自动化t细胞培养
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年6月7日提交的美国临时专利申请no.62/858,736的在先申请日的优先权权益，其在此通过引用整体并入本文。
3.序列表的引用
4.本技术通过引用并入了创建于2020年5月27日，并且包含18千字节的以计算机可读形式提交的序列表。
技术领域
5.本公开内容总体涉及细胞培养领域。具体而言，本公开内容涉及用于哺乳动物细胞(例如t细胞)的小规模自动化培养和遗传修饰的系统和方法。
背景技术：
6.多种细胞治疗方法可用于治疗疾病和病症。在细胞治疗方法中存在涉及用重组受体(例如嵌合抗原受体)进行遗传改造的免疫细胞(例如t细胞)的方法。需要用于制造和/或改造这样的细胞治疗的改善的方法，其包括提供更有效的测试多种条件和经遗传改造的t细胞的方法。
技术实现要素：
7.本公开内容的一个方面是作为t细胞的规模缩减(scale-down)制造的自动化方法，其中该方法包括：通过使从一个或更多个供体获得的t细胞输入组与一种或更多种活化试剂接触来活化t细胞输入组，以产生活化的t细胞组；通过使活化的t细胞与重组病毒载体在促进活化的t细胞的病毒感染的条件下接触来转导活化的t细胞组，其中所述重组病毒载体包含编码异源重组蛋白的核酸；通过将活化的t细胞组转移到接种和/或孵育培养基中来接种和/或孵育经转导的t细胞组，通过从接种和/或孵育培养基中回收经转导的t细胞组并将经转导的t细胞组转移到扩增培养基中来扩增经转导的t细胞组；从扩增培养基中回收经转导的t细胞组；以及通过冷冻保存经转导的t细胞组来收获经转导的t细胞组，以产生收获的经转导的t细胞组。
8.在一些实施方案中，该方法还包括设置具有实验室器具和一种或更多种活化试剂的工作台。
9.在以上任何实施方案中，可以自动进行一个或更多个步骤。例如，使从一个或更多个供体获得的t细胞输入组与一种或更多种活化试剂自动接触，使活化的t细胞与重组病毒载体自动接触，将活化的t细胞组自动转移到接种和/或孵育培养基中，从接种培养基中自动回收经转导的t细胞组，并将经转导的t细胞组转移到扩增培养基中，从扩增培养基中自动回收经转导的t细胞组和/或自动冷冻保存经转导的t细胞组。在一些实施方案中，本公开内容涉及t细胞的规模缩减制造的自动化方法，其中该方法包括：通过使从一个或更多个供体获得的t细胞输入组与一种或更多种活化试剂自动接触来活化t细胞输入组，以产生活化
的t细胞组；通过使活化的t细胞与重组病毒载体在促进活化的t细胞的病毒感染的条件下自动接触来转导活化的t细胞组，其中所述重组病毒载体包含编码异源重组蛋白的核酸；通过将活化的t细胞组自动转移到接种和/或孵育培养基中来接种和/或孵育经转导的t细胞组，通过从接种培养基中自动回收经转导的t细胞组并将经转导的t细胞组转移到扩增培养基中来扩增经转导的t细胞组；从扩增培养基中自动回收经转导的t细胞组；以及通过自动冷冻保存经转导的t细胞组来收获经转导的t细胞组，以产生收获的经转导的t细胞组。
10.在可与任何另外的实施方案结合的方法的多个实施方案中，转导包括：获得活化的t细胞组的样品以用于活细胞计数；制备活化的t细胞组用于旋转孵育(spinoculation)；通过使活化的t细胞组与重组病毒载体接触并对活化的t细胞组施加离心力来使活化的t细胞组进行旋转孵育；以及，在转导之后在哺乳动物细胞培养箱中孵育和/或接种活化的t细胞组。在一些实施方案中，可以自动进行以上步骤中的任何一个或更多个。例如：自动获得活化的t细胞组的样品以用于活细胞计数；自动制备活化的t细胞组用于旋转孵育；通过使活化的t细胞组与重组病毒载体接触并对活化的t细胞组施加离心力来使活化的t细胞组进行自动旋转孵育；以及，在转导之后在哺乳动物细胞培养箱中自动孵育和/或接种活化的t细胞组。
11.在一些实施方案中，方法还包括设置具有实验室器具和试剂以用于转导活化的t细胞组的工作台。
12.在方法的多个实施方案中，接种包括：在转导之后获得活化的t细胞组的样品以用于活细胞计数；以及通过将所述活化的t细胞组自动转移至扩增板并将含有所述活化的t细胞组的扩增板置于哺乳动物细胞培养箱中来接种所述活化的t细胞组。在一些实施方案中，可以自动进行以上步骤中的任何一个或更多个。例如，在转导之后自动获得活化的t细胞组的样品以用于活细胞计数。
13.在一些实施方案中，方法还包括设置具有实验室器具和试剂以用于接种活化的t细胞组的工作台。
14.在方法的多个实施方案中，扩增还包括：获得经转导的t细胞组的样品以用于活细胞计数；以及进行模拟灌注/细胞培养基更换。在一些实施方案中，可以自动进行以上步骤中的任何一个或更多个。例如：自动进行模拟灌注/细胞培养基更换。
15.在一些实施方案中，方法还包括设置具有实验室器具和试剂以用于扩增经转导的t细胞组的工作台。
16.在方法的多个实施方案中，脱珠包括：在脱珠步骤之前获得样品以用于活细胞计数；通过施加磁场来使经转导的t细胞组脱珠；以及任选地，在脱珠步骤之后获得样品以用于活细胞计数。在一些实施方案中，可以自动进行以上步骤中的任何一个或更多个。例如：在脱珠步骤之前自动获得样品以用于活细胞计数；通过施加磁场来使经转导的t细胞组自动脱珠；以及任选地，在脱珠步骤之后自动获得样品以用于活细胞计数。
17.在一些实施方案中，方法还包括设置具有实验室器具和试剂以用于脱珠的工作台。
18.在方法的多个实施方案中，收获包括：将经转导的t细胞组置于带有冷冻保存培养基的冷冻瓶中；以及将所述冷冻瓶置于液氮罐中。
19.在一些实施方案中，方法还包括设置具有实验室器具和试剂以用于冷冻保存经转
导的t细胞的工作台。
20.在方法的多个实施方案中，t细胞包括cd4 t细胞。
21.在方法的多个实施方案中，t细胞包括cd8 t细胞。
22.在方法的多个实施方案中，t细胞包括cd4 t细胞和cd8 t细胞。
23.在方法的多个实施方案中，异源重组蛋白包括重组受体。
24.在方法的多个实施方案中，重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关、对疾病、障碍或病症的细胞或组织具有特异性和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
25.在方法的多个实施方案中，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
26.在方法的多个实施方案中，靶抗原是肿瘤抗原。
27.在方法的多个实施方案中，重组受体是或包含功能性非t细胞受体(t cell receptor，tcr)抗原受体或tcr或其抗原结合片段。
28.在方法的多个实施方案中，重组受体是嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)。
29.在方法的多个实施方案中，病毒载体包括是逆转录病毒载体。
30.在方法的多个实施方案中，病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
31.在方法的多个实施方案中，t细胞包括从一个或更多个供体获得的原代t细胞。
32.在方法的多个实施方案中，一个或更多个供体是人对象。
33.关于所公开的方法，提及通过使活化的t细胞与重组病毒载体在促进活化的t细胞的病毒感染的条件下接触来转导活化的t细胞组。然而，考虑了所公开的方法学可包括并入编码异源重组蛋白的核酸的非病毒方法。用于将核酸并入到活化的t细胞组中的非病毒方法学的实例可包括但不限于电穿孔、基于试剂的转染、细胞加压(cell compression)或挤压(squeezing)。考虑了可以自动进行核酸的非病毒并入，例如通过自动电穿孔、基于试剂的自动转染、自动细胞加压、自动挤压等，而不脱离本公开内容的范围。
34.因此，在多个实施方案中，如本文所公开的用于t细胞的规模缩减加工的自动化方法包括：通过使从一个或更多个供体(例如一个或更多个人供体)获得的t细胞输入组与一种或更多种活化试剂自动接触来活化所述t细胞输入组，以产生活化的t细胞组；通过使所述活化的t细胞组与重组多核苷酸在促进所述重组多核苷酸并入到所述活化的t细胞组中的条件下接触，来修饰所述活化的t细胞组以产生经修饰的t细胞组，其中所述重组多核苷酸包含编码异源重组蛋白的核酸；在扩增培养基中扩增经修饰的t细胞组；从扩增培养基中回收经修饰的t细胞组；以及通过自动冷冻保存所述经修饰的t细胞组来收获所述经修饰的t细胞组，以产生收获的经修饰的t细胞组。
35.在方法的多个实施方案中，修饰活化的t细胞组以产生活化的t细胞组还包括通过转导、电穿孔、基于试剂的转染、细胞加压或挤压中的至少一种并入重组多核苷酸。
36.在方法的多个实施方案中，自动进行活化t细胞输入组、修饰活化的t细胞组、扩增经修饰的t细胞组、回收经修饰的t细胞组和收获经修饰的t细胞组中的一个或更多个，而无需操作者干预。
37.例如，在方法的一些实施方案中，方法还包括设置具有用于转导、电穿孔、基于试
剂的转染、细胞加压或挤压以将重组多核苷酸并入到活化的t细胞组中的试剂和/或实验室器具中的一个或更多个的工作台。在一些实例中，工作台的设置可以自动进行，或者至少部分自动地进行。
38.在方法的一些实例中，方法还包括接种和/或孵育经修饰的t细胞组。例如，经修饰的t细胞组可自动转移到接种和/或孵育培养基中。方法还可包括通过将经修饰的t细胞组自动转移至扩增培养基来扩增经修饰的t细胞组。在一些实例中，方法可包括设置用于接种和/或扩增程序的工作台。在一些实例中，可自动或至少部分自动地设置用于接种和/或扩增程序的工作台。
39.在方法的一些实例中，方法包括脱珠步骤。脱珠步骤可包括在脱珠步骤之前获得样品用于活细胞计数，并基于细胞计数，在珠被磁场吸引或响应磁场的情况下，通过施加磁场来使经修饰的t细胞组脱珠。在一些实例中，样品是在脱珠之后获得的以用于活细胞计数程序。在一些实例中，采样和/或脱珠步骤可以自动进行，或者至少部分自动地进行。在一些实例中，设置工作台用于脱珠和/或细胞计数/采样步骤，并且在一些实例中，工作台设置是自动或至少部分自动地完成的。
40.在方法的一些实例中，方法包括设置具有实验室器具和/或试剂以用于回收和/或收获经修饰的t细胞组的工作台。在一些实例中，用于回收和/或收获经修饰的t细胞组的工作台的设置可自动或至少部分自动地完成。在一些实例中，收获经修饰的t细胞组包括将经修饰的t细胞组置于带有冷冻保存培养基的冷冻瓶中。在一些实例中，在一些实例中，收获经修饰的t细胞组还包括将冷冻瓶置于液氮罐中。
