杂芳基氨基吡啶醇衍生物以及包含其为活性成分的用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物组合物的制作方法

杂芳基氨基吡啶醇衍生物以及包含其为活性成分的用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物组合物


背景技术：
技术领域
1.本发明涉及杂芳基氨基吡啶醇衍生物以及包含其作为活性成分的用于预防或治疗自身免疫性疾病，例如炎性肠病和类风湿性关节炎的药物组合物。
2.相关技术的描述
3.免疫是活体抵御侵入或注入活体组织中的所有外来聚合物的自我保护系统之一。所有正常个体不会对构成自身的抗原产生有害反应，但它们有能力识别非自身抗原并对其产生反应并且将其除去。然而，如果宿主的免疫系统无法区分外源抗原和自身抗原，并会诱导异常的免疫应答，则体内的免疫细胞攻击它们自身的细胞成分，并引起各种疾病，这称为自身免疫性疾病。
4.自身免疫性疾病由多种原因引起，例如遗传、应激、激素、重金属、食物、感染和杀虫剂，约占世界人口的5至8％。自身免疫性疾病的实例包括炎性肠病、孤独症、哮喘、1型糖尿病、类风湿性关节炎、风湿性多肌痛、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、银屑病、湿疹、硬皮病、白癜风、多发性硬化、il-17诱导的痴呆、末梢神经炎、葡萄膜炎、干眼综合征、器官移植排斥和癌症。目前，抗炎和免疫抑制药物被用作自身免疫性疾病的治疗剂，但是一些患者对这些药物有抗性，使得治疗困难。
5.在自身免疫性疾病中，炎性肠病是一个慢性且反复发作的消化道炎性疾病，分为两种疾病：溃疡性结肠炎和克罗恩病。该疾病的确切原因尚不清楚，但它是由具有遗传易感性的人对肠道中细菌的不适当免疫应答引起的。肠道免疫系统，例如中性粒细胞和巨噬细胞(其为先天性免疫细胞)以及淋巴细胞(其为获得性免疫细胞)的连续或不适当激活最终会导致粘膜破坏和溃疡。在炎症状态下，各种炎性细胞因子在肠道粘膜中产生和分泌，其中，tnf-α(肿瘤坏死因子-α)在溃疡性结肠炎患者的肠腔和上皮细胞中高度表达。根据最近的研究，已知tnf-α在溃疡性结肠炎的发病机理中起重要作用。
6.已知英夫利昔单抗(一种抗tnf-α抗体)不仅在治疗疖中有效，而且在治疗以前未治疗的克罗恩病中也有效。然而，这种治疗是昂贵的，并且在一些患者中会引起副作用，例如流体反应或感染性并发症。托法替尼是一种janus激酶(jak)抑制剂，已被证实在溃疡性结肠炎中具有治疗功效，但已被证实在克罗恩病中无效。换句话说，仍然没有可靠的用于炎性肠病的口服治疗剂，因此需要开发用于该疾病的有效且低成本的口服治疗。
7.在自身免疫性疾病中，类风湿性关节炎是一种占成人人口大约1％的常见疾病，并且是一种在大多数患者中导致关节破坏和关节畸形、最终导致残疾的疾病。在类风湿性关节炎的病理生理学中，据报道，这种疾病的发生是由于在根据病毒或细菌感染的炎症反应后，对关节抗原(如胶原蛋白或蛋白多糖)产生的新肽有特异性的自身反应性t细胞的激活。类风湿性关节炎与t淋巴细胞以及b淋巴细胞与滑膜细胞之间的相关性是众所周知的。与类风湿性关节炎相关的重要细胞因子是tnf-α、il-1和il-6。它们增加内皮细胞中粘附分子的
表达，以增加白细胞向关节的流入，并促进滑膜细胞和软骨细胞中基质金属蛋白酶的分泌，以诱导组织破坏。在新近开发的用于治疗类风湿性关节炎的药物中，抗tnf-α抗体制剂是最有代表性的，并且其中，依那西普英夫利昔单抗和阿达木单抗是最常用的药物。
8.然而，这些药物是昂贵的，并且给药不便是治疗障碍。托法替尼是最近开发的一种治疗类风湿性关节炎的口服药物，在一系列针对类风湿性关节炎患者的临床试验中，憩室炎被报告为“严重”感染。特别地，由于临床试验中报告了憩室穿孔(胃肠道穿孔的一种情形)，fda于2015年12月更新了“注意事项”和“不良反应”部分。迄今为止，还没有开发出安全有效的口服治疗剂作为靶向tnf-α或tnf受体的药物，tnf-α或tnf受体已经成为类风湿性关节炎的最有效的治疗靶标。因此，要求开发靶向该靶标的有效、低成本、安全且高效的口服类风湿性关节炎治疗剂。
9.t细胞在免疫系统中起核心作用，免疫系统是抵抗多种病原体的生物防御系统，t细胞作为各种类型的分化细胞存在。th1细胞参与细胞介导的免疫，th2细胞参与体液免疫，th17细胞参与感染性和炎性疾病，treg细胞通过抑制免疫来维持体内稳态。然而，已知当th1细胞和th17细胞的活性异常升高时会发生自身免疫疾病，当th2细胞的活性由于超敏反应而异常升高时会发生免疫疾病。由于能调节这些细胞活性的treg细胞具有通过抑制异常活化的免疫细胞的功能来控制炎症反应的特性，许多实验报道通过增加treg细胞活性的作用来治疗免疫疾病。在不受treg细胞控制的自身免疫疾病的情况下，已经强调开发了靶向抑制th1和th17细胞活化的自身免疫疾病治疗剂。除了通过抑制t细胞的活化治疗免疫疾病之外，目前正在开发控制免疫细胞分泌的细胞因子数量的疗法，以及使用靶向免疫细胞分泌的细胞因子的抗体的疗法。然而，其中，使用抗体的方法的问题在于制造成本高且给药不方便。因此，需要开发一种新的低分子量化合物免疫疾病治疗剂，其可以口服给药，对各种自身免疫疾病具有优异的治疗和预防效果。


技术实现要素：

10.本发明的一个目的是提供杂芳基氨基吡啶醇衍生物。
11.本发明的另一个目的是提供一种制备杂芳基氨基吡啶醇衍生物的方法。
12.本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物组合物，该药物组合物包含杂芳基氨基吡啶醇衍生物作为活性成分。
13.为了实现上述目的，在本发明的一个方面中，本发明提供一种式1所示的化合物、其异构体、其溶剂化物、其水合物或其药学上可接受的盐：
14.[通式1]
[0015][0016]
(在式1中，
[0017]
a、r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r
10
如本说明书所定义)。
[0018]
在本发明的另一个方面中，本发明提供一种制备式1所示的化合物的方法，该方法包括通过使式2所示的化合物与式3所示的化合物反应制备式1所示的化合物的步骤，如下述反应式1所示：
[0019]
[反应式1]
[0020][0021]
(在反应式1中，
[0022]
a、r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r
10
如本说明书所定义)。
[0023]
在本发明的另一个方面中，本发明提供一种制备式1所示的化合物的方法，该方法包括如下步骤，如下述反应式2所示：
[0024]
通过使式2a所示的化合物与式3所示的化合物反应制备式4所示的化合物(步骤1)；
[0025]
通过将上述步骤1中获得的式4所示的化合物脱保护，制备式1a所示的化合物(步骤2)；以及
[0026]
通过使上述步骤2中获得的式1a所示的化合物与式5所示的化合物反应，制备式1b所示的化合物(步骤3)：
[0027]
[反应式2]
[0028][0029]
(在反应式2中，
[0030]
a、r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r
10
如本说明书所定义，但r6为氢时除外；
[0031]
式1a所示的化合物是式1的衍生物，其中r6是氢；
[0032]
式1b表示的化合物是式1的衍生物，但r6为氢时除外；
[0033]
pg1为醇保护基，选自乙酰基(ac)、苯甲酰基(bz)、苄基(bn)、甲硫基甲醚、mem(β-甲氧乙氧甲基醚)、dmt(二甲氧基三苯甲基，[双-(4-甲氧苯基)苯甲基])、mom(甲氧甲基醚)、mmt(甲氧三苯甲基[(4-甲氧苯基)二苯基甲基])、pmp(对甲氧苄基醚)、piv(叔戊酰基)、thp(四氢吡喃)、thf(四氢呋喃)和三苯甲基(三苯甲基，tr)；以及
[0034]
x为卤素)。
[0035]
在本发明的另一个方面中，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含式1所示的化合物、其异构体、其溶剂化物、其水合物或其药学上可接受的盐作为用于预防或治疗自身免疫性疾病的活性成分。
[0036]
在本发明的另一个方面中，本发明提供一种健康功能性食品，该健康功能性食品包含式1所示的化合物、其异构体、其溶剂化物、其水合物或其药学上可接受的盐作为用于预防或改善自身免疫性疾病的活性成分。
[0037]
在本发明的另一个方面中，本发明提供一种预防或治疗自身免疫性疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用药物组合物或健康功能性食品的步骤，所述药物组合物或健康功能性食品包含式1所示的化合物、其异构体、其溶剂化物、其水合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。
[0038]
在本发明的另一个方面中，本发明提供上述药物组合物或保健功能性食品用于预防或治疗自身免疫性疾病的用途，所述药物组合物或保健功能性食品包含式1所示的化合物、其异构体、其溶剂化物、其水合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。
[0039]
有益效果
[0040]
本发明的杂芳基氨基吡啶醇衍生物具有优异的抑制粘附至肠上皮细胞的tnf-α或il-6诱导的单核细胞，并被证明在体内对炎性肠病和类风湿性关节炎具有治疗作用。因此，杂芳基氨基吡啶醇衍生物可有利地用于治疗自身免疫性疾病，特别是炎性肠病或类风湿性关节炎。
附图说明
[0041]
图1示出在实验例3的tnbs诱导的炎性肠病动物模型中，测量根据本发明的化合物治疗肠粘膜损伤恢复效果的一组图，图1a：通过评分显示结肠粘膜损伤和恢复程度的图，图1b：用苏木精和曙红染色的结肠组织图像。
[0042]
图2a示出在实验例4的dss诱导的慢性肠炎动物模型中测定本发明的化合物的药理作用的给药时间示意图。
[0043]
图2b示出在实验例4的dss诱导的慢性肠炎动物模型中根据本发明的化合物治疗的体重变化示意图。
[0044]
图2c示出在实验例4的dss诱导的慢性肠炎动物模型中根据本发明的化合物治疗的结肠的形态学变化示意图。
[0045]
图2d示出在实验例4的dss诱导的慢性肠炎动物模型中根据本发明的化合物治疗的肠重量变化示意图。
[0046]
图3a示出在实验例4的dss诱导的急性肠炎动物模型中本发明的化合物的药理作用的给药时间示意图。
[0047]
图3b示出在实验例4的dss诱导的急性肠炎动物模型中根据本发明化合物治疗的体重变化示意图。
[0048]
图3c示出在实验例4的dss诱导的急性肠炎动物模型中根据本发明的化合物治疗的结肠的形态学变化示意图。
[0049]
图3d示出在实验例4的dss诱导的急性肠炎动物模型中根据本发明化合物治疗的肠重量变化示意图。
[0050]
图4示出在实验例4的浓度依赖性功效测量实验中观察小鼠结肠形状后通过对肠组织进行苏木精-伊红染色得到的肠粘膜损伤程度的一组图，图4a：示出结肠粘膜损伤程度评分和比较示意图，图4b：形态学观察后，用苏木精和曙红染色的结肠组织图像。
[0051]
图5a示出在实验例5的类风湿性动物模型中用本发明的化合物治疗的关节炎评分图。
[0052]
图5b示出在实验例5的类风湿性动物模型中用本发明的化合物处理的小鼠爪厚的变化图。
[0053]
图5c示出在实验例5的类风湿性动物模型中用本发明的化合物处理的小鼠体重变化图。
[0054]
图6示出在实验例5的类风湿性动物模型中根据本发明的化合物治疗的关节炎程度周变化的一组图。
[0055]
图7示出在实验例5的类风湿动物模型中根据本发明的化合物处理的通过苏木精-伊红染色和番红o染色的关节组织恢复程度(评分)的一组图像。图7a：苏木精-曙红染色和番红o染色的图像，图7b：示出转化为评分的关节组织恢复程度图。
[0056]
图8a示出在实验例5的类风湿性动物模型中对用本发明的化合物处理的脾脏中免疫细胞总数进行分析的结果图。
[0057]
图8b示出在实验例5的类风湿性动物模型中对用本发明的化合物处理的脾脏内炎症细胞数进行分析的结果图。
[0058]
图8c示出在实验例5的类风湿性动物模型中对用本发明的化合物处理的引流淋巴
结中炎症细胞数进行分析的结果图。
具体实施方式
[0059]
下文将详细描述本发明。
[0060]
本发明的实施方式可以以各种其它形式修改，并且本发明的范围不限于下面描述的实施方式。本领域的普通技术人员应当理解，给出本发明的实施方式是为了更精确地解释本发明。此外，除非另外特别说明，否则本发明中“包括”某个元素并不排除其他元素，而是可以包括其他元素。
[0061]
在本发明的一个方面中，本发明提供一种式1所示的化合物、其异构体、其溶剂化物、其水合物或其药学上可接受的盐。
[0062]
[式1]
[0063][0064]
(在式1中，
[0065]
a为nra、o或s，其中ra为氢或直链或支链c
1-5
烷基；
[0066]
r1、r2、r3、r4和r5独立地为氢、卤素、直链或支链c
1-5
烷基或直链或支链c
1-5
烷氧基，其中所述烷基和烷氧基能够独立地被一个或多个卤素取代；
[0067]
