一种玫瑰皮刺调控基因RrCPC及其应用

一种玫瑰皮刺调控基因rrcpc及其应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种玫瑰皮刺调控基因rrcpc及其应用。


背景技术：

2.玫瑰（rosa rugosa thunb.）是蔷薇科蔷薇属落叶灌木，花香宜人，品种繁多，是我国传统名花，也是名贵的天然香料植物和优良的园林绿化材料。其花可提取玫瑰精油、制成玫瑰花茶、玫瑰酱等，广泛应用于香料、食品以及化妆品等行业，经济和保健价值极高。
3.随着社会经济的发展和人们生活水平的提高，国际国内市场对玫瑰产品的需求逐渐增加，并呈现多元化的特征，对玫瑰的香气、品质、观赏和品种等的要求也日益提高。然而，玫瑰茎杆多刺，在园林应用、田间管理和花朵采摘过程中存在诸多不便，若能培育出少刺或者无刺的玫瑰品种，将极大提高玫瑰田间管理及采摘的工作效率，进而提高玫瑰种植的经济效益。
4.研究表明，植物皮刺是茎表皮形成的尖锐突起，是由表皮毛在长期的进化过程中，为了防御食草动物而不断生长和硬化修饰而来，是一种由皮部发生，不与木质部相连，不含维管束的多细胞、无腺体的特殊形态表皮毛。模式植物拟南芥表皮毛分子调控网络揭示：植物表皮毛的启动是由gl1/myb23（myb类转录因子）、gl3/egl3（bhlh类转录因子）和ttg1（wd40重复蛋白类转录因子）的产物组成的复合体（mbw）控制，mbw直接作用于下游基因gl2，控制拟南芥表皮毛的起始。同时，mbw还可以调控try、cpc等负调节因子向附近的表皮细胞移动，进而抑制表皮毛的发育。
5.cpc基因在拟南芥嫩叶原基和正在发育的表皮毛细胞中均有表达，cpc过表达会导致表皮毛减少，cpc突变体表皮毛则呈簇生状。cpc编码一种r3-myb转录因子，该类转录因子只含有1个dna结合域，缺少转录激活域，能在细胞间移动，与gl3和egl3的末端相互作用，与gl1竞争性地结合到bhlh蛋白上，形成无活性的复合体，从而抑制表皮毛的发育。本研究通过对玫瑰皮刺种类特性的调查，发现紫枝玫瑰具有一级侧枝皮刺较多、二级侧枝皮刺稀疏、三级侧枝光滑无刺的特性，以紫枝玫瑰为试材，克隆玫瑰cpc基因，通过荧光定量pcr及转化拟南芥验证，有助于阐明玫瑰皮刺调控的分子机制，为少刺、无刺玫瑰的基因工程育种提供分子工具，具有降低玫瑰管理和采摘的人工成本的潜在经济价值。


技术实现要素：

6.本发明的目的针对现有技术中存在的不足，提供一种玫瑰皮刺调控基因rrcpc及其应用，一个目的是提供一种玫瑰皮刺调控基因rrcpc负调控皮刺发育，另一目的是提供一种上述玫瑰皮刺调控基因rrcpc的应用。
7.本发明是通过以下技术方案实现：一种玫瑰皮刺调控基因rrcpc，其核苷酸序列如seq id no.1所示。所述玫瑰花香调控基因rrcpc的表达蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.含有所述的玫瑰皮刺调控基因rrcpc的过表达载体。
9.含有所述的玫瑰皮刺调控基因rrcpc的宿主细胞。
10.所述玫瑰皮刺调控基因rrcpc在减少玫瑰皮刺中的应用。
11.有益效果：本发明以紫枝玫瑰为材料，通过race技术克隆了rrcpc基因。通过实时荧光定量检测技术，检测rrcpc基因在玫瑰不同级别侧枝上的表达模式，同时通过构建过表达载体转化拟南芥，证明其为表皮毛发生的负调控因子，对培育少刺或无刺玫瑰新种质、提升玫瑰管理效率有重要应用价值。
12.本发明提供了玫瑰皮刺调控基因rrcpc及其在少刺和无刺玫瑰方面的应用。在无刺玫瑰育种领域有重要应用价值。
附图说明
13.图1是rrcpc基因时空表达模式图；图2是植物过表达载体pcambia1304质粒图谱；图3是t2代转基因拟南芥中rrcpc基因的相对表达量；图4是t3代rrcpc过表达拟南芥和野生型拟南芥的表型；图5是rrcpc过表达拟南芥和野生型拟南芥与在表皮毛分子调控网络中相关基因表达量变化。
具体实施方式
14.下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