41.在方法的一些实例中，t细胞输入组包括cd4 t细胞。
42.在方法的一些实例中，t细胞输入组包括cd8 t细胞。
43.在一些实例中，t细胞包括cd4 t细胞和cd8 t细胞。
44.在方法的一些实例中，异源重组蛋白包括重组受体。作为一个实例，重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与相关疾病、障碍或病症的细胞或组织相关、对相关疾病、障碍或病症的细胞或组织具有特异性和/或在相关疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。例如，所述疾病、障碍或病症可以是感染性疾病或障碍、自身免疫病、炎性疾病或者肿瘤或癌症中的一种或更多种。在一些实例中，靶抗原为肿瘤抗原。在一些实例中，重组受体是功能性非t细胞抗原受体，或t细胞受体的抗原结合片段。在一些实例中，重组受体是嵌合抗原受体(car)。
45.本公开内容的另一方面是用于t细胞的规模缩减制造的多路自动化系统。在一些实施方案中，该系统包括自动液体处理系统和与所述自动液体处理系统通信的控制系统，所述控制系统包括一个或更多个处理器，所述处理器被编程为控制所述自动液体处理系统以进行以下单元处理：活化t细胞组；修饰(例如通过转导)t细胞组；使t细胞组脱珠；接种t细胞组；扩增t细胞组；以及收获t细胞组。
46.在系统的多个实施方案中，自动液体处理系统包括柔性通道液体操纵模块，其被配置为以独立的多通道移液管形式转移液体，其中每个移液管被配置为独立操作。
47.在系统的多个实施方案中，柔性通道液体操纵模块被配置为基于液体类别的确定来精确操纵约0.5至5000μl的流体体积。
48.在系统的多个实施方案中，柔性通道液体操纵模块被配置为使用一次性尖端来提
供无菌培养。
49.在系统的多个实施方案中，柔性通道液体操纵模块是液体置换柔性通道臂。
50.在系统的多个实施方案中，自动液体处理系统由被配置为以多通道移液管形式转移液体的静态多通道液体操纵模块构成。
51.在系统的多个实施方案中，静态多通道液体操纵模块是多通道臂。
52.在系统的多个实施方案中，自动液体处理系统包括具有可互换夹持器配置的容器操纵模块。
53.在系统的多个实施方案中，可互换夹持器配置包括：被配置用于水平接近和运输实验室器具的偏心指件(finger)；被配置用于垂直接近实验室器具的中心指件；以及被配置用于运输管类型的实验室器具的管指件。
54.在系统的多个实施方案中，容器操纵模块是长z轴机器人夹持器臂。
55.在系统的多个实施方案中，自动液体处理系统包括可独立配置用于活化、转导、接种、扩增、脱珠和收获单元操作的工作台。
56.在系统的多个实施方案中，自动液体处理系统包括温度受控的机器人离心机。
57.在系统的多个实施方案中，自动液体处理系统包括被配置为容纳和夹持圆形实验室器具的瓶夹持器模块。
58.在系统的多个实施方案中，自动液体处理系统包括被配置为进行活细胞计数测量的自动细胞计数模块。
59.在系统的多个实施方案中，自动液体处理系统包括被配置为容纳冷冻瓶的便携式冷冻瓶冷却室(cooling chamber)/盖容纳室(cap holder)。
60.在系统的多个实施方案中，自动液体处理系统提供无菌环境。
61.在一些实施方案中，系统还包括哺乳动物细胞培养箱。
62.应理解，上述系统可用于进行本文中公开的任何方法。
附图说明
63.通过以下详细描述结合附图和所附权利要求书，将容易理解实施方案。在附图的图中通过示例而非限制的方式举例说明了一些实施方案。
64.图1是根据本文中公开的实施方案的自动化多路哺乳动物细胞培养系统的示意框图。
65.图2是液体置换柔性通道臂(flexible channel arm，fca)的示意图。
66.图3是多通道臂(multiple channel arm，mca)的示意图。
67.图4a是96通道适配器的顶侧的数字图像。
68.图4b是图4a中所示的96通道适配器的底侧的数字图像。
69.图5是机器人夹持器臂长(rga)的示意图。
70.图6是图5中所示的机器人夹持器臂长(rga)的偏心指件的示意图。
71.图7是图5中所示的机器人夹持器臂长(rga)的中心指件的示意图。
72.图8是图5中所示的机器人夹持器臂长(rga)的管指件的示意图。
73.图9是图2中所示的fca的注射器配置的数字图像。
74.图10是7mm微板嵌套段(nest segment)和7mm嵌套的示意图。
75.图11是100ml试剂槽(trough)的示意图。
76.图12是50ml锥形管滑行架(runner)的示意图。
77.图13是6位置集(hotel)105的示意图。
78.图14是机器人离心机的示意图。
79.图15是示出了所命名的组件的配置的工作台60的示意图。
80.图16是示出了分别在图2、3和5中示出的fca、mca和rga的配置的液体处理系统的示意图。
81.图17是根据某些实施方案的t细胞培养的自动化方法的工作流的示意图。
具体实施方式
82.以下详细描述本质上仅是举例说明性的，并非旨在限制本主题的实施方案或者这样的实施方案的应用和用途。如本文所使用的，词语“示例性”意指“用作实施例、实例或说明”。本文中描述为示例性的任何实施不一定被解释为比其他实施优选或有利。此外，不旨在受前述技术领域、背景技术、发明内容或以下详细描述中呈现的任何明示或暗示的理论的束缚。
83.本说明书包括对“一个实施方案”或“实施方案”的引用。短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”的出现不一定是指相同实施方案。特定特征、结构或特性可以以与本公开内容一致的任何合适的方式组合。
84.术语。以下段落提供了本公开内容(包括所附权利要求书)中存在的术语的示例性描述和/或语境：
[0085]“包括/包含”。该术语是开放式的。如在所附权利要求中所使用的，该术语不排除另外的结构或步骤。
[0086]“被配置为”。多种单元或组件可被描述或声称为“被配置为”进行一项或更多项任务。在这样的语境中，“被配置为”用于通过指示单元/组件包括在操作期间进行那些一项或更多项任务的结构来表示结构。因此，可以说该单元/组件被配置为进行该任务，即使在指定的单元/组件当前不可操作(例如，未开启/运转)时也是如此。引用单元/电路/组件“被配置为”进行一项或更多项任务明确旨在不援引35 u.s.c.
§
112第六段用于该单元/组件。
[0087]“第一”、“第二”等。如本文所用，这些术语用作它们后面的名词的标签，并且不暗示任何类型的排序(例如，空间、时间、逻辑等)。
[0088]“联接(coupled)
”‑
以下描述是指“联接”在一起的元件或节点或特征。如本文所用，除非另有明确说明，否则“联接”意指一个元件/节点/特征直接或间接地与另一元件/节点/特征连接(或者直接或间接地与其通信)，而不一定是机械地连接。
[0089]
此外，在以下描述中也可使用某些术语以用于仅参考目的，并且因此不旨在限制。例如，在所参考的附图中，例如“上部”、“下部”、“以上”、“以下”、“前面”和“后面”的术语是指方向。术语例如“前面”、“后面”、“后部”、“侧面”、“外侧”、“内侧”、“左侧”和“右侧”在一致但任意的参考框架内描述了组件的某部分的方位和/或位置，或者描述了组件之间的相对方位和/或位置，这通过参考描述所讨论组件的文本和相关附图变得清楚。这样的术语可以包括以上特别提及的词、其派生词和类似含义的词。
[0090]
在下面的描述中，为了提供对本公开内容的实施方案的透彻理解，阐述了许多具
体的细节，例如特定操作。对本领域的技术人员明显的是，本公开内容的实施方案可以在没有这些具体细节的情况下实践。在另一些实例中，不详细描述公知技术以避免不必要地模糊本公开内容的实施方案。本文中所用的章节标题仅用于组织目的并且不应被解释为限制所描述的主题。
[0091]
简介
[0092]
产生用于细胞治疗的经遗传改造的t细胞(例如cd4 t细胞和/或cd8 t细胞)是包含多个变量的多步骤过程。例如，为了产生经遗传改造的t细胞，在刺激条件下孵育细胞，通过转导将重组多肽引入细胞，并在促进增殖和/或扩增的条件下培养细胞。这些过程中的每一个都可能会发生变化，无论是在测试条件方面还是在使用者/操作者方面可变。此外，目前的t细胞的规模缩减测试可受到设施优良的操作者(resourced operator)的数目和操作者在给定的时间可以进行的条件的最大数目的限制。测试也可暴露于由于操作者操作和移液不准确造成的可变性和不一致性。这些可变性可导致结果的不一致性。为了降低与使用者/操作者输入相关的不一致性，并帮助提高发育通量，需要自动化的规模缩减t细胞培养平台。自动化的规模缩减平台将提供标准化的t细胞培养平台，并改善规模缩减实验的一致性。该平台将有利于常规测试例如原材料验证，或复杂任务，例如培养基开发。可以编写另外的方法以允许如培养基和培养补充剂筛选以及大型实验设计(design of experiment，doe)实验设计的任务。为了满足以上需求，发明人开发了自动化台式细胞培养系统以及使用该系统促进经遗传改造的治疗性t细胞的开发的方法。
[0093]
示例系统
[0094]
参考图1，本文中公开了自动化细胞培养系统10，其可被称为自动化的t细胞规模缩减模型系统。系统10包括控制系统20(例如计算机实施的控制系统)和自动液体处理系统30。如所示，控制系统20和液体处理系统30通过网络42连接。该系统还可包括任选的哺乳动物细胞培养箱35。网络42可以是任何网络，包括局域网(local area network，lan)或广域网(wide area network，wan)，或者连接可以连接到外部计算装置(例如，通过使用因特网服务提供者的因特网)，或者无线网络，或者甚至作为直接连接，例如作为系统10的集成组件。控制系统20控制自动液体处理系统30的多个模块。在某些实施方案中，自动液体处理系统30包括无菌环境，例如用于无菌细胞培养工作，并且可以包含在具有过滤器和/或正压通风以防止污染的壳(例如罩或柜)中。液体处理系统30由用于操纵液体的多个模块构成，液体和包含液体的容器可包含目标哺乳动物细胞，例如t细胞，例如cd4 t细胞和/或cd8 t细胞。