r6为氢、直链或支链c
1-5
烷基、-(ch2)mc(＝o)nh(ch2)nrb或-c(＝o)rc，其中所述烷基能够被一个或多个卤素取代，并且m和n独立地为0至5的整数，
[0068]
rb是氢、直链或支链c
1-10
烷基、c
3-10
环烷基或c
6-10
芳基，
[0069]
rc是金刚烷基含有一个或多个选自n、o和s的杂原子的3-10元杂环烷基，c
6-10
芳基，或含有一个或多个选自n、o和s的杂原子的5-10元杂芳基，其中所述芳基和杂芳基能够独立地被至少一个选自卤素、直链或支链c
1-5
烷基和直链或支链c
1-5
烷氧基的基团取代；
[0070]
r7、r8和r9独立地为直链或支链c
1-5
烷基；以及
[0071]r10
为氢或直链或支链c
1-5
烷基)。
[0072]
在上式1中，a是nra、o或s，其中ra是氢或直链或支链c
1-3
烷基；
[0073]
r1、r2、r3、r4和r5独立地为氢、卤素、直链或支链c
1-3
烷基、或直链或支链c
1-3
烷氧基，其中所述烷基和烷氧基能够独立地被一个或多个卤素取代；
[0074]
r6为氢、直链或支链c
1-3
烷基、-(ch2)mc(＝o)nh(ch2)nrb或-c(＝o)rc，其中所述烷基能够被一个或多个卤素取代，并且m和n独立地为0至3的整数，
[0075]
rb是氢、直链或支链c
1-6
烷基、c
3-8
环烷基或苯基，
[0076]
rc是金刚烷基含有一个或多个选自n、o和s的杂原子的3-8元杂环烷基，苯基，或含有一个或多个选自n、o和s的杂原子的5-6元杂芳基，其中所述苯基和杂芳基能够独立地被至少一个选自卤素、直链或支链c
1-3
烷基和直链或支链c
1-3
烷氧基的基团取代；
[0077]
r7、r8和r9独立地为直链或支链c
1-3
烷基；以及
[0078]r10
为氢或直链或支链c
1-3
烷基。
[0079]
在上式1中，a是nra、o或s，其中ra是氢或甲基；
[0080]
r1、r2、r3、r4和r5独立地为氢、-cl、-br、-f、甲基、甲氧基、-cf3或-ocf3；
[0081]
r6为氢、甲基、-(ch2)mc(＝o)nh(ch2)nrb或-c(＝o)rc，其中m为1，n为0或1，
[0082]
rb是氢、直链或支链c
1-3
烷基、c
3-6
环烷基或苯基，
[0083]
rc是金刚烷基含有一个或多个选自n、o和s的杂原子的6元杂环烷基，苯基，或含有一个或多个选自n、o和s的杂原子的6元杂芳基，其中所述苯基和杂芳基能够独立地被至少一个选自卤素和直链或支链c
1-3
烷氧基的基团取代；
[0084]
r7、r8和r9是甲基；以及
[0085]r10
为氢或甲基。
[0086]
在上式1中，r6为氢、甲基、-(ch2)c(＝o)nhrb或-c(＝o)rc，
[0087]
rb是氢、异丙基、环丙基、环己基、苯基或苄基，
[0088]
rc是金刚烷基吗啉基、苯基或吡啶基，其中所述苯基和吡啶基能够独立地被至少一个选自f、cl和甲氧基的基团取代。
[0089]
根据本发明的式1所示的化合物的实例包括以下化合物：
[0090]
《1》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-1h-吲哚-2-甲酰胺；《2》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-1-甲基-1h-吲哚-2-甲酰胺；《3》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-7-溴-1h-吲哚-2-甲酰胺；《4》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-6-氯-1h-吲哚-2-甲酰胺；《5》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-6-溴-1h-吲哚-2-甲酰胺；《6》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-氟-1h-吲哚-2-甲酰胺；《7》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-溴-1h-吲哚-2-甲酰胺；《8》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-氯-1h-吲哚-2-甲酰胺；《9》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-甲基-1h-吲哚-2-甲酰胺；《10》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-(三氟甲基)-1h-吲哚-2-甲酰胺；《11》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-(三氟甲氧基)-1h-吲哚-2-甲酰胺；《12》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-6-甲氧基-1h-吲哚-2-甲酰胺；《13》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-甲氧基-1h-吲哚-2-甲酰胺；《14》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5，6-二甲氧基-1h-吲哚-2-甲酰胺；《15》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)苯并呋喃-2-甲酰胺；《16》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-氯苯并呋喃-2-甲酰胺；《17》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲
三甲基吡啶-3-基4-氟苯甲酸酯；《62》3-甲氧基苯甲酸6-(3-氯-6-氟苯并[b]噻吩-2-甲酰胺基)-2，4，5-三甲基吡啶-3-基酯；《63》6-(3-氯-6-氟苯并[b]噻吩-2-甲酰胺基)-2，4，5-三甲基吡啶-3-基4-甲氧基苯甲酸；《64》5-氟吡啶甲酸6-(3-氯-6-氟苯并[b]噻吩-2-甲酰胺基)-2，4，5-三甲基吡啶-3-基酯；《65》6-(3-氯-6-氟苯并[b]噻吩-2-甲酰胺基)-2，4，5-三甲基吡啶-3-基6-氟烟酸酯；《66》6-(3-氯-6-氟苯并[b]噻吩-2-甲酰胺基)-2，4，5-三甲基吡啶-3-基5-氯吡啶甲酸酯；《67》6-(3-氯-6-氟苯并[b]噻吩-2-甲酰胺基)-2，4，5-三甲基吡啶-3-基-6-氯吡啶甲酸酯；《68》6-(3-氯-6-氟苯并[b]噻吩-2-甲酰胺基)-2，4，5-三甲基吡啶-3-基(3r，5r，7r)-金刚烷-1-羧酸酯；《69》6-(3-氯-6-氟苯并[b]噻吩-2-甲酰胺基)-2，4，5-三甲基吡啶-3-基吗啉-4-甲酸酯。
[0091]
本发明式1所示的化合物能够用作药学上可接受的盐，其中所述盐优选为由药学上可接受的游离酸形成的酸加成盐。本文所述的酸加成盐可以由无机酸、无毒有机酸或有机酸获得，所述无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚硝酸和亚磷酸；所述无毒有机酸例如脂肪族单/二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸和脂族/芳族磺酸；所述有机酸例如乙酸、苯甲酸、柠檬酸、乳酸、马来酸、葡糖酸、甲磺酸、4-甲苯磺酸、酒石酸和富马酸。药学上无毒的盐的实例为硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、氟化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、癸酸盐、庚酸盐、丙酸盐(propiolate)、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐(cabacate)、富马酸盐、马来酸盐(maliate)、丁炔-1，4-二酸盐、己烷-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、羟基丁酸盐、乙醇酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐和扁桃酸盐。
[0092]
根据本发明的酸加成盐可通过本领域技术人员已知的常规方法制备。例如，将式1所示的衍生物溶解在有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙腈中，向其中加入有机酸或无机酸以诱导沉淀。然后，过滤沉淀物并干燥，获得盐。或者将溶剂和过量的酸减压蒸馏，干燥，获得盐。或者在有机溶剂中结晶沉淀物，获得盐。
[0093]
使用碱可制备药学上可接受的金属盐。通过以下方法获得碱金属或碱土金属盐：将化合物溶于过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中；过滤不溶性复合盐；蒸发剩余溶液并干燥。此时，优选将金属盐制备成药学上合适的钠盐、钾盐或钙盐的形式。相应的盐是通过碱金属或碱土金属盐与适当的银盐(例如硝酸银)反应制备的。
[0094]
另外，本发明不仅包括式1所示的化合物，而且包括其药学上可接受的盐，以及可能由其产生的溶剂化物、光学异构体或水合物。
[0095]
术语“水合物”是指含有通过非共价分子间力结合的化学计量或非化学计量的水的本发明的化合物或其盐。本发明式1所示的化合物的水合物可以含有化学计量或非化学计量的通过非共价分子间力结合的水。所述水合物可以含有1当量或更多的水，优选1-5当量的水。所述水合物可以通过从水或含水溶剂中结晶式1所示的化合物、其异构体或其药学上可接受的盐来制备。
[0096]
术语“溶剂化物”是指含有通过非共价分子间力结合的化学计量或非化学计量的
溶剂的本发明的化合物或其盐。优选的溶剂包括挥发性的、无毒的和/或适合应用于人的溶剂。
[0097]
术语“异构体”是指具有相同化学式或分子式、但结构或空间上不同的本发明化合物或其盐。这些异构体包括结构异构体如互变异构体、具有不对称碳中心的r或s异构体，立体异构体如几何异构体(反式，顺式)和光学异构体(对映体)。所有这些异构体及其混合物也包括在本发明的范围内。
[0098]
本发明的式1所示的化合物可以根据以下反应式1或反应式2所示的制备方法来制备，但这仅是实例，且不限于此，并且每个制备步骤可以使用本领域技术人员公知的方法来执行。
[0099]
本发明式1所示的化合物可通过制备式1所示的化合物的方法来制备，该方法包括使式2所示的化合物与式3所示的化合物反应制备式1所示的化合物的步骤，如以下反应式1所示：
[0100]
[反应式1]
[0101][0102]
(在反应式1中，
[0103]
a、r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r
10
如式1中所定义)。
[0104]
如反应式1所示，式2所示的化合物的胺与式3所示的化合物的cl反应，以制备式1所示的化合物，其中形成酰胺键。上述步骤可以使用本领域技术人员公知的方法进行，且可以根据本发明的实施方式来制备所述化合物，但是这仅是实例并且不限于此。
[0105]
本发明的式1所示的化合物可通过制备式1所示化合物的方法来制备，该方法包括如下步骤，如以下反应式2所示：
[0106]
通过使式2a所示的化合物与式3所示的化合物反应制备式4所示的化合物(步骤1)；
[0107]
通过将上述步骤1中获得的式4所示的化合物脱保护来制备式1a所示的化合物(步骤2)；以及
[0108]
通过使上述步骤2中获得的式1a所示的化合物与式5所示的化合物反应来制备式1b所示的化合物(步骤3)：
[0109]
[反应式2]
[0110][0111]
(在反应式2中，
[0112]
a、r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r
10
如式1中所定义，但是r6为氢时除外；
[0113]
式1a所示的化合物是式1的衍生物，其中r6是氢；
[0114]
式1b所示的化合物是式1的衍生物，但是r6是氢时除外；
[0115]
pg1为醇保护基，选自乙酰基(ac)、苯甲酰基(bz)、苄基(bn)、甲硫基甲基醚、mem(β-甲氧基乙氧基甲基醚)、dmt(二甲氧基三苯甲基，[双-(4-甲氧苯基)苯甲基])、mom(甲氧甲基醚)、mmt(甲氧三苯甲基[(4-甲氧苯基)二苯甲基])、pmp(对甲氧基苄基醚)、piv(叔戊酰基)、thp(四氢吡喃基)、thf(四氢呋喃)和三苯甲基(三苯基甲基，tr)；以及
[0116]
x为卤素)。
[0117]
如反应式2的步骤1所示，式2a所示的化合物的胺与式3所示的化合物的cl反应，以制备式4所示的化合物，其中形成酰胺键。上述步骤可以使用本领域技术人员公知的方法进行，且可以根据本发明的实施方式来制备所述化合物，但是这仅是实例，并不限于此。
[0118]
