的释放；和/或调节含btb/poz nph3结构域的蛋白的降解速率。
303.在一个方面，含btb/poz nph3结构域的蛋白的活性和或表达可以通过修改相互作
用蛋白的活性或表达来调节，例如降低。
304.不希望受理论束缚，在一个方面，所述相互作用蛋白可以降低或阻断btb/poz nph3蛋白的活性和/或表达。例如，所述相互作用蛋白可以结合和/或隔绝btb/poz nph3蛋白；因此增加相互作用蛋白的活性和/或表达可以降低含btb/poz nph3结构域的蛋白的活性和/或表达。
305.在一个替代方面，所述相互作用蛋白可以增加或增强btb/poz nph3蛋白的活性和/或表达。例如，所述相互作用蛋白可以充当btb/poz nph3蛋白的辅助因子；因此降低相互作用蛋白的活性和/或表达可以降低含btb/poz nph3结构域的蛋白的活性和/或表达。
306.在一个方面，btb/poz nph3蛋白的活性和/或表达可以通过修改相互作用蛋白的活性和/或表达来调节(例如降低)。
307.适当地，所述相互作用蛋白可以选自seq id no. 33、seq id no. 36、seq id no. 39、seq id no. 42或其与其具有至少80%同一性(诸如至少85%同一性、至少90%同一性、至少95%、至少97%同一性、至少98%同一性)的变体。
308.适当地，所述相互作用蛋白可以具有选自seq id no. 34、seq id no. 37、seq id no. 40、seq id no. 43或其与其具有至少80%同一性(诸如至少85%同一性、至少90%同一性、至少95%、至少97%同一性、至少98%同一性)的编码序列。
309.适当地，所述相互作用蛋白可以由选自seq id no. 35、seq id no. 38、seq id no. 41、seq id no. 44或其与其具有至少80%同一性(诸如至少85%同一性、至少90%同一性、至少95%、至少97%同一性、至少98%同一性)的核苷酸序列编码。
310.生物碱含量在一个实施方案中，本发明提供了调节植物(例如烟草植物)或其部分的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物。
311.术语“调节”在本文中用于意指增加或降低。
312.术语“增加生物碱含量”在本文中用于意指，与未根据本发明进行修饰的可比较产品相比，在本发明的产品(例如植物、其部分(例如叶片)、加工叶片或由植物制备的产品(例如烟草工业产品))中的生物碱含量更高。
313.术语“降低生物碱含量”在本文中用于意指，与未根据本发明进行修饰的可比较产品相比，在本发明的产品(例如植物、其部分(例如叶片)、加工叶片或由植物制备的产品(例如烟草工业产品))中的生物碱含量更低。
314.在一些实施方案中，生物碱含量的调节是指生物碱含量的增加，其中至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达是增加的(或换言之，所述蛋白过表达)。
315.在一些实施方案中，生物碱含量的调节是指生物碱含量的降低，其中至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的表达是减少或抑制或消除的。
316.在进一步的方面，从叶片测量生物碱的含量。在一个方面，从绿色叶片测量生物碱含量。在进一步的方面，从调制的叶片，例如晾制(air-cured)、烟道烘烤(flue-cured)、明火烘烤(fire-cured)或晒制(sun-cured)叶片测量生物碱含量。在进一步的方面，从烟道烘烤的叶片测量生物碱含量。在进一步的方面，从晾制叶片测量生物碱含量。
317.术语“生物碱含量”在本文中用于意指分类为生物碱的整组化合物的浓度和/或总量或分类为生物碱的一种或多种化合物的浓度和/或总量。烟草中通常存在的生物碱包括尼古丁、降烟碱、pon、新烟草碱、新烟碱和米喔斯明。在一些实施方案中，选自尼古丁、降烟碱、pon、新烟草碱、新烟碱和米喔斯明的一种或多种生物碱、诸如两种或更多种生物碱、诸如三种或更多种生物碱、诸如四种或更多种生物碱、诸如五种或更多种生物碱、诸如所有六种生物碱的含量被调节。在一些实施方案中，选自尼古丁、降烟碱、pon、新烟草碱、新烟碱和米喔斯明的一种或多种生物碱、诸如两种或更多种生物碱、诸如三种或更多种生物碱、诸如四种或更多种生物碱、诸如五种或更多种生物碱、诸如所有六种生物碱的含量增加。在一些实施方案中，选自尼古丁、降烟碱、pon、新烟草碱、新烟碱和米喔斯明的一种或多种生物碱、诸如两种或更多种生物碱、诸如三种或更多种生物碱、诸如四种或更多种生物碱、诸如五种或更多种生物碱、诸如所有六种生物碱的含量降低。在一些实施方案中，植物或细胞的总生物碱含量被调节。在一些实施方案中，总生物碱含量增加。在一些实施方案中，总生物碱含量增加。
318.在一个实施方案中，尼古丁含量基本上没有减少，但选自pon、降烟碱、新烟草碱、新烟碱和米喔斯明的一种或多种生物碱的含量被调节。
319.在一个实施方案中，尼古丁含量基本上没有减少，但选自pon、降烟碱、新烟草碱和新烟碱的一种或多种生物碱的含量被调节。适当地，尼古丁含量不可被调节，但pon的含量被调节。适当地，尼古丁含量基本上没有减少，但pon的含量降低。
320.可以使用本领域已知的用于确定生物碱的浓度和/或总量的任何方法。用于分析生物碱含量的一种优选方法涉及通过气相色谱-火焰电离检测方法(gc-fid)或通过反相高效液相色谱和串联质谱(lc-ms/ms)的分析。
321.在一个实施方案中，提供了用于生产以下的方法：通过本发明的植物可获得或获得的植物(例如烟草植物)或其部分、植物繁殖材料(例如烟草植物繁殖材料)、细胞(例如烟草细胞)、叶片(例如烟草叶片)、收获的叶片(例如收获的烟草叶片)、切割的收获的叶片(例如切割的收获的烟草叶片)、加工叶片(例如加工烟草叶片)、切割且加工的叶片(例如切割且加工的烟草叶片)、包含所述植物或其部分的产品(例如烟草工业产品)或其组合，所述本发明的植物具有调节的生物碱含量，所述方法包括修饰所述植物以调节编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达。调节的生物碱含量可以通过将以下中的生物碱含量与可比较产品进行比较来确定：植物(例如烟草植物)或其部分、植物繁殖材料(例如烟草植物繁殖材料)、细胞(例如烟草细胞)、叶片(例如烟草叶片)、收获的叶片(例如收获的烟草叶片)、切割的收获的叶片(例如切割的收获的烟草叶片)、加工叶片(例如加工烟草叶片)、切割且加工的叶片(例如切割且加工的烟草叶片)、包含本发明的植物或其部分的产品例如烟草工业产品或其组合。
322.适当地，生物碱含量可以在植物，例如烟草植物，例如修饰的烟草植物中进行调节。适当地，生物碱含量可以在叶片(例如烟草叶片，例如来自修饰的烟草植物的烟草叶片)中进行调节。适当地，生物碱含量可以在收获的叶片(例如来自修饰的烟草植物的收获的烟草叶片)中进行调节。适当地，生物碱含量可以在切割的收获的叶片(例如来自修饰的烟草植物的切割的收获的烟草叶片)中进行调节。适当地，生物碱含量可以在加工叶片(例如加工烟草叶片，例如来自修饰的烟草植物的加工烟草叶片)中进行调节。适当地，生物碱含量
可以在切割且加工的叶片(例如切割且加工的烟草叶片，例如来自修饰的烟草植物的切割且加工的烟草叶片)中进行调节。适当地，生物碱含量可以在调制的叶片(例如来自修饰的烟草植物的调制的烟草叶片)中进行调节。适当地，生物碱含量可以在绿色叶片(例如来自修饰的烟草植物的绿色烟草叶片)的提取物中进行调节。适当地，生物碱含量可以在包含本发明植物或其部分的产品(例如烟草工业产品，例如由修饰的烟草植物或其部分生产的烟草工业产品)中进行调节。适当地，生物碱含量可以在任何一种上述产品或其组合中进行调节。适当地，上述生物碱含量的调节可以是生物碱含量的增加。适当地，上述生物碱含量的调节可以是生物碱含量的降低(例如pon含量的降低)。
323.在一个实施方案中，选自降烟碱、pon、新烟草碱和新烟碱的一种或多种生物碱的含量降低。在一个实施方案中，pon的含量降低。在一个实施方案中，降烟碱的含量降低。在一个实施方案中，新烟草碱的含量降低。在一个实施方案中，新烟碱的含量降低。
324.在一个实施方案中，尼古丁的含量基本上没有降低。适当地，上述生物碱含量的调节可以是选自降烟碱、pon、新烟草碱和新烟碱的一种或多种生物碱的含量的降低，而不是尼古丁含量的降低。
325.在一个实施方案中，修饰的植物(例如烟草植物)、植物繁殖材料(例如烟草植物繁殖材料)、叶片(例如烟草叶片)、收获的叶片(例如收获的烟草叶片)、切割的收获的叶片(例如切割的收获的烟草叶片)、加工叶片(例如加工烟草叶片)、切割且加工的叶片(例如切割且加工的烟草叶片)、或来自修饰的烟草植物的烟草工业产品的尼古丁含量基本上没有降低。适当地，尼古丁含量是可比较产品的尼古丁含量的至少85% (诸如至少90%，诸如至少95%，诸如至少98%，诸如至少99%)。
326.在一个实施方案中，当分别与未进行修饰以调节至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达且已在相似的生长条件下生长的植物(例如烟草植物)或其部分的生物碱含量相比较时，植物(例如烟草植物)或其部分的生物碱含量可以被调节至少0.5、1.5、2、3或4倍。适当地，生物碱含量可以被调节约0.5倍至约4倍。适当地，生物碱含量可以被调节约4倍。适当地，修饰可以是生物碱含量的增加或降低。适当地，所述调节可以是选自尼古丁、降烟碱、pon、新烟草碱、新烟碱和米喔斯明的一种或多种生物碱的调节。适当地，所述调节可以是选自尼古丁、降烟碱、pon、新烟草碱和新烟碱的一种或多种生物碱的调节。适当地，降烟碱含量可以降低。适当地，pon含量可以降低。适当地，新烟草碱含量可以降低。适当地，新烟碱含量可以降低。
327.在本发明的一个实施方案中，与未根据本发明进行修饰的植物(例如烟草植物)或其部分相比，植物(例如烟草植物)或其部分的生物碱含量可以被调节至少1%、2%、5%、8%、10%、12%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一个实施方案中，与未修饰的植物或其部分相比，生物碱含量可以被调节至少30%。在一个实施方案中，与未修饰的植物或其部分相比，生物碱含量可以被调节至少40%。在一个实施方案中，与未修饰的植物或其部分相比，生物碱含量可以被调节至少50%。在一个实施方案中，与未修饰的植物或其部分相比，生物碱含量可以被调节至少60%。当与未修饰的植物(例如烟草植物)或其部分相比较时，所述调节可以是生物碱含量的增加或降低。
328.适当地，调节可以是总生物碱含量的调节。适当地，所述调节可以是选自尼古丁、降烟碱、pon、新烟草碱、新烟碱和米喔斯明的一种或多种生物碱的调节。适当地，所述调节
可以是选自尼古丁、降烟碱、pon、新烟草碱和新烟碱的一种或多种生物碱的调节。适当地，所述调节可以是降烟碱含量的调节，诸如降烟碱含量的降低。适当地，所述调节可以是新烟碱含量的调节，诸如新烟碱含量的降低。适当地，所述调节可以是pon含量的调节，诸如pon含量的降低。适当地，所述调节可以是新烟草碱含量的调节，诸如新烟草碱含量的降低。
329.适当地，所述调节可以是选自尼古丁、降烟碱、pon、新烟草碱、新烟碱和米喔斯明的多于一种生物碱、诸如两种或更多种生物碱、诸如三种或更多种生物碱、诸如四种或更多种生物碱、诸如五种或更多种生物碱、诸如所有六种生物碱的调节。
330.在一些实施方案中，植物的生物碱含量可以被调节约5%至约100%、约10%至约90%、约20%至约80%、约30%至约70%、约40%至60%、约40%至50%或约50%至60%。
331.烟草特异性亚硝胺(tsna)含量在一个实施方案中，本发明提供了减少植物(例如烟草植物)或其部分中的至少一种烟草特异性亚硝胺(tsna)前体含量的方法。适当地，所述方法可以包括通过调节至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰所述植物。在一个实施方案中，本发明提供了生产具有降低的tsna含量(例如，相对于可比较的产品)的加工叶片的方法。生产具有降低的tsna含量的加工叶片的方法可以包括：通过降低或抑制至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰植物；从所述植物收获叶片；和调制所述收获的叶片。
332.tsna可以在加工烟草例如调制的烟草或再造烟草中进行测量。在一个实施方案中，tsna含量在调制的烟草植物或其部分(例如调制的烟草叶片)中进行测量和/或修饰(例如减少)。
333.如本文所用的术语“烟草特异性亚硝胺”或“tsna”具有其在本领域中的通常含义，即仅在烟草工业产品或其他含尼古丁的产品中发现的亚硝胺。适当地，至少一种烟草特异性亚硝胺可以是4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(nnk)、n'-亚硝基降烟碱(nnn)、n'-亚硝基新烟草碱(nat)或n'-亚硝基新烟碱(nab)。