[0095]
在一些实施方案中，液体处理系统30包括柔性通道液体操纵模块40，例如液体置换柔性通道臂(例如，参见图2)。在一些实施方案中，柔性通道液体操纵模块40被配置为将液体(例如含有哺乳动物细胞的液体)从一个容器转移到另一个容器，例如扁平或圆形底的板、管(例如锥形管)等。该臂被称为“柔性的”，因为每个移液通道可以独立操作，并且因此模块40能够同时转移不同体积的液体。在一些实施方案中，柔性液体操纵模块40是多路的，因为其具有独立操纵样品的多个独立移液通道，所述样品例如含有哺乳动物细胞例如t细胞(例如，cd4 t细胞和/或cd8 t细胞)的不同的液体样品。在某些实施方案中，通道或通道子集可以独立地操作。例如，控制系统20可被编程为独立操作通道或通道子集。在一些实施方案中，每个移液通道独立地操作，并且柔性液体操纵模块40能够同时转移不同体积的
液体。在一些实施方案中，柔性液体操纵模块40具有约2个至196个或更多个通道。在一些实施方案中，柔性液体操纵模块40使用液体置换技术以进行液体转移。在一些实施方案中，通过稀释剂注射器活塞产生的压差进行液体转移。例如，向下的活塞运动产生负压差，并且使得能够在移液管尖端处吸入液体，而向上的活塞运动产生正压差，并且使得液体能够从移液管尖端分配出。在某些实施方案中，移液管的尖端(将是移液管与液体接触的部分)使用一次性尖端(disposable tip，diti)以提供无菌培养。在另一些实施方案中，尖端是固定的，但是是灭菌的，例如通过uv光或其他化学或辐射处理。diti配置使得能够使用约0.5ml至约5ml的注射器，例如约1.25ml至约5ml的注射器，例如1.25ml注射器和5ml注射器。在一些实施方案中，单独的移液管通道能够精确地操纵约0.5至5000μl的流体体积(参见下面的液体类别确定章节)。diti类型也可以在细胞培养方法中直接互换，例如下文关于t细胞培养所述的。在一些具体实施方案中，液体处理系统30使用液体置换柔性通道臂(fca)(例如，参见图2)。在图2所示的实施方案中，液体fca是利用液体置换技术以进行液体转移的八个移液通道的系统。标准fca注射器配置包括8
×
1.25ml注射器，其允许转移多至1ml液体。由于需要大体积转移细胞培养基，因此开发了用于系统的注射器配置以允许5ml注射器(参见图9)。参考图9，5ml注射器置于位置1和8处，以限制对剩余6个1.25ml注射器的空间障碍。此外，具有连续的1.25ml注射器对于规模缩减方法脚本高度有益。总的来说，1.25/5ml注射器配置使得能够大体积转移，且为方法脚本和开发提供了灵活性。
[0096]
在一些实施方案中，除了柔性通道液体操纵模块40之外，液体处理系统30还任选地包括静态多通道液体操纵模块45，例如多通道臂(mca)(参见图3)。静态多通道液体操纵模块45是“静态”的，因为它不能同时差分转移不同体积的液体。当穿过通道的液体体积相同时，可使用静态多通道液体操纵模块45。通常，静态多通道液体操纵模块45用于以多孔形式(例如96或384通道形式)转移液体。在一些实施方案中，静态多通道液体操纵模块45是空气置换系统，其具有384个柱塞，这些柱塞基于每个气缸内的压差进行吸入和分配步骤。然而，与柔性通道液体操纵模块40不同，静态多通道液体操纵模块45柱塞同时移动，因此无法同时差分转移不同体积的液体。静态多通道液体操纵模块45可与多种适配器类型兼容。在系统的某些实施例中，96通道适配器与静态多通道液体操纵模块45结合使用(参见图4a和4b)。在某些实施方案中，移液管的尖端(将是移液管与液体接触的部分)使用一次性尖端(diti)以提供无菌培养。在另一些实施方案中，尖端是固定的，但是是灭菌的，例如通过uv光或其他化学或辐射处理。举例来说，挑取diti尖端并在所有96个diti一起、前2行12个diti的行或diti的前四列的情况下转移液体，这取决于系统10配置。在一些实施方案中，96通道适配器使用diti(与固定的尖端相反)，并且能够多路转移0.2μl至250μl(例如0.5μl至125μl)的液体。
[0097]
在一些实施方案中，液体处理系统30可包括容器操纵模块50，例如长z轴机器人夹持器臂(rga)(参见图5)。容器操纵模块50可配备不同的夹持器配置或头部，以根据活动操纵不同形状和尺寸的容器。在某些实施方案中，容器操纵模块50在无菌环境中使用，例如用于如上所述的无菌细胞培养工作。在某些实施方案中，不同的夹持器配置或头部可由系统10自动改变，例如在控制系统20的控制下。基于夹持器配置，容器操纵模块50允许在整个工作台60及其下方运输一系列的实验室器具。实验室器具可包括微板、深孔板、锥形管、diti盒等。容器操纵模块50还可用于将实验室器具运输至存储位置和设备，以及从存储位置和
设备运输实验室器具。在某些实施方案中，例如使用长z轴机器人夹持器臂(rga)，容器操纵模块50在x、v和z方向上移动容器。如图5所描绘的，容器操纵模块50的夹持器指件还可以打开和关闭(g)，以及旋转360
°
(r)。
[0098]
在某些配置中，容器操纵模块50使用偏心指件52(例如，参见图6)。偏心指件52允许水平接近和运输实验室器具。偏心指件52能够运输标准细胞培养板(例如6孔和24孔板)和采样板(例如1.0ml深孔板、96平/圆板)。偏心指件52进一步允许集105接近和负载(下文讨论)。
[0099]
在某些配置中，容器操纵模块50使用中心指件54(例如，参见图7)。中心指件54垂直接近实验室器具，并用于接近水平接近受限的位点。中心指件54允许将所有深孔细胞培养板(离心机和扩增板)和离心机组件运输到工作台60周围及下方。
[0100]
在某些配置中，容器操纵模块50使用管指件56(参见图8)。管指件56用于运输管类型的实验室器具。管指件56也可用于冷冻瓶(参见活化和收获单元操作)和50ml锥形管(参见活化单元操作)的加盖和去盖。
[0101]
再次参考图1，除了上面讨论的模块之外，液体处理系统30还包括工作台60，该工作台60具有配置为实现以下方法中阐述的当前规模缩减应用的组件。这些应用包括t细胞的活化、转导、接种、扩增、脱珠和收获单元操作。面板段(deck segment)85(嵌套类型)(参考图10)、槽滑行架、管滑行架、集105、定制实验室器具和集成设备被配置为能够最大限度地处理每个单元操作，而不用在不同单元操作之间对工作台60进行显著修饰。每个单元操作方法的工作台60的布局使用嵌套位点和集105来使所使用的实验室器具的量最大化，从而使每个单元操作所进行的条件的数量最大化，大大增强系统10的多路能力。
[0102]
在一些实施方案中，面板段85是可根据仪器使用者的配置定位在工作台60上的面板组件(例如，参见图10)。面板段85含有嵌套位点，其用于容纳实验室器具。在一些实施方案中，工作台60装饰有25
×
7mm的嵌套，以能够使用微板和深孔板二者。
[0103]
在一些实施方案中，液体处理系统30包括槽滑行架90，例如320ml试剂槽滑行架。320ml试剂槽滑行架为2个位置的网格段(grid segment)，其容纳3
×
320ml试剂槽。320ml槽容纳多至256ml液体，并可被选择用于容纳大体积试剂，例如细胞培养基。
[0104]
在一些实施方案中，液体处理系统30包括试剂槽95，例如100ml试剂槽(参见图11)。100ml试剂槽容纳3
×
100ml试剂槽。100ml容纳多至80ml液体，并被选择用于容纳大体积试剂，例如冷冻保存培养基和细胞生存力测量试剂，例如guava viacount试剂。
[0105]
在一些实施方案中，液体处理系统30包括锥形管滑行架100，例如50ml锥形管滑行架(参见图12)。在一个实例中，50ml锥形管滑行架是具有2个位置的网格段，其容纳10
×
50ml锥形管。在自动化规模缩减方法之内，50ml锥形管用于大体积细胞混合物，即在活化单元操作中，其中使用新鲜细胞培养基洗涤细胞并离心。
[0106]
在一些实施方案中，液体处理系统30包括集105(参见图13)。集105用于储存板类型的实验室器具。在一些实施方案中，集105具有2至10个位置。多个集105可用于增加位置数量。这使得工作台60的空间最大化。实验室器具可储存在集105中直到使用，然后可在需要时通过容器操纵模块50偏心指件52转移到工作台60。在某些实施方案中，具有六个位置的集105因为其容纳不同的实验室器具组的能力而被选择。在自动化规模缩减方法之内，24平孔板、6孔板、96深孔板、96平微板、96圆微板、6mm盖、9mm板盖、金属扩增盖等中的一个或
更多个可存储在具有6个位置的集105内，用于单元操作。可以理解的是，在不脱离本公开内容的范围的情况下，可以在集105内存储另外的或替代的实验室器具。
[0107]
在一些实施方案中，液体处理系统30包括机器人离心机65(例如，参见图14)。在某些实施方案中，机器人离心机65是温度受控的。在某些实施方案中，机器人离心机65是计算机控制的，例如通过控制系统20来，以感测和控制转子定位，例如以允许容易地操纵管和/或板、将管和/或板置于机器人离心机65中和/或从机器人离心机65中去除管和/或板。在某些实施方案中，机器人离心机65具有约2至约8个位置，用于插入一个或更多个容器以提供灵活性。在某些实施方案中，机器人离心机65是具有四(4)个位置的机器人离心机，其是温度受控的，具有计算机控制的转子定位。在某些实施方案中，机器人离心机65具有面板下能力(例如，垂直与水平接近)。在下文公开的自动化t细胞培养方法中，容器操纵模块50，例如长z轴机器人夹持器臂(rga)，通过中心指件54挑取实验室器具，然后通过顶部负载自动化门将实验室器具垂直转移到机器人离心机65中。这些操纵，包括机器人离心机65的操作，可由控制系统20控制，例如基于使用者输入，或具有用于操作机器人离心机65和容器操纵模块50的指令的预先存在的程序文件。
[0108]