反应式2的步骤2是通过除去式4所示的化合物的醇保护基来制备式1a所示的醇化合物的步骤，该步骤可以根据能够除去醇保护基的已知方法进行，并且本领域技术人员可以根据保护基的类型容易地选择和进行在何种条件下可以进行除去反应。该化合物可以根据本发明的实施方式来制备，但这仅是实例，并不限于此。
[0119]
方案2的步骤3是通过使式1a所示的化合物的羟基与式4所示的化合物的卤化物反应制备式1b所示的化合物的步骤，上述步骤可以使用本领域技术人员公知的方法进行，并且可以根据本发明的实施方式来制备该化合物，但这仅是实例，并不限于此。
[0120]
在本发明的另一个方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含式1所示的化合物、其异构体、其溶剂化物、其水合物或其药学上可接受的盐作为用于预防或治疗自身免疫性疾病的活性成分。
[0121]
该化合物可以通过tnf-α或il-6抑制单核细胞粘附至肠上皮细胞。
[0122]
自身免疫性疾病可以选自以下的至少一种：炎性肠病、哮喘、1型糖尿病、类风湿性关节炎、风湿性多肌痛、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、银屑病、湿疹、硬化症、白癜风、多发
性硬化症、il-17诱发的痴呆症、周围神经炎、葡萄膜炎、多肌炎/皮肌炎、自身免疫性血细胞减少症、自身免疫性心肌炎、特应性皮炎、原发性肝硬化、干眼综合征、纤维肌痛、古德帕斯丘综合征(goodpasture’s syndrome)、自身免疫性脑膜炎、干燥综合征、系统性红斑狼疮、艾迪生病、斑秃、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、乳糜泻、格林-巴利综合征、桥本病、溶血性贫血、重症肌无力、肌萎缩侧索硬化症、寻常天疱疮、风湿热、结节病、皮肤硬化、脊椎关节炎、甲状腺炎、脉管炎、白癜风、粘液水肿、恶性贫血、抗磷脂综合征、实体器官移植的晚期和慢性排斥反应，以及移植物抗宿主病。
[0123]
炎性肠病可以是选自以下的任一种：肠炎、结肠炎、溃疡性肠炎、克罗恩病、克罗恩细胞瘤、肠易激综合征、出血性直肠溃疡、囊炎、消化性溃疡、肠白塞病和胃炎。
[0124]
在本发明的药物组合物中，式1所示的化合物或其药学上可接受的盐可以口服或肠胃外给药，优选肠胃外给药，并且可以以药物制剂的一般形式使用。即，该化合物或其药学上可接受的盐可以通过与常用的稀释剂或赋形剂如填料、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂混合来制备成用于口服或肠胃外给药的制剂。用于口服给药的固体制剂是片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂和胶囊剂。这些固体制剂通过将一种或多种化合物与一种或多种合适的赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等混合来制备。除了简单的赋形剂之外，可以使用润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石等。口服给药的液体制剂是混悬剂、溶液剂、乳剂和糖浆剂，并且上述制剂除了通常使用的简单稀释剂如水和液体石蜡外，还可以含有各种赋形剂如润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。用于肠胃外给药的制剂是无菌水溶液、水不溶性赋形剂、悬浮液和乳液。除了活性化合物之外，水不溶性赋形剂和混悬液可以含有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射的酯如油酸乙酯等。
[0125]
包含式1所示化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物可以通过肠胃外给药，所述肠胃外给药包括皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射或胸内注射。
[0126]
此时，为了制备用于肠胃外给药的制剂的式1所示的化合物或其药学上可接受的盐，将式1所示的化合物或其药学上可接受的盐与稳定剂或缓冲剂在水中混合以制备溶液或悬浮液，然后将其配制为安瓿或小瓶。本文的组合物可以是无菌的，并且另外含有防腐剂、稳定剂、可湿性粉剂或乳化剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂、以及其它治疗上有用的物质，并且所述组合物可以通过常规混合、制粒或包衣方法配制。
[0127]
用于口服给药的制剂的例子有片剂、丸剂、硬/软胶囊、溶液、悬浮液、乳剂、糖浆、颗粒、酏剂和锭剂等。这些制剂除了活性成分之外还可以包括稀释剂(例如：乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸)和润滑剂(例如：二氧化硅、滑石、硬脂酸盐及其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇)。片剂可以包括粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，并且如果需要，还可以包括崩解剂，例如淀粉、琼脂糖、藻酸或其钠盐或共沸混合物和/或吸收剂、着色剂、香料和甜味剂。
[0128]
在本发明的另一方面中，本发明提供一种健康功能性食品，该健康功能性食品包含式1所示的化合物、其异构体、其溶剂化物、其水合物或其药学上可接受的盐作为活性成分用于预防或改善自身免疫性疾病。
[0129]
在本发明的另一个方面中，本发明提供一种用于预防或治疗自身免疫性疾病的方法，该方法包括向有需要的对象施用药物组合物或健康功能性食品的步骤，所述药物组合
物或健康功能性食品包含式1所示的化合物、其异构体、其溶剂化物、其水合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。
[0130]
在本发明的另一个方面中，本发明提供所述药物组合物或保健功能性食品用于预防或治疗自身免疫性疾病的用途，所述药物组合物或保健功能性食品包含式1所示的化合物、其异构体、其溶剂化物、其水合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。
[0131]
以下，通过实施例和实验例对本发明进行详细说明。
[0132]
然而，以下实施例和实验实施例仅用于说明本发明，本发明的内容并不限于此。
[0133]
《制备实施例1》5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-胺的制备
[0134][0135]
步骤1：4，5-双(氯甲基)-2-甲基吡啶-3-醇盐酸盐(式ii)的合成
[0136]
将socl2(15ml)和dmf(0.38ml)加入盐酸吡哆醇(式i)(10g)中，并将混合物在80℃下搅拌30分钟。将反应混合物冷却到室温，加入et2o(140ml)，在冰冷却下搅拌混合物1小时。在减压下过滤反应溶液中的沉淀固体，过滤的固体用et2o洗涤并干燥，得到白色固体形式的目标化合物ii(11.3g)。
[0137]1h-nmr((cd3)2so)δ8.42(s,1h),4.99(s,2h),4.96(s,2h),2.63(s,3h).
[0138]
步骤2：2，4，5-三甲基吡啶-3-醇(式iii)的合成
[0139]
将锌粉(8.08g)分几次少量加入化合物ii(10g)的乙酸(50ml)悬浮液中，并将混合物在130℃下回流搅拌2小时。将反应混合物冷却至室温，并在减压下过滤除去反应溶液中的固体。然后，用10m naoh溶液将滤液的ph调节至6。用盐饱和滤液，然后用etoac萃取几次。萃取液用饱和盐水洗涤，通过无水mgso4干燥，过滤，并在减压下浓缩。残余物通过柱层析(chcl3：meoh＝20:1)纯化，得到白色固体形式的目标化合物iii(5.2g)。
[0140]1h-nmr((cd3)2so)δ8.49(s,1h),7.72(s,1h),2.31(s,3h),2.12(s,3h),2.08(s,3h).
[0141]
步骤3：6-溴-2，4，5-三甲基吡啶-3-醇(式iv)的合成
[0142]
将1，3-二溴-5，5-二甲基乙内酰脲(dbdmh，2.5g)加入化合物iii(2.5g)的thf悬浮液(30ml)中，然后在室温下搅拌3小时。反应混合物浓缩后，残余物用etoac和水稀释，水层
用etoac萃取。用饱和盐水洗涤etoac溶液，通过无水mgso4干燥，过滤，并在减压下浓缩。残余物通过柱层析(etoac：己烷＝1:4)纯化，得到浅黄色固体形式的目标化合物iv(3.22g)。
[0143]1h-nmr(cdcl3)δ5.56(br s,1h),2.42(s,3h),2.31(s,3h),2.25(s,3h).
[0144]
步骤4：3-(苄氧基)-6-溴-2，4，5-三甲基吡啶(式v)的合成
[0145]
向化合物iv(6.5g)的dmf溶液(15ml)中依次加入k2co3(20.78g)和苄基氯(5.2ml)，然后在室温下搅拌12小时。用etoac稀释反应溶液，用少量水洗涤几次。用饱和盐水洗涤etoac溶液，通过无水mgso4干燥，过滤，并在减压下浓缩。残余物通过柱层析(etoac：己烷＝1:20)纯化，得到白色固体形式的目标化合物v(8.9g)。
[0146]1h-nmr(cdcl3)δ7.38-7.43(m,5h),4.77(s,2h),2.46(s,3h),2.32(s,3h),2.24(s,3h).
[0147]
步骤5：5-(苄氧基)-n-(二苯基亚甲基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-胺(式vi)的合成
[0148]
将苯并酚胺(benzophenoneimine)(1.73ml)加入到化合物v(3g)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(203mg)、2，2'-双(二苯基膦)-1，1'-联萘(249mg)和nao
t
bu(1.36g)的甲苯(30ml)溶液中，并将混合物在回流下搅拌12小时。将反应溶液冷却至室温，用etoac和水稀释。用饱和盐水洗涤etoac溶液数次，通过无水mgso4干燥，过滤，并在减压下浓缩。残余物通过柱层析(etoac：己烷＝1:4)纯化，得到黄色固体形式的目标化合物vi(3.28g)。
[0149]1h-nmr(cdcl3)δ7.80(d,j＝7.1hz,2h),7.17-7.48(m,13h),4.69(s,2h),2.29(s,3h),2.03(s,3h),1.91(s,3h).
[0150]
步骤6：5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-胺(式vii)的合成
[0151]
在冰冷却下，将乙酰氯(3.2ml)逐渐地加入甲醇(20ml)的溶液加入到化合物vi(7.7g)的甲醇(60ml)-thf(20ml)混合溶液中，然后在室温下搅拌12小时。反应溶液在减压下浓缩后，残留物用etoac稀释，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤几次。用饱和盐水洗涤etoac溶液，通过无水mgso4干燥，过滤，并在减压下浓缩。残余物通过柱层析(chcl3：meoh＝20:1)纯化，得到浅黄色固体形式的目标化合物vii(4.36g)。
[0152]1h-nmr(cdcl3)δ7.31-7.45(m,5h),4.68(s,2h),4.25(br s,1h),2.34(s,3h),2.16(s,3h),1.99(s,3h).
[0153]
《实施例的通用制备过程1》
[0154]
根据反应式a的制备方法制备实施例1-26的化合物(化合物ix-01～ix-26)。
[0155]
[反应式a]
[0156][0157]
在上述反应式a中，
[0158]
a、r1、r2、r3、r4和r5如本说明书所定义。
[0159]
具体地，在室温下，将化合物viii(1.5～2.0mmol)和et3n(2.0mmol)依次加入化合物vii(1.0mmol)的ch2cl2(或clch2ch2cl，10ml)溶液中，并将反应混合物在室温～60℃下搅
拌，直至化合物vii在tlc上消失。用ch2cl2稀释反应混合物，并用饱和nahco3水溶液洗涤。ch2cl2溶液通过无水mgso4干燥，过滤，在减压下浓缩，残余物经硅胶柱色谱纯化得到化合物ix-01至ix-26。
[0160]
《实施例1》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-1h-吲哚-2-甲酰胺(式ix-01)的合成
[0161]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0162]1h-nmr(cdcl3)δ9.69(s,1h),8.75(s,1h),7.67(d,j＝7.9hz,1h),7.52-7.27(m,7h),7.19-7.08(m,2h),4.80(s,2h),2.47(s,3h),2.31(s,3h),2.23(s,3h).
