一种高纯度、低IgA含量静注人免疫球蛋白的制备工艺的制作方法

一种高纯度、低iga含量静注人免疫球蛋白的制备工艺
技术领域
1.本发明属于血液制品领域，具体涉及一种高纯度、低iga含量静注人免疫球蛋白的制备工艺。


背景技术：

2.静注人免疫球蛋白是由健康人血浆经分离提取的免疫球蛋白组分，并经病毒灭活、去除等步骤精制而成。静注人免疫球蛋白具有免疫替代和免疫调节的双重治疗作用，临床使用广泛，在原发性或获得性免疫球蛋白缺陷症、细菌感染、病毒感染、血液系统疾病、川崎病等的治疗中有显著的效果。
3.作为血液制品的静注人免疫球蛋白，为了更好的控制临床效果，需要进行严格的质量控制。各国药典都对静注人免疫球蛋白的质量控制有相应的规定，其中静注人免疫球蛋白的质量控制标准：
①
主要成分应为igg，其纯度应不低于蛋白总量的95.0％，且igg亚类应齐全，其含量与正常人血清lgg亚类分布相近；
②
静注人免疫球蛋白制品应尽可能不含或少含iga、ige等非igg免疫球蛋白成分(其中，iga会导致先天性选择性iga缺乏症出现过敏反应，其含量应当越少越好)；
③
应当保证静注人免疫球蛋白中抗体的生物活性、高滴度以及高效性；
④
还需要保证静注人免疫球蛋白制品的病毒安全性。
4.因此，控制静注人免疫球蛋白的制备工艺至关重要。目前，静注人免疫球蛋白的制备工艺基本都采用低温乙醇分离提取工艺。但是，目前的低温乙醇工艺制备的免疫球蛋白制剂中iga的含量相对较高，先天性选择性iga缺乏症患者输注后易发生不良反应，需要进行改进，如公开号为cn104402993b的专利申请文件中公开的方法，制备得到的人免疫球蛋白制品的iga含量平均为9.3μg/ml。而且在静注人免疫球蛋白的制备过程中，常使用s/d灭活(国外部分血液制品企业选择在30℃下对静注人免疫球蛋白进行6h病毒灭活)或采用纳米膜过滤除去病毒，病毒灭活效果较一般，有部分病毒无法有效除去，影响产品临床使用安全性。例如，张战发表文献《不同病毒灭活工艺对静注免疫球蛋白质量和收率的影响》，分别采用低ph孵放、纳米膜过滤、巴氏消毒和s/d病毒灭活工艺处理静注人免疫球蛋白原液，但是，对静注免疫球蛋白的质量有一定影响，且会影响静注免疫球蛋白的收率。
5.随着目前静注人免疫球蛋白市场需求量的提升，现有的静注人免疫球蛋白制备技术的产品收率、纯度已不够理想，因此，寻找一种产品收率、纯度都较高，iga含量低，并且安全性较好的静注人免疫球蛋白的制备工艺，是目前急需解决的问题。
6.本发明公开了一种静注人免疫球蛋白的制备工艺，本发明的主要步骤包括从组分i ii iii中分离组分i iii、经s/d灭活、第一次超滤、层析、第二次超滤、中间品配制、巴氏灭活、第三次超滤、纳米膜除病毒过滤、半成品配制、除菌灌装后制得的产品收率高、纯度高、iga含量低，并且采取s/d灭活和巴氏灭活结合的病毒灭活工艺，达到灭活脂包膜和非脂包膜病毒的目的，灭活效果良好。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种静注人免疫球蛋白的制备工艺，所述制备工艺包括以下步骤：
8.(1)制备组分i iii或组分iii；
9.(2)s/d灭活：在组分i iii或组分iii滤液中加入s/d溶液，24～26℃恒温处理6h，得s/d灭活液，其中所述s/d溶液为聚乙二醇辛基苯基醚(triton x-100)和磷酸三丁酯(tnbp)；
10.(3)第一次超滤：调步骤(2)所述s/d灭活液的ph为3.5～4.0后进行超滤浓缩和透析，使蛋白含量＞60g/l；
11.(4)层析：调步骤(3)所述超滤浓缩液的电导为1.9～2.3ms/cm，ph为6.4～6.8，蛋白浓度≥30g/l，上离子交换层析柱，收集流出液；
12.(5)第二次超滤：调步骤(4)所述流出液ph为3.5～4.0后，进行超滤浓缩和透析，使蛋白含量≥60g/l；