15.实施例11、通过race技术克隆rrcpc基因；基于玫瑰转录本，设计race引物，以为玫瑰花器官总rna为模板，获取5’和3’末端片段，克隆入t-载体，对插入片段进行阳性筛选后进行测序，测序结果序列通过重叠区拼接，得到cdna全长。
16.i.引物设计：3’race特异性引物：outer primer：5
’‑
gaagaggtaagcagcatt-3’；inner primer：5
’‑
caggtcggaaagcagaag-3’；3’race接头引物：outer primer：5
’‑
taccgtcgttccactagtgattt-3’；inner primer：5
’‑
cgcggatcctccactagtgatttcactatagg-3’；cgcagagt-3’用于通用接头引物。
[0017]5’
race接头引物：outer primer：5
’‑
ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt-3’；inner primer：5
’‑
ctaatacgactcactatagggc-3’；5’race特异性引物：gene-specific primers ：5
’‑
ttgctattattaagctgctggggttgctg-3’；ii.3
’ꢀ
race 反应过程：
（1）反转录，将以下成分加入到一个置于冰上的rnase-free的小离心管中：1μg total rna，2μl 5
×
primescript buffer，1μl 3
’ꢀ
race adapter(5μm)，1μl dntp mixture(10mm each)，0.25μl rnase inhibitor(40u/μl)，0.25μl primescript rtase(200u/μl)，rnase free dh2o补至10μl。
[0018]
（2）轻轻混匀，短暂离心，42℃温育1h；进入pcr步骤，或-20℃保存反应物；（3）3
’ꢀ
race巢式pcr；反应体系为：50μl的 outer 3
’ꢀ
race组成：5.0μl 10
×
la pcr buffer ii (mg
2 free)，8.0μl 1
×
cdna dilution buffer ii，2.0μl 3
’ꢀ
race gene-specific outer primer，2.0μl 3
’ꢀ
race outer primer (10μm)，2.0 μl rt reaction product，0.5μl takara la taq(5u/μl)，30.5μl ddh2o。
[0019]
反应程序：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，20cycles；72℃10min。
[0020]
μl的 inner 3
’ꢀ
race组成：5.0μl 10
×
la pcr buffer ii (mg
2 free)，8.0μl dntp mixture(2.5mm each)，2.0μl gene-specific inner primer，2.0μl 3
’ꢀ
race inner primer(10μm)，1.0μl outer 3
’ꢀ
race pcr product，0.5μl takara la taq(5u/μl)，31.5μl ddh2o。
[0021]
反应程序：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30cycles；72℃10min。
[0022]
（4）纯化片段与克隆载体的连接反应采用takara公司的pmd19-t simple 载体克隆目的dna分子。
[0023]
反应体系（5μl）：2.2μl纯化回收的pcr产物，0.3μl pmd-19 simple vector，2.5μl solution i。
[0024]
反应条件：16℃30min；4℃保存。
[0025]
（5）大肠杆菌转化：将新鲜制备或-70℃冻存的大肠杆菌top10感受态细胞在冰上融化；取5μl纯化片段与克隆载体的连接产物，加入到100μl感受态细胞中，并轻轻混匀，冰浴30min左右；42℃水浴中热击90sec，迅速置于冰上3-5min；加入800μl lb液体培养基，37℃&100rmp 摇菌1h；4000rmp离心3min，吸掉上层800μl培养基，混匀剩余菌液；将菌液涂抹于含有km的lb筛选培养板上，37℃倒置培养过夜。