[0163]
《实施例2》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-1-甲基-1h-吲哚-2-甲酰胺(式ix-02)的合成
[0164]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0165]1h-nmr(cdcl3)δ8.34(s,1h),7.68(d,j＝8.0hz,1h),7.51-7.32(m,7h),7.15(d,j＝0.5hz,2h),4.80(s,2h),4.06(s,3h),2.47(s,3h),2.30(s,3h),2.23(s,3h).
[0166]
《实施例3》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-7-溴-1h-吲哚-2-甲酰胺(式ix-03)的合成
[0167]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0168]1h-nmr(cdcl3)δ9.45(s,2h),7.60(d,j＝8.0hz,1h),7.51-7.33(m,6h),7.21(s,1h),7.04(d,j＝7.8hz,1h),4.77(s,2h),2.45(s,3h),2.26(s,3h),2.22(s,3h).
[0169]
《实施例4》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-6-氯-1h-吲哚-2-甲酰胺(式ix-04)的合成
[0170]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0171]1h-nmr((cd3)2so)δ11.84(s,1h),10.51(s,1h),7.69(d,j＝8.5hz,1h),7.56-7.35(m,7h),7.08(dd,j＝8.5,1.9hz,1h),4.85(s,2h),2.40(s,3h),2.26(s,3h),2.08(s,3h).
[0172]
《实施例5》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-6-溴-1h-吲哚-2-甲酰胺(式ix-05)的合成
[0173]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0174]1h-nmr((cd3)2so)δ11.84(s,1h),10.52(s,1h),7.65(d,j＝10.3hz,2h),7.58-7.35(m,6h),7.20(dd,j＝8.4,1.2hz,1h),4.86(s,2h),2.40(s,3h),2.27(s,3h),2.09(s,3h).
[0175]
《实施例6》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-氟-1h-吲哚-2-甲酰胺(式ix-06)的合成
[0176]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0177]1h-nmr(cdcl3)δ9.66(s,1h),8.64(s,1h),7.52-7.37(m,5h),7.30(dd,j＝6.6,2.8hz,2h),7.09-6.99(m,2h),4.81(s,2h),2.46(s,3h),2.30(s,3h),2.22(s,3h).
[0178]
《实施例7》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-溴-1h-吲哚-2-甲酰胺(式ix-07)的合成
[0179]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0180]1h-nmr(cdcl3)δ9.93(s,1h),7.80(d,j＝1.7hz,1h),7.50-7.37(m,6h),7.35(d,j＝1.8hz,1h),7.30(s,1h),7.06(d,j＝1.4hz,1h),4.75(s,2h),2.48(s,3h),2.21(d,j＝
8.1hz,6h).
[0181]
《实施例8》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-氯-1h-吲哚-2-甲酰胺(式ix-08)的合成
[0182]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0183]1h-nmr(cdcl3)δ10.25(s,1h),9.18(dd,j＝5.2,2.9hz,1h),7.58(s,1h),7.43(dd,j＝11.2,5.4hz,5h),7.19(d,j＝2.6hz,2h),7.02(s,1h),4.81(s,2h),2.45(s,3h),2.30(s,3h),2.23(s,3h).
[0184]
《实施例9》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-甲基-1h-吲哚-2-甲酰胺(式ix-09)的合成
[0185]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0186]1h-nmr(cdcl3)δ12.72(s,1h),11.04(s,1h),10.37(s,1h),7.84(s,1h),7.55-7.35(m,7h),7.20(d,j＝8.4hz,1h),4.84(s,2h),2.55(s,3h),2.52(s,3h),2.31(s,3h),2.25(s,3h).
[0187]
《实施例10》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-(三氟甲基)-1h-吲哚-2-甲酰胺(式ix-10)的合成
[0188]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0189]1h-nmr(cdcl3)δ10.26(s,1h),9.16(s,1h),7.94(s,1h),7.53-7.33(m,7h),7.17(d,j＝1.3hz,1h),4.83(s,2h),2.46(s,3h),2.32(s,3h),2.24(s,3h).
[0190]
《实施例11》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-(三氟甲氧基)-1h-吲哚-2-甲酰胺(式ix-11)的合成
[0191]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0192]1h-nmr(cdcl3)δ10.06(s,1h),9.03(s,1h),7.53-7.28(m,7h),7.12(d,j＝11.8hz,2h),4.82(s,2h),2.46(s,3h),2.31(s,3h),2.23(s,3h).
[0193]
《实施例12》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-6-甲氧基-1h-吲哚-2-甲酰胺(式ix-12)的合成
[0194]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0195]1h-nmr(cdcl3)δ9.54(s,1h),8.76-8.54(m,1h),7.56-7.35(m,6h),7.03(d,j＝1.8hz,1h),6.81(dd,j＝4.6,2.4hz,2h),4.79(s,2h),3.83(s,3h),2.45(s,3h),2.28(s,3h),2.22(s,3h).
[0196]
《实施例13》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-甲氧基-1h-吲哚-2-甲酰胺(式ix-13)的合成
[0197]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0198]1h-nmr(cdcl3)δ9.72(s,1h),9.24-8.76(m,1h),7.54-7.33(m,5h),7.23(s,1h),7.04(s,2h),6.98-6.89(m,1h),4.78(s,2h),3.83(s,3h),2.46(s,3h),2.28(s,3h),2.22(s,3h).
[0199]
《实施例14》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5，6-二甲氧基-1h-吲哚-2-甲酰胺(式ix-14)的合成
[0200]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0201]1h-nmr(cdcl3)δ9.57(s,1h),7.41(dd,j＝8.6,3.9hz,5h),7.02(s,2h),6.84(s,
1h),4.73(s,2h),3.91(s,6h),2.47(s,3h),2.22(d,j＝4.8hz,6h).
[0202]
《实施例15》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)苯并呋喃-2-甲酰胺(式ix-15)的合成
[0203]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0204]1h-nmr(cdcl3)δ8.60(s,1h),7.70(d,j＝7.7hz,1h),7.59(d,j＝0.8hz,1h),7.57-7.28(m,8h),4.81(s,2h),2.47(s,3h),2.30(s,3h),2.23(s,3h).
[0205]
《实施例16》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-氯苯并呋喃-2-甲酰胺(式ix-16)的合成
[0206]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0207]1h-nmr(cdcl3)δ8.64(s,1h),7.70-7.64(m,1h),7.52(d,j＝0.8hz,1h),7.50-7.36(m,7h),4.81(s,2h),2.46(s,3h),2.30(s,3h),2.22(s,3h).
[0208]
《实施例17》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-溴苯并呋喃-2-甲酰胺(式ix-17)的合成
[0209]
[n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-溴苯并呋喃-2-甲酰胺]
[0210]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0211]1h-nmr(cdcl3)δ8.70(s,1h),7.85(d,j＝1.9hz,1h),7.54(d,j＝3.3hz,2h),7.50-7.38(m,6h),4.81(s,2h),2.47(s,3h),2.31(s,3h),2.22(s,3h).
[0212]
《实施例18》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-7-甲氧基苯并呋喃-2-甲酰胺(式ix-18)的合成
[0213]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0214]1h-nmr(cdcl3)δ8.98(s,1h),7.66-7.59(m,1h),7.51-7.33(m,5h),7.25-7.22(m,2h),6.94(dd,j＝7.3,1.6hz,1h),4.81(s,2h),4.03(s,3h),2.49(s,3h),2.31(d,j＝2.3hz,3h),2.22(s,3h).
[0215]
《实施例19》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-3-甲基苯并呋喃-2-甲酰胺(式ix-19)的合成
[0216]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0217]1h-nmr(cdcl3)δ8.59(s,1h),7.63(d,j＝7.9hz,1h),7.56-7.27(m,8h),4.81(s,2h),2.64(s,3h),2.48(s,3h),2.27(d,j＝10.2hz,6h).
[0218]
《实施例20》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式ix-20)的合成
[0219]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0220]1h-nmr(cdcl3)δ8.69(s,1h),7.97(s,1h),7.90-7.82(m,2h),7.51-7.35(m,7h),4.80(s,2h),2.44(s,3h),2.29(s,3h),2.23(s,3h).
[0221]
《实施例21》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-3-氯苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式ix-21)的合成
[0222]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0223]1h-nmr(cdcl3)δ8.87(s,1h),7.97-7.90(m,1h),7.85(dt,j＝5.2,3.3hz,1h),7.54-7.39(m,7h),4.81(s,2h),2.48(s,3h),2.29(s,3h),2.24(s,3h).
[0224]
《实施例22》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-3-溴苯并[b]噻吩-2-甲酰
胺(式ix-22)的合成
[0225]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0226]1h-nmr(cdcl3)δ8.89(s,1h),7.97-7.82(m,2h),7.56-7.38(m,7h),4.81(s,2h),2.47(s,3h),2.30(s,3h),2.25(s,3h).
[0227]
《实施例23》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-3-氯-6-甲基苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式ix-23)的合成
[0228]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0229]1h-nmr(cdcl3)δ10.27(s,1h),8.65(s,1h),8.34(d,j＝1.6hz,1h),7.91(d,j＝8.7hz,1h),7.63(dd,j＝8.7,1.9hz,1h),2.32(s,3h),2.18(s,3h),2.10(s,3h).
[0230]
《实施例24》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-3-氯-6-氟苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式ix-24)的合成
[0231]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0232]1h-nmr(cdcl3)δ8.84(s,1h),7.89(dd,j＝9.0,5.0hz,1h),7.58-7.50(m,1h),7.49-7.33(m,5h),7.32-7.27(m,1h),4.81(s,2h),2.47(s,3h),2.30(s,3h),2.24(s,3h).
[0233]
《实施例25》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-3，6-二氯苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式ix-25)的合成
[0234]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0235]1h-nmr(cdcl3)δ8.97-8.61(m,1h),7.84(dd,j＝5.2,3.4hz,2h),7.53-7.34(m,6h),4.81(s,6h),2.46(s,3h),2.29(s,3h),2.24(s,3h).
[0236]
《实施例26》n-(5-(苄氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-3-氯-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式ix-26)的合成
[0237]
目标化合物按照实施例的通用制备过程1的方法来制备。
[0238]1h-nmr(cdcl3)δ8.77(s,1h),7.79(d,j＝9.0hz,1h),7.53-7.33(m,5h),7.12(dd,j＝9.0,2.3hz,1h),4.81(s,2h),3.91(s,3h),2.47(s,3h),2.29(s,3h),2.23(s,3h).
[0239]
《实施例的通用制备过程2》
[0240]
按照以下反应式b的制备方法来制备实施例27-52的化合物(化合物x-01～x-26)。
[0241]
[反应式b]
[0242][0243]
在上述反应式b中，
[0244]
a、r1、r2、r3、r4和r5如本说明书所定义。
[0245]
将五甲基苯(3.0mmol)加入化合物ix(1.0mmol)的ch2cl2(10ml)中，并将反应溶液用冰冷却。向其中缓慢加入1m bcl3的ch2cl2溶液(2.0mmol)，冰冷却下搅拌反应混合物直到tlc上的化合物ix消失。向反应溶液中加入10ml chcl3和meoh(9:1)的混合溶液，室温搅拌
30分钟，然后在减压下浓缩。残余物通过硅胶柱层析纯化，得到化合物x-01～x-26。
[0246]
《实施例27》n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-1h-吲哚-2-甲酰胺(式x-01)的合成
[0247]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0248]1h-nmr((cd3)2so)δ11.64(s,1h),10.24(s,1h),8.60(s,1h),7.64(d,j＝8.0hz,1h),7.45(d,j＝8.2hz,1h),7.36(d,j＝1.4hz,1h),7.31-7.13(m,1h),7.10-6.99(m,1h),2.35(s,3h),2.18(s,3h),2.05(s,3h).