13.(6)中间品配置：在步骤(5)所述透析浓缩液中加入麦芽糖至终浓度为100～110g/l，用除菌滤芯进行过滤，得中间品；
14.(7)巴氏灭活：在步骤(6)所述中间品中添加山梨醇至终浓度为32～34％w/v，调整ph为4.6～5.2，在59.5～60.5℃下恒温灭活10h，得巴氏灭活液；
15.(8)第三次超滤：用0.85％的氯化钠溶液对步骤(7)所述巴氏灭活液进行透析浓缩至蛋白浓度应≥60g/l，得蛋白超滤液；
16.(9)纳米膜过滤除病毒：用孔径20nm的纳米膜过滤步骤(8)所述的蛋白液，得原液；
17.(10)成品静注人免疫球蛋白的制备：在步骤(9)所述原液中加入麦芽糖，调ph为3.9～4.3，蛋白终含量为40～60g/l，麦芽糖终含量100～110g/l得半成品，将所述半成品经0.45μm滤芯除菌后灌装制得成品静注人免疫球蛋白。
18.优选地，步骤(1)中所述组分i iii的制备过程为：用0～2℃，0.01mol/l氯化钠溶解组分i ii iii沉淀，调ph为5.05～5.15，在低于0℃条件下，加入温度低于-15℃的95％乙醇，使乙醇终浓度为17％v/v，控制温度-6.0～-4.0℃反应2h，分离反应液获得组分i iii滤液。
19.优选地，所述乙醇的加入速度≤80kg/h；所述分离为压滤分离，压滤压力为0.05～0.25mpa，出液温度为-5.5～-3.5℃。
20.优选地，步骤(2)中所述聚乙二醇辛基苯基醚(triton x-100)的终浓度为1％，所述磷酸三丁酯(tnbp)的浓度为0.3％。
21.优选地，所述步骤(3)中，将所述s/d灭活液用0.45μm滤芯过滤后用30kda超滤膜包进行浓缩，当所述蛋白含量为30～50g/l时，用5倍浓缩液体积2～8℃透析水连续等体积透析脱醇，使蛋白含量＞60g/l。
22.优选地，所述步骤(4)中，在透析液上离子交换层析柱前，先平衡层析柱，所述平衡层析柱的方法为：先用醋酸盐缓冲液处理层析柱，再用磷酸盐平衡缓冲液平衡层析柱。
23.优选地，所述离子层析柱为deae sepharose fast flow离子交换层析柱，所述透析液的上样速度≤3l/min。
24.优选地，所述步骤(5)中，将流出液置于收集罐，调整转速为10～40rpm超滤浓缩，
当蛋白含量浓缩至40～50g/l时，用2～8℃透析水连续等体积透析，浓缩至蛋白含量≥60g/l。
25.优选地，步骤(9)中所述除病毒过滤过程中的前端过滤压力≤0.3mpa。
26.优选地，步骤(10)所述半成品中蛋白含量为50.5g/l，麦芽糖含量为100g/l。
27.本发明的有益效果是：
28.本发明所述制备工艺采取s/d灭活和巴氏灭活结合的病毒灭活工艺，达到灭活脂包膜和非脂包膜病毒的目的，灭活效果良好；且不影响静注人免疫球蛋白的收率、纯度，依据本发明所述制备工艺制备的静注人免疫球蛋白的收率高于5.9g/l(2.5g/瓶规格2271瓶/吨)，纯度高于99％；同时本发明所述制备工艺显著降低了静注人免疫球蛋白iga的含量，提高了igg单体与二聚体含量，其中所制备的成品静注人免疫球蛋白中iga含量低于8mg/ml，igg单体与二聚体含量之和高于98％。
具体实施方式
29.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
30.实施例1静注人免疫球蛋白的制备工艺1
31.(1)从血浆中分离组分i ii iii沉淀
32.(2)组分i iii制作与分离
33.用8倍组分i ii iii沉淀重量，0℃的0.01mol/l氯化钠溶液溶解组分i ii iii沉淀，开启搅拌至30rpm。完全溶解后加入ph4.0醋酸盐缓冲液，调整ph值为5.10，降温至0℃以下，喷入-15℃的95％乙醇，使最终乙醇浓度达到17％v/v，乙醇喷入速度80kg/h。控制最终反应液温度为-5.5℃。乙醇添加完成后，继续搅拌2h，静置6h，开启搅拌转速30rpm，15min后进行压滤分离，压滤压力控制在0.05mpa，出液温度控制在-5.5℃。