334.当关于至少一种烟草特异性亚硝胺使用时，术语“其前体”是指烟草植物的一种或多种化学品或化合物，其引起烟草特异性亚硝胺的形成或与导致烟草特异性亚硝胺产生的亚硝化反应相关。
335.在一个实施方案中，tsna可以是选自以下的组的一种或多种：n'-亚硝基降烟碱(nnn)、n'亚硝基新烟草碱(nat)、n'-亚硝基新烟碱(nab)和4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(nnk)。适当地，至少一种烟草特异性亚硝胺可以是nnk或nnn。在一个实施方案中，烟草特异性亚硝胺是nnk。
336.在一个实施方案中，tsna的前体是选自降烟碱、新烟碱、新烟草碱和尼古丁的氧化衍生物诸如假氧化尼古丁(pon)的组的一种或多种。
337.在一个实施方案中，所述tsna是4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(nnk)和/或所述前体是pon。在一个实施方案中，nnk的含量降低。在一个实施方案中，pon的含量降低。在一个实施方案中，nnk和pon的含量降低。
338.在一个实施方案中，所述tsna是n'亚硝基降烟碱(nnn)和/或所述前体是降烟碱。
在一个实施方案中，所述tsna是n'亚硝基新烟草碱(nat)和/或所述前体是新烟草碱。
339.在一个实施方案中，所述tsna是n'-亚硝基新烟碱(nab)和/或所述前体是新烟碱。
340.tsna的前体(例如nnk、nnn、nab和/或nat)可以在绿色烟草叶片中，例如在加工之前，例如在调制之前进行测量。在一个实施方案中，tsna的前体(例如nnk、nnn、nab和/或nat)在绿色烟草叶片中，例如在加工之前，例如在调制之前进行测量和/或修饰(例如减少)。
341.在一个实施方案中，当与未根据本发明进行修饰的烟草植物(或其部分)相比较时，实施本发明的方法和或用途导致修饰的烟草植物(或其部分)中的至少一种tsna或其前体的减少。
342.术语“减少至少一种tsna或其前体”或“至少一种tsna或其前体的减少”在本文中用于意指，相对于可比较的产品、方法或用途，本发明的产品、方法或用途中的至少一种tsna或其前体的浓度和/或总含量较低。例如，可比较的烟草工业产品将衍生自这样的烟草植物，其未根据本发明进行修饰，但其中所有其他相关特征都是相同的(例如植物物种、生长条件、加工烟草的方法等)。
343.可以使用本领域已知的用于确定至少一种tsna或其前体的浓度和/或水平的任何方法。具体而言，可以使用这种方法，其可以包括添加氘标记的内标、水提取和过滤，随后为使用具有串联质谱分析法的反相高效液相色谱(lc-ms/ms)的分析。用于确定烟草特异性亚硝胺前体的浓度和/或水平的其他实例包括方法，诸如coresta推荐的方法crm-72：通过lc-ms/ms确定烟草和烟草产品中的烟草特异性亚硝胺(coresta recommended method crm-72: determination of tobacco specific nitrosamines in tobacco and tobacco products by lc-ms/ms)；正被开发为iso/dis 21766的crm或wagner等人 (2005) analytical chemistry，77(4)，1001-1006中详述的方法，其全部通过引用并入本文。
344.适当地，可以通过实施本发明的方法和/或用途来减少至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量。适当地，当与未根据本发明进行修饰的烟草植物中的至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或水平相比较时，至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或水平在本发明(例如，通过本发明的方法和/或用途可获得或获得)的烟草植物中可以是减少的。
345.当与可获得自或得自未根据本发明进行修饰的烟草植物(或烟草植物的部分或烟草细胞培养物)的烟草叶片、收获的叶片、加工烟草叶片、烟草工业产品或其组合相比较时，至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量在可获得自或得自本发明的烟草植物(或烟草植物的部分或烟草细胞培养物)的烟草叶片、收获的叶片、加工烟草叶片、烟草工业产品或其组合中可以是减少的。
346.适当地，至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量在加工烟草叶片中可以是减少的。
347.适当地，至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体的浓度和/或水平在烟草工业产品中可以是减少的。
348.在一个实施方案中，至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体可以减少至少约1%、至少约3%、至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%或至少约50%。在一些实施方案中，至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体可以减少约5%至约50%、约10%至约50%、约20%
至约50%、约30%至约50%或约40%至50%。
349.关于加工(例如调制的)烟草叶片(例如调制的或再造的)，至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体可以减少约5000 ng/g至约50 ng/g、约4000 ng/g至约100 ng/g、约3000 ng/g至500 ng/g、或2000 ng/g至1000 ng/g。在一些实施方案中，至少一种烟草特异性亚硝胺或其前体可以减少至少约5000 ng/g、至少约4000 ng/g、至少约3000 ng/g、至少约2000 ng/g、至少约1000 ng/g、至少约500 ng/g、至少约100 ng/g或至少约50 ng/g。
350.生物质产生在一些情况下，可能期望生产具有高生物碱水平(例如高水平的尼古丁含量)的植物或生物质，使得可以纯化尼古丁以生产纯尼古丁产品，例如用于利用含有尼古丁的液体的设备(例如电子烟)中或烟草加热设备内。例如，以这种方式生产尼古丁可以降低用于生产用于电子烟的电子烟液的尼古丁提取成本。
351.在一个方面，本发明提供了产生生物质的方法，其包括：使细胞在产生生物质的条件下生长，所述细胞已进行工程改造，以调节(例如增加)编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达。适当地，可以增加含btb/poz nph3结构域的蛋白的活性或表达以增加浓度和/或总尼古丁含量。
352.在一个实施方案中，本发明提供了生产具有尼古丁的改变(例如增加)的浓度和/或总含量的生物质的方法，其包括使已经工程改造以增加至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达的细胞生长，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28中所示的氨基酸序列，或其功能变体或功能片段或直向同源物，或与seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28具有至少80%同一性的序列；或其中所述至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30中所示的核苷酸序列、或seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30的功能变体或功能片段或直向同源物、或与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的核酸序列。
353.可以通过本领域已知的任何方法工程改造细胞以改变至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达。适当地，可以工程改造细胞以表达编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的外源基因。适当地，可以工程改造细胞以过表达编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因。适当地，可以工程改造细胞以降低编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达。
354.适当地，与由未根据本发明进行修饰的可比较细胞产生的生物质相比，生物质可以含有更高的尼古丁浓度和/或总含量。
355.适当地，用于生物质产生的细胞可以是植物细胞，诸如烟草细胞。
356.适当地，用于生物质产生的细胞可以是酵母细胞。
357.在一个实施方案中，细胞(例如酵母细胞)可以进一步进行修饰，以包含增加尼古丁生物碱生物合成的一种或多种序列。适当地，这些一种或多种序列可以并入适合于细胞(例如酵母细胞)转化的核酸构建体内。一种或多种序列可以在细胞(例如酵母细胞)中过表达。序列可以选自下述基因中的一种或多种：mpo(或甲基腐胺氧化酶或mpo1或mpo2)；a622(或异黄酮还原酶样蛋白或异黄酮还原酶同源物(homolog)或异黄酮还原酶样蛋白)；bbl
(或小檗碱桥酶或小檗碱桥酶样或bbe或nbb1)；pmt(或腐胺n-甲基转移酶或腐胺甲基转移酶或s-腺苷-l-甲硫氨酸:腐胺n-甲基转移酶或pmt或pmt1或pmt2或pmt3或pmt4)和qpt(或喹啉酸磷酸核糖基转移酶)。在一个实施方案中，所述序列可以选自下述基因中的一种或多种：bbl、a622、pmt和mpo(mpo1或mpo2)。适合于以这种方式修饰的基因可以在例如通过引用并入本文的us2016032299中得到教导。
358.商业上期望的性状在一个实施方案中，本发明的植物具有修饰的(即增加的或降低的)总生物碱含量，和/或修饰的(即增加的或降低的)一种或多种生物碱含量，而香味特征和/或其他商业上期望的性状至少得到维持。适当地，本发明的植物可以具有降低的总生物碱含量和/或降低的一种或多种生物碱的含量，同时至少维持风味特征和/或其他商业上期望的性状。
359.在一个实施方案中，本发明的植物产生具有与未根据本发明修饰的植物相似等级和/或品质的叶片。
360.在一个实施方案中，本发明的植物具有降低的降烟碱和/或pon和/或新烟碱和/或新烟草碱含量，而植物的风味特征没有显著变化(例如，与未根据本发明修饰的相同植物相比)。
361.在一个实施方案中，本发明的植物具有降低的总生物碱含量，而尼古丁含量没有显著变化(例如，与未根据本发明修饰的相同植物相比)。在一个实施方案中，本发明的植物具有降低的降烟碱和/或pon和/或新烟碱和/或新烟草碱含量，而尼古丁含量没有显著变化(例如，与未根据本发明修饰的相同植物相比)。
362.适当地，根据本发明的植物的尼古丁含量是可比较植物中存在的尼古丁含量的至少85%(例如与未根据本发明修饰的相同植物相比)。适当地，根据本发明的植物的尼古丁含量是可比较植物中存在的尼古丁含量的至少90%。适当地，根据本发明的植物的尼古丁含量是可比较植物中存在的尼古丁含量的至少95%。适当地，根据本发明的植物的尼古丁含量是可比较植物中存在的尼古丁含量的至少98%。适当地，根据本发明的植物的尼古丁含量是可比较植物中存在的尼古丁含量的至少99%。
363.在一个实施方案中，本发明的植物具有降低的tsna前体含量，而没有植物的其他商业上期望的性状中的显著变化(例如降低) (例如，与未根据本发明进行修饰的相同植物相比)。具体而言，与未根据本发明进行修饰的相同植物相比，修饰的植物的产量优选没有减少。
364.因此，在一个实施方案中，本发明的方法和用途涉及降低tsna前体含量，同时维持香味特征和/或其他商业上期望的性状(例如产量)。
365.如本文所用的术语“商业上期望的性状”将包括性状诸如产量、成熟植株高度、可收获的叶片数、平均节长度、腰叶(cutter leaf)长度、腰叶宽度、质量(例如，叶片质量，适当地调制的叶片质量)、非生物(例如干旱)胁迫耐受性、除草剂耐受性和/或生物(例如昆虫、细菌或真菌)胁迫耐受性。
366.例如根据美国农业部(united states department of agriculture)(usda)等级和标准，可以基于调制的叶片的颜色、质地和香气来测量叶片质量。
367.烟草等级基于包括但不限于以下的因素进行评价：叶柄位置、叶片大小、叶片颜色、叶片均匀性和完整性、成熟度、质地、弹性、光泽(与叶片的着色强度和深度以及光亮相
关)、吸湿性(烟草叶片吸收且保留环境水分的能力)和绿色细微差别(green nuance)或特质(cast)。
368.可以使用本领域已知的标准方法，例如，使用由美国农业部农产品营销服务局(agricultural marketing service of the us department of agriculture)公布的官方标准等级(official standard grades)(7 u.s.c.