[0249]
《实施例28》n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-1-甲基-1h-吲哚-2-甲酰胺(式x-02)的合成
[0250]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0251]1h-nmr((cd3)2so)δ10.18(s,1h),8.56(s,1h),7.67(d,j＝7.9hz,1h),7.55(d,j＝8.4hz,1h),7.34-7.25(m,2h),7.13(dd,j＝11.0,3.9hz,1h),4.00(s,3h),2.35(s,3h),2.18(s,3h),2.07(s,3h).
[0252]
《实施例29》7-溴-n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-1h-吲哚-2-甲酰胺(式x-03)的合成
[0253]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0254]1h-nmr((cd3)2so)δ11.62(s,1h),10.64(d,j＝0.8hz,1h),9.09-8.86(m,1h),7.70(d,j＝7.9hz,1h),7.46(dd,j＝14.5,4.5hz,2h),7.04(t,j＝7.8hz,1h),2.39(s,3h),2.22(s,3h),2.09(s,3h).
[0255]
《实施例30》6-氯-n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-1h-吲哚-2-甲酰胺(式x-04)的合成
[0256]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0257]1h-nmr((cd3)2so)δ11.83(s,1h),10.36(s,1h),8.65(s,1h),7.68(d,j＝8.5hz,1h),7.42(d,j＝14.2hz,2h),7.07(dd,j＝8.5,1.6hz,1h),2.34(s,3h),2.17(s,3h),2.03(s,3h).
[0258]
《实施例31》6-溴-n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-1h-吲哚-2-甲酰胺(式x-05)的合成
[0259]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0260]1h-nmr((cd3)2so)δ11.79(s,1h),10.32(s,1h),8.62(s,1h),7.63(d,j＝8.7hz,2h),7.38(d,j＝1.3hz,1h),7.18(dd,j＝8.5,1.8hz,1h),2.35(s,3h),2.18(s,3h),2.04(s,3h).
[0261]
《实施例32》5-氟-n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-1h-吲哚-2-甲酰胺(式x-06)的合成
[0262]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0263]1h-nmr((cd3)2so)δ11.77(s,1h),10.30(s,1h),8.62(s,1h),7.43(dt,j＝6.6,3.0hz,2h),7.35(d,j＝1.5hz,1h),7.07(td,j＝9.4,2.5hz,1h),2.35(s,3h),2.18(s,3h),2.04(s,3h).
[0264]
《实施例33》5-溴-n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-1h-吲哚-2-甲酰胺(式x-07)的合成
[0265]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0266]1h-nmr((cd3)2so)δ11.85(s,1h),10.31(s,1h),8.61(s,1h),7.87(d,j＝1.2hz,1h),7.35(dd,j＝9.5,7.8hz,3h),2.35(s,3h),2.18(s,3h),2.05(s,3h).
[0267]
《实施例34》5-氯-n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-1h-吲哚-2-甲酰胺(式x-08)的合成
[0268]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0269]1h-nmr((cd3)2so)δ11.90(s,1h),10.37(s,1h),8.67(s,1h),7.73(d,j＝1.8hz,1h),7.44(d,j＝8.8hz,1h),7.35(s,1h),7.20(dd,j＝8.8,2.0hz,1h),2.34(s,3h),2.17(s,3h),2.04(s,3h).
[0270]
《实施例35》n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-甲基-1h-吲哚-2-甲酰胺(式x-09)的合成
[0271]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0272]1h-nmr((cd3)2so)δ11.54(d,j＝1.1hz,1h),10.22(s,1h),8.63(s,1h),7.41(s,1h),7.30(dd,j＝12.6,4.9hz,2h),7.03(dd,j＝8.4,1.4hz,1h),2.36(d,j＝8.1hz,6h),2.17(s,3h),2.04(s,3h).
[0273]
《实施例36》n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-(三氟甲基)-1h-吲哚-2-甲酰胺(式x-10)的合成
[0274]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0275]1h-nmr((cd3)2so)δ12.13(s,1h),10.44(s,1h),8.64(s,1h),8.10(s,1h),7.62(d,j＝8.7hz,1h),7.59-7.44(m,2h),2.35(s,3h),2.18(s,3h),2.05(s,3h).
[0276]
《实施例37》n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-(三氟甲氧基)-1h-吲哚-2-甲酰胺(式x-11)的合成
[0277]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0278]1h-nmr((cd3)2so)δ12.08(s,1h),10.74(s,1h),9.31(s,1h),7.71(s,1h),7.53(d,j＝9.2hz,2h),7.21(d,j＝8.8hz,1h),2.44(s,3h),2.26(s,3h),2.11(s,3h).
[0279]
《实施例38》n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-6-甲氧基-1h-吲哚-2-甲酰胺(式x-12)的合成
[0280]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0281]1h-nmr((cd3)2so)δ11.42(s,1h),10.07(s,1h),8.54(s,1h),7.51(d,j＝8.7hz,1h),7.28(s,1h),6.90(s,1h),6.71(dd,j＝8.7,2.3hz,1h),3.78(s,3h),2.34(s,3h),2.18(s,3h),2.04(s,3h).
[0282]
《实施例39》n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5-甲氧基-1h-吲哚-2-甲酰胺(式x-13)的合成
[0283]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0284]1h-nmr((cd3)2so)δ11.85(s,1h),10.31(s,1h),8.61(s,1h),7.87(d,j＝1.2hz,1h),7.35(dd,j＝9.5,7.8hz,3h),2.35(s,3h),2.18(s,3h),2.05(s,3h).
[0285]
《实施例40》n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-5，6-二甲氧基-1h-吲哚-2-甲酰胺(式x-14)的合成
[0286]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0287]1h-nmr((cd3)2so)δ11.33(s,1h),10.04(s,1h),8.55(s,1h),7.24(d,j＝1.7hz,1h),7.09(s,1h),6.90(s,1h),3.77(s,6h),2.34(s,3h),2.17(s,3h),2.04(s,3h).
[0288]
《实施例41》n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)苯并呋喃-2-甲酰胺(式x-15)的合成
[0289]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0290]1h-nmr((cd3)2so)δ10.44(s,1h),8.66(s,1h),7.81(d,j＝7.7hz,1h),7.76-7.65(m,2h),7.53-7.45(m,1h),7.35(t,j＝7.5hz,1h),2.34(s,3h),2.17(s,3h),2.04(s,3h).
[0291]
《实施例42》5-氯-n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)苯并呋喃-2-甲酰胺(式x-16)的合成
[0292]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0293]1h-nmr((cd3)2so)δ10.75(s,1h),9.28-9.04(m,1h),7.93(d,j＝2.2hz,1h),7.75(d,j＝9.2hz,2h),7.53(dd,j＝8.7,2.2hz,2h),2.41(s,3h),2.24(s,3h),2.10(s,3h).
[0294]
《实施例43》5-溴-n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)苯并呋喃-2-甲酰胺(式x-17)的合成
[0295]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0296]1h-nmr((cd3)2so)δ10.44(s,1h),8.66(s,1h),7.81(d,j＝7.7hz,1h),7.76-7.65(m,2h),7.53-7.45(m,1h),7.35(t,j＝7.5hz,1h),2.34(s,3h),2.17(s,3h),2.04(s,3h).
[0297]
《实施例44》n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-7-甲氧基苯并呋喃-2-甲酰胺(式x-18)的合成
[0298]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0299]1h-nmr((cd3)2so)δ10.53(s,1h),8.90(d,j＝2.5hz,1h),7.76(s,1h),7.40-7.22(m,2h),7.09(d,j＝7.6hz,1h),3.98(s,3h),2.37(s,3h),2.20(s,3h),2.07(s,3h).
[0300]
《实施例45》n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-3-甲基苯并呋喃-2-甲酰胺(式x-19)的合成
[0301]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0302]1h-nmr((cd3)2so)δ10.10(s,1h),8.58(s,1h),7.77(d,j＝7.7hz,1h),7.62(d,j＝8.2hz,1h),7.55-7.46(m,1h),7.41-7.33(m,1h),2.55(s,3h),2.33(s,3h),2.17(s,3h),2.06(s,3h).
[0303]
《实施例46》n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式x-20)的合成
[0304]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0305]1h-nmr((cd3)2so)δ11.33(s,1h),10.17-9.79(m,1h),8.55(s,1h),8.04(dd,j＝14.2,7.7hz,2h),7.62-7.38(m,2h),2.53(s,3h),2.33(s,3h),2.20(s,3h).
[0306]
《实施例47》3-氯-n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式x-21)的合成
[0307]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0308]1h-nmr((cd3)2so)δ10.26(s,1h),8.67(s,1h),8.13(dd,j＝6.2,3.0hz,1h),7.92(dd,j＝6.3,3.0hz,1h),7.61(dd,j＝6.1,3.2hz,2h),2.33(s,3h),2.18(s,3h),2.11(s,3h).
[0309]
《实施例48》3-溴-n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式x-22)的合成
[0310]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0311]1h-nmr((cd3)2so)δ10.37(s,1h),8.63(s,1h),8.19-8.09(m,1h),7.94-7.84(m,1h),7.60(dd,j＝6.1,3.1hz,2h),2.33(s,3h),2.18(s,3h),2.12(s,3h).
[0312]
《实施例49》3-氯-n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-6-甲基苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式x-23)的合成
[0313]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0314]1h-nmr((cd3)2so)δ10.16(s,1h),8.64(s,1h),7.92(s,1h),7.81(d,j＝8.3hz,1h),7.44(dd,j＝8.3,0.9hz,1h),3.32(s,3h),2.34(s,3h),2.19(s,3h),2.12(s,3h).
[0315]
《实施例50》3-氯-6-氟-n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式x-24)的合成
[0316]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0317]1h-nmr((cd3)2so)δ10.40(s,1h),9.12(s,1h),8.10(dd,j＝9.1,2.3hz,1h),7.96(dd,j＝9.0,5.1hz,1h),7.49(td,j＝9.0,2.4hz,1h),2.40(s,3h),2.23(s,3h),2.14(s,3h).
[0318]
《实施例51》3，6-二氯-n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式x-25)的合成
[0319]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0320]1h-nmr((cd3)2so)δ10.27(s,1h),8.65(s,1h),8.34(d,j＝1.6hz,1h),7.91(d,j＝8.7hz,1h),7.63(dd,j＝8.7,1.9hz,1h),2.32(s,3h),2.18(s,3h),2.10(s,3h).
[0321]
《实施例52》3-氯-n-(5-羟基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-6-甲氧基苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式x-26)的合成
[0322]
目标化合物按照实施例的通用制备过程2的方法来制备。
[0323]1h-nmr((cd3)2so)δ10.16(s,1h),8.64(s,1h),7.92(s,1h),7.81(d,j＝8.3hz,1h),7.44(dd,j＝8.3,0.9hz,1h),3.32(s,3h),2.34(s,3h),2.19(s,3h),2.12(s,3h).
[0324]
《实施例53》3-氯-6-氟-n-(5-甲氧基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式xi-01)的合成
[0325]
将thf和水1:1的混合溶剂(2ml)加入化合物x-24(20mg)中，向其中依次加入k2co3(76mg)和ch3i(34μl)。将反应混合物在室温下搅拌24小时，然后在减压下浓缩。用ch2cl2和水稀释残余物，用ch2cl2萃取水层几次。ch2cl2溶液通过无水mgso4干燥，过滤，并在减压下浓缩。残余物用硅胶柱层析(ch2cl2：meoh＝40:1)纯化，得到白色固体形式的化合物xi-01(13mg)。
[0326]1h-nmr((cd3)2so)δ10.48(s,1h),8.11(dd,j＝9.1,2.3hz,1h),8.00-7.92(m,1h),7.50(td,j＝9.0,2.4hz,1h),3.69(s,3h),2.37(s,3h),2.23(s,3h),2.12(s,3h).