34.(3)s/d灭活
35.按滤液体积的10％缓慢(搅拌转速20rpm)加入s/d溶液，加入聚乙二醇辛基苯基醚(triton x-100)至终浓度为1％，加入磷酸三丁酯(tnbp)至浓度为0.3％，24℃保温6h。
36.(4)第一次超滤
37.s/d灭活液加入0.5mol/l盐酸溶液，调整滤液ph值至3.50，然后经0.45μm滤芯过滤后使用30kda超滤膜包进行浓缩和透析。用5倍浓缩液体积的8℃透析水(注射用水)连续等体积透析脱醇，然后浓缩蛋白含量＞60g/l，收集浓缩液于超滤罐中。用适量透析水(注射用水)冲洗超滤膜，将冲洗液并入浓缩液中。
38.(5)层析
39.采用deae sepharose fast flow离子交换层析柱纯化：先用ph4.0醋酸盐缓冲液处理层析柱(直径800mm、柱高180mm)；再用磷酸盐平衡缓冲液(浓度0.02mol/l、ph值6.4)平衡层析柱；将超滤收集的浓缩液先用1mol/l磷酸盐缓冲液调整浓缩液电导至1.9ms/cm，再用0.5mol/l氢氧化钠溶液调整浓缩液ph至6.4，蛋白液浓度≥30g/l；层析上样，上样速度控制在3l/min以内，当层析系统uv检测器显示峰值刚出现时开始收集流穿液，上样完成后用磷酸盐平衡缓冲液顶洗层析柱，待uv检测器显示值下降至最高峰的约1/6时，停止收集流穿液。用ph4.0醋酸盐缓冲液冲洗层析柱。
40.(6)第二次超滤
41.层析后开启制品收集罐搅拌(转速30rpm)，搅拌均匀后加入0.5mol/l盐酸溶液，调整ph至3.5。搅拌转速调整至10rpm开始超滤浓缩，将制品蛋白含量浓缩至40g/l时，开始透析。用6倍浓缩液体积的8℃透析水(注射用水)进行连续等体积透析，透析完成进行终浓缩，收集浓缩液。用适量透析水冲洗超滤膜，将冲洗液并入浓缩液中，最终浓缩液蛋白含量≥60g/l。
42.(7)中间品配制
43.开启制品收集罐搅拌(转速50rpm)，按麦芽糖含量100g/l加入麦芽糖，蛋白含量50g/l。配液后用0.2μm除菌滤芯进行过滤。
44.(8)巴氏灭活
45.调整制品ph值为4.9
±
0.3，山梨醇浓度为33
±
1％，60℃
±
0.5℃进行10h病毒灭活。
46.(9)第三次超滤
47.用5倍待超滤液体积的0.85％氯化钠溶液(8℃)进行透析，透析后进行浓缩，收集浓缩液。用适量透析水冲洗超滤膜，将冲洗液并入浓缩液中，最终收集液蛋白浓度应≥60g/l，得蛋白超滤液。
48.(10)纳米膜除病毒过滤
49.超滤液先用0.2μm滤芯进行预过滤，再用过滤孔径为20nm的纳米膜进行除病毒过滤，除病毒过滤过程中前端过滤压力为0.3mpa。
50.(11)半成品配制
51.按照以下要求进行半成品配制：蛋白含量50g/l；麦芽糖含量110g/l；ph值3.9。
52.(12)除菌灌装
53.半成品经0.45μm滤芯除菌灌装制得成品静注人免疫球蛋白。
54.实施例2静注人免疫球蛋白的制备工艺2
55.(1)从血浆中分离组分i ii iii沉淀
56.(2)组分i iii制作与分离
57.用10倍组分i ii iii沉淀重量、1℃的0.01mol/l氯化钠溶液溶解组分i ii iii沉淀，开启搅拌至70rpm。完全溶解后加入ph4.0醋酸盐缓冲液，调整ph值为5.0，降温至0℃以下，喷入-20℃的95％乙醇，使最终乙醇浓度达到17％v/v，乙醇喷入速度70kg/h。控制最终反应液温度为-5.0℃。乙醇添加完成后，继续搅拌2h，静置6h，开启搅拌转速35rpm，15min后进行压滤分离，压滤压力控制在0.20mpa，出液温度控制在-4.5℃。
58.(3)s/d灭活