[0026]
（6）阳性克隆筛选及测序分析从筛选培养板上挑选单菌落接种于lb液体培养基中，37℃&250rmp摇菌过夜；直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子的pcr检测。
[0027]
反应体系（20.0μl）：2.0μl 10
×
pcr buffer(mg
2 free)，1.5μl mgcl
2 (25mm)，1.3μl dntp mixture (each 2.5mm)，1.0μl 3
’ꢀ
race gene specific inner primer (10μm)，1.0μl 3
’ꢀ
race inner primer(10μm)，0.1μl菌液，1.0μl rtaq，12.1μl milli-q water。
[0028]
反应程序：94℃3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min ，28 cycles；72℃ 7min。
[0029]
菌液pcr检测为阳性的克隆送生工生物公司（上海）测序。
[0030]
iii.生成5’race-ready cdna（1）按下列体积配制 buffer mix 用于cdna 合成反应：4.0μl 5x first-strand buffer，0.5μl dtt(100mm)，1.0μl dntps(20mm)，为保证体积量充足，额外多配制 1 个反应的量。混合以上试剂，在微型离心机上短暂旋转，室温放置，用于后续实验；（2）在单独的微量离心管 tube 中加入下列试剂：1.0μg total rna，1.0μl 5
′‑
cds primer a，加水补至11.0μl；（3）混合组分，在微型离心机上短暂旋转；（4）72℃孵育 3min，42℃冷却 2min。冷却后，14,000 xg 下离心 10sec，把试剂收集在管底（在孵育 tube 的同时，可以准备第6步的混合液）；（5）在5’race cdna 合成反应液中添加1μl的smarter ii oligonucleotide；（6）按下列体积配制 5’race cdna 合成反应液。室温下按下列顺序混合：5.5μl buffer mix （上一步），0.5μl rnase inhibitor(40u/μl)，2.0μl smartscribe reverse transcriptase(100u)；（7）取第 6 步的 master mix 8μl，加入到第 5 步的变性 rna（5’race cdna）中，cdna 合成反应的总体积为 20μl；（8）轻柔吸打混匀，短暂离心收集组分于管底；（9）42℃孵育90min，70℃加热10min；（10）使用 50μl tricine-edta buffer 稀释第一链 cdna 合成反应产物，常温下静置15min ，-20℃保存反应物；iv. 5
’ꢀ
race巢式pcr反应体系（50.0μl）：5.0μl 10
×ꢀ
advantage 2 pcr buffer，5.0μl dntp mixture(each 10 mm)，2.5μl 5
’‑
race ready cdna，1.0μl gsp，1.0μl upm (10x)，1.0μl 50
ꢀ×ꢀ
advantage 2 polymerase mix，34.5μl pcr-grade water。
[0031]
反应程序：94℃30sec，72℃3min，5cycles；94℃30sec，70℃30sec ，72℃3min，5cycles；94℃30sec，68℃30sec ，72℃3min，25cycles。
[0032]
（4）pcr产物克隆测序，操作与3
’ꢀ
race克隆一致。
[0033]
拼接3
’ꢀ
race和5
’ꢀ
race序列得到全长cdna，并利用ncbi-orf finder工具预测其开放阅读框，并设计正向引物5
’‑
gagcggttcaaagatgagca-3’和反向引物5
’‑