[0327]
《实施例54》3-氯-6-氟-n-(5-甲氧基-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-n-甲基苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式xi-02)的合成
[0328]
将k2co3(17mg)和ch3i(13μl)依次加入化合物x-24(15mg)的dmf(1ml)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌24小时。将反应混合物用etoac稀释，且用水和饱和盐水洗涤。etoac
溶液通过无水mgso4干燥，过滤，并在减压下浓缩。残余物用硅胶柱层析(etoac：己烷＝3:7)纯化，得到黄色固体形式的化合物xi-02(10mg)。
[0329]1h-nmr((cd3)2so)δ7.90(dd,j＝9.1,2.3hz,1h),7.78(dd,j＝8.9,5.1hz,1h),7.36(td,j＝9.0,2.3hz,1h),3.59(s,3h),3.25(s,3h),2.24(s,4h),2.13(s,3h),2.10(s,3h).
[0330]
《实施例的通用制备过程3》
[0331]
按照以下反应式c的制备方法来制备实施例55-59的化合物(化合物xi-03～xi-07)。
[0332]
[反应式c]
[0333][0334]
在上述反应式c中，
[0335]r6a
为-(ch2)mc(＝o)nh(ch2)nrb，m、n和rb如本说明书所定义。
[0336]
将nah(0.3mmol)和n-取代的-2-氯乙酰胺(0.2mmol)依次加入到化合物x-24(0.1mmol)的dmf(1ml)溶液中，然后在室温下搅拌，直到化合物x-24在tlc上消失。将反应混合物用etoac稀释，用水和饱和盐水洗涤。etoac溶液通过无水mgso4干燥，过滤，并在减压下浓缩。用硅胶柱层析纯化得到的残余物，以得到化合物xi-03～xi-07。
[0337]
《实施例55》3-氯-6-氟-n-(5-(2-(异丙基氨基)-2-氧代乙氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式xi-03)的合成
[0338]
目标化合物按照实施例通用制备过程3的方法来制备。
[0339]1h-nmr((cd3)2so)δ10.49(s,1h),8.11(dd,j＝9.1,2.3hz,1h),8.04(d,j＝8.1hz,1h),7.96(dd,j＝9.0,5.1hz,1h),7.50(td,j＝9.0,2.4hz,1h),4.21(s,2h),4.01(tt,j＝13.2,6.6hz,1h),2.38(s,3h),2.25(s,3h),2.12(s,3h),1.14(s,3h),1.13(s,3h).
[0340]
《实施例56》3-氯-n-(5-(2-(环丙基氨基)-2-氧代乙氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-6-氟苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式xi-04)的合成
[0341]
目标化合物按照实施例通用制备过程3的方法来制备。
[0342]1h-nmr(cdcl3)δ9.19(s,1h),7.89(dd,j＝9.0,4.9hz,1h),7.53(dd,j＝8.3,2.1hz,1h),7.33-7.22(m,1h),6.86(s,1h),4.25(s,2h),2.90-2.82(m,1h),2.48(s,3h),2.28(s,3h),2.22(s,3h),0.92-0.84(m,2h),0.68-0.61(m,2h).
[0343]
《实施例57》3-氯-n-(5-(2-(环己基氨基)-2-氧代乙氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-6-氟苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式xi-05)的合成
[0344]
目标化合物按照实施例通用制备过程3的方法来制备。
[0345]1h-nmr(cdcl3)δ9.25(s,1h),7.90(dd,j＝9.0,4.9hz,1h),7.54(dd,j＝8.3,2.2hz,1h),7.32-7.23(m,1h),6.67(d,j＝8.3hz,1h),4.26(s,2h),3.92(dt,j＝10.5,7.4hz,1h),2.51(s,3h),2.30(s,3h),2.23(s,3h),2.04-1.97(m,2h),1.81-1.72(m,2h),
1.66(dd,j＝9.2,3.8hz,1h),1.42(ddd,j＝15.1,9.0,5.8hz,2h),1.34-1.26(m,2h),1.21(d,j＝3.6hz,1h).
[0346]
《实施例58》n-(5-(2-(苄基氨基)-2-氧代乙氧基)-3，4，6-三甲基吡啶-2-基)-3-氯-6-氟苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式xi-06)的合成
[0347]
目标化合物按照实施例通用制备过程3的方法来制备。
[0348]1h-nmr((cd3)2so)δ10.50(s,1h),8.83(t,j＝6.2hz,1h),8.11(dd,j＝9.1,2.3hz,1h),7.96(dd,j＝9.0,5.1hz,1h),7.50(td,j＝9.0,2.4hz,1h),7.37-7.29(m,4h),7.28-7.22(m,1h),4.40(d,j＝6.1hz,2h),4.33(s,2h),2.39(s,3h),2.26(s,3h),2.12(s,3h).
[0349]
《实施例59》3-氯-6-氟-n-(3，4，6-三甲基-5-(2-氧代-2-(苯基氨基)乙氧基)吡啶-2-基)苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(式xi-07)的合成
[0350]
目标化合物按照实施例通用制备过程3的方法来制备。
[0351]1h-nmr((cd3)2so)δ10.53(s,1h),10.14(s,1h),8.13(dd,j＝9.0,2.3hz,1h),7.98(dd,j＝8.9,5.1hz,1h),7.76-7.70(m,2h),7.52(td,j＝9.0,2.4hz,1h),7.40-7.33(m,2h),7.15-7.09(m,1h),4.49(s,2h),2.45(s,3h),2.32(s,3h),2.16(s,3h).
[0352]
《实施例的通用制备过程4》
[0353]
按照下述反应式d的制备方法来制备实施例60-68的化合物(化合物xi-08～xi-16)。
[0354]
[反应式d]
[0355][0356]
在上述反应式d中，
[0357]r6b
为-c(＝o)rc，rc如本说明书所定义。
[0358]
方法(1)：将et3n(0.2mmol)和酰氯(0.1mmol)依次加入化合物x-24(0.1mmol)的ch2cl2(1ml)悬浮液中，随后在室温下搅拌直至化合物x-24在tlc上消失。用ch2cl2稀释反应混合物，并依次用水、饱和nahco3溶液、水和饱和盐水洗涤。ch2cl2溶液通过无水mgso4干燥，过滤，并在减压下浓缩。用硅胶柱层析纯化得到的残余物，以得到化合物xi-08～xi-16。
[0359]
方法(2)：将edci(0.15mmol)、hobt(0.15mmol)和et3n(0.25mmol)加入化合物x-24(0.1mmol)的dmf(1ml)溶液中。加入羧酸(0.2mmol)，在室温下搅拌反应混合物，直到化合物x-24在tlc上消失。用ch2cl2稀释反应混合物，并依次用水和饱和盐水洗涤。ch2cl2溶液通过无水mgso4干燥，过滤，并在减压下浓缩。用硅胶柱层析纯化得到的残余物，以得到化合物xi-08～xi-16。
[0360]
《实施例60》6-(3-氯-6-氟苯并[b]噻吩-2-甲酰胺基)-2，4，5-三甲基吡啶-3-基苯甲酸甲酯(式xi-08)的合成
[0361]
目标化合物按照实施例通用制备过程4的方法(1)制备。
[0362]1h-nmr((cd3)2so)δ10.65(s,1h),8.26-8.21(m,2h),8.12(dd,j＝9.1,2.3hz,1h),
氯吡啶甲酸酯(式xi-15)的合成
[0382]
目标化合物按照实施例通用制备过程4的方法(1)制备。
[0383]1h-nmr((cd3)2so)δ10.66(s,1h),9.22(dd,j＝2.5,0.6hz,1h),8.60(dd,j＝8.4,2.5hz,1h),8.12(dd,j＝9.1,2.3hz,1h),7.98(dd,j＝9.0,5.1hz,1h),7.83(dd,j＝8.4,0.6hz,1h),7.51(td,j＝9.0,2.4hz,1h),2.29(s,3h),2.20(s,3h),2.16(s,3h).
[0384]
《实施例68》6-(3-氯-6-氟苯并[b]噻吩-2-甲酰胺基)-2，4，5-三甲基吡啶-3-基(3r，5r，7r)-金刚烷-1-甲酸酯(式xi-16)的合成
[0385]
目标化合物按照实施例通用制备过程4的方法(1)制备。
[0386]1h-nmr((cd3)2so)δ10.58(s,1h),8.12(dd,j＝9.1,2.3hz,1h),7.97(dd,j＝9.0,5.1hz,1h),7.51(td,j＝9.0,2.4hz,1h),2.20(s,3h),2.15(s,3h),2.07(m,12h),1.76(m,6h).
[0387]
《实施例69》6-(3-氯-6-氟苯并[b]噻吩-2-甲酰胺基)-2，4，5-三甲基吡啶-3-基吗啉-4-羧酸酯(式xi-17)的合成
[0388]
将化合物x-24(200mg)和nah(44mg)溶解在dmf(1.8ml)中，向其中加入1h-咪唑-1-基-4-吗啉基甲酮(100mg)，将混合物在室温下搅拌24小时。用etoac稀释反应溶液，用水和饱和盐水洗涤。etoac溶液通过无水mgso4干燥，过滤，并在减压下浓缩。残余物通过柱层析(ch2cl2：meoh＝99:1)纯化，得到黄色固体形式的目标化合物xi-17(40mg)。
[0389]1h-nmr((cd3)2so)δ10.57(s,1h),8.12(dd,j＝9.1,2.3hz,1h),7.97(dd,j＝9.0,5.1hz,1h),7.51(td,j＝9.0,2.4hz,1h),3.68(s,6h),3.45(d,j＝12.6hz,2h),2.26(s,3h),2.15(s,3h),2.12(s,3h).