59.按滤液体积的10％缓慢(搅拌转速30rpm)加入s/d溶液，加入聚乙二醇辛基苯基醚(triton x-100)至终浓度为1％，加入磷酸三丁酯(tnbp)至浓度为0.3％，25℃保温6h。
60.(4)第一次超滤
61.s/d灭活液加入0.5mol/l盐酸溶液，调整滤液ph值至3.8，然后经0.45μm滤芯过滤后使用30kda超滤膜包进行浓缩和透析。用5倍浓缩液体积的5℃透析水(注射用水)连续等体积透析脱醇，然后浓缩蛋白含量＞60g/l，收集浓缩液于超滤罐中。用适量透析水(注射用水)冲洗超滤膜，将冲洗液并入浓缩液中。
62.(5)层析
63.采用deae sepharose fast flow离子交换层析柱纯化：先用ph4.0醋酸盐缓冲液处理层析柱(直径800mm、柱高180mm)；再用磷酸盐平衡缓冲液(浓度0.02mol/l、ph值6.6)平衡层析柱；将超滤收集的浓缩液先用1mol/l磷酸盐缓冲液调整浓缩液电导至2.1ms/cm，再用0.5mol/l氢氧化钠溶液调整浓缩液ph至6.6，蛋白液浓度≥30g/l；层析上样，上样速度控制在3l/min以内，当层析系统uv检测器显示峰值刚出现时开始收集流穿液，上样完成后用磷酸盐平衡缓冲液顶洗层析柱，待uv检测器显示值下降至最高峰的约1/6时，停止收集流穿液。用ph4.0醋酸盐缓冲液冲洗层析柱。
64.(6)第二次超滤
65.层析后开启制品收集罐搅拌(转速50rpm)，搅拌均匀后加入0.5mol/l盐酸溶液调整ph至3.8。搅拌转速调整至10～40rpm开始超滤浓缩，将制品蛋白含量浓缩至45g/l时，开始透析。用6倍浓缩液体积的5℃透析水(注射用水)进行连续等体积透析，透析完成进行终浓缩，收集浓缩液。用适量透析水冲洗超滤膜，将冲洗液并入浓缩液中，最终浓缩液蛋白含量≥60g/l。
66.(7)中间品配制
67.开启制品收集罐搅拌(转速70rpm)，按麦芽糖含量100g/l加入麦芽糖，蛋白含量55g/l。配液后用0.45μm除菌滤芯进行过滤。
68.(8)巴氏灭活
69.调整制品ph值为4.9，山梨醇浓度为33％，60℃进行10h病毒灭活。
70.(9)第三次超滤
71.用5倍待超滤液体积的0.85％氯化钠溶液(5℃)进行透析，透析后进行浓缩，收集浓缩液。用适量透析水冲洗超滤膜，将冲洗液并入浓缩液中，最终收集液蛋白浓度应≥60g/l，即蛋白超滤液。
72.(10)纳米膜除病毒过滤
73.超滤液先用0.2μm滤芯进行预过滤，再用过滤孔径为20nm的纳米膜进行除病毒过滤，除病毒过滤过程中前端过滤压力为0.2mpa。
74.(11)半成品配制
75.根据原液检定结果按照以下要求进行半成品配制：蛋白含量50.5g/l；麦芽糖含量100g/l；ph值4.0。
76.(12)除菌灌装
77.半成品经0.45μm滤芯除菌灌装制得成品静注人免疫球蛋白。
78.实施例3静注人免疫球蛋白的制备工艺3
79.(1)从血浆中分离组分i ii iii沉淀
80.(2)组分i iii制作与分离
81.用12倍组分i ii iii沉淀重量、2℃的0.01mol/l氯化钠溶液溶解组分i ii iii沉淀，开启搅拌至30rpm。完全溶解后加入ph4.0醋酸盐缓冲液，调整ph值为5.15，降温至0℃以下，喷入-20℃的95％乙醇，使最终乙醇浓度达到17％v/v，乙醇喷入速度50kg/h。控制最终反应液温度为-5.5℃。乙醇添加完成后，继续搅拌2h，静置6h，开启搅拌转速50rpm，15min后进行压滤分离，压滤压力控制在0.25mpa，出液温度控制在-4.0℃。
82.(3)s/d灭活
83.按滤液体积的10％缓慢(搅拌转速40rpm)加入s/d溶液，加入聚乙二醇辛基苯基醚(triton x-100)至终浓度为1％，加入磷酸三丁酯(tnbp)至浓度为0.3％，26℃保温6h。
84.(4)第一次超滤