§
511)，来确定叶片等级。参见，例如，于1990年11月5日生效的白肋烟(burley tobacco)(美国31型和外国93型)的官方标准等级(55 f.r. 40645)；于1989年3月27日生效的烤烟(美国11、12、13、14型和外国92型)的官方标准等级(54 f.r. 7925)；于1965年1月8日生效的宾夕法尼亚阔叶烟(pennsylvania seedleaf tobacco)(美国41型)的官方标准等级(29 f.r. 16854)；于1963年12月8日生效的俄亥俄州雪茄叶烟(ohio cigar-leaf tobacco)(美国42、43和44型)的官方标准等级(28 f.r. 11719和28 f.r. 11926)；于1969年11月20日生效的威斯康星州雪茄内包皮烟(wisconsin cigar-binder tobacco)(美国54和55型)的官方标准等级(34 f.r. 17061)；于1969年11月20日生效的威斯康星州雪茄内包皮烟(美国54和55型)的官方标准等级(34 f.r. 17061)；于1971年4月生效的乔治亚州和佛罗里达州遮阴栽培雪茄外包皮烟(shadegrown cigar-wrapper tobacco)(美国62型)的官方标准等级。usda等级指数值可以根据产业公认的等级指数来确定。参见，例如，bowman等人 (1988) tobacco science, 32:39-40；烟草遗产文献图书馆(legacy tobacco document library)(bates document #523267826-523267833，1988年7月1日，拟议白肋烟等级指数备忘录(memorandum on the proposed burley tobacco grade index))；和miller等人 (1990) tobacco intern., 192:55-57(所有前述参考文献都以其整体引入本文)。
369.在一个方面，usda等级指数是接收的联邦等级的0-100数值表示，并且是所有柄位置的加权平均值。较高的等级指数指示较高的质量。或者，可以经由超光谱成像(hyper-spectral imaging)来确定叶片等级。参见，例如，wo 2011/027315(其通过引用并入本文)。
370.在一个实施方案中，本发明的烟草植物提供了商业上可接受等级的烟草。
371.适当地，本发明的烟草植物提供了商业上可接受等级的调制的烟草。
372.在一个实施方案中，当在相似的生长条件下生长时，本发明的烟草植物能够产生具有可比较植物叶片的usda等级指数值的至少约70%的usda等级指数值的叶片。适当地，当在相似的生长条件下生长时，本文公开的烟草植物可能能够产生具有对照植物的usda等级指数值的至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约98%的usda等级指数值的叶片。适当地，本文公开的烟草植物可能能够产生具有可比较植物的usda等级指数值的65%至130%、70%至130%、75%至130%、80%至130%、85%至130%、90%至130%、95%至130%、100%至130%、105%至130%、110%至130%、115%至130%或120%至130%的usda等级指数值的叶片。
373.在一个方面，本发明的烟草植物能够产生具有至少50的usda等级指数值的叶片。适当地，本文公开的烟草植物可能能够产生具有55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高以及95或更高的usda等级指数值的叶片。
374.除非另有说明，否则本文使用的烟草产量是指调制的叶片产量，其遵循标准农学和调制实践，在标准的田间条件下，基于每英亩的调制的烟草叶片重量进行计算。
375.在一个方面，当在相似的田间条件下生长时，本发明的植物(例如烟草植物)具有
的产量为可比较植物的产量的50%至150%、55%至145%、60%至140%、65%至135%、70%至130%、75%至125%、80%至120%、85%至115%、90%至110%、95%至105%、50%至100%、55%至100%、60%至100%、65%至100%、70%至100%、75%至100%、80%至100%、85%至100%、90%至100%、95%至100%、100%至150%、105%至150%、110%至150%、115%至150%、120%至150%、125%至150%、130%至150%、135%至150%、140%至150%或145%至150%。
376.在另一个方面，当在相似的田间条件下生长时，本发明的植物(例如烟草植物)的产量是可比较植物的产量的大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0倍。
377.在另一个方面，当在相似的田间条件下生长时，本发明的烟草植物的产量与烟道烘烤的可比较植物的产量是可比较的。
378.在一个方面，本发明的烟草植物提供了选自以下的产量：约1200至3500、1300至3400、1400至3300、1500至3200、1600至3100、1700至3000、1800至2900、1900至2800、2000至2700、2100至2600、2200至2500以及2300至2400磅/英亩。
379.在另一个方面，本发明的烟草植物提供了选自以下的产量：约1200至3500、1300至3500、1400至3500、1500至3500、1600至3500、1700至3500、1800至3500、1900至3500、2000至3500、2100至3500、2200至3500、2300至3500、2400至3500、2500至3500、2600至3500、2700至3500、2800至3500、2900至3500、3000至3500以及3100至3500磅/英亩。
380.在进一步的方面，本发明的烟草植物提供了选自以下的产量：约1200至3500、1200至3400、1200至3300、1200至3200、1200至3100、1200至3000、1200至2900、1200至2800、1200至2700、1200至2600、1200至2500、1200至2400、1200至2300、1200至2200、1200至2100、1200至2000、1200至1900、1200至1800、1200至1700、1200至1600、1200至1500以及1200至1400磅/英亩。
381.植物育种在一个实施方案中，本发明提供了产生具有修饰的生物碱含量和/或修饰的烟草特异性亚硝胺(tsna)前体含量的植物的方法，其包括：a. 使供体植物与受体烟草植物杂交，所述供体植物具有修饰的尼古丁含量和/或修饰的烟草特异性亚硝胺(tsna)前体含量，并且其中至少一种编码根据本发明的含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达已根据本发明在供体植物中进行调节，所述受体烟草植物不具有修饰的尼古丁含量或修饰的烟草特异性亚硝胺(tsna)前体含量，并且具有商业上期望的性状；b. 从与所述受体植物杂交的所述供体植物的后代中分离遗传物质；和c. 用分子标记物进行分子标记物辅助的选择，其包括：i.鉴定在编码a中定义的蛋白的多核苷酸序列中包含突变的基因渗入的区域。
382.适当地，当与可比较植物相比较时，蛋白的活性或表达在供体植物中被调节，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28中所示的氨基酸序列、或者其功能变体或功能片段或直向同源物、或者与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的序列；或所述蛋白由以下编码：如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30中所示的核苷酸序列、或者seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30的功能变
体或功能片段或直向同源物、或者与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的核酸序列。
383.分子标记物辅助的选择可以包括进行pcr，以鉴定包含突变的基因渗入的核酸序列，所述突变调节蛋白的活性或表达，所述蛋白包含如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
384.植物在一个实施方案中，本发明涉及调节(例如降低)植物或其部分或植物细胞中的生物碱含量的方法。
385.根据本发明的合适植物包括茄科植物，其包括例如曼陀罗草、茄子、曼德拉草、致命性茄属植物(颠茄)、辣椒属(红辣椒、辣椒)、土豆和烟草。
386.在一个实施方案中，茄科的合适属是烟草属(nicotiana)，例如烟草或黄花烟草(nicotiana rustica)。
387.烟草属的合适物种可以是烟草。烟草属的物种在本文中可以被称为烟草植物，或简单地烟草。
388.烟草植物本发明提供了针对植物(例如烟草植物)的方法、用途以及细胞(例如烟草细胞)、植物(例如烟草植物)和植物繁殖材料。
389.如本文所用的术语“烟草植物”是指在烟草工业产品的生产中使用的烟草属中的植物。合适的“烟草”植物的非限制性实例包括烟草和黄花烟草(例如，烟草(n. tabacum l.)、la b21、ln ky171、tl 1406、basma、galpao、perique、beinhart 1000-1和petico)。
390.在一个方面，根据本发明的烟草植物是非天然存在的烟草植物。适当地，所述烟草植物可以是突变的、非天然存在的烟草植物。适当地，所述烟草植物可以是转基因烟草植物。
391.在一个方面，根据本发明的烟草植物包含非天然存在的突变，其调节(例如降低)至少一种如本文所定义的含btb/poz nph3结构域的蛋白的活性或表达。适当地，所述烟草植物可以包含已引入的突变。
392.烟草材料可以衍生自或得自烟草类型的变种，通常称为白肋烟变种、烤烟(flue)或亮色(bright)变种和深色(dark)变种。在一些实施方案中，烟草材料衍生自白肋烟、弗吉尼亚(virginia)或深色烟草植物。烟草植物可以选自白肋烟草、稀有烟草、特产烟草(speciality tobacco)、膨胀烟草等等。
393.适当地，所述植物可能不是本氏烟草(nicotiana benthamiana)。
394.本文还考虑了烟草栽培种和原种(elite)烟草栽培种的使用。因此，用于本文的烟草植物可以是烟草变种或原种烟草栽培种。特别有用的烟草变种包括烤烟弗吉尼亚型、白肋烟型和东方型(oriental type)。
395.在一些实施方案中，烟草植物可以例如选自下述变种中的一种或多种：l. 栽培种t.i. 1068、aa 37-1、b 13p、xanthi(mitchell-mor)、kt d#3杂种(hybrid)107、bel-w3、79-615、samsun holmes nn、来自杂交bu21 x hoja parado的f4、品系97、ktrdc#2杂种49、ktrdc#4杂种1 10、burley 21、pm016、ktrdc#5 ky 160 si、ktrdc#7 fca、ktrdc#6 tn 86 si、pm021、k 149、k 326、k 346、k 358、k 394、k 399、k 730、ky 10、ky 14、ky 160、ky 17、
ky 8959、ky 9、ky 907、md 609、mcnair 373、nc 2000、pg 01、pg 04、p01、p02、p03、rg 11、rg 17、rg 8、speight g-28、tn 86、tn 90、va 509、as44、banket a1、basma drama b84/31、basma i zichna zp4/b、basma xanthi bx 2a、batek、besuki jember、c104、coker 319、coker 347、criollo misionero、pm092、delcrest、djebel 81、dvh 405、galpao comum、hb04p、hicks broadleaf、kabakulak elassona、pm102、kutsage e1、ky 14 x l8、ky 171、la bu 21、mcnair 944、nc 2326、nc 71、nc 297、nc 3、pvh 03、pvh 09、pvh 19、pvh 21 10、red russian、samsun、saplak、simmaba、talgar 28、pm132、wislica、yayaldag、nc 4、tr madole、prilep hc-72、prilep p23、prilep pb 156/1、prilep p12-2/1、yaka jk-48、yaka jb 125/3、ti-1068、kdh-960、ti-1070、tw136、pm204、pm205、basma、tkf 4028、l8、tkf 2002、tn 90、gr141、basma xanthi、gr149、gr153和petit havana。