[0390]
以上制备的本发明化合物的编号、化学结构和名称总结于下表1中。
[0391]
[表1]
[0392]
[0393]
[0394]
[0395]
[0396]
[0397]
[0398]
[0399]
[0400]
[0401][0402]
《实验例1》抑制tnf-α诱导的单核细胞与肠上皮细胞粘附的活性试验
[0403]
《试验方法》
[0404]
将ht-29人结肠癌上皮细胞和u937人单核细胞在37℃、5％co2培养箱中含有10％fbs和1％青霉素/链霉素(ps)的rpmi 1640培养基中培养。当细胞生长超过培养瓶底部面积的80％时，以1:3的比例传代并用于本实验。将ht-29细胞在24孔板中以2
×
105细胞/cm2的密度进行培养，并且将测试药物在含有1％fbs和1％ps的培养基中预处理1小时。然后，将10μg/ml的bcecf-am处理至其中，并在37℃下反应30分钟。将负载bcecf和tnf-α(10ng/ml)的u937细胞与预先用试验药物处理的ht-29细胞在37℃下反应3小时。反应完成后，除去培养基，用pbs洗涤培养瓶两次，以除去未粘附的u937细胞。在下一步骤中，通过用0.1％triton x-100(0.1m tris)处理来裂解细胞，并在室温下反应30分钟。然后，使用fluostar optima酶标仪(bmg labtechnologies，德国)测量并定量荧光(carvalho等人，1996；thapa等人，2008)。
[0405]
carvalho,d.、savage,c.o.、black,c.m.和pearson,j.d.，硬皮病患者的igg抗内皮细胞自身抗体在体外诱导白细胞粘附到人血管内皮细胞上。诱导粘附分子表达以及参与内皮源性细胞因子(igg antiendothelial cell autoantibodies from scleroderma patients induce leukocyte adhesion to human vascular endothelial cells in vitro.induction of adhesion molecule expression and involvement of endothelium-derived cytokines)，j.clin.invest.97,111-119(1996)。
[0406]
thapa,d.,lee,j.s.,park,s.y.,bae,y.h.,bae,s.k.,kwon,j.b.,kim,k.j.,kwak,m.k.,park,y.j.,choi,h.g.和kim,j.a.，克霉唑通过核因子-κb-依赖性方式抑制白介素-8的表达来改善肠道炎症和异常血管生成(clotrimazole ameliorates intestinal inflammation and abnormal angiogenesis by inhibiting interleukin-8expression through a nuclear factor-kb-dependent manner)，j.pharmacol，
j.pharmacol.exp.ther.327,353-364(2008)。
[0407]
[表2]
[0408][0409]
如表2所示，其显示研究试验药物(1μm)对tnf-α诱导的肠上皮细胞(ht-29)和单核细胞(u937)的粘附的抑制活性的结果，5-asa(阳性对照，是目前用于治疗炎性肠病的临床试验中使用的药物柳氮磺胺吡啶的活性代谢物)的抑制率为3.8％，显示很小的效果，而本发明的化合物x-24的抑制率为90.3％，显示非常优异的活性。
[0410]
另外，化合物x-07的抑制率为88.9％，化合物xi-07的抑制率为84.1％，化合物x-09的抑制率为82.8％，化合物xi-11的抑制率为77.2％。
[0411]
显示50％或更高抑制率的化合物按照抑制活性优异顺序列于以下：化合物xi-17＞化合物xi-06＞化合物xi-03＞化合物x-10＞化合物x-18＞化合物x-12。除化合物xi-09以外，证实所有其它化合物都比5-asa具有更好的抑制活性。
[0412]
上述结果证实本发明的式1所示的化合物可以有效地用于治疗炎性肠病，并且可以看出，本发明的化合物可以用作现有药物的替代物。
[0413]
《实验例2》抑制il-6诱导的单核细胞和肠上皮细胞粘附的活性试验
[0414]
《试验方法》
[0415]
使用与tnf-α相同的方法进行il-6对肠上皮细胞-单核细胞粘附的抑制活性试验。
将ht-29细胞在24孔板中以2
×
105细胞/cm2的密度进行培养，并且将测试药物在含有1％fbs和1％ps的培养基中预处理1小时。然后，将10μg/ml bcecf-am处理至其中，在37℃下反应30分钟。将负载bcecf和il-6(10ng/ml)的u937细胞与预先用试验药物处理的ht-29细胞在37℃下反应3小时。反应完成后，除去培养基，用pbs洗涤培养瓶两次，以除去未粘附的u937细胞。在下一步骤中，通过用0.1％triton x-100(0.1m tris)处理来裂解细胞，并在室温下反应30分钟。然后，使用fluostar optima酶标仪(bmg labtechnologies，德国)测量和定量荧光。
[0416]
[表3]
[0417][0418][0419]
如表3所示，其阐明了研究试验药物(1μm)对il-6诱导的肠上皮细胞(ht-29)和单核细胞(u937)粘附的抑制活性的结果，在1μm的浓度下，现有药物5-asa的抑制率低于1.7％，这显示很小的效果，而托法替尼显示49.1％的抑制率。
[0420]
本发明的化合物x-07的抑制率为80.3％，显示出非常好的活性。另外，化合物x-24的抑制率为79.2％，化合物xi-07的抑制率为72.8％，化合物x-09的抑制率为71.7％，化合物xi-11的抑制率为67％，化合物xi-17的抑制率为59.6％，化合物xi-06的抑制率为
54.1％。证实所有其它化合物具有比5-asa更好的抑制活性。
[0421]
研究两种具有优异活性的化合物对tnf-α和il-6诱导的肠上皮细胞和单核细胞的粘附的抑制活性的结果(ic
50
)如下表4所示。
[0422]
[表4]
[0423]
化合物tnf-α(ic
50
)il-6(ic
50
)5-asa18.1mm25.1mm托法替尼0.70μm0.44μmx-090.30μm0.34μmx-240.23μm0.35μm
[0424]
如表4所示，对于用作对照药物的5-asa而言，抑制通过tnf-α粘附的ic
50
为18.1mm，抑制通过il-6粘附的ic
50
为25.1mm。另一方面，对于本发明化合物x-09而言，抑制通过tnf-α和il-6粘附的ic
50
分别为0.30μm和0.34μm。对于化合物x-24，抑制通过tnf-α和il-6粘附的ic
50
分别为0.23μm和0.35μm。化合物x-09和x-24分别显示出比5-asa高数万倍的优异活性，并且还显示比托法替尼更优异的活性。
[0425]
上述结果证实本发明的式1所示的化合物可以有效地用于治疗炎性肠病，并且可以看出，本发明的化合物可以用作现有药物的替代物。
[0426]
《实验例3》在tnbs诱导的炎性肠病大鼠模型中口服化合物的体内药效测试
[0427]
《试验方法》
[0428]
7-8周龄的sd大鼠(sprague dawley大鼠)购自orientbio(韩国)，用通用固体饲料稳定3天，然后用于本实验。在实验期间自由地供应饲料和水，并且将饲养室的温度维持在25
±
1℃，相对湿度维持在50
±
10％。通过自动照明控制器以12小时的亮-暗循环控制照明管理。实验组被分成5组(对照组，单独tnbs处理组，tnbs 柳氮磺胺吡啶(300mg/kg)处理组，tnbs 托法替尼(30mg/kg)处理组，tnbs 试验药物(1mg/kg)处理组)，其中每组6只动物，并且根据随机区组设计平均体重为180
±
10g。
[0429]
(1)经直肠给予tnbs诱发肠炎
[0430]
大鼠用乙醚麻醉禁食24小时后，使用与聚乙烯导管连接的1ml注射器将0.8ml用50v/v％乙醇稀释的5％的tnbs缓慢注射到结肠腔中，然后将大鼠倒置放置60秒，以防止5％tnbs泄漏至肛门。对于对照组，以与其他组相同的方式仅注射溶剂[50v/v％乙醇](thapa等人，2008)。
[0431]
(2)药物施用
[0432]
为了研究药物的效果，从tnbs治疗后的那天开始，每天以固定的时间给药5天。
[0433]
(3)重量观察
[0434]
用数字质量仪观察每只大鼠从禁食期到tnbs给药和药物施用过程的体重变化。
[0435]
(4)测量结肠重量
[0436]
取出大鼠的结肠，将距肛门5-6cm的组织切成1cm的长度，并测量组织的重量。
[0437]
(5)结肠组织的染色和粘膜损伤的测量
[0438]
将称重的大鼠组织用4％多聚甲醛溶液固定，然后转移至30％蔗糖溶液中。当组织沉降时，将它们取出，用冷冻切片机(microm hm 450，thermo fisher scientific，德国)切成25μm厚，并储存在冷冻保存溶液中。用kpbs洗涤组织切片后，将组织切片附着于载玻片
上，干燥，然后用苏木精和曙红染色并在显微镜下观察。粘膜损伤和恢复程度如下表5所示进行评分，并且确认每只大鼠总分为6分。
[0439]
[表5]
[0440][0441]
《化合物口服给药对tnbs诱导的肠炎的影响分析》
[0442]
将在体外粘附抑制试验中显示优异活性的化合物以固定剂量(1mg/kg)测定的体内肠炎抑制活性作为肠重量恢复率和体重恢复率，结果示于表6。另外，化合物x-09的剂量依赖活性示于表7。
[0443]
[表6]
[0444][0445][0446]
[表7]
[0447][0448]
1.重量变化
[0449]
在体重为180-190g的大鼠中，在用5％tnbs处理诱发肠炎的结肠炎模型中，基于tnbs处理前的体重，在每天的某个时间观察体重变化5天。结果，溶剂处理对照组大鼠的体重持续增加，tnbs处理组大鼠的体重持续降低，从第5天起体重略微恢复，但是与正常组大鼠相比，体重显著降低。以阳性对照组柳氮磺胺吡啶300mg/kg处理的大鼠体重逐渐恢复，尽管与溶剂处理对照组大鼠相比体重降低，但是与单独用tnbs处理的大鼠的相比体重显著增加，导致体重恢复率为50.5％。当给药1mg/kg时，吡啶醇化合物显示60.2％-86.6％的回收率。化合物以优异的重量恢复率的顺序列出如下：化合物x-24、xi-07、x-09及xi-17。对于化合物x-09，剂量依赖性活性是通过在阳性对照组300mg/kg柳氮磺胺吡啶的基础上加入10mg/kg曲安奈德来测量的。结果证实，化合物x-09表现出剂量依赖性体重恢复活性，并且在相同浓度下比去炎松更有效。
[0450]
2.形态学观察
[0451]
给药5天后，取出结肠并目测检查。结果，与对照组大鼠相比，以tnbs处理的大鼠结肠出现水肿和充血，观察到阑尾水肿和充血以及肠组织粘连。在用300mg/kg柳氮磺胺吡啶处理的组(阳性对照组)中，肉眼观察到的症状和其它器官之间的粘连以及结肠充血也被显著抑制。在用吡啶醇化合物处理的组中，与用300mg/kg柳氮磺胺吡啶处理的组相比，症状改善更多。还证实化合物x-09对肠炎显示剂量依赖性治疗活性，并且在相同浓度下比曲安奈德更有效。
[0452]
3.结肠重量的测量
[0453]
大鼠结肠的炎症程度是ibd进展的关键尺度(重要指标)，其比体重变化更重要。提取结肠并测量距离肛门5-6cm的组织重量。结果，与溶剂处理的对照组大鼠相比，单独用tnbs处理的大鼠组中水肿结肠的重量显著增加。在用300mg/kg柳氮磺胺吡啶(阳性对照)处理的大鼠组中，结肠组织的重量恢复率为69.6％。当给药1mg/kg时，吡啶醇化合物显示出79.8％-97.4％的回收率。化合物以优异的重量恢复率的顺序列出如下：化合物x-24、xi-07、x-09及xi-17。也证实化合物x-09显示剂量依赖性体重恢复活性且在相同浓度下比去炎松更有效。
[0454]
4.大鼠结肠粘膜损伤恢复的测量
[0455]
在剂量依赖性活性测量实验中观察结肠的形态学后，进行结肠组织的苏木精-伊红染色，以对结肠粘膜损伤程度进行评分和比较。结果，证实化合物x-09显示剂量依赖性粘膜损伤恢复活性，并且在相同浓度下比去炎松更有效(图1)。
[0456]
从实验例3的结果，证实本发明的式1所示的化合物可以有效地用于治疗炎性肠病，并且可以看出，本发明的化合物可以用作现有药物的替代品。
[0457]
《实验例4》在葡聚糖硫酸钠(dss)诱导的炎性肠病小鼠模型中口服化合物的体内药效试验
[0458]
《试验方法》
[0459]
7-8周龄的c57bl/6小鼠购自orientbio(韩国)，用通用的固体饲料稳定7天，然后用于本实验。在实验期间自由地供应饲料和水，并且将饲养室的温度维持在25
±
1℃，相对湿度维持在50
±
10％。通过自动照明控制器以12小时的亮-暗循环控制照明管理。
[0460]
(1)dss诱导急慢性肠炎及药物预防和治疗效果的测定
[0461]