在一些实施方案中，液体处理系统30包括瓶夹持器模块70)。在一些实施方案中，瓶夹持器模块70是能够对管(例如锥形管)进行加盖和去盖的气动装置。这可包括标准的15ml和50ml管尺寸。对于管离心步骤，例如下文公开的方法，进行锥形管加盖/去盖。使用管指件56，容器操纵模块50将锥形管转移到瓶夹持器模块70中，并且基于压力变化，瓶夹持器模块70夹持管。然后，容器操纵模块50挑取管的盖并将其置于锥形管上并盖住管。最后，容器操纵模块50将管转移到离心机管适配器中，用于在机器人离心机65中进行离心。离心之后，将管返回至瓶夹持器模块70以进行去盖。在下文的方法中，瓶夹持器模块70用于活化单元处理中的管离心步骤。这些操纵，包括瓶夹持器模块70的操作，可由控制系统20控制，例如基于使用者输入，或具有用于操作瓶夹持器模块70和机器人离心机65以及容器操纵模块50的指令的预先存在的程序文件。
[0109]
在一些实施方案中，液体处理系统30任选地包括细胞计数模块75，例如以去除手动细胞活力确定。在某些实施方案中，容器操纵模块50直接将计数板转移到细胞计数模块75中。在某些实施方案中，细胞计数模块75将活细胞计数(viable cell count，vcc)测量转移到控制系统20。自动vcc测量允许方法的直接传播而无需操作者交互。
[0110]
在一些实施方案中，液体处理系统30包括便携式冷冻瓶冷却室/盖容纳室80。在一些实施方案中，冷冻瓶冷却室是用于2ml冷冻瓶的具有12个位置的容纳室。在一些实施方案中，冷冻瓶冷却室/盖容纳室80是螺纹的，以允许使用容器操纵模块50管指件56进行加盖和去盖功能。冷冻瓶冷却室/盖容纳室80可在使用之前置于冰箱中，并将冷冻瓶保持在源温度下持续方法的持续时间。冷冻瓶冷却室/盖容纳室80可以是便携式的，以允许在容纳或暂停步骤期间可运输至温度受控的离心机。盖容纳室可以是定制单元，并且可用于储存2ml冷冻瓶盖，以进行加盖和去盖步骤。
[0111]
在一些实施方案中，液体处理系统30包括便携式管离心机适配器110，例如50ml管离心机适配器110。50ml管离心机适配器110是定制的离心机存储桶，其可实现50ml管的离心。这些适配器也用作需要管操纵的步骤的管容纳室。50ml管离心机适配器110设计为便携式的，以允许使用容器操纵模块50容易地运输进和出离心机。在工作台60上，它们被置于定
制的离心机适配器嵌套上。
[0112]
在一些实施方案中，液体处理系统30包括管盖容纳室115，例如50ml管盖容纳室。50ml管盖容纳室是用于存储50ml管盖的定制单元，以用于进行加盖和去盖步骤。
[0113]
所公开的系统以及定制载体的实施实现了全自动化的t细胞培养平台。该平台的实施允许更一致的实验，从而降低实验中引入的基于操作者的可变性。与人操作者相比，该平台将改善进行的实验次数和每次实验所需的时间。
[0114]
如所示的控制系统20可包括一个或更多个计算装置。在一些实施方案中，计算装置包括许多组件，例如一个或更多个处理器和至少一个通信模块。在多个实施方案中，所述一个或更多个处理器各自包含一个或更多个处理器核。在多个实施方案中，所述至少一个通信模块与所述一个或更多个处理器物理联接和/或电联接。在另一些实施中，通信模块是一个或更多个处理器的一部分。在多个实施方案中，计算装置包括印制电路板(printed circuit board，pcb)。对于这些实施方案，一个或更多个处理器和通信模块设置在其上。计算装置根据其应用包括可以与或者可以不与pcb物理联接和电联接的其他组件。这些其他组件包括但不限于存储器控制器、易失性存储器(例如，动态随机存取存储器(dynamic random access memory，dram)(未示出))、非易失性存储器，例如只读存储器(read only memory，rom)、闪存、i/o端口、数字信号处理器、密码处理器、图形处理器、一种或更多种天线、显示器(例如，触摸屏显示器)、显示控制器(例如，触摸屏显示器控制器)、电池、音频编解码器、视频编解码器和海量存储设备(例如硬盘驱动器、固态驱动器、光盘(compact disk，cd)、数字通用光盘(digital versatile disk，dvd))等。
[0115]
在一些实施方案中，一个或更多个处理器通过一个或更多个链路(例如，互连线、总线等)有效联接至系统存储器。在一些实施方案中，系统存储器能够存储一个或更多个处理器用来操作和执行程序和操作系统的信息。在不同的实施方案中，系统存储器是任何可用类型的可读和可写存储器，例如动态随机存取存储器(dram)的形式。在一些实施方案中，计算装置包括多种输入和输出/反馈装置或以其他方式与其相关联以使得使用者能够通过一个或更多个使用者接口或外围组件接口与计算装置和/或与计算装置相关联的外围组件或装置进行交互。在一些实施方案中，使用者接口可包括但不限于物理键盘或小键盘、触摸板、显示装置(触摸屏或非触摸屏)、扬声器、麦克风、图像传感器、触觉反馈装置和/或一个或更多个致动器等。在一些实施方案中，计算装置可以包含存储器元件(未示出)，其可以存在于可移动智能芯片或安全数字(“sd”)卡内，或者其可以被嵌入牙科设备(dental ex)上的固定芯片内。在某些示例性实施方案中，可以使用用户标志组件(“subscriber identity component，sim”)卡。在多个实施方案中，存储器元件可以允许软件应用驻留在该装置上。
[0116]
在一些实施方案中，一个或更多个处理器、闪存和/或存储装置包括存储编程指令的相关固件，所述相关固件被配置成使得响应于由一个或更多个处理器执行编程指令的计算装置能够根据本公开内容的一些实施方案实践本文中公开的方法的所有方面或选定方面。
[0117]
在一些实施方案中，通信模块能够进行有线和/或无线通信，用于将数据转移到计算装置和从计算装置转移数据，例如将数据转移到液体操纵系统30和/或其多种模块以及从液体操纵系统30和/或其多种模块转移数据。在多个实施方案中，计算装置还包括网络接口，其配置成经由发送器和接收器(或任选地，收发器)以无线方式、和/或经由使用通信端
口的有线连接将计算装置连接至一个或更多个联网计算装置。在一些实施方案中，网络接口和发送器/接收器和/或通信端口被统称为“通信模块”。在一些实施方案中，无线发送器/接收器和/或收发器可以配置成根据一个或更多个无线通信标准进行操作。术语“无线”及其派生词可用于描述可通过使用通过非固态介质的调制电磁辐射来通信数据的电路、装置、系统、方法、技术、通信信道等。该术语并不暗示相关装置不包含任何导线，尽管在一些实施方案中其可能不包含导线。在一些实施方案中，计算装置包括无线通信模块以用于发送数据和接收数据，例如用于从网络(例如电信网络)发送数据和接收数据。在一些实施方案中，计算装置通过使用例如蓝牙和/或ble协议、wifi协议、红外线数据协会(irda)协议、ant和/或ant 协议、lte prose标准等经由直接无线连接与一个或更多个装置直接连接。在一些实施方案中，通信端口被配置成根据例如以下的一个或更多个已知的有线通信协议进行操作：串行通信协议(例如，通用串行总线(usb)、火线、串行数字接口(sdi)和/或其他类似串行通信协议)、并行通信协议(例如ieee 1284、计算机自动测量和控制(camac)和/或其他类似的并行通信协议)和/或网络通信协议(例如，以太网、令牌环、光纤分布式数据接口(fddi)和/或其他类似的网络通信协议)。
[0118]
在一些实施方案中，计算装置被配置成运行、执行或以其他方式操作一个或更多个应用。在一些实施方案中，应用包括本机应用、网络应用和混合应用。在一些实施方案中，本机应用是平台或操作系统(os)特定的或非特定的。在一些实施方案中，本机应用是使用平台特定的开发工具、编程语言等针对特定平台开发的。这样的平台特定的开发工具和/或编程语言由平台供应商提供。在一些实施方案中，本机应用在制造期间被预先安装在计算装置上，或者由应用服务器经由网络提供给计算装置。网络应用是响应于由服务提供者请求网络应用而加载到计算装置的网络浏览器中的应用。在一些实施方案中，网络应用是通过考虑多种计算装置参数(例如资源可用性、显示器尺寸、触摸屏输入等)而设计或定制的用以在计算装置上运行的网站。以这种方式，网络应用可以在网络浏览器内提供类似于本机应用的体验。网络应用可以是使用任何服务器端开发工具和/或编程语言(例如php、node.js、asp.net和/或提供html的任何其他类似技术)开发的任何服务器端应用。混合应用可以是本机应用与网络应用之间的混合。混合应用可以是独立的框架或可以加载应用容器内的网站的其他类似应用容器。混合应用可以使用网站开发工具和/或编程语言(例如html5、css、javascript等)编写。在一些实施方案中，混合应用使用计算装置的浏览器引擎而不是使用计算装置的网络浏览器来在本地提供网站的服务。在一些实施方案中，混合应用还访问在网络应用中不可访问的计算装置功能，例如加速度计、摄像机、本地存储装置等。
[0119]
一个或更多个计算机可用或计算机可读介质的任意组合可以在本文中公开的一些实施方案的情况下使用。计算机可用或计算机可读介质可以是，例如但不限于，电子、磁、光、电磁、红外或半导体系统、设备、装置或传播介质。计算机可读介质的更具体实例(非详尽列表)将包括以下：具有一个或更多个导线的电连接、便携式计算机软盘、硬盘、随机存取存储器(ram)、只读存储器(rom)、可擦可编程只读存储器(eprom或闪存)、光纤、便携式小型光盘只读存储器(cd-rom)、光学存储装置、传输介质例如支持因特网或内联网的那些、或磁存储装置。注意，计算机可用或计算机可读介质甚至可以是在其上打印有程序的纸或另外合适的介质，因为可以经由例如对该纸或其他介质的光学扫描来电子地捕获程序，然后以
合适的方式进行编译、解释或以其他方式处理(如果有必要的话)，并且然后存储在计算机存储器中。在本文件的背景下，计算机可用或计算机可读介质可以是可包含、存储、传送、传播或传输程序以供指令执行系统、设备或装置使用或与之连接使用的任何介质。计算机可用介质可以包括在基带中或者作为载波一部分的传播的数据信号，其中体现有计算机可用程序代码。计算机可用程序代码可以使用任何合适的介质，包括但不限于无线、有线、光纤线缆、rf等来传输。
[0120]
用于执行本公开内容的操作的计算机程序代码可以以一种或更多种编程语言的任意组合来编写，所述编程语言包括面向对象的编程语言例如java、smalltalk、c 等以及常规的过程编程语言，例如“c”编程语言或类似的编程语言或控制系统20的本机编程语言。程序代码可以完全在使用者的计算装置上执行，作为独立的软件包部分地在使用者的计算装置上执行，部分地在使用者的计算装置上并且部分地在远程计算机上执行，或者完全在远程计算机或服务器上执行。在后一种情况下，远程计算机可以通过任何类型的网络(包括局域网(lan)或广域网(wan))连接至使用者的计算装置，或者连接可以连接到外部计算装置(例如，通过使用因特网服务提供者的因特网)或如上所述的无线网络。