396.变种或栽培种的非限制性实例是：bd 64、cc 101、cc 200、cc 27、cc 301、cc 400、cc 500、cc 600、cc 700、cc 800、cc 900、coker 176、coker 319、coker 371 gold、coker 48、cd 263、df91 1、dt 538 lc、galpao烟草、gl 26h、gl 350、gl 600、gl 737、gl 939、gl 973、hb 04p、hb 04p lc、hb3307plc、杂种403lc、杂种404lc、杂种501 lc、k 149、k 326、k 346、k 358、k394、k 399、k 730、kdh 959、kt 200、kt204lc、ky10、ky14、ky 160、ky 17、ky 171 、ky 907、ky907lc、kty14xl8 lc、little crittenden、mcnair 373、mcnair 944、msky 14xl8、narrow leaf madole、narrow leaf madole lc、nbh 98、n-126、n-777lc、n-7371 lc、nc 100、nc 102、nc 2000、nc 291、nc 297、nc 299、nc 3、nc 4、nc 5、nc 6、nc7、nc 606、nc 71、nc 72、nc 810、nc bh 129、nc 2002、neal smith madole、oxford 207、pd 7302 lc、pd 7309 lc、pd 7312 lc 'periq'e'烟草、pvh03、pvh09、pvh19、pvh50、pvh51、r 610、r 630、r 7-1 1、r 7-12、rg 17、rg 81、rg h51、rgh 4、rgh 51、rs 1410、speight 168、speight 172、speight 179、speight 210、speight 220、speight 225、speight 227、speight 234、speight g-28、speight g-70、speight h-6、speight h20、speight nf3、tl 1406、tl 1269、tn 86、tn86lc、tn 90、tn 97、tn97lc、tn d94、tn d950、tr(tom rosson)madole、va 309、va359、aa 37-1、b 13p、xanthi(mitchell-mor)、bel-w3、79-615、samsun holmes nn、ktrdc 2号杂种49、burley 21、ky 8959、ky 9、md 609、pg 01、pg 04、p01、p02、p03、rg 1 1、rg 8、va 509、as44、banket a1、basma drama b84/31、basma i zichna zp4/b、basma xanthi bx 2a、batek、besuki jember、c104、coker 347、criollo misionero、delcrest、djebel 81、dvh 405、galpao comum、hb04p、hicks broadleaf、kabakulak elassona、kutsage e1、la bu 21、nc 2326、nc 297、pvh 21 10、red russian、samsun、saplak、simmaba、talgar 28、wislica、yayaldag、prilep hc-72、prilep p23、prilep pb 156/1、prilep p12-2/1、yaka jk-48、yaka jb 125/3、ti-1068、kdh-960、tl-1070、tw136、basma、tkf 4028、l8、tkf 2002、gr141、basma xanthi、gr149、gr153、petit havana。即使本文并未具体确定，还考虑了上述的低转化子亚变种(low converter subvarieties)。
397.烟草植物可以是白肋烟、烤烟弗吉尼亚或东方。
398.在一个实施方案中，植物繁殖材料可以是从本发明的植物(例如烟草植物)可获得的。
399.如本文所用的“植物繁殖材料”是指取自植物的任何植物物质，可以由其产生进一步的植物。适当地，植物繁殖材料可以选自种子、植物愈伤组织和植物块。适当地，植物繁殖
材料可以是种子。适当地，植物繁殖材料可以是植物愈伤组织。适当地，植物繁殖材料可以是植物块。
400.在一个实施方案中，细胞(例如烟草细胞)、烟草植物和/或植物繁殖材料可以是通过根据本发明的方法可获得的(例如获得的)。
401.适当地，当与未修饰的烟草植物相比较时，根据本发明的烟草植物可以具有调节的(例如降低的)尼古丁含量，其中所述烟草植物已进行修饰，以调节(例如降低)至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达。
402.适当地，当与未修饰的烟草植物相比较时，根据本发明的烟草植物可以具有调节的(例如减少的)烟草特异性亚硝胺(tsna)前体含量，其中所述烟草植物已进行修饰，以调节(例如增加)至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达。
403.在一个实施方案中，根据本发明的烟草植物包含本发明的烟草细胞。
404.在另一个实施方案中，植物繁殖材料可以是从本发明的烟草植物可获得的(例如获得的)。
405.在一个实施方案中，提供了如本文所述的烟草植物育种烟草植物的用途。
406.在另一个实施方案中，本发明还提供了前述实施方案的烟草植物用于生产烟草工业产品的用途。
407.在另一个实施方案中，提供了本发明的烟草植物种植作物的用途。
408.在一个实施方案中，提供了具有至少一种编码btb/poz nph3蛋白的基因的调节的活性或表达的细胞，诸如植物细胞，诸如烟草植物细胞。适当地，所述细胞可以是非天然存在的细胞。适当地，所述细胞可以是突变细胞。适当地，所述细胞可以是非天然存在的突变细胞。例如，所述细胞可以包含非天然存在的突变，其调节(例如降低)至少一种编码btb/poz nph3蛋白的基因的活性或表达。
409.在一个实施方案中，提供了如在前述实施方案中提供的细胞用于生产烟草工业产品的用途。
410.在一个实施方案中，本发明提供了细胞培养物(例如体外培养物)。
411.所述烟草细胞培养物可以是细胞悬浮培养物。可以将这些体外培养的细胞并入烟草工业产品内，例如作为常规烟草颗粒、烟丝(shreds)、细切或长切烟草薄片的取代物，作为添加物成分，或者既作为取代物又作为添加物。适当地，细胞培养物可以产生尼古丁。
412.在一个实施方案中，提供了细胞培养物，例如根据本发明的收获的和/或加工的细胞或细胞培养物用于生产烟草工业产品的用途。
413.从体外培养物中收获的烟草细胞可以进行干燥，例如冷冻干燥，例如以产生粉末。
414.在一个实施方案中，所述细胞培养物是烟草细胞培养物。技术人员将知道用于确立烟草细胞的体外培养物的已知方法。仅举例来说，可以使用下述方法：收集来自目标烟草植物的种子，并且对其外部进行灭菌以消除不想要的生物，种植所述种子以生长目标烟草植物，从烟草植物中(例如，从烟草茎中)取出组织供用作外植体，从烟草外植体确立愈伤组织培养物，从愈伤组织培养物确立细胞悬浮培养物，并且收获培养材料(例如包括烟草细胞)以产生烟草细胞培养物。
415.烟草细胞可以通过各种方法进行收获，所述方法包括过滤，例如真空过滤。可以通过添加水在滤器中洗涤样品，并且用过滤例如真空过滤去除剩余的液体。
416.收获的烟草细胞培养物可以进一步进行加工，例如干燥，诸如风干和/或冷冻干燥。可以将收获的烟草细胞培养物或干燥的收获的烟草细胞培养物或其提取物并入根据本发明的烟草工业产品内。
417.在一个实施方案中，本发明提供了用于分子种植的植物(例如烟草植物)或其部分。适当地，根据本发明修饰的植物或其部分可以用于制造蛋白，诸如治疗剂，例如抗生素、病毒样颗粒、营养药或小分子。
418.在一个实施方案中，本发明提供了用于生产蛋白(例如治疗用蛋白)的方法，所述方法包括通过调节至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来修饰能够产生所述蛋白(例如治疗用蛋白)的植物或其部分，所述含btb/poz nph3结构域的蛋白具有如seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28中所示的氨基酸序列、或者其功能变体或功能片段或直向同源物、或者与seq id no. 1、4、7、10、13、16、19、22、25或28具有至少80%同一性的序列；或者其中至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包含如seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30中所示的核苷酸序列、或者seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30的功能变体或功能片段或直向同源物、或者与seq id no. 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29或30具有至少80%同一性的核酸序列；并且在足以允许产生所述蛋白(例如治疗用蛋白)的条件下培养植物。
419.产品本发明还提供了可获得自或得自根据本发明的植物的产品。提供了从其中编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达已进行调节的植物可获得或获得的产品。
420.在一个实施方案中，产品可以包含本发明的构建体，其调节至少一种编码如本文所定义的含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达。在一个实施方案中，产品可以包含本发明的构建体，其修饰至少一种编码如本文所定义的含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的核酸序列。
421.本发明还提供了可获得自或得自根据本发明的烟草的产品。
422.在一个实施方案中，提供了本发明的烟草植物生产烟草叶片的用途。
423.适当地，烟草叶片可以经受下游应用，诸如加工。
424.因此，在一个实施方案中，前述实施方案的使用可以提供加工烟草叶片。适当地，烟草叶片可以经受调制、发酵、巴氏灭菌或其组合。在另一个实施方案中，烟草叶片可以被切割。在一些实施方案中，烟草叶片可以在经受调制、发酵、巴氏灭菌或其组合之前或之后被切割。
425.在一个实施方案中，本发明提供了本发明的烟草植物的收获的叶片。
426.在进一步的实施方案中，收获的叶片可以是从由本发明的繁殖材料繁殖的烟草植物可获得的(例如获得的)。
427.在另一个实施方案中，提供了可获得自本发明的方法或用途的收获的叶片。
428.适当地，收获的叶片可以是切割的收获的叶片。
429.在一些实施方案中，收获的叶片可以包含活的烟草细胞。在其他实施方案中，收获的叶片可以经受进一步加工。
430.还提供了加工烟草叶片。
431.加工烟草叶片可以是从本发明的烟草植物可获得的。适当地，加工烟草叶片可以是从根据本发明的任何方法和/或用途获得的烟草植物可获得的。
432.适当地，加工的叶片可以包含降低含量的一种或多种选自nnk、nnn、nat和nab的tsna。优选地，nnk的含量降低。适当地，tsna含量相对于未根据本发明修饰的可比较产品降低。
433.在另一个实施方案中，加工烟草叶片可以是从由根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物可获得的。
434.本发明的加工烟草叶片可以是通过加工本发明的收获的叶片可获得的。
435.如本文所用的术语“加工烟草叶片”是指已经历本领域中烟草经受的一个或多个加工步骤的烟草叶片。“加工烟草叶片”不包含或基本上不包含活细胞。
436.术语“活细胞”是指能够生长和/或具有代谢活性的细胞。因此，如果细胞被说成不是活的，也被称为“非存活的”，则细胞不展示活细胞的特征。
437.术语“基本上无活细胞”意指全部细胞的小于约5%是活的。全部细胞的优选小于约3%，更优选小于约1%，甚至更优选小于约0.1%是活的。
438.在一个实施方案中，加工烟草叶片可以通过以下中的一种或多种进行加工：调制、发酵和/或巴氏灭菌。
439.适当地，加工烟草叶片可以通过调制进行加工。
440.烟草叶片可以通过本领域已知的任何方法进行调制。在一个实施方案中，烟草叶片可以通过选自以下的一种或多种调制方法进行调制：晾制、明火烘烤、烟道烘烤和晒制。
441.适当地，烟草叶片可以被晾制。
442.通常，晾制通过将烟草叶片悬挂在通风良好的烤房中并允许干燥来实现。这通常在四至八周的时间段期间进行。晾制尤其适合于白肋烟。
443.适当地，烟草叶片可以被明火烘烤。明火烘烤通常通过将烟草叶片悬挂在大型烤房中来实现，在所述大型烤房中，让硬木火一直连续或间歇低闷烧着，并且取决于工艺和烟草，通常需要三天至十周。
444.在另一个实施方案中，烟草叶片可以被烟道烘烤。烟道烘烤可以包括将烟草叶片串到烟草杆上，并且将它们挂在调制烤房中的挂烟杆(tier-poles)上。烤房通常具有以外部供应的火箱运行的烟道。通常，这导致在不暴露于烟的情况下已进行热调制的烟草。通常，温度在调制的过程期间缓慢升高，而整个过程需要大约1周。
445.适当地，烟草叶片可以被晒制。这种方法通常包括将无覆盖物的烟草暴露于太阳。
446.适当地，加工烟草叶片可以通过发酵进行加工。
447.发酵可以以本领域已知的任何方式进行。通常，在发酵过程中，将烟草叶片堆成覆盖在例如麻袋中的调制的烟草垛(堆)以保留水分。叶片内部的剩余水与烟草重量的组合生成了使烟草成熟的天然热量。每天监控堆中心的温度。在一些方法中，每周将整个堆打开。然后取出叶片以摇动且润湿，并且将堆旋转，使得内部叶片到外面且底部叶片置于堆的顶部。这确保了整个堆的均匀发酵。叶片上的额外水分加上叶片本身的实际旋转生成热量，从而释放烟草的天然氨并减少尼古丁，同时也加深了颜色并改善了烟草的香气。通常，发酵过程延续最多到6个月，这取决于烟草的变种、叶片上的柄位置、叶片的厚度和预期用途。
448.适当地，加工烟草叶片可以通过巴氏灭菌进行加工。当烟草叶片将用于制备无烟
烟草工业产品、最优选口含烟(snus)时，巴氏灭菌可以是特别优选的。
449.烟草叶片巴氏灭菌法可以通过本领域已知的任何方法来进行。例如，巴氏灭菌法可以如j foulds，l ramstrom，m burke，k fagerstrom. effect of smokeless tobacco(snus)on smoking and public health in sweden. tobacco control(2003)12: 349
–
359 (其教导通过引用并入本文)中详述的进行。
450.在口含烟生产过程中，巴氏灭菌法通常通过其中用蒸气将烟草热处理24-36小时(达到大约100℃的温度)的工艺来进行。这导致几乎无菌的产物，并且不希望受理论的束缚，这样的后果之一被认为是限制进一步的tsna形成。
451.在一个实施方案中，巴氏灭菌法可以是蒸气巴氏灭菌法。
452.在一些实施方案中，加工烟草叶片可以被切割。加工烟草叶片可以在加工之前或之后被切割。适当地，加工烟草叶片可以在加工之后被切割。
453.在一个实施方案中，前述实施方案的使用可以提供再造的烟草。
454.在一个实施方案中，提供了再造的烟草。
455.如本文所用的“再造的”也可以被称为重构(recon)、再循环或均质的薄片烟草，并且指由加工后的烟草叶片残余物生成的烟草材料。再造的烟草允许生产一致、高质量的掺合物，并且允许调整各种组分的比率。
456.再造的烟草可以是纳米纤维(nano fibre)重构(纳米纤维可以以固体或液体形式提取)，造纸重构(其使用茎、碎屑和中脉(midrib)等作为原材料)，或浆液型重构(其使用磨成粉末，与水和植物粘合剂混合的细粉材料和烟草茎的混合物；通过提取水使可溶性残余物形成薄片)。