通过让小鼠自由摄取含有2％dss盐的饮用水(m.w.，36,000～50,000，mp biomedicals，llc，oh，usa)在小鼠中诱导肠炎。对于慢性肠炎模型，使用dss给药的方案在前7天给予dss，给予正常饮用水14天，从第21天开始重复给予dss 7天，并给予正常饮用水7天。该药物从dss处理的第一天每周6天、每天一次给药(图2a)。实验组分为6组(对照组、单独dss处理组、dss 柳氮磺胺吡啶(300mg/kg)处理组、dss 托法替尼(30mg/kg)处理组、dss 试验药物(1mg/kg)处理组和dss 试验药物(3mg/kg)处理组)，其中每组6只动物且根据随机区组设计平均体重为20
±
1g。为了测量药物在急性肠炎模型中的剂量依赖性治疗效果，给予dss5天以诱发肠炎，然后给予药物14天以测量肠炎的恢复和治疗程度(图3a)。该药物在固定时间口服，每日一次，持续10天。
[0462]
(2)重量观察
[0463]
在dss和给药期间，使用数字质量仪观察每只小鼠的体重变化。
[0464]
(3)结肠长度和重量的测量
[0465]
提取小鼠的结肠，并测量从肛门到盲肠的长度和重量。
[0466]
(4)测量mpo
[0467]
通过mpo(嗜中性粒细胞标记酶)的量来测量组织中嗜中性粒细胞浸润程度。用冷pbs洗涤大小为1cm的结肠组织并称重，向其中加入裂解缓冲液(ph7.4，200mm nacl，5mm edta，10mm tris，10％甘油，1mm pmsf，1μg/ml亮抑酶肽和28μg/ml抑肽酶)(500μl/10mg组织重量)，然后用beadd2400匀浆器(beadmark scientific，nj，usa)匀浆。将匀浆后的样品以1500
×
g离心两次，共5分钟，以得到上清液，然后使用试剂盒测定100μl该上清液。将匀浆后的样品以1500
×
g离心两次，共5分钟，以得到上清液，然后用mpo elisa试剂盒(hk210，hycult biotechnology，荷兰)测定100μl的该上清液。将该上清液加入用抗小鼠mpo抗体包被的96孔板(100μl/孔)中，在室温下孵育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤3次。将重构的示踪剂加入板中(100μl/孔)，在室温下反应1小时，洗涤3次，然后将100μl链霉亲和素-过氧化物酶结合物加入板的每个孔中。将板在室温下反应1小时，洗涤，并将100μl tmb底物溶液加入板的每个孔中，随后反应30分钟。通过向板的每个孔中加入100μl终止溶液终止反应，并在450nm处测量吸光度。mpo活性是指在25℃下1分钟内从水中还原的1μm过氧化氢量。这是以1ml结肠组织匀浆中包含的mpo的量计算的。
[0468]
(5)组织染色
[0469]
以与对大鼠结肠组织进行苏木精/伊红染色相同的方式进行组织染色，并以相同的方式应用粘膜损伤和恢复的评分指数。
[0470]
《口服给药化合物对dss诱导的急性和慢性小鼠肠炎的影响分析》
[0471]
测定化合物x-24对dss诱导的慢性小鼠肠炎的抑制活性，结果如表8所示，测定化合物x-09对dss诱导的急性小鼠肠炎的剂量依赖性治疗效果，结果如表9所示。
[0472]
[表8]
[0473][0474]
[表9]
[0475][0476]
1.重量变化
[0477]
在慢性肠炎模型中，在体重为19-21g的小鼠中，通过提供含2％dss的水7天、水14天、然后含2％dss的水7天来诱发慢性炎症，测量吡啶醇化合物的药效。在慢性肠炎模型中观察体重的变化。结果，溶剂(载体)处理的对照组小鼠的体重继续增加，dss处理组小鼠的体重由于dss处理而降低，并且在饮水时开始恢复体重，但是由于第二次施用dss体重再次显著降低。与溶剂处理的对照组小鼠相比，用300mg/kg柳氮磺胺吡啶或30mg/kg托法替尼处
理(阳性对照组)的组的小鼠在35天后的体重恢复率分别为22.8％和29.4％。另一方面，用吡啶醇化合物x-24处理的组的小鼠显示出剂量依赖性体重恢复率(22.8％，73.3％)(图2b)。
[0478]
在急性肠炎模型中，通过在体重为19-21g的小鼠中提供含2％dss的水7天而诱发肠炎，每天的某个时间观察基于dss处理前的体重的体重变化。结果，溶剂处理的对照组小鼠的体重持续增加，dss处理组小鼠的体重持续降低，因此与正常组小鼠相比，体重显著降低。以阳性对照组柳氮磺胺吡啶300mg/kg或托法替尼30mg/kg处理的小鼠的体重逐渐恢复，尽管与溶剂处理的对照组大鼠相比体重降低，但与单独用dss处理的小鼠的体重相比，体重显著增加，导致体重恢复率分别为65.9％和80.9％。测量口服给予化合物x-09对dss诱导的急性肠炎的剂量依赖性疗效。结果，在化合物浓度分别为0.3、1、3和10mg/kg时，用吡啶醇化合物x-09处理的小鼠组显示体重恢复率为56.5、72.0、80.7和88.1％(图3b)。
[0479]
2.形态学观察
[0480]
给药7天后，取出结肠并目测。结果，用dss处理的小鼠的结肠与对照组相比显著更短，并且观察到水肿和充血。此外，观察到阑尾水肿和充血以及肠组织粘连。在用300mg/kg柳氮磺胺吡啶或30mg/kg托法替尼处理的组(阳性对照组)中，观察到肠道长度的恢复，并且肉眼可见的症状和其它器官之间的粘连以及结肠充血也被显著抑制。在用吡啶醇化合物处理的组中，观察到比用30mg/kg托法替尼处理的组以及用300mg/kg柳氮磺胺吡啶处理的组症状改善得更多(图2c)。化合物x-09显示出剂量依赖性疗效，且在以10mg/kg化合物x-09处理的组中的治疗效果显著优于以30mg/kg托法替尼处理的对照组(图3c)。
[0481]
3.结肠重量的测量
[0482]
提取小鼠的结肠并测量肛门和盲肠之间的组织重量。结果，与溶剂处理的对照组小鼠相比，单独dss处理组的小鼠水肿的结肠重量显著增加。在慢性肠炎模型中，用300mg/kg柳氮磺胺吡啶或30mg/kg托法替尼处理的小鼠(阳性对照)的肠组织重量的恢复率分别为67.3％和68.8％。化合物x-24在1mg/kg和3mg/kg时表现出剂量依赖性回收率(58.1％和98.2％)(图2d)。
[0483]
在急性肠炎模型中测量化合物的治疗功效。结果，在用300mg/kg柳氮磺胺吡啶或30mg/kg托法替尼处理的组(阳性对照)中观察到肠组织重量恢复。化合物x-09显示出剂量依赖性作用，在3mg/kg和10mg/kg时比阳性对照组显示更好的作用(图3d)。此外，测量mpo的水平，mpo是组织炎症的生化指标。结果，dss引起的mpo显著增加的水平被化合物x-09剂量依赖性地降低，并且用浓度为3mg/kg和10mg/kg的化合物x-09处理的组比阳性对照组显示更好的效果(图3e)。
[0484]
4.小鼠结肠粘膜损伤恢复的测量
[0485]
在剂量依赖性活性测量实验中观察结肠的形态学后，进行结肠组织的苏木精-伊红染色以对结肠粘膜损伤的程度进行评分和比较。结果，化合物x-09显示出剂量依赖性粘膜损伤恢复作用，并且证实该作用优于对照组托法替尼(图4)。
[0486]
实验例4的结果证实本发明的式1所示的化合物可以有效地用于治疗炎性肠病，并且可以看出，本发明的化合物可以用作现有药物的替代物。
[0487]
《实验实施例5》胶原诱导的类风湿性关节炎动物模型中口服化合物的体内药效试验
[0488]
《试验方法》
[0489]
12周龄的正常雄性小鼠和关节炎诱导的dba/1j小鼠购自中心实验室动物有限公司。[为了诱导关节炎，dba/1j小鼠在8周龄时通过在耳廓基部皮内注射完全弗氏佐剂(cfa；difco，detroit，mi)和牛ii型胶原(1:1，v/v)的混合溶液致敏，然后在11周龄时通过在尾部皮内注射进行二次致敏]。将购买的关节炎小鼠适应实验室环境一周，然后开始口服给药。
[0490]
(1)关节炎的肉眼观察和测量
[0491]
基于参考文献(barnett等人，1998)，使用下列评分肉眼观察关节炎损害。
[0492]
0：无水肿或肿胀，
[0493]
1：足部或踝关节局部轻度肿胀或红肿，
[0494]
2：踝关节至跗骨轻度肿胀和红肿，
[0495]
3：踝关节至跗骨中度肿胀和红肿，
[0496]
4：脚踝至整条腿肿胀、发红和关节僵硬。
[0497]
因此，关节炎病变的最高评分是每只小鼠16分。从给药之日起，每周进行两次观察，持续5周，评估数据由两名不认识实验组和对照组的人准备。
[0498]
另外，拍摄照片以视觉上确定关节炎的程度。
[0499]
(2)后爪厚度的测定
[0500]
使用卡尺测量后爪厚度，后爪厚度是类风湿性关节炎的病理指标之一。
[0501]
(3)关节组织染色
[0502]
取出每只小鼠的右后腿，并除去所有皮肤和肌肉，仅留下骨骼和关节。将后腿在4％多聚甲醛溶液中固定2天，然后在10％甲酸中浸泡5天以脱钙，然后在30％蔗糖溶液中浸泡。当组织消退时，用冷冻切片机(microm hm 450，thermo fisher scientific，germany)将关节组织切成30μm厚，并储存在冷冻保存溶液中。使用保存的组织切片进行染色。将组织切片附着到载玻片上后，用100％、95％、70％和50％乙醇溶液水合，一些用番红染色，另一些用苏木精/曙红染色。对于番红染色，首先用0.1％固绿溶液对组织切片进行染色，用1％乙酸溶液洗涤，然后用1％番红溶液染色。然后，按照水合的相反顺序，浸入乙醇溶液中使组织切片脱水，然后在二甲苯溶液和封固溶液中保存，并在显微镜下拍照。以与结肠组织染色相同的方式进行苏木精/伊红染色。将组织切片脱水，在二甲苯溶液和封固溶液中保存，并在显微镜下观察。
[0503]
使用以下评分测量染色的关节组织的显微组织损伤程度。
[0504]
1级：关节面无损伤，
[0505]
2级：关节面不连续，
[0506]
3级：接缝处产生垂直裂纹，
[0507]
4级：接缝处腐蚀，
[0508]
5级：暴露关节侵蚀，
[0509]
6级：关节畸形。
[0510]
(4)淋巴细胞分离和刺激
[0511]
提取小鼠脾脏和引流淋巴结后，计数免疫细胞的数目。为了确定th1和th17细胞的分布，使用pma/离子霉素和golgi stop刺激从每个器官获得的免疫细胞。
[0512]
在使用能够识别th1细胞的抗ifn-γ抗体、能够识别th17细胞的抗il-17抗体和能
够识别细胞毒性t细胞的抗cd8抗体染色后，使用流式细胞术确认总免疫细胞中炎性细胞的比例。
[0513]
barnett ml、kremer jm、st clair ew、clegon do、furst d、weisman m等人，口服ii型胶原治疗类风湿性关节炎，多中心、双盲、安慰剂对照试验的结果(treatment of rheumatoid arthritis with oral type ii collagen.results of a multicenter,double-blind,placebo-controlled trial)，arthritis rheum 1998；41:290-7。
[0514]
《口服给予化合物x-09对胶原诱导类风湿性关节炎(cia)动物模型的作用分析》
[0515]
关节炎程度的目测评分和体重变化如图5所示，关节炎诱导的小鼠平均关节炎评分为12.8，几乎处于相似的水平，直至给药的第4天。溶剂给药组小鼠关节炎程度没有改善，第35天关节炎指数为13.8分。然而，当给予托法替尼或化合物x-09时，关节炎程度以剂量依赖性方式显著改善。在给药的第35天，用50mg/kg化合物x-09处理的组显示最佳的功效，关节炎评分为7.2，接着为用50mg/kg托法替尼处理的组、用10mg/kg化合物x-09处理的组及用1mg/kg化合物x-09处理的组(图5a)。在给药的第四天，关节炎小鼠的后爪厚度为2.58-2.61mm，与正常小鼠的平均后爪厚度1.64mm相比，显著增加。在给药的第35天，炎性水肿导致的后爪厚度增加保持在2.65mm，在用50mg/kg化合物x-09处理的组中，后爪厚度显著降低至1.70mm，后爪厚度按用50mg/kg托法替尼处理组、用10mg/kg化合物x-09处理组和用1mg/kg化合物x-09处理组的顺序降低(图5b)。与同龄正常小鼠相比，关节炎小鼠的体重显著降低，并且体重与关节炎改善的程度成比例地逐渐恢复(图5c)。
[0516]
后爪关节炎程度的每周变化如照片所示(图6)。用苏木精和曙红以及番红o对关节组织进行染色，并将关节组织的恢复程度转换为评分(图7)。
[0517]
给药35天后，从脾脏和引流淋巴结中分离免疫细胞并进行分析。结果证实，脾脏中免疫细胞总数与正常组没有明显差异(图8a)，但是炎性细胞th1和th17的数目以及活化cd8细胞数目明显减少。上述结果证实化合物x-09的剂量依赖性降低(图8b)。在引流淋巴结中炎性细胞th1和th17的数量以及分泌干扰素γ的活化cd8细胞的数量也显著减少(图8c)，化合物x-09显示出剂量依赖性效应。
[0518]
从上述结果可以证实，本发明的式1所示化合物可有效地用于治疗类风湿性关节炎。
[0519]
因此，如上述实验所证实的，本发明的化合物可有效地用作预防和治疗自身免疫性疾病，特别是炎性肠病或类风湿性关节炎的药物组合物。