[0121]
此外，一些示例性实施方案可以通过硬件、软件、固件、中间件、微代码、硬件描述语言或其任意组合来实现。当以软件、固件、中间件或微代码实现时，用于执行必要任务的程序代码或代码段可以存储在机器或计算机可读介质中。代码段可以表示过程、功能、子程序、程序、例程、子例程、模块、程序代码、软件包、类，或者指令、数据结构、程序语句的任意组合等。
[0122]
在多个实施方案中，可以采用制品来实现本文中公开的一种或更多种方法。制品可以包括计算机可读非暂态存储介质和存储介质。存储介质可以包括编程指令，其配置成使设备根据本公开内容的一些实施方案实践本文中公开的方法的一些方面或所有方面。
[0123]
存储介质可以表示本领域中已知的广泛范围的持久性存储介质，包括但不限于闪存、光盘或磁盘。特别地，编程指令可以响应于设备对其的执行而使得该设备能够执行本文中所述的多种操作。例如，存储介质可以包括编程指令，其配置成使设备根据本公开内容的一些实施方案实践本文中方法的一些方面或所有方面。
[0124]
示例性过程
[0125]
尽管上述系统可用于进行下述方法，但决不应将其解释为限制可用于本文中所公开的方法和单元的系统。
[0126]
参考图17，所公开的方法200包括六个单元，独立地涵盖针对t细胞的活化单元操作210、转导单元操作220、接种单元操作230、扩增单元操作240、脱珠单元操作250和扩增单元操作260。本文中公开的方法的一些工作实施方案已在液体处理系统(例如，高度改变的tecan fluent 780系统)上实施。如上所讨论的，使用fca、mca和rga进行所公开方法的一些工作实施方案(参见图16)。这些臂分别允许液体和实验室器具转移。注意，活化单元操作210、转导单元操作220、接种单元操作230、扩增单元操作240、脱珠单元操作250和收获单元操作260可针对数个实验设置同时进行。例如，细胞在哺乳动物细胞培养箱中的时间可以与其他细胞被系统10的其余组件操纵的时间错开或交错。
[0127]
样品
[0128]
本文中提供的方法和系统在哺乳动物细胞的情况下使用，例如从对象分离的细
胞，其与t细胞(例如cd4 和/或cd8 t细胞)特别相关。在一些实施方案中，本文中公开的系统和方法使用从生物样品分离的细胞或其组合物，例如获自或源自对象，例如患有特定疾病或病症或者需要细胞治疗或者将施用细胞治疗的对象的那些。在一些实施方案中，本文中公开的系统和方法使用从生物样品分离的细胞或其组合物，例如获自或源自对象，例如健康供体的那些。在一些方面中，对象是人，例如是需要特殊治疗干预(例如细胞被分离、加工和/或改造的过继性细胞治疗)的患者的对象。因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如，原代人细胞。样品包括直接从对象采集的组织、流体和其他样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品，也可以是经加工的样品。生物样品包括但不限于体液，例如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿和汗液、组织和器官样品，包括源自其的经加工样品。在一些实施方案中，本文中公开的系统和方法在非原代细胞，例如细胞系的情况下使用，例如作为方法学的测试程序或验证的一部分等。
[0129]
在一些实施方案中，样品为血液或血液来源样品，或来源于去除术或白细胞去除术产物。示例性样品包括全血、外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、黏膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或来源于其的细胞。在细胞治疗(例如过继性细胞治疗)方面，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。在一些实例中，细胞是从对象的循环血液中获得的，例如通过去除术或白细胞去除术。样品在一些方面中包括白细胞，其包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、红细胞、和/或血小板，并且在一些方面中包括除红细胞和血小板以外的细胞。在某些实施方案中，本文中公开的系统和方法中使用的细胞是对于cd4 t细胞富集的t细胞。在某些实施方案中，本文中公开的系统和方法中使用的细胞是对于cd8 t细胞富集的t细胞。在一些实施方案中，富集的cd4 t细胞和富集的cd8 t细胞的两种单独的组合物单独经受本文中公开的多种系统和方法。在一些实施方案中，单组合物是富集的cd4 和cd8 t细胞的组合物，例如已经单独富集的细胞和已经从单独的组合物组合的细胞。富集cd4 t细胞和/或cd8 t细胞的方法是本领域中已知的。
[0130]
活化单元操作
[0131]
活化单元操作210从工作台设置开始，并且参考图1的系统10，控制系统20提示使用者/操作者设置工作台60，例如在diti、试剂槽、细胞培养基、细胞计数试剂等的情况下。控制系统20还提示使用者输入实验参数，例如t细胞供体数量、活化剂数量和运行条件数量。其他分析参数可由使用者设置。可以提示使用者实时输入这些参数，或者作为脚本的一部分，例如，在启动如图17所示的方法200的系统10之前由使用者设置。在一些实施方案中，提示使用者输入待运行的条件的数量。在一些实施方案中，提示使用者输入期望的采样体积。在一些实施方案中，提示使用者输入是否在方法结束时进行采样。如果使用者选择“是”，则接着会提示使用者指定总的细胞材料和aaa/流式细胞术采样体积。在一些实施方案中，如果选择了多个供体，则接着会提示使用者输入供体cd4和cd8供体的数量，以及方法需要的冷冻瓶的总数量。在一些实施方案中，提示使用者还包括每孔待分配的活化试剂体积。本文中所提及的“活化试剂”意指一种或更多种试剂。
[0132]
一旦控制系统20接收到实验输入，控制系统就确定所选参数所需的实验室器具和工作台60的配置。在一些实施方案中，在该单元处理和其他单元处理中，将实验室器具自动
置于自动液体处理系统30中，例如使用容器操纵模块50，例如在控制系统20的指示下。在另一些实施方案中，由一个或更多个使用者将一些或全部实验室器具置于工作台60上，例如如通过控制系统20所提示的。在某些实施方案中，根据供体输入的数量，将一定数量的50ml锥形管(或其他相关管类型/体积)置于工作台60上。在一些实施方案中，锥形管置于离心管适配器中。在一些实施方案中，由控制系统提示使用者根据供体输入的数量将50ml锥形管置于工作台60上。在一些实施方案中，具有管指件56的容器操纵模块50(例如rga)将50ml锥形管转移至瓶夹持器模块70并将它们去盖。将管盖放在锥形管盖容纳室上，并且在离心之后将管返回到离心管适配器。
[0133]
在某些实施方案中，将基于条件输入数量的“n”数量的细胞材料板置于工作台60上。采样板可包括96深孔板、96孔低附着板(细胞计数)和96孔圆底板(aaa/流式细胞术)。在某些实施方案中，提示使用者设置工作台60的采样和基于条件输入数量的细胞材料板的“n”数量。在一些实施方案中，容器操纵模块50，例如rga，使用偏心指件52，将所有细胞材料和采样板放入集105中。
[0134]
一旦工作台设置完成，由控制系统20启动洗涤。对于cd4 和cd8 样品二者，可以选择每个供体的冷冻瓶数量。在一些实施方案中，冷冻瓶的数量可由控制系统20确定。在某些实施方案中，提示使用者对于cd4 和cd8 样品二者选择每个供体的冷冻瓶数量。使用输入的cd4 和cd8 数量、工作台设置所需的冷冻瓶数量以及对于cd4 和cd8 样品二者每个供体的冷冻瓶数量，柔性液体操纵模块40(例如fca)将冷冻瓶中的内容物转移至50ml锥形管。在一些实施方案中，柔性液体操纵模块40分配平衡细胞培养基以达到每个50ml锥形管的所选体积。在一些实施方案中，容器操纵模块50使用管指件56将50ml锥形管转移至瓶夹持器模块70并对每个管重新加盖。在一些实施方案中，容器操纵模块50使用管指件56将50ml锥形管转移回离心管适配器中。在一些实施方案中，容器操纵模块50用中心指件54替换管指件56，并且将带有管的离心管适配器垂直地运输到机器人离心机65中以进行离心。
[0135]
在离心之后，将离心适配器连同锥形管一起返回到工作台60。在一些实施方案中，容器操纵模块50用管指件56替换中心指件52，并将管转移到瓶夹持器模块70并对其进行去盖。在一些实施方案中，柔性液体操纵模块40(例如fca)随后去除上清液，而不破坏每个锥形管的细胞沉淀物。在一些实施方案中，然后基于所选的vcc和添加的冷冻瓶的数量重新悬浮每个管。
[0136]
一旦洗涤完成，就由控制系统20开始采样。将每个50ml锥形管混合，然后吸入每个管的总样品体积，并分配到96深孔板中。然后混合分配的采样体积，并将其等分到低附着细胞计数板中。然后根据条件输入数量将细胞计数试剂分配到低附着细胞计数板中。在某些实施方案中，采样板的细胞计数由细胞计数模块75自动读取。在另一些实施方案中，采样板被带到工作台60的前部以便于使用者触及，然后由使用者从工作台60上取下以进行手动细胞计数。细胞浓度测量通过系统控制器20获得，或者从细胞计数模块75自动获得，或者由使用者手动输入。基于当前vcc，计算达到目标vcc所需的细胞体积。
[0137]
一旦采样完成，就由控制系统20启动活化。活化试剂添加至工作台60，例如自动地。在某些实施方案中，提示使用者将活化试剂添加至工作台60。在一些实施方案中，容器操纵模块50(例如rga)使用偏心指件52，根据条件数量将“n”个数量的孔板(例如，6孔板、12孔板、24孔板和/或48孔板等)从集105置于工作台60上。孔板可以是圆底板、平底板等。对于
六孔板，每六种条件需要一块板。在一些实施方案中，然后根据条件输入数量将活化试剂分配至板的每个孔。在一些实施方案中，柔性液体操纵模块40随后通过混合每个管进行处理。柔性液体操纵模块40然后根据使用者输入分配所需的细胞体积以达到总的有核细胞计数(tnc)。柔性液体操纵模块40随后根据条件将平衡细胞培养基分配到板的每个孔中，以达到期望的vcc。