457.本领域中已知的任何方法都可以用于制备再造的烟草，例如，参见coresta congress，sapporo，2012，smoke science/product technology groups，sspt 12(通过引用并入本文)。
458.在一些实施方案中，烟草植物、烟草植物的收获的叶片和/或加工烟草叶片可以用于提取尼古丁。尼古丁的提取可以使用本领域已知的任何方法来实现。例如，用于从烟草中提取尼古丁的方法在通过引用并入本文的us 2,162,738中得到教导。
459.在一个方面，本发明提供了由根据本发明的烟草植物或其部分制成的调制的烟草材料。
460.适当地，调制的烟草可以包含降低含量的一种或多种选自nnk、nnn、nat和nab的tsna。优选地，nnk的含量降低。适当地，tsna含量相对于未根据本发明修饰的可比较产品降低。
461.在另一个方面，本发明提供了烟草掺合物，其包含由根据本发明的烟草植物或其部分、或者根据本发明的烟草细胞培养物制成的烟草材料。在一个方面，本发明提供了烟草掺合物，其包含根据本发明的调制的烟草材料。
462.适当地，根据本发明的烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约10%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约20%的烟草。适当地，烟
草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约30%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约40%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约50%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约60%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约70%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约80%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的大约90%的烟草。
463.在一个方面，本发明的烟草掺合物产品包含按干重计至少约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或95百分比的烟草，所述烟草由根据本发明的烟草植物或其部分或者根据本发明的烟草细胞培养物调制。
464.适当地，调制的烟草材料可以被晾制。适当地，调制的烟草材料可以被烟道烘烤。适当地，调制的烟草材料可以被晒制。适当地，调制的烟草材料可以被明火烘烤。
465.根据本发明的烟草工业产品或吸烟制品可以包含根据本发明的烟草材料(例如，调制的烟草材料或再造的烟草材料)。
466.在另一个方面，本发明提供了烟草工业产品。
467.在一个实施方案中，根据本发明的烟草工业产品可以是掺合的烟草工业产品。适当地，烟草掺合物可以包含根据本发明的调制的烟草材料。
468.在一个实施方案中，烟草工业产品可以从本发明的烟草植物或其部分制备。
469.适当地，烟草植物或其部分可以由根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖。
470.如本文在烟草植物的上下文中使用的术语“其部分”是指烟草植物的一部分。适当地，“其部分”可以是烟草植物的叶、根或茎或花。适当地，“其部分”可以是烟草植物的叶、根或茎。
471.递送系统如本文所用，术语“递送系统”旨在涵盖向用户递送至少一种物质的系统，并且包括：可燃气雾剂供应系统，诸如香烟、小雪茄和雪茄和烟草，其用于烟斗或自卷烟或自制香烟(无论是基于烟草、烟草衍生物、膨胀烟草、再造烟草、烟草替代品还是其他可吸烟材料)；非可燃气雾剂供应系统，其从气雾剂生成材料释放化合物，而不燃烧气雾剂生成材料，诸如电子烟、烟草加热产品以及使用气雾剂生成材料的组合生成气雾剂的混杂系统；和无气雾剂递送系统，其将至少一种物质经口、经鼻、经皮或以其他方式递送至用户而不形成气雾剂，包括但不限于锭剂、口胶、贴剂、包含可吸入粉末的制品和口腔产品，诸如作为包括口含烟或湿鼻烟的口腔烟草，其中至少一种物质可以包含或可以不包含尼古丁。
472.根据本公开，“可燃”气雾剂供应系统是这样的一种系统，其中气雾剂供应系统(或其组件)的组成气雾剂生成材料在使用期间燃着或燃烧以促进将至少一种物质递送至用
户。
473.在一些实施方案中，所述递送系统是可燃气雾剂供应系统，诸如选自香烟、小雪茄和雪茄的系统。
474.在一些实施方案中，本公开涉及用于可燃气雾剂供应系统中的组件，诸如过滤嘴，过滤嘴条(filter rod)、过滤嘴条段(filter rod segment)、烟草条、塞子、气雾剂改性剂释放组件，诸如胶囊、线、珠或纸，诸如成型纸(plug wrap)、接装纸或香烟纸。
475.根据本公开，“非可燃”气雾剂供应系统是这样的一种系统，其中气雾剂供应系统(或其组件)的组成气雾剂生成材料不燃着或燃烧以促进将至少一种物质递送至用户。
476.在一些实施方案中，所述递送系统是非可燃气雾剂供应系统，诸如动力非可燃气雾剂供应系统。
477.在一些实施方案中，所述非可燃气雾剂供应系统是电子烟，也称为蒸汽烟设备或电子尼古丁递送系统(end)，尽管应注意，不要求气雾剂生成材料中存在尼古丁。
478.在一些实施方案中，所述非可燃气雾剂供应系统是气雾剂生成材料加热系统，也称为热不燃烧系统。这种系统的一个实例是烟草加热系统。
479.在一些实施方案中，所述非可燃气雾剂供应系统是混杂系统以使用气雾剂生成材料的组合(其中一种或多种可以被加热)来生成气雾剂。气雾剂生成材料中的每一种可以呈例如固体、液体或凝胶的形式并且可以含有或可以不含尼古丁。在一些实施方案中，所述混杂系统包含液体或凝胶气雾剂生成材料和固体气雾剂生成材料。固体气雾剂生成材料可以包括例如烟草或非烟草产品。
480.通常，所述非可燃气雾剂供应系统可以包括非可燃气雾剂供应设备和与所述非可燃气雾剂供应设备一起使用的消耗品。
481.在一些实施方案中，本公开涉及包含气雾剂生成材料并被配置为与非可燃气雾剂供应装置一起使用的消耗品。这些消耗品有时在整个公开内容中被称为制品。
482.在一些实施方案中，所述非可燃气雾剂供应系统，诸如其非可燃气雾剂供应设备，可以包括动力源和控制器。例如，动力源可以是电源或放热电源。在一些实施方案中，所述放热电源包括碳基底，其可以被通电以便以热的形式将能量分配给气雾剂生成材料或靠近放热电源的传热材料。
483.在一些实施方案中，所述非可燃气雾剂供应系统可以包括用于接收消耗品的区域、气雾剂生成器、气雾剂生成区域、外壳、烟嘴、过滤嘴和/或气雾剂改性剂。
484.在一些实施方案中，用于与非可燃气雾剂供应装置一起使用的消耗品可包括气雾剂生成材料、气雾剂生成材料储存区、气雾剂生成材料转移组件、气雾剂生成器、气雾剂生成区、外壳、包裹物、过滤嘴、烟嘴和/或气雾剂改性剂。
485.适当地，所述递送系统可以由根据本发明的烟草植物或其部分制备(例如可以包含根据本发明的烟草植物或其部分)。
486.适当地，所述递送系统可以由根据本发明的烟草细胞培养物制备。
487.适当地，所述递送系统可以由从根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分制备(例如可以包含从根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分)。
488.适当地，所述递送系统可以由根据本发明的烟草植物的收获叶片制备(例如可以
包含根据本发明的烟草植物的收获叶片)。
489.适当地，所述递送系统可以由根据本发明的加工烟叶制备(例如可以包含根据本发明的加工烟叶)。
490.适当地，所述递送系统可以由根据本发明的调制烟草材料制备(例如可以包含根据本发明的调制烟草材料)。
491.适当地，所述递送系统可以由根据本发明的烟草掺合物制备(例如可以包含根据本发明的烟草掺合物)。
492.在一个实施方案中，所述递送系统是选自香烟、小雪茄和雪茄的可燃吸烟制品。
493.在一个实施方案中，所述递送系统包含可燃吸烟制品的一种或多种组件，诸如过滤嘴，过滤嘴条(filter rod)，过滤嘴条段(filter rod segment)，烟草，烟草条，烟草条段，塞子(spill)、添加剂释放组件诸如胶囊，线，珠，纸诸如成型纸(plug wrap)，接装纸或香烟纸。
494.在一个实施方案中，所述递送系统是非可燃气雾剂供应系统。
495.在一个实施方案中，所述递送系统包含非可燃气雾剂供应系统的一种或多种组件，诸如加热器和可气雾化基质。
496.在一个实施方案中，气雾剂供应系统是电子香烟，也称为蒸汽烟设备(vaping device)。
497.在一个实施方案中，电子香烟包括加热器、能够向加热器供电的电源、可气雾化基质诸如液体或凝胶、壳以及任选的烟嘴。
498.在一个实施方案中，所述可气雾化基质被容纳在基质容器中。在一个实施方案中，基质容器与加热器结合或包括加热器。
499.在一个实施方案中，所述递送系统是加热产品，其通过加热而不是燃烧基质材料而释放一种或多种化合物。基质材料是可气雾化材料，其可以是例如烟草或其他非递送系统，其可以含有或可以不含有尼古丁。在一个实施方案中，加热产品是烟草加热产品。
500.在一个实施方案中，加热产品是电子设备。
501.在一个实施方案中，烟草加热产品包括加热器、能够向加热器供电的电源、可气雾化基质诸如固体或凝胶材料。
502.在一个实施方案中，加热产品是非电子制品。
503.在一个实施方案中，加热产品包括可气雾化基质诸如固体或凝胶材料和热源，所述热源能够在没有任何电子工具的情况下向可气雾化基质供应热能，诸如通过燃烧诸如炭的燃烧材料。
504.在一个实施方案中，加热产品还包括能够过滤通过加热可气雾化基质而生成的气雾剂的过滤嘴。
505.在一些实施方案中，可气雾化基质材料可以包含蒸气或气雾剂生成剂或湿润剂，诸如甘油、丙二醇、三乙酸甘油酯或二甘醇。
506.在一个实施方案中，所述递送系统是混杂系统，以通过加热而不燃烧基质材料的组合来生成气雾剂。基质材料可以包括例如固体、液体或凝胶，其可以含有或可以不含有尼古丁。在一个实施方案中，混杂系统包括液体或凝胶基质和固体基质。固体基质可以是例如烟草或其他非递送系统，其可以含有或可以不含有尼古丁。在一个实施方案中，混杂系统包
括液体或凝胶基质和烟草。
507.在另一个实施方案中，所述产品可以包含本发明的构建体，其在植物(例如烟草植物)中表达时调节至少一种含btb/poz nph3结构域的蛋白的活性或表达，且由此降低生物碱含量。
508.烟草工业产品如本文所用，术语“烟草工业产品”意图包括可燃吸烟制品，诸如香烟，小雪茄，雪茄烟，用于烟斗或手卷烟的烟草(无论是基于烟草、烟草衍生物、膨胀烟草、再造的烟草、烟草取代物还是其他可抽吸材料)，非可燃气雾剂供应系统，诸如无需燃烧而从基质材料释放化合物的加热产品，诸如电子香烟，烟草加热产品，以及从基质材料的组合生成气雾剂的混杂系统，例如含有液体或凝胶或固体基质的混杂系统，以及在这些气雾剂供应系统内使用的可气雾化基质材料；以及无气雾剂的递送制品，诸如锭剂，口香糖，贴剂，包含可以吸入的粉末的制品，以及无烟烟草工业产品诸如口含烟和鼻烟，所述无气雾剂的递送制品可以递送或可以不递送尼古丁。
509.在一个实施方案中，烟草工业产品可以由本发明的烟草植物或其部分制备(例如可以包含本发明的烟草植物或其部分)。
510.适当地，烟草植物或其部分可以由根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖。
511.如本文在烟草植物的上下文中使用的，术语“其部分”是指烟草植物的一部分。优选地，“其部分”是烟草植物的叶片。
512.在另一个实施方案中，烟草工业产品可以由本发明的收获的叶片制备。
513.在进一步的实施方案中，烟草工业产品可以由本发明的加工烟草叶片制备。
514.适当地，烟草工业产品可以由通过以下中的一种或多种进行加工的烟草叶片制备：调制、发酵和/或巴氏灭菌。
515.适当地，烟草工业产品可以包含切割的烟草叶片，任选地按照前述实施方案进行加工。
516.在另一个实施方案中，烟草工业产品可以由根据本发明的烟草细胞或细胞培养物制备。
517.在另一个实施方案中，烟草工业产品可以由根据本发明的调制的烟草材料制备(例如可以包含根据本发明的调制的烟草材料)。
518.在另一个实施方案中，烟草工业产品可以由根据本发明的烟草掺合物制备(例如可以包含根据本发明的烟草掺合物)。
519.在一个实施方案中，烟草工业产品可以是吸烟制品。
520.如本文所用，术语“吸烟制品”可以包括可抽吸产品，诸如卷烟、香烟、雪茄和小雪茄，无论是基于烟草、烟草衍生物、膨胀烟草、再造的烟草还是烟草取代物。
521.在另一个实施方案中，烟草工业产品可以是无烟烟草工业产品。
522.如本文所用的术语“无烟烟草工业产品
”ꢀ
是指并不意图抽吸和/或经受燃烧的烟草工业产品。
523.无烟烟草工业产品(包括加热不燃烧(heat-not-burn)的材料)可以含有沉积在其他成分上、在其他成分中混合、由其他成分包围、或与其他成分组合的任何形式(包括干燥颗粒、烟丝、颗粒、粉末或浆液)的烟草，所述其他成分采取任何形式，诸如薄片、薄膜、接片
(tabs)、泡沫或珠。
524.在一个实施方案中，无烟烟草工业产品可以包括口含烟、鼻烟、嚼烟等等。
525.在一个实施方案中，烟草工业产品是选自香烟、小雪茄和雪茄的可燃吸烟制品。
526.在一个实施方案中，烟草工业产品包含可燃吸烟制品的一种或多种组件，诸如过滤嘴，过滤嘴条(filter rod)，过滤嘴条段(filter rod segment)，烟草，烟草条，烟草条段，塞子(spill)、添加物释放组件诸如胶囊，线，珠，纸诸如成型纸(plug wrap)，接装纸或卷烟纸。
527.在一个实施方案中，烟草工业产品是非可燃气雾剂供应系统。
528.在一个实施方案中，烟草工业产品包含非可燃气雾剂供应系统的一种或多种组件，诸如加热器和可气雾化基质。
529.在一个实施方案中，气雾剂供应系统是电子香烟，也称为蒸汽烟设备(vaping device)。
530.在一个实施方案中，电子香烟包括加热器、能够向加热器供电的电源、可气雾化基质诸如液体或凝胶、壳以及任选的接口。
531.在一个实施方案中，可气雾化基质被容纳在基质容器中。在一个实施方案中，基质容器与加热器结合或包括加热器。