85.s/d灭活液加入0.5mol/l盐酸溶液，调整滤液ph值至4.0，然后经0.45μm滤芯过滤后使用30kda超滤膜包进行浓缩和透析。用5倍浓缩液体积的2℃透析水(注射用水)连续等体积透析脱醇，然后浓缩蛋白含量＞60g/l，收集浓缩液于超滤罐中。用适量透析水(注射用水)冲洗超滤膜，将冲洗液并入浓缩液中。
86.(5)层析
87.采用deae sepharose fast flow离子交换层析柱纯化：先用ph4.0醋酸盐缓冲液处理层析柱(直径800mm、柱高180mm)；再用磷酸盐平衡缓冲液(浓度0.02mol/l、ph值6.5)平衡层析柱；将超滤收集的浓缩液先用1mol/l磷酸盐缓冲液调整浓缩液电导至2.3ms/cm，再用0.5mol/l氢氧化钠溶液调整浓缩液ph至6.5，蛋白液浓度≥30g/l；层析上样，上样速度控制在3l/min以内，当层析系统uv检测器显示峰值刚出现时开始收集流穿液，上样完成后用磷酸盐平衡缓冲液顶洗层析柱，待uv检测器显示值下降至最高峰的约1/6时，停止收集流穿液。用ph4.0醋酸盐缓冲液冲洗层析柱。
88.(6)第二次超滤
89.层析后开启制品收集罐搅拌(转速70rpm)，搅拌均匀后加入0.5mol/l盐酸溶液，调整ph至4.0。搅拌转速调整至40rpm开始超滤浓缩，用6倍浓缩液体积的2～8℃透析水(注射用水)进行连续等体积透析，透析完成进行终浓缩，收集浓缩液。用适量透析水冲洗超滤膜，将冲洗液并入浓缩液中，最终浓缩液蛋白含量≥60g/l。
90.(7)中间品配制
91.开启制品收集罐搅拌(转速60rpm)，按麦芽糖含量100g/l加入麦芽糖，蛋白含量60g/l。配液后用0.2μm除菌滤芯进行过滤。
92.(8)巴氏灭活
93.调整制品ph值为5.0，山梨醇浓度为32％，60℃进行10h病毒灭活。
94.(9)第三次超滤
95.用5倍待超滤液体积的0.85％氯化钠溶液(2℃)进行透析，透析后进行浓缩，收集浓缩液。用适量透析水冲洗超滤膜，将冲洗液并入浓缩液中，最终收集液蛋白浓度应≥60g/l，得蛋白超滤液。
96.(10)纳米膜除病毒过滤
97.超滤液先用0.1μm滤芯进行预过滤，再用过滤孔径为20nm的纳米膜进行除病毒过滤，除病毒过滤过程中前端过滤压力为0.3mpa。
98.(11)半成品配制
99.根据原液检定结果按照以下要求进行半成品配制：蛋白含量60g/l，麦芽糖含量90g/l，ph值4.3。
100.(12)除菌灌装
101.半成品经0.45μm滤芯除菌灌装制得成品静注人免疫球蛋白。
102.实施例4成品静注人免疫球蛋白的质量指标检测
103.对实施1-3制备的成品静注人免疫球蛋白的纯度、产率、iga含量、分子大小分布(igg单体与二聚体含量之和)进行测定，其中标准规定静注人免疫球蛋白的纯度应不小于95.0％，分子大小分布不低于95.0％。结果如下表1所示，依据本发明所述制备工艺制备获得的成品静注人免疫球蛋白的纯度高于99.2％，收率高达5.9g/l(2.5g瓶规格2271瓶/吨)，iga含量低于8mg/ml，igg单体与二聚体含量之和高于98.2％，相比于现有技术制备的成品静注人免疫球蛋白，本发明所述制备工艺制备获得的成品静注人免疫球蛋白的iga含量显著降低，igg单体与二聚体含量之和升高，且显著高于国家标准规定，纯度也显著高于国家标准规定，并且收率较高。
104.表1成品静注人免疫球蛋白的质量指标检测结果
[0105][0106]
根据药典规定，对实施1-3制备的成品静注人免疫球蛋白的热源及病毒含量检测均符合国家标准规定(按家兔体重每1kg注射0.5g蛋白质，符合规定)。
[0107]
根据药典规定，对实施1-3制备的成品静注人免疫球蛋白的灭火剂残留进行测定，均符合规定(磷酸三丁酯小于10μg/ml)。
[0108]
以上所述仅为本发明的个别示范性实施案例的细节，对于本领域的技术人员来说，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。