[0138]
一旦活化完成，任选地就由控制系统20开始采样。如果期望采样，则将每个样品孔混合，然后吸入每个样品的总样品体积，并分配到96深孔板中。然后混合分配的采样体积，并将其等分到细胞计数板和aaa/流式细胞术板中。在某些实施方案中，采样板的细胞计数由细胞计数模块75自动读取。在另一些实施方案中，采样板随后被带到工作台60的前部以便于使用者触及，然后由使用者从工作台60上取下以进行手动细胞计数。细胞浓度测量通过系统控制器20获得，或者从细胞计数模块75自动获得，或者由使用者手动输入。在一些实施方案中，板被自动重新加盖。在一些实施方案中，板自动转移至培养箱。在一些实施方案中，剩余的实验室器具从工作台自动去除。在一些实施方案中，提示使用者将板置于培养箱中。在一些实施方案中，提示使用者从工作台去除所有剩余的实验室器具。
[0139]
如果未完成采样，则不会由控制系统20开始采样。在一些实施方案中，板被自动重新加盖。在一些实施方案中，板自动转移至培养箱。在一些实施方案中，所有剩余的实验室器具从工作台自动去除。在一些实施方案中，提示使用者将板置于培养箱中。在一些实施方案中，提示使用者从工作台去除所有剩余的实验室器具。
[0140]
在一些实施方案中，所提供的方法和系统在活化条件下结合孵育细胞而使用，例如与在活化单元操作220期间所添加的一种或更多种试剂一起。在一些实施方案中，活化条件包括活化或刺激和/或能够活化或刺激细胞(例如cd4 t细胞或cd8 t细胞)中信号的条件。在一些实施方案中，活化条件包括在使用和/或存在活化试剂(例如，活化或刺激和/或能够活化或刺激细胞中信号的试剂)的情况下培养(culture)、培育(cultivate)、孵育、活化、增殖细胞中的一个或更多个步骤。
[0141]
在一些实施方案中，活化条件下的孵育可包括培养、培育、刺激、活化、增殖，包括在存在活化条件下的孵育，所述活化条件例如设计用于以下的条件：诱导群中细胞的增殖、扩增、活化和/或存活，用于模拟抗原暴露，和/或用于诱发细胞以进行转导，例如引入重组抗原受体。在一些具体实施方案中，活化条件可以包括以下中的一种或更多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂例如营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和设计用于活化细胞的任何其他药剂。
[0142]
在一些具体实施方案中，活化条件包括使用活化试剂孵育、培养和/或培育细胞。在某些实施方案中，活化试剂包含或包括珠。在某些实施方案中，在活化条件下的孵育、培养和/或培育细胞的启动和/或开始在当细胞与活化试剂接触和/或与活化试剂一起孵育时发生。在一些具体实施方案中，在转导细胞(例如通过转导或转染将重组多核苷酸引入到细胞中)之前、期间和/或之后将细胞与活化试剂一起孵育。
[0143]
在一些实施方案中，以或以约3∶1、2.5∶1、2∶1、1.5∶1、1.25∶1、1.2∶1、1.1∶1、1∶1、0.9∶1、0.8∶1、0.75∶1、0.67∶1、0.5∶1、0.3∶1或0.2∶1的活化试剂和/或珠与细胞的比例孵育富集的t细胞组合物。在一些具体实施方案中，活化试剂和/或珠与细胞的比例为2.5∶1至
0.2∶1、2∶1至0.5∶1、1.5∶1至0.75∶1、1.25∶1至0.8∶1、1.1∶1至0.9∶1。在一些具体实施方案中，活化试剂与细胞的比例为约1∶1或为1∶1。
[0144]
在一些具体实施方案中，活化试剂包括一种或更多种细胞因子。在一些具体实施方案中，一种或更多种细胞因子为重组细胞因子。在一些实施方案中，一种或更多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，一种或更多种细胞因子与由t细胞表达和/或是t细胞内源性的受体结合和/或能够与由t细胞表达和/或是t细胞内源性的受体结合。在一些具体实施方案中，一种或更多种细胞因子是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(il-2)、白介素4(il-4)、白介素7(il-7)、白介素9(il-9)、白介素12(il-12)、白介素15(il-15)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。在一些实施方案中，一种或更多种细胞因子是或包括il-15。在一些具体实施方案中，一种或更多种细胞因子是或包括il-7。在一些具体实施方案中，一种或更多种细胞因子是或包括il-2。
[0145]
在一些具体实施方案中，活化试剂包括il-2，例如重组il-2。不希望受到理论的约束，一些具体实施方案考虑从一些对象获得的cd4 t细胞不以如下量产生或充分产生il-2，该量允许在整个方法中生长、分裂和扩增，以产生输出细胞(例如适用于细胞治疗的经改造细胞)的组合物。在一些实施方案中，在存在重组il-2的情况下的活化条件下孵育富集的cd4 t细胞的组合物提高了组合物的cd4 t细胞将在孵育步骤期间和整个方法中继续存活、生长、扩增和/或活化的概率或可能性。
[0146]
在某些实施方案中，一种或更多种细胞因子的量或浓度以国际单位(iu)测量和/或量化。国际单位可用于量化维生素、激素、细胞因子、疫苗、血液制品和类似的生物活性物质。在一些实施方案中，iu是或包括通过与特定重量和强度的国际参考标准比较来测量生物制品效力的单位(例如，人il-2的who第一国际标准，86/504)。国际单位是报道已发表并源自国际合作研究工作(international collaborative research effort)的生物活性单位的唯一公认的和标准化方法。在一些具体实施方案中，细胞因子的组合物、样品或来源的iu可通过与类似who标准产品进行产品比较测试来获得。例如，在一些实施方案中，将人重组il-2、il-7或il-15的组合物、样品或来源的iu/ml分别与who标准品il-2产品(nibsc编码：86/500)、who标准品il-17产品(nibsc编码：90/530)和who标准品il-15产品(nibsc编码：95/554)进行比较。
[0147]
在一些实施方案中，以iu/ml表示的生物活性等于(以ng/ml表示的ed50)1
×
106。在一些具体实施方案中，重组人il-2或il-15的ed50(在施用其的50％群体中产生质化效应(quantal effect)的中位有效剂量)等于ctll-2细胞(源自c57bl/6小鼠的细胞毒性t细胞)的细胞增殖的半最大刺激(xtt或氢氧化四唑，切割)所需的浓度。在某些实施方案中，重组人il-7的ed50等于pha(植物血凝素p)活化的人外周血淋巴细胞增殖的半最大刺激所需的浓度。关于il-2的iu的测定和计算的细节在wadhwa et al.，journal of immunological methods(2013)，379(1-2)：1-7和gearing and thorpe，journal ofimmunological methods(1988)，114(1-2)：3-9中讨论；关于il-15的iu的测定和计算的细节在soman et al.journal of immunological methods(2009)348(1-2)：83-94中讨论；其在此通过引用整体并入。
[0148]
在一些实施方案中，将细胞与以下浓度的细胞因子(例如，重组人细胞因子)孵育：
1iu/ml至1,000iu/ml、10iu/ml至50iu/ml、50iu/ml至100iu/ml、100iu/ml至200iu/ml、100iu/ml至500iu/ml、250iu/ml至500iu/ml或500iu/ml至1,000iu/ml。
[0149]
在一些实施方案中，将细胞与以下浓度的il-2(例如人重组il-2)孵育：1iu/ml至200iu/ml、10iu/ml至100iu/ml、50iu/ml至150iu/ml、80iu/ml至120iu/ml、60iu/ml至90iu/ml或70iu/ml至90iu/ml。在一些具体实施方案中，将富集的t细胞组合物与浓度为以下或约以下的重组il-2孵育：50iu/ml、55iu/ml、60iu/ml、65iu/ml、70iu/ml、75iu/ml、80iu/ml、85iu/ml、90iu/ml、95iu/ml、100iu/ml、110iu/ml、120iu/ml、130iu/ml、140iu/ml或150iu/ml。
[0150]
在一些实施方案中，将细胞与以下浓度的重组il-7(例如人重组il-7)孵育：100iu/ml至2,000iu/ml、500iu/ml至1,000iu/ml、100iu/ml至500iu/ml、500iu/ml至750iu/ml、750iu/ml至1,000iu/ml或550iu/ml至650iu/ml。在一些具体实施方案中，将细胞与浓度为以下或约以下的il-7孵育：50iu/ml、100iu/ml、150iu/ml、200iu/ml、250iu/ml、300iu/ml、350iu/ml、400iu/ml、450iu/ml、500iu/ml、550iu/ml、600iu/ml、650iu/ml、700iu/ml、750iu/ml、800iu/ml、750iu/ml、750iu/ml、750iu/ml或1,000iu/ml。
[0151]
在一些实施方案中，将细胞与以下浓度的重组il-15(例如人重组il-15)孵育：0.1iu/ml至100iu/ml、1iu/ml至50iu/ml、5iu/ml至25iu/ml、25iu/ml至50iu/ml、5iu/ml至15iu/ml或10iu/ml至00iu/ml。在一些具体实施方案中，将细胞与浓度为以下或约以下的il-15孵育：1iu/ml、2iu/ml、3iu/ml、4iu/ml、5iu/ml、6iu/ml、7iu/ml、8iu/ml、9iu/ml、10iu/ml、11iu/ml、12iu/ml、13iu/ml、14iu/ml、15iu/ml、20iu/ml、25iu/ml、30iu/ml、40iu/ml或50iu/ml。
[0152]