532.在一个实施方案中，烟草工业产品是加热产品，其通过加热而不是燃烧基质材料而释放一种或多种化合物。基质材料是可气雾化材料，其可以是例如烟草或其他非烟草产品，其可以含有或可以不含有尼古丁。在一个实施方案中，加热产品是烟草加热产品。
533.在一个实施方案中，加热产品是电子设备。
534.在一个实施方案中，烟草加热产品包括加热器、能够向加热器供电的电源、可气雾化基质诸如固体或凝胶材料。
535.在一个实施方案中，加热产品是非电子制品。
536.在一个实施方案中，加热产品包括可气雾化基质诸如固体或凝胶材料和热源，所述热源能够在没有任何电子工具的情况下向可气雾化基质供应热能，诸如通过燃烧诸如炭的燃烧材料。
537.在一个实施方案中，加热产品还包括能够过滤通过加热可气雾化基质而生成的气雾剂的过滤器。
538.在一些实施方案中，可气雾化基质材料可以包含蒸气或气雾剂生成剂或湿润剂，诸如甘油、丙二醇、三乙酸甘油酯或二甘醇。
539.在一个实施方案中，烟草工业产品是混杂系统，以通过加热而不燃烧基质材料的组合来生成气雾剂。基质材料可以包括例如固体、液体或凝胶，其可以含有或可以不含有尼古丁。在一个实施方案中，混杂系统包括液体或凝胶基质和固体基质。固体基质可以是例如烟草或其他非烟草产品，其可以含有或可以不含有尼古丁。在一个实施方案中，混杂系统包括液体或凝胶基质和烟草。
540.在进一步的实施方案中，烟草工业产品可以是烟草加热设备或混杂设备或电子烟等等。
541.通常在烟草加热设备或混杂设备中，通过将热量从热源传递到物理上分开的气雾剂形成基质或材料来生成气雾剂，所述气雾剂形成基质或材料可以位于热源内、周围或下
游。在吸烟期间，挥发性化合物通过来自热源的热传递而从气雾剂形成基质释放，并且夹带在通过吸烟制品吸进的空气中。随着释放的化合物冷却，它们凝聚以形成被使用者吸入的气雾剂。
542.用于消费或抽吸烟草加热设备的气雾剂生成制品和设备是本领域已知的。它们可以包括例如电加热的气雾剂生成设备，其中通过将热量从气雾剂生成设备的一个或多个电加热元件传递到烟草加热设备的气雾剂形成基质来生成气雾剂。
543.适当地，烟草加热设备可以是气雾剂生成设备。
544.优选地，烟草加热设备可以是加热不燃烧设备。加热不燃烧设备是本领域已知的，并且通过加热而不是燃烧烟草来释放化合物。
545.合适的、加热不燃烧设备的实例可以是通过引用并入本文的wo2013/034459或gb2515502中教导的设备。
546.在一个实施方案中，烟草加热设备的气雾剂形成基质可以是根据本发明的烟草工业产品。
547.在一个实施方案中，烟草加热设备可以是混杂设备。
548.多核苷酸/多肽/构建体在本发明的某些实施方案中，适当地在启动子的指导下，可以将调节至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达的构建体转化入植物细胞内。
549.在本发明的某些实施方案中，在启动子的指导下，降低(即抑制)至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达的构建体可以转化到植物细胞内。例如，遗传构建体可以是基因编辑构建体或可以包含rnai分子，所述rnai分子可以包含小干扰rna(sirna)分子或短发夹环(shrna)分子。
550.在本发明的某些实施方案中，适当地在启动子的指导下，可以将增加编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达的构建体转化到植物细胞内，例如编码含btb/poz nph3结构域的蛋白、诸如内源性含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的构建体。
551.可以借助于合适的载体例如植物转化载体，将构建体引入根据本发明的植物内。植物转化载体可以包含表达盒，其在转录方向5'-3'上包含启动子序列、靶向编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的构建体序列和任选地3'非翻译的终止子序列，包括用于rna聚合酶的终止信号和用于多腺苷酸化酶(polyadenylase)的多腺苷酸化信号。启动子序列可以以一个或多个拷贝存在，并且此类拷贝可以是相同的或是如上所述的启动子序列的变体。终止子序列可以得自植物、细菌或病毒基因。合适的终止子序列是例如豌豆rbcs e9终止子序列，衍生自根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)的胭脂碱合酶基因的nos终止子序列，以及来自花椰菜花叶病毒的35s终止子序列。本领域技术人员将容易地知道其他合适的终止子序列。
552.本发明的构建体还可以包含基因表达增强机制，以增加启动子的强度。这种增强子元件的实例是衍生自豌豆质体蓝素基因的启动子的一部分的增强子元件，并且是通过引用并入本文的国际专利申请号wo 97/20056的主题。合适的增强子元件可以是例如衍生自根癌农杆菌的胭脂碱合酶基因的nos增强子元件，以及来自花椰菜花叶病毒的35s增强子元件。
553.这些调节区可以衍生自与启动子dna序列相同的基因，或者可以衍生自来自烟草
或其他生物，例如来自茄科植物或来自亚科亚香树亚科(cestroideae)的不同基因。所有调节区都应该能够在待转化组织的细胞中起作用。
554.启动子dna序列可以衍生自与目标基因相同的基因，例如启动子将要指导的基因，例如根据本发明的编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因，本发明中使用的编码序列，或者可以衍生自来自烟草或另一种生物，例如来自茄科植物或来自亚科亚香树亚科的不同基因。
555.可以将表达盒并入基础植物转化载体，诸如pbin 19 plus、pbi 101、pkylx71:35s2、pcambia2300或本领域已知的其他合适的植物转化载体内。除表达盒之外，植物转化载体将含有如对于转化过程必需的这种序列。这些可以包括农杆菌属(agrobacterium)vir基因，一个或多个t-dna边界序列(border sequences)，以及选择性标记物或鉴定转基因植物细胞的其他手段。
556.术语“表达载体或植物转化载体”意指能够在体内或体外表达的构建体。优选地，将表达载体并入生物的基因组中。在一个实施方案中，本发明的载体表达蛋白，例如如本文所述的含btb/poz nph3结构域的蛋白。术语“并入”优选包括稳定并入基因组内。
557.用于转化植物的技术是本领域众所周知的，并且包括例如农杆菌属介导的转化。基因修饰植物的构建中的基本原理是在植物基因组中插入遗传信息，以便获得所插入的遗传物质的稳定维持。一般技术的综述可以在通过potrykus(annu rev plant physiol plant mol biol [1991] 42:205-225)和christon(agrofood-industry hi-tech 1994年3月/4月 17-27)的论文(其通过引用并入本文)中找到。
[0558]
通常，在农杆菌属介导的转化中，通过农杆菌属与来自靶植物的外植体的共培养，将携带目标外源dna的双元载体(binary vector)，即根据本发明的构建体，从适当的农杆菌属菌株转移到靶植物。然后在选择培养基上再生转化的植物组织，所述选择培养基包含选择性标记物和植物生长激素。替代方案是浸花法(clough & bent，1998 plant j. 1998年12月；16(6):735-43，其通过引用并入本文)，由此使完整植物的花芽与含有嵌合基因的农杆菌属菌株的悬浮液接触，并且在结实之后，通过在选择培养基上的生长，使转化的个体萌发并进行鉴定。通过农杆菌属直接感染植物组织是简单技术，其已得到广泛采用，并且在butcher等人，(1980)，tissue culture methods for plant pathologists，编辑: d. s. ingrams和j.p. helgeson，203-208中进行描述，所述参考文献通过引用并入本文。
[0559]
进一步的合适转化方法包括例如使用聚乙二醇或电穿孔技术、粒子轰击、显微注射以及碳化硅纤维的使用，将基因直接转移到原生质体内。使用冲击转化(ballistic transformation)和通过碳化硅须晶介导的转化生产能育的转基因玉蜀黍植物来转化植物在frame等人 (1994) the plant journal 6:(6): 941-948(其通过引用并入本文)中得到教导，并且病毒转化技术在例如meyer等人 (1992) mol. gen. genet. 231(3): 345-352(其通过引用并入本文)中得到教导。木薯花叶病毒作为用于植物的载体系统的用途在meyer等人 (1992) gene 110: 213-217(其通过引用并入本文)中得到教导。关于植物转化的进一步教导可以在通过引用并入本文的ep-a-0449375中找到。
[0560]
在进一步的方面，本发明涉及载体系统，其携带构建体，并且将其引入生物诸如植物，适当地烟草植物的基因组内。载体系统可以包含一种载体，但它可以包含两种载体。在两种载体的情况下，载体系统通常被称为双元载体系统。双元载体系统在gynheung等人，
(1980)，binary vectors，plant molecular biology manual a3，1-19中得到进一步详细描述，所述参考文献通过引用并入本文。
[0561]
用于转化植物细胞的一种广泛采用的系统使用来自根癌农杆菌的ti质粒或来自发根农杆菌(agrobacterium rhizogenes)的ri质粒，其通过an等人 (1986) plant physiol.81, 301-305和butcher等人 (1980) tissue culture methods for plant pathologists编: d. s. ingrams和j.p. helgeson, 203-208(其通过引用并入本文)进行描述。在植物中根据本发明的所期望的外源基因的每种引入方法后，进一步的dna序列的存在和/或插入可能是必需的。t-dna用于植物细胞转化的用途已得到充分研究，并且在ep-a-120516; hoekema (1985) the binary plant vector system, offset-drukkerij kanters b. b., amsterdam chapter v; fraley等人 crit. rev. plant sci.4:1-46; 和an等人 (1985) embo j 4: 277-284(其通过引用并入本文)中进行描述。
[0562]
根据众所周知的组织培养方法，诸如通过在供应有必需生长因子诸如氨基酸、植物激素、维生素等的合适培养基中培养细胞，可以生长且维持用一种或多种构建体转化的植物细胞，所述一种或多种构建体调节至少一种编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达。
[0563]
与本发明相关的术语“转基因植物”包括包含构建体的任何植物，所述构建体调节至少一种编码根据本发明的含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达。相应地，转基因植物是已用根据本发明的构建体进行转化的植物。优选地，根据本发明，转基因植物表现出调节的生物碱含量和/或调节的tsna前体含量。术语“转基因植物”不包括当处于其天然启动子(所述天然启动子也处于其自然环境中)的控制下时处于其自然环境中的天然核苷酸编码序列。
[0564]
在一个方面，根据本发明的编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因、构建体、植物转化载体或植物细胞处于分离的形式。术语“分离的”意指所述序列至少基本上不含所述序列与之在自然界中天然结合且如自然界中发现的至少一种其他组分。
[0565]
在一个方面，根据本发明的编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因、构建体、植物转化载体或植物细胞处于纯化的形式。术语“纯化的”意指处于相对纯的状态，例如至少约90%纯、或至少约95%纯或至少约98%纯。
[0566]
如本文所用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(诸如其部分)。核苷酸序列可以具有基因组或合成或重组起源，其可以是双链或单链的，无论代表有义链还是反义链。
[0567]
与本发明相关的术语“核苷酸序列”包括基因组dna、cdna、合成dna和rna。优选地，它意指编码本发明的dna，更优选cdna序列。
[0568]
在优选的实施方案中，当与本发明本身的范围相关并且当被本发明的范围本身包括时，核苷酸序列即编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因包括当处于其自然环境中时并且当它连接到也处于其自然环境中的一种或多种其天然相关序列时的天然核苷酸序列。为了便于参考，我们应该将该优选实施方案称为“天然核苷酸序列”。在这方面，术语“天然核苷酸序列”意指整个核苷酸序列，其处于其自然环境中，并且当可操作地连接至它与之天然结合的整个启动子时，所述启动子也处于其自然环境中。
[0569]
用于本发明的核苷酸序列可以存在于载体中，其中所述核苷酸序列可操作地连接
至调节序列，所述调节序列能够提供核苷酸序列由合适的宿主生物的表达。用于本发明的构建体可以转化到如本文所述的合适的宿主细胞内，以提供本发明的多肽的表达。载体例如质粒、粘粒或噬菌体载体的选择经常取决于它待引入其内的宿主细胞。载体可以在体外例如用于rna的生产，或者用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。
[0570]
在一些应用中，用于本发明的核苷酸序列可操作地连接至调节序列，所述调节序列能够提供核苷酸序列例如通过所选宿主细胞的表达。例如，本发明包括包含与这种调节序列可操作地连接的如本文所述的编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的核苷酸序列的载体，即载体是表达载体。
[0571]
术语“可操作地连接的
”ꢀ
是指其中所述组分处于允许其以其预期方式起作用的关系中的并列关系。与编码序列“可操作地连接”的调节序列以这样的方式连接，使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
[0572]