ccttgtgaacacacataggtagg-3’，扩增rrcpc基因的表达框验证其真实性。rrcpc的cdna全长797bp，其序列如seq id no.1所示，具有完整的开放阅读框(339bp)、5’非编码区(251bp)、3’非编码区(195bp)，poly(a)尾(12bp)，对应的rrcpc蛋白序列为113个氨基酸残基，其序列如seqid no.2所示。
[0034]
实施例2通过荧光定量pcr技术探究rrcpc基因时空表达模式，基于rrcpc基因的外显子区域设计荧光定量pcr引物正向引物5
’‑
aagccaagacttgcagcagttcc-3
’ꢀ
和反向引物5
’‑
acctgtctccgacgagcttgtac-3’，基于actin基因设计内参引物正向引物5
’‑
tgaggccatttacgacat-3’和反向引物5
’‑
agatcacaggagcataggag-3’。利用sybr premix ex taq（takara公司）和荧光定量pcr仪cfx96tm (bio-rad公司)，参照生产商说明书的pcr体系和程序，进行荧光定量pcr获取达到荧光阈值的循环数，计算出rrcpc基因在紫枝玫瑰一、二、三级侧枝上的相对表达量。
[0035]
如图1所示，rrcpc基因在紫枝玫瑰的一级侧枝（fcb）表皮组织中表达量最低、二级侧枝（scb）表皮组织中表达量稍有提升、三级侧枝（tcb）表皮组织中表达量最高。rrcpc基因表达模式具有一定的部位特异性，在玫瑰一、二、三级侧枝中随着皮刺的减少上调表达。
[0036]
实施例3 rrcpc过表达载体构建和拟南芥遗传转化
为了能更好地阐明rrcpc基因的功能，申请人将其在拟南芥植物中作过量表达，根据转基因植株的表型来进行功能验证。方法如下：利用ncoi酶切位点将rrcpc表达框插入过表达载体pcambia1304的多克隆位点（图2），获得的质粒通过液氮冻融法转化农杆菌eha105感受态，鉴定pcambia1304：rrcpc农杆菌阳性菌株。
[0037]
通过花序蘸染法（常规方法）侵染拟南芥，经过筛选具有潮霉素抗性的转化苗即得到转基因植株。
[0038]
本发明的遗传转化的主要步骤和应用试剂如下所述：i. 试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：km（kanamycin，卡那霉素）；hyg（hygromycin b，潮霉素b）；拟南芥转化辅助试剂（silwet l-77）。
[0039]
ii. 农杆菌介导的遗传转化步骤（1）农杆菌的培养首先，将含有目的载体的农杆菌eha105在含有对应抗性（km）选择的固体lb培养基(10g/l蛋白胨 5g/l酵母提取物 10g/l氯化钠 50mg/l km 15g/l琼脂)上28℃培养2-3天，并挑取阳性单克隆接种于对应抗性（km）选择的液体lb培养基（10g/l蛋白胨 5g/l酵母提取物 10g/l氯化钠 50mg/l km）中，于28℃200rpm摇床培养过夜，至菌液浓度od600值为1.5-2.0。
[0040]
（2）拟南芥花序蘸染法将摇好的菌液4500rpm离心10min，并用5％的蔗糖溶液（附加20μl /100ml的拟南芥转化表面活性剂重悬），将拟南芥花序在重悬液中浸泡30s左右，遮光保湿并横平放置12-24h。
[0041]
（3）阳性苗的筛选侵染放置后，将拟南芥放入培养箱中正常培养，收获的种子在超净工作台通过70％酒精15s-30s和2％次氯酸钠 15min进行消毒，无菌水洗3-4次后平铺于含抗性的1/2ms培养基（1/2ms 30g/l蔗糖 7g/l琼脂 20mg/l hyg）进行筛选；筛选的t1代植株进行pcr阳性检测并移栽至光照培养箱等待收种。
[0042]
实施例4 rrcpc基因转基因植株qrt-pcr检测与表型观测将移栽至土中的转基因拟南芥在16h光照/8h黑暗的光照培养箱中进行培养，成熟收种后使用同上的消毒方式和抗性培养基筛选得到t2代转基因植株，并进行pcr阳性检测。通过观察比较，发现转rrcpc基因的部分拟南芥表皮毛减少（基本无表皮毛）。
[0043]