在一些实施方案中，il-2、il-7和/或il-15是重组的。在某些实施方案中，il-2、il-7和/或il-15是人的。在一些具体实施方案中，一种或更多种细胞因子是或包括人重组il-2、il-7和/或il-15。
[0153]
在一些具体实施方案中，将细胞与活化试剂在一种或更多种抗氧化剂的存在下孵育。在一些实施方案中，抗氧化剂包括但不限于包括以下的一种或更多种抗氧化剂：生育酚、三烯生育酚、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-三烯生育酚、β-三烯生育酚、α-生育酚醌、trolox(6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)、丁基羟基茴香醚(bha)、丁羟甲苯(bht)、黄酮类化合物、异黄酮、番茄红素、β-胡萝卜素、硒、泛醌、梅毒菌素(luetin)、s-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、n-乙酰半胱氨酸(nac)、柠檬酸、左旋肉碱、bht、单硫代甘油、抗坏血酸、没食子酸丙酯、甲硫氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽、胱胺和胱硫醚和/或甘氨酸-甘氨酸-组氨酸。
[0154]
在一些实施方案中，一种或更多种抗氧化剂是或包括含硫氧化剂。在某些实施方案中，含硫抗氧化剂可以包括含硫醇的抗氧化剂和/或表现出一个或更多个硫部分(例如在环结构内)的抗氧化剂。在一些实施方案中，含硫抗氧化剂可包括，例如，n-乙酰基半胱氨酸(nac)和2，3-二巯基丙醇(dmp)、l-2-氧代-4-噻唑烷羧酸酯(otc)和硫辛酸。在一些具体实施方案中，含硫抗氧化剂是谷胱甘肽前体。在一些实施方案中，谷胱甘肽前体是可在细胞内通过一个或更多个步骤被修饰为衍生的谷胱甘肽的分子。在一些具体实施方案中，谷胱甘肽前体可包括但不限于n-乙酰半胱氨酸(nac)、l-2-氧代噻唑烷-4-羧酸(丙环司坦)、硫辛酸、s-烯丙基半胱氨酸或甲基甲硫氨酸硫氯化物。
[0155]
在一些实施方案中，在活化条件下孵育细胞包括在一种或更多种抗氧化剂存在下孵育细胞。在一些具体实施方案中，在一种或更多种抗氧化剂存在下用活化试剂刺激细胞。在一些实施方案中，细胞在以下浓度的一种或更多种抗氧化剂的存在下孵育：1ng/ml至100ng/ml、10ng/ml至1μg/ml、100ng/ml至10μg/ml、1μg/ml至100μg/ml、10μg/ml至1mg/ml、100μg/ml至1mg/ml、1500μg/ml至2mg/ml、500μg/ml至5mg/ml、1mg/ml至10mg/ml或1mg/ml至100mg/ml。在一些实施方案中，细胞在为或为约以下浓度的一种或更多种抗氧化剂的存在下孵育：1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml。在一些实施方案中，一种或更多种抗氧化剂是或包括含硫抗氧化剂。在一些具体实施方案中，一种或更多种抗氧化剂是或包括谷胱甘肽前体。
[0156]
在一些实施方案中，一种或更多种抗氧化剂是或包括n-乙酰半胱氨酸(nac)。在一些实施方案中，在活化条件下孵育细胞包括在nac存在下孵育细胞。在一些具体实施方案中，在存在nac的情况下用活化试剂刺激细胞。在一些实施方案中，细胞在以下浓度的nac的存在下孵育：1ng/ml至100ng/ml、10ng/ml至1μg/ml、100ng/ml至10μg/ml、1μg/ml至100μg/ml、10μg/ml至1mg/ml、100μg/ml至1mg/ml、1500μg/ml至2mg/ml、500μg/ml至5mg/ml、1mg/ml至10mg/ml或1mg/ml至100mg/ml。在一些实施方案中，细胞在为或为约以下浓度的nac的存在下孵育：1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml。
[0157]
在一些实施方案中，刺激和/或活化的条件可以包括以下中的一种或更多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂例如营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在活化细胞的药剂。
[0158]
在一些实施方案中，孵育(例如，用活化剂)的总持续时间为约1小时至96小时、1小时至72小时、1小时至48小时、4小时至36小时、8小时至30小时或12小时至24小时，例如至少6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些实施方案中，另外孵育的时间为约1小时至48小时、4小时至36小时、8小时至30小时或12小时至24小时，包括端点。
[0159]
在一些实施方案中，在例如通过转导和/或转染将多核苷酸例如编码重组受体的多核苷酸引入至细胞的步骤之前和/或期间在活化条件下培养、培育和/或孵育细胞。在某些实施方案中，在转导单元操作之前在活化条件下培养、培育和/或孵育细胞持续30分钟至2小时、1小时至8小时、1小时至6小时、6小时至12小时、12小时至18小时、16小时至24小时、12小时至36小时、24小时至48小时、24小时至72小时、42小时至54小时、60小时至120小时、96小时至120小时、90小时至110小时、1天至7天、3天至8天、1天至3天、4天至6天或4天至5天的时间量。
[0160]
在某些实施方案中，在转导单元操作细胞之前和/或期间，将细胞与活化试剂和/或在活化试剂存在下孵育。在某些实施方案中，将细胞与活化试剂和/或在活化试剂存在下孵育持续12小时至36小时、24小时至48小时、24小时至72小时、42小时至54小时、60小时至120小时、96小时至120小时、90小时和2天至7天、3天至8天、1天至8天、4天至6天或者4天至5
天的时间量。在一些具体实施方案中，在转导单元操作细胞之前和/或期间在活化条件下培养、培育和/或孵育细胞持续少于10天、9天、8天、7天、6天或5天、4天的时间量，或少于168小时、162小时、156小时、144小时、138小时、132小时、120小时、114小时、108小时、102小时或96小时的时间量。在一些具体实施方案中，将细胞与活化试剂和/或在活化试剂存在下孵育4天、5天、6天或7天或约4天、5天、6天或7天。
[0161]
在一些实施方案中，在活化条件下孵育细胞包括用活化试剂孵育细胞。在一些实施方案中，活化试剂包含或包括珠，例如顺磁珠，并且细胞与活化试剂以小于3∶1(珠∶细胞)的比例，例如以1∶1的比例孵育。在一些具体实施方案中，在一种或更多种细胞因子和/或一种或更多种抗氧化剂的存在下将细胞与刺激/活化试剂一起孵育。在一些实施方案中，在重组il-2、il-7、il-15和nac的存在下，将富集的cd4 t细胞的组合物与活化试剂以1∶1(珠∶细胞)的比例孵育。在某些实施方案中，在重组il-2、il-15和nac的存在下，将富集的cd8 t细胞的组合物与刺激试剂以1∶1(珠∶细胞)的比例孵育。在一些实施方案中，在从孵育开始或启动(例如，将活化试剂添加至细胞或与细胞接触的时间)起6天、5天或4天时、6天、5天或4天之内、或约6天、5天或4天之内从细胞中去除和/或分离活化试剂。
[0162]
在一些实施方案中，在活化条件下孵育富集的细胞组合物是或包括将富集的细胞组合物与能够活化和/或扩增t细胞的活化试剂孵育和/或接触。在一些实施方案中，活化试剂能够活化和/或激活细胞内的一种或更多种信号。在一些实施方案中，一种或更多种信号由受体介导。在一些具体实施方案中，一种或更多种信号是以下或与以下相关：第二信使(例如camp和/或细胞内钙)的信号转导和/或水平或量的变化，一种或更多种细胞蛋白质的量、细胞定位、构象、磷酸化、泛素化和/或截短的变化，和/或细胞活性例如转录、翻译、蛋白质降解、细胞形态学、活化状态和/或细胞分裂的变化。在一些具体实施方案中，活化试剂活化和/或能够活化t细胞受体(tcr)复合体的一种或更多种组分的一个或更多个细胞内信号传导结构域和/或一种或更多种共刺激分子的一个或更多个细胞内信号传导结构域。
[0163]
在某些实施方案中，活化试剂包含颗粒，例如珠，其与能够活化和/或扩增细胞(例如t细胞)的一种或更多种药剂(例如生物分子)缀合或连接。在一些实施方案中，一种或更多种药剂与珠结合。在一些实施方案中，珠是生物相容性的，即，由适合生物用途的材料构成。在一些实施方案中，珠对于培养的细胞(例如培养的t细胞)是无毒性的。在一些实施方案中，珠可以是能够以允许药剂与细胞之间相互作用的方式附着药剂的任何颗粒。
[0164]
在一些实施方案中，活化试剂包含一种或更多种能够活化和/或扩增细胞(例如t细胞)的药剂，其与珠结合或以其他方式附着于珠，例如珠的表面。在某些实施方案中，珠是非细胞颗粒。在一些具体实施方案中，珠可包括胶体颗粒、微球、纳米颗粒、磁珠等。在一些实施方案中，珠为琼脂糖珠。在某些实施方案中，珠为琼脂糖凝胶珠。
[0165]
在一些具体实施方案中，活化试剂包含单分散的珠。在某些实施方案中，单分散的珠包含相互之间直径标准偏差小于5％的尺寸分散体。
[0166]
在一些实施方案中，珠包含一种或更多种药剂，例如与珠表面联接、缀合或连接(直接或间接)的药剂。在一些实施方案中，如本文中所设想的药剂可包括但不限于rna、dna、蛋白质(例如酶)、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段、碳水化合物、脂质凝集素或任何其他对期望的靶标具有亲和力的生物分子。在一些实施方案中，期望的靶标是t细胞受体和/或t细胞受体的组分。在某些实施方案中，期望的靶标是cd3。在某些实施方案中，期
望的靶标为t细胞共刺激分子，例如cd28、cd137(4-1-bb)、ox40或icos。一种或更多种药剂可通过多种本领域已知和可用的方法直接或间接地附着至珠。附着可以是共价的、非共价的、静电的或疏水的，并可通过多种附着手段实现，包括例如化学手段、机械手段或酶手段。在一些实施方案中，生物分子(例如，生物素化抗cd3抗体)可以通过另一个直接连接到珠上的生物分子(例如，抗生物素抗体)间接连接到珠上。
[0167]