术语“调节序列”包括启动子和增强子以及其他表达调节信号。术语“启动子”以本领域的通常含义使用，例如rna聚合酶结合位点。编码基因的构建体内的核苷酸序列可以与至少一个启动子可操作地连接，所述基因编码含btb/poz nph3结构域的蛋白。
[0573]
与术语诸如“盒”或“载体”同义的术语“构建体”包括直接或间接附接至启动子的用于根据本发明使用的核苷酸序列。
[0574]
间接附接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列的中间，提供合适的间隔基团，诸如内含子序列，诸如sh1-内含子或adh内含子。对于与本发明相关的术语“融合的”同样如此，其包括直接或间接附接。在一些情况下，所述术语并不包括通常与野生型基因启动子结合，以及当它们均处于其自然环境中时的编码蛋白的核苷酸序列的天然组合。构建体甚至可以含有或表达标记物，其允许遗传构建体的选择。
[0575]
在一些实施方案中，启动子可以与构建体或载体中的核苷酸序列可操作地连接，所述核苷酸序列用于调节细胞或细胞培养物或烟草植物或其部分中的尼古丁浓度和/或总含量。
[0576]
在一些实施方案中，启动子可以选自：组成型启动子、组织特异性启动子、发育调节的启动子和诱导型启动子。
[0577]
在一个实施方案中，启动子可以是组成型启动子。
[0578]
组成型启动子指导基因在植物发育期间连续地遍及植物各个部分的表达，尽管基因可能不在所有细胞类型中以相同水平表达。已知的组成型启动子的实例包括与以下相关的那些：花椰菜花叶病毒35s转录物(odell jt，nagy f，chua nh.(1985). identification of dna sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35s promoter. nature. 313 810-2)、水稻肌动蛋白1基因(zhang w，mcelroy d，wu r.(1991). analysis of rice act1 5' region activity in transgenic rice plants. plant cell 3 1155-65)以及玉蜀黍泛素1基因(cornejo mj，luth d，blankenship km，anderson od，blechl ae.(1993). activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic rice. plant molec. biol. 23 567-81)。组成型启动子，诸如香石竹蚀环病毒(cerv)启动子(hull r，sadler j，longstaffm(1986)(camv/35s)，玄参花叶病毒(figwort mosaic virus) 35s启动子. the sequence of carnation etched ring virus dna: comparison with cauliflower mosaic virus and retroviruses. embo journal，5(2):3083-3090)。
[0579]
组成型启动子可以选自：香石竹蚀环病毒(cerv)启动子、花椰菜花叶病毒(camv 35s启动子)、来自水稻肌动蛋白1基因或玉蜀黍泛素1基因的启动子。
[0580]
启动子可以是组织特异性启动子。组织特异性启动子是指导基因在植物的一个(或几个)部分中的表达的启动子，通常贯穿那些植物部分的一生。组织特异性启动子的类别通常还包括其特异性不绝对的启动子，即它们还可以指导在除优选组织外的组织中以较低水平的表达。组织特异性启动子包括菜豆蛋白启动子、豆球蛋白b4-启动子、usp-启动子、sbp-启动子、st-ls1启动子、b33(马铃薯糖蛋白(patatin) i类启动子)。
[0581]
在另一个实施方案中，启动子可以是发育调节的启动子。
[0582]
发育调节的启动子指导基因在植物发育期间的特定时间，在植物的一个或多个部分中的表达中的变化。基因可以在其他时间以不同(通常较低)的水平在所述植物部分中表达，并且也可以在其他植物部分中表达。
[0583]
在一个实施方案中，启动子可以是诱导型启动子。
[0584]
诱导型启动子能够响应诱导物指导基因的表达。在不存在诱导物的情况下，基因将不表达。诱导物可以直接作用于启动子序列，或者可以通过抵消阻遏物分子的效应而起作用。诱导物可以是化学剂诸如代谢物，蛋白，生长调节子(诸如激活ocs启动子的生长素和水杨酸)或有毒元素，生理应激诸如热，光(诸如大豆 ssu启动子)，损伤(例如nos、胭脂碱合酶启动子)，或渗透压，或者病原体或害虫作用的间接后果。发育调节的启动子可以被描述为特定类型的诱导型启动子，其响应由植物产生的内源性诱导物或在植物的生活史中的特定时刻的环境刺激。已知的诱导型启动子的实例包括与诸如由warner sa，scott r，draper j.((1993)plant j. 3 191-201)描述的与伤口应答、如由benfey & chua(1989)(benfey，p.n.,和chua，n-h.((1989)science 244 174-181)公开的温度应答以及如由gatz((1995)methods in cell biol. 50 411-424)描述的化学诱导的相关的那些启动子。
[0585]
可以从产生所述蛋白的任何细胞或生物中鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有作为如本文所定义的编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的特定性质的蛋白或者适合于修饰的蛋白。用于核苷酸序列的鉴定和/或分离和/或纯化的各种方法是本领域内众所周知的。例如，一旦合适的序列已鉴定和/或分离和/或纯化，就可以使用pcr扩增技术来制备更多的序列。
[0586]
在再进一步的替代方案中，编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的核苷酸序列可以通过确立的标准方法进行合成制备，所述标准方法例如通过beucage等人，(1981)tetrahedron letters 22，1859-1869(其通过引用并入本文)描述的亚磷酰胺法，或者通过matthes等人，(1984)embo j. 3，801-805(其通过引用并入本文)描述的方法。在亚磷酰胺法中，寡核苷酸例如在自动dna合成仪中合成、纯化、退火、连接且在适当的载体中克隆。
[0587]
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
[0588]
本发明还包括序列的使用，所述序列与具有本文定义的特定性质的多肽的一种或多种氨基酸序列、或任何核苷酸序列即编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因具有一定程度的序列同一性或序列同源性(在下文中被称为“一种或多种同源序列”)。此处，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。此处，术语“同源
性”可以与“同一性”相等。
[0589]
同源氨基酸序列和/或核苷酸序列和/或片段应该提供和/或编码多肽，其保留含btb/poz nph3结构域的蛋白基因的功能活性和/或增强含btb/poz nph3结构域的蛋白基因的活性。通常，同源序列将包含例如与主题氨基酸序列相同的活性位点等，或者将编码相同的活性位点。尽管同源性也可以按照相似性加以考虑(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，但在本发明的背景下，它优选表示按照序列同一性的同源性。同源序列通常保留功能性结构域或基序。
[0590]
在一个实施方案中，采用同源序列以包括氨基酸序列或核苷酸序列，所述氨基酸序列或核苷酸序列与主题序列相比具有一个、两个或几个添加、缺失和/或取代。
[0591]
序列同一性序列同一性比较可以通过眼睛进行，或更通常地，借助于可容易获得的序列比较程序进行。这些商购可得的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的%同源性。%同源性或%同一性可以在邻接序列上进行计算，即一个序列与另一序列进行比对，并且一个序列中的每个氨基酸与另一序列中的相应氨基酸直接进行比较，一次比较一个残基。这称为“无缺口”比对。通常，仅在相对短数目的残基上进行这种无缺口比对。
[0592]
尽管这是非常简单且一致的方法，但它未能考虑到，例如，在其他方面等同的序列对中，一个插入或缺失将导致后面的氨基酸残基不能比对，因此潜在地导致当进行总体比对时，%同源性的大大降低。因而，大多数序列比较方法被进行设计以产生最佳比对，其在不过度惩罚总同源性得分的情况下考虑到可能的插入和缺失。这通过在序列比对中插入“缺口”以尝试使局部同源性达到最大来实现。
[0593]
然而，这些更复杂的方法将“缺口罚分(gap penalties)”分配给比对中出现的每个缺口，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的缺口的序列比对
ꢀ‑ꢀ
反映了两个比较的序列之间的更高相关性
ꢀ–ꢀ
将获得比具有许多缺口的比对更高的得分。通常使用“仿射缺口成本(affine gap cost)”，其对于缺口的存在负担相对高的成本，而对缺口中的每个之后的残基负担较小的罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分将当然产生具有较少缺口的最优化比对。大多数比对程序允许修改缺口罚分。然而，当使用这种软件用于序列比较时，优选使用缺省值。
[0594]
因此，最大%同源性的计算首先需要产生考虑到缺口罚分的最佳比对。用于进行这种比对的合适计算机程序是vector nti(invitrogen corp.)。可以进行序列比较的软件实例包括，但不限于，例如blast程序包(参见ausubel等人1999 short protocols in molecular biology，第4版
ꢀ‑ꢀ
第18章)、blast 2(参见fems microbiol lett 1999 174(2): 247-50；fems microbiol lett 1999 177(1): 187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)、fasta(altschul等人1990 j. mol. biol. 403-410)和alignx。至少blast、blast 2和fasta可用于离线和在线检索(参见ausubel等人1999，第7-58至7-60页)。
[0595]
尽管最终的%同源性可以按照同一性进行测量，但比对过程本身通常不基于全或无成对比较。相反，通常使用改变比例的相似性得分矩阵，其基于化学相似性或进化距离对每个配对比较分配得分。通常使用的这种矩阵的实例是blosum62矩阵
ꢀ‑ꢀ
blast程序套件的缺省矩阵。vector nti程序通常使用公开的缺省值或惯例符号比较表(如果提供的话)(关于进一步细节，参见用户手册)。对于一些应用，优选使用vector nti程序包的缺省值。
[0596]
或者，可以基于类似于clustal(higgins dg & sharp pm(1988)，gene 73(1)，237-244)的算法，使用vector nti(invitrogen corp.)中的多重比对特征计算来百分比同源性。一旦软件已产生最佳比对，就可能计算%同源性，优选%序列同一性。软件通常将其作为序列比较的一部分来进行，并且生成数值结果。
[0597]
如果当确定序列同一性时应该使用缺口罚分，则优选地下述参数用于配对比对：对于blast 缺口打开(gapopen)0缺口延伸(gapextension)0对于clustaldna蛋白 字长21k三联体缺口罚分1510 缺口延伸6.660.1 [0598]
在一个实施方案中，clustal可以与如上定义的缺口罚分和缺口延伸集合一起使用。在一些实施方案中，用于blast或clustal比对的缺口罚分可以不同于上文详述的那些。技术人员将理解，用于进行blast和clustal比对的标准参数可能定期改变，并且将能够基于当时对于blast或clustal比对算法详述的标准参数来选择适当的参数。
[0599]
适当地，在至少50个邻接核苷酸上，优选在至少60个邻接核苷酸上，优选在至少70个邻接核苷酸上，优选在至少80个邻接核苷酸上，优选在至少90个邻接核苷酸上，优选在至少100个邻接核苷酸上，优选在至少150个邻接核苷酸上，优选在至少200个邻接核苷酸上，优选在至少250个邻接核苷酸上，优选在至少300个邻接核苷酸上，优选在至少350个邻接核苷酸上，优选在至少400个邻接核苷酸上，优选在至少450个邻接核苷酸上，优选在至少500个邻接核苷酸上，优选在至少550个邻接核苷酸上，优选在至少600个邻接核苷酸上，优选在至少650个邻接核苷酸上，或优选在至少700个邻接核苷酸上，确定关于核苷酸序列的同一性程度。
[0600]
适当地，可以在整个序列上确定关于核苷酸、cdna、cds或氨基酸序列的同一性程度。
[0601]
序列还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，其产生沉默变化并导致功能上等效的物质。可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲特性中的相似性，来进行有意的氨基酸取代，只要物质的次级结合活性得到保留。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；且具有相似的亲水性值的具有不带电的极性首基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
[0602]
可以例如根据下表进行保守取代。第二列中相同组中的氨基酸，且优选第三列中的同一行中的氨基酸可以彼此取代：脂族非极性gap
ꢀꢀ
ilv 极性
ꢀ–ꢀ
不带电的cstm
ꢀꢀ
nq 极性
ꢀ–
带电的de
ꢀꢀ
kr芳族 hfwy
[0603]
本发明还包括可能出现的同源取代(取代和置换两者在本文中均用于意指现有氨基酸残基与替代残基的互换)，即同类(like-for-like)取代，诸如碱性取代碱性、酸性取代酸性、极性取代极性等。非同源取代也可以出现，即从一类残基到另一类残基，或者另一方面涉及非天然氨基酸的包括，所述非天然氨基酸诸如鸟氨酸(下文称为z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为b)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为o)、吡啶基丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