为了验证t2代转基因拟南芥表皮毛的改变是否与转入的rrcpc基因有关，本发明采取常用的荧光定量pcr方法对五株表型较明显的t2代转基因植株中rrcpc基因的表达量进行了检测，结果如图3。具体步骤如下：采用takara试剂（购自takara公司）从转基因拟南芥中提取叶片的总rna(提取方法根据上述takara试剂说明书操作)，利用反转录酶(takara公司)将其反转录合成cdna，反应条件为42℃ 2min，37℃ 15min，85℃ 5s（参考takara公司反转录试剂盒说明书）。荧光定量pcr方式同实施例2。
[0044]
根据图3的试验结果，以中高表达量的内参基因atactin7作对照，rrcpc基因在野生型拟南芥里没有表达，而在选取的五株转基因样品中大部分与atactin7表达量相似，甚至高于atactin7表达量。这说明rrcpc基因在不同的转基因株系中已实现过表达。从rrcpc
过表达株系中选择了定量结果较为稳定的rrcpc-2、rrcpc-3、rrcpc-4株系单株收种至t3代，并消毒播种，待长大后观察表型。图4a结果显示，从整体上看，相较于野生型，三种过表达株系的莲座叶片表皮毛明显减少，取相似大小的新生叶片放在体视镜下放大观察（图4b），发现部分过表达株系叶片的表皮毛密度不超过野生型的一半，部分叶片边缘存在个别数量的表皮毛，部分叶片表皮光滑，完全没有表皮毛。同样取两种类型拟南芥的主茎近根部和花序作放大观察，相较与野生型，rrcpc过表达株系在这两个部位全都表现为光滑无毛（图4c，图4d）。同时通过转录组测序分析了野生型和rrcpc转基因拟南芥中下游基因atgl2 (nm_001198514.1)的相对表达量，如图5所示，结果表明后者atgl2基因的表达量明显下调，说明rrcpc基因在转基因拟南芥中是通过调控下游基因atgl2的表达来调控表皮毛发育的。
[0045]
玫瑰皮刺和表皮毛是同源物，表皮毛的负调控因子，推测在玫瑰中作为皮刺的负调控因子存在，通过转基因和基因编辑等方式提高其表达水平，可以创制少刺、无刺的玫瑰新种质，为玫瑰日常田间管理、人工采摘提供便利。
[0046]
seq id no.1rrcpc基因核苷酸序列acatggggagcggttcaaagatgagcaagctcttctctcaatgagccatttaaaactgagcctgttttttttcctgtagaaaacaaattcctcttgggaaactatttaaaacccaattcttcccccttctaatcttatcactccaaaaattctacttgggttcctctccctcctctctctttcatctccctgtgttcattctcaaattggcccaactactccaaaagtgcttgtggaaaaagctagcagctatggacgtcaaacgccgcagaaaacaagccaagacttgcagcagttccttctcggaagaggtaagcagcattgagtgggagttcataaacatgtcggaacaagaagaagatctcatttgtagaatgtacaagctcgtcggagacaggtggggacttatagccgggaggcttccgggccggaaagcagaagaaatagagaggttctggttaatgagacacggagaagtatttgcaagtagaagaagaacagagcaggagaagtaccagcaaccccagcagcttaataatagcaataacatgaataagtctactaagaatagtaggagatacaattcttgatcctgatcaatcatcatcattggttttccttgtcagtagtagtaaacagtaggacttagaactagctaaaagaaatttaatttctaattcatgtctctttttttcctttttgaccacctacctatgtgtgttcacaaggtaaggtagctgtgacttacctctttggttaatctatttagacttattacccctcttaaaaaaaaaaaaseq id no.2rrcpc蛋白氨基酸序列mdvkrrrkqaktcsssfseevssiewefinmseqeedlicrmyklvgdrwgliagrlpgrkaeeierfwlmrhgevfasrrrteqekyqqpqqlnnsnnmnkstknsrryns