[0604]
置换也可以由非天然氨基酸进行，所述非天然氨基酸包括；α*和α-双取代的*氨基酸，n-烷基氨基酸*，乳酸*，天然氨基酸的卤化物衍生物诸如三氟酪氨酸*，对-cl-苯丙氨酸*，对-br-苯丙氨酸*，对-i-苯丙氨酸*，l-烯丙基-甘氨酸*，β-丙氨酸*，l-α-氨基丁酸*，l-γ-氨基丁酸*，l-α-氨基异丁酸*，l-ε-氨基己酸
#
，7-氨基庚酸*，l-甲硫氨酸砜
#
*，l-正亮氨酸*，l-正缬氨酸*，对硝基-l-苯丙氨酸*，l-羟脯氨酸
#
，l-硫代脯氨酸(thioproline)*，苯丙氨酸(phe)的甲基衍生物诸如4-甲基-phe*，五甲基-phe*，l-phe(4-氨基)
#
，l-tyr(甲基)*，l-phe(4-异丙基)*，l-tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸)*，l-二氨基丙酸
#
和l-phe(4-苄基)*。记号*已用于上文讨论的目的(与同源取代或非同源取代相关)，以指示衍生物的疏水特性，而#已用于指示衍生物的亲水特性，#*指示两亲特征。
[0605]
除氨基酸间隔基诸如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外，变体氨基酸序列可以包括合适的间隔基，其可以插入序列的任何两个氨基酸残基之间，包括烷基诸如甲基、乙基或丙基。进一步的变异形式涉及拟肽形式的一个或多个氨基酸残基的存在，其将是本领域技术人员充分理解的。为了避免疑问，“拟肽形式”用于指变体氨基酸残基，其中α-碳取代基位于残基的氮原子而不是α-碳上。用于制备拟肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如simon等人 (1992) pnas 89(20), 9367-9371和horwell (1995) trends biotechnol. 13(4), 132-134。
[0606]
用于本发明的核苷酸序列可以在其内包括合成或修饰的核苷酸。许多不同类型的对寡核苷酸的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3'和/或5'端处的吖啶或聚赖氨酸链添加。对于本发明的目的，应理解本文描述的核苷酸序列可以通过本领域中可获得的任何方法进行修饰。可以进行此类修饰，以增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。
[0607]
本发明还包括与本发明的核酸序列互补的序列，或能够与本发明的序列或与和其互补的序列杂交的序列。如本文所用的术语“杂交”应该包括“通过其核酸链经由碱基配对与互补链结合的过程”，以及如在聚合酶链反应(pcr)技术中进行的扩增过程。
[0608]
本发明还涉及可以与本发明的核苷酸序列(包括本文呈现的那些的互补序列)杂交的核苷酸序列。优选地，在严格性条件(例如50℃和0.2xssc {1xssc = 0.15 m nacl、0.015 m柠檬酸钠，ph 7.0})下测定杂交。更优选地，在高严格性条件(例如65℃和0.1xssc {1xssc = 0.15 m nacl、0.015 m柠檬酸钠，ph 7.0})下测定杂交。
[0609]
用于转化植物的一般技术的综述可以在诸如potrykus等人 (1991) annu rev plant physiol. plant mol. biol. 42:205-225和christou等人 (1994) agro-food-industry hi-tech march/april 17-27的论文(其通过引用并入本文)中找到。关于植物转
化的进一步教导可以在通过引用并入本文的ep-a-0449375中找到。
[0610]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本公开内容所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。singleton等人，dictionary of microbiology and molecular biology，20 ed.，john wiley and sons，new york(1994)以及hale & marham，the harper collins dictionary of biology，harper perennial，ny(1991)为技术人员提供了本公开内容中使用的众多术语的一般字典。
[0611]
本公开内容并不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些方法和材料相似或等效的任何方法和材料都可以用于本公开内容的实施方案的实践或测试中。数值范围包括限定范围的数值在内。除非另外指出，否则分别地，任何核酸序列均以5'至3'的取向从左到右书写；氨基酸序列以氨基至羧基的取向从左到右书写。
[0612]
本文提供的标题不是对本公开内容的各个方面或实施方案的限制，其可以通过整个地参考说明书来获得。相应地，紧在下文定义的术语通过整个地参考说明书更全面地定义。
[0613]
氨基酸在本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写来提及。如本文所用，术语“蛋白”包括蛋白、多肽和肽。如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
[0614]
在本公开内容和权利要求中，可以使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。氨基酸的3-字母代码如依照iupaciub生物化学命名联合委员会(iupaciub joint commission on biochemical nomenclature)(jcbn)定义的。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由不止一种核苷酸序列编码。
[0615]
术语的其他定义可能在整个说明书中出现。在更详细地描述示例性实施方案之前，应理解，本公开内容并不限于所述的特定实施方案，因为这些当然可以变化。还应理解，本文使用的术语学仅为了描述特定实施方案起见，且不预期是限制性的，这是因为本公开内容的范围将仅受所附权利要求的限制。
[0616]
在提供值范围的情况下，应理解，除非上下文另有明确指示，否则在所述范围的上限和下限之间的每个以下限单位的十分之一为基准的中间值也被具体公开。在规定范围内的任何规定值或中间值与所述规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围都包括在本公开内容内。根据规定范围中任何具体排除的限值，这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述范围内或从所述范围中排除，并且其中在较小范围内包括任一限值、不包括限值或包括两个限值的每个范围也包括在本公开内容中。在规定范围包括一个或两个限值的情况下，排除这些包括的限值中的任一或两者的范围也包括在本公开内容中。
[0617]
必须指出的是，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”包括复数对象，除非上下文另有明确指示。因此，例如，提及“酶”或“硝酸还原酶”包括本领域技术人员已知的多种这种候选试剂及其等效物，等等。
[0618]
优点已经令人惊讶地发现，通过调节至少一种编码如本文教导的充当烟草中的生物碱含量的正调节子的含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达，植物的生物碱和/
或tsna前体含量可以被调节。由此，可以生产具有调节(例如降低)的生物碱含量)和/或降低的tsna前体含量以及烟草工业产品消费者所追求的商业上期望性状的烟草工业产品。
[0619]
本发明人已经令人惊讶地确定通过调节编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来调节植物(例如烟草植物)的生物碱含量和/或tsna前体含量的方法。可以通过降低或抑制编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达来降低植物(例如烟草植物)的生物碱或tsna前体含量。在本发明之前，尚不知晓如本文所述的编码含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因的活性或表达的调节可用于调节植物(例如烟草植物)的生物碱和/或tsna前体含量。
[0620]
本文讨论的出版物仅由于其公开内容在本技术的申请日之前而提供。本文中的任何内容都不应解释为承认这种出版物构成本文所附权利要求的现有技术。
[0621]
实施例实施例1
ꢀ‑ꢀ
含btb/poz nph3结构域的蛋白的瞬时过表达增加叶片中的生物碱含量方法和材料克隆含btb/poz nph3结构域的表达载体使用位于侧接基因序列的限制位点外部的引物，从gateway
™
相容的cdna文库中扩增nitab4.5_0000868g0020.2，含btb/poz nph3结构域的蛋白的基因序列(seq id no. 3)。
[0622]
对所得到的质粒进行测序，并且通过热休克转化到根癌农杆菌gv3101pmp90内且在烟草叶片中瞬时表达。
[0623]
瞬时基因表达携带目标构建体的根癌农杆菌gv3101菌株在补加有适当抗生素的luria-bertani(lb)培养基中生长过夜。将培养物快速离心(spin down)，并且在含有10 mm mgcl2、10 mm mes ph 5.6和100
ꢀµ
m乙酰丁香酮的缓冲液中，重悬浮至od600=0.6，并且于室温温育1小时。用无针注射器进行进入烟草叶片内的渗入。渗入后5天获得样品。
[0624]
测试以两个生物学重复进行。
[0625]
生物碱测量通过具有串联质谱的反相高效液相色谱(lc-ms/ms)来确定吡啶生物碱的相对含量。色谱分离使用gemini-nx柱(100 mm
ꢀ×ꢀ
3.0 mm，粒度3 μm，phenomenex)以及使用6.5 mm乙酸铵缓冲液(aq)(ph10)和甲醇的梯度色谱分离来实现。
[0626]
质谱仪使用预定的mrm数据采集以电喷射(esi)正模式运行。对于每种分析物监控两次mrm跃迁，并且对于同位素标记的内标监控一次。分析物前体离子子离子(量(quant)/确认)尼古丁163.1130/106尼古丁d4167.1134.1新烟碱163.180/120新烟草碱161.1144/80降烟碱149.180/130降烟碱d4153.184.1
pon176.1106.0/148pond4183.1110.0
[0627]
结果表达nitab4.5_0000868g0020.2构建体的5周龄烟草叶片的生物碱含量显示于图1中。生物碱含量相对于对照表示，并且包括通过单向t-检验分析的两个生物学重复。值显示为平均值
±ꢀ
sem。星号指示p值≤ 0.001的统计显著性。
[0628]
nitab4.5_0000868g0020.2的过表达导致叶片中生物碱含量的显著增加。
[0629]
图35显示nitab4.5_0000868g0020.2的敲除导致生物碱含量的显著降低。显示nitab4.5_0000868g0020.2被敲除的3个tn90株系的生物碱含量。生物碱含量相对于对照表示。结果通过t-检验分析。值显示为平均值
±
sem。星号指示p值≤0.001的统计显著性。
[0630]
结论nitab4.5_0000868g0020是生物碱含量的正调节子，并且是烟草中吡啶生物碱的调节子。
[0631]
实施例2
ꢀ–
靶向nitab4.5_0000868g0020.2的反义rna的瞬时表达减少叶片中的生物碱含量材料和方法以相反方向将nitab4.5_0000868g0020.2编码序列克隆至由cerv启动子驱动的植物表达载体中。
[0632]
结果表达nitab4.5_0000868g0020.2反义rna的5周龄烟草叶片的生物碱含量显示于图2中。
[0633]
生物碱含量相对于对照表示，并且包含通过t-检验分析的三个生物学重复。值显示为平均值
±ꢀ
sem。星号指示p值≤ 0.001的统计显著性。
[0634]
使用反义rna抑制nitab4.5_0000868g0020.2表达导致叶片中生物碱含量的降低，特别是pon、降烟碱、新烟碱和新烟草碱含量的降低。
[0635]
结论nitab4.5_0000868g0020.2是叶片中的生物碱含量、特别是生物碱含量的正调节子，并且是烟草中吡啶生物碱的调节子。
[0636]
实施例3
–
同源物测试如实施例1和2中所述，在测定中测试seq id no.3的同源物(即seq id no 6、9、12、15、18、21、24、27和30)的作用。
[0637]
实施例4
–
nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用组学研究方法：将nitab4.5_0000868g0020.2的三次重复免疫共沉淀样品送去进行质谱分析。样品用胰蛋白酶消化并在thermo scientific
™ꢀ
orbitrap fusion
™
质谱仪上进行分析。使用5%错误发现率，用proteome discoverer 2.1针对bat烟草蛋白质组数据库和常见污染物数据库分析数据。基于以下分选蛋白：候选样品的所有重复中的鉴定；候选样品中鉴定并且不存在于对照(gfp)或其他候选样品中的肽的数量。使用这些标准生成nitab4.5_0000868g0020.2的候选相互作用者的列表。
[0638]
结果和结论：表征nitab4.5_0000868g0020.2的相互作用组(数据未显示)。最强的相互作用者(seq id no)位于叶绿体或叶绿体膜中，表明与其最接近的拟南芥同源物(at5g67385, nch1)一样，nitab4.5_0000868g0020.2参与叶绿体运动的调节。叶绿体信号传导通路受到植物生长素的严格调节，所述植物生长素参与烟草植物中从枝条起的长距离信号传导并调节根部中的尼古丁合成。
[0639]
这些发现给出了关于nitab4.5_0000868g0020.2参与烟草中的尼古丁和尼古丁类生物碱水平的调节的机制见解。