在一些实施方案中，活化试剂包含珠和一种或更多种与细胞表面的大分子直接相互作用的药剂。在某些实施方案中，珠(例如顺磁珠)通过一种或更多种对细胞上的一种或更多种大分子(例如，一种或更多种细胞表面蛋白)具有特异性的药剂(例如抗体)与细胞相互作用。在某些实施方案中，珠(例如顺磁珠)标记有本文中所述的第一药剂，例如一抗(例如，抗生物素抗体)或其他生物分子，然后添加第二药剂，例如二抗(例如，生物素化抗cd3抗体)或其他第二生物分子(例如链霉亲和素)，由此二抗或其他第二生物分子与这样的一抗或者颗粒上的其他生物分子特异性地结合。
[0168]
在一些实施方案中，活化试剂包含一种或更多种药剂(例如抗体)，其附着于珠(例如顺磁珠)并与细胞(例如t细胞)上的一种或更多种以下大分子特异性结合：cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、cd25、cd27、cd28、cd29、cd31、cd44、cd45ra、cd45ro、cd54(icam-1)、cd127、mhci、mhcii、ctla-4、icos、pd-1、ox40、cd27l(cd70)、4-1bb(cd137)、4-1bbl、cd30l、light、il-2r、il-12r、il-1r、il-15r；ifn-γr、tnf-αr、il-4r、il-10r、cd18/cd1 la(lfa-1)、cd62l(l-选择素)、cd29/cd49d(vla-4)、notch配体(例如δ-样1/4、锯齿状1/2等)、ccr1、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr7和cxcr3或其片段，包括这些大分子或其片段的相应配体。在一些实施方案中，附着至珠的药剂(例如抗体)与细胞(例如t细胞)上的一种或更多种以下大分子特异性结合：cd28、cd62l、ccr7、cd27、cd127、cd3、cd4、cd8、cd45ra和/或cd45ro。
[0169]
在一些实施方案中，附着至珠的一种或更多种药剂为抗体。抗体可包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体、双抗体(diabody)和单链分子以及抗体片段(例如，fab、f(ab’)2和fv)。在一些实施方案中，活化试剂是抗体片段(包括抗原结合片段)，例如fab、fab
′‑
sh、fv、scfv或(fab
′
)2片段。应当理解的是，任何同种型的恒定区均可用于本文中考虑的抗体，其包括igg、igm、iga、igd和ige恒定区，并且这样的恒定区可从任何人或动物物种(例如鼠物种)获得。在一些实施方案中，药剂是结合和/或识别t细胞受体的一种或更多种组分的抗体。在一些具体实施方案中，药剂是抗cd3抗体。在某些实施方案中，药剂是结合和/或识别共受体的抗体。在一些实施方案中，活化试剂包含抗cd28抗体。
[0170]
在一些实施方案中，珠的直径大于约0.001μm、大于约0.01μm、大于约0.1μm、大于约1.0μm、大于约10μm、大于约50μm、大于约100μm或大于约1000μm且不超过约1500μm。在一些实施方案中，珠的直径为约1.0μm至约500μm、约1.0μm至约150μm、约1.0μm至约30μm、约1.0μm至约10μm、约1.0μm至约5.0μm、约2.0μm至约5.0μm、或约3.0μm至约5.0μm。在一些实施方案中，珠的直径为约3μm至约5μm。在一些实施方案中，珠的直径至少为约0.001μm、0.01μm、0.1μm、0.5μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm、9.5μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μm或20μm。在某些实施方案中，珠的直径为或为约4.5μm。在某些实施方案中，珠的直径为或为约2.8μm。
[0171]
在一些实施方案中，珠的密度大于0.001g/cm3、大于0.01g/cm3、大于0.05g/cm3、大于0.1g/cm3、大于0.5g/cm3、大于0.6g/cm3、大于0.7g/cm3、大于0.8g/cm3、大于0.9g/cm3、大于1g/cm3、大于1.1g/cm3、大于1.2g/cm3、大于1.3g/cm3、大于1.4g/cm3、大于1.5g/cm3、大于2g/cm3、大于3g/cm3、大于4g/cm3或大于5g/cm3。在一些实施方案中，珠的密度为约0.001g/cm3至约100g/cm3、约0.01g/cm3至约50g/cm3、约0.1g/cm3至约10g/cm3、约0.1g/cm3至约.5g/cm3、约0.5g/cm3至约1g/cm3、约0.5g/cm3至约1.5g/cm3、约1g/cm3至约1.5g/cm3、约1g/cm3至约2g/cm3或约1g/cm3至约5g/cm3。在一些实施方案中，珠的密度为约0.5g/cm3、约0.5g/cm3、约0.6g/cm3、约0.7g/cm3、约0.8g/cm3、约0.9g/cm3、约1.0g/cm3、约1.1g/cm3、约1.2g/cm3、约1.3g/cm3、约1.4g/cm3、约1.5g/cm3、约1.6g/cm3、约1.7g/cm3、约1.8g/cm3、约1.9g/cm3或约2.0g/cm3。在某些实施方案中，珠的密度为约1.6g/cm3。在一些具体实施方案中，珠或颗粒的密度为约1.5g/cm3。在某些实施方案中，颗粒的密度为约1.3g/cm3。在某些实施方案中，多个珠具有均匀的密度。在某些实施方案中，均匀的密度包括平均珠密度的小于10％、小于5％或小于1％的密度标准偏差。在一些实施方案中，珠的表面积为约0.001m2/克颗粒(m2/g)至约1,000m2/g、约.010m2/g至约100m2/g、约0.1m2/g至约10m2/g、约0.1m2/g至约1m2/g、约1m2/g至约10m2/g、约10m2/g至约100m2/g、约0.5m2/g至约20m2/g、约0.5m2/g至约5m2/g或约1m2/g至约4m2/g。在一些实施方案中，颗粒或珠的表面积为约1m2/g至约4m2/g。
[0172]
在一些实施方案中，珠在珠表面处或附近包含至少一种可以与药剂联接、连接或缀合的材料。在一些实施方案中，珠是表面官能化的，即包含能够与结合分子(例如多核苷酸或多肽)形成共价键的官能团。在一些具体实施方案中，珠包含表面暴露的羧基、氨基、羟基、甲苯磺酰基、环氧基和/或氯甲基基团。在一些具体实施方案中，珠包括表面暴露的琼脂糖和/或琼脂糖凝胶。在某些实施方案中，珠表面包含附着的可结合或附着结合分子的活化试剂。在一些具体实施方案中，生物分子是多肽。在一些实施方案中，珠包括表面暴露的蛋白a、蛋白g或生物素。
[0173]
在一些实施方案中，珠与磁场反应或在磁场中响应或针对磁场响应。在一些实施方案中，珠是磁珠。在一些实施方案中，磁珠是顺磁性的。在一些具体实施方案中，磁珠是超顺磁性的。在某些实施方案中，珠不展示任何磁特性，除非它们暴露于磁场。
[0174]
在一些具体实施方案中，珠包括磁芯、顺磁性芯，或超顺磁性芯。在一些实施方案中，磁芯包含金属。在一些实施方案中，金属可以是但不限于铁、镍、铜、钴、钆、锰、钽、锌、锆或其任意组合。在某些实施方案中，磁芯包含金属氧化物(例如，氧化铁)、铁氧体(例如，锰铁氧体、钴铁氧体、镍铁氧体等)、赤铁矿和金属合金(例如cotazn)。在一些实施方案中，磁芯包括一种或更多种铁氧体、金属、金属合金、氧化铁或二氧化铬。在一些实施方案中，磁芯包含元素铁或其化合物。在一些实施方案中，磁芯包含一种或更多种磁铁矿(fe3o4)、磁赤铁矿(γfe2o3)或硫复铁矿(fe3s4)。在一些实施方案中，内芯包含氧化铁(例如，fe3o4)。
[0175]
在某些实施方案中，珠包含由表面官能化包衣或包被覆盖的磁芯、顺磁性芯和/或超顺磁性芯。在一些实施方案中，包衣可包含可包括但不限于聚合物、多糖、二氧化硅、脂肪酸、蛋白质、碳、琼脂糖、琼脂糖凝胶或其组合的材料。在一些实施方案中，聚合物可以是聚乙二醇、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚戊二醛、聚氨酯、聚苯乙烯或聚乙烯醇。在某些实施方案中，外包衣或包被包含聚苯乙烯。在一些具体实施方案中，外包被是表面官能化的。
[0176]
在一些实施方案中，活化试剂包含含有金属氧化物芯(例如，氧化铁芯)和包衣的
珠，其中金属氧化物芯包含至少一种多糖(例如右旋糖酐)，并且其中包衣包含至少一种多糖(例如氨基右旋糖酐)、至少一种聚合物(例如聚氨酯)和二氧化硅。在一些实施方案中，金属氧化物芯是胶体氧化铁芯。在某些实施方案中，一种或更多种药剂包括抗体或其抗原结合片段。在一些具体实施方案中，一种或更多种药剂包括抗cd3抗体和抗cd28抗体。在一些实施方案中，活化试剂包含抗cd3抗体、抗cd28抗体和抗生物素抗体。在一些实施方案中，活化试剂包含抗生物素抗体。在一些实施方案中，珠的直径为约3μm至约10μm。在一些实施方案中，珠的直径为约3μm至约5μm。在某些实施方案中，珠的直径为约3.5μm。
[0177]
在一些实施方案中，活化试剂包含一种或更多种附着于包含金属氧化物芯(例如，氧化铁内芯)和包衣(例如，保护性包衣)的珠的药剂，其中包衣包含聚苯乙烯。在某些实施方案中，珠是单分散的顺磁性(例如超顺磁性)珠，其包含顺磁性(例如，超顺磁性)铁芯(例如，包含磁铁矿(fe3o4)和/或磁赤铁矿(γfe2o3)的芯)和聚苯乙烯包衣或包被。在一些实施方案中，珠是无孔的。在一些实施方案中，珠包含一种或更多种药剂附着至其的官能化表面。在某些实施方案中，一种或更多种药剂在表面处与珠共价结合。在一些实施方案中，一种或更多种药剂包括抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，一种或更多种药剂包括抗cd3抗体和抗cd28抗体。在一些实施方案中，一种或更多种药剂包括抗cd3抗体和/或抗cd28抗体，以及能够与标记的抗体(例如，生物素化抗体)(例如标记的抗cd3或抗cd28抗体)结合的抗体或其抗原片段。在某些实施方案中，珠的密度为约1.5g/cm3，且表面积为约1m2/g至约4m2/g。在一些具体实施方案中；珠是直径为约4.5μm且密度为约1.5g/cm3的单分散超顺磁性珠。在一些实施方案中，珠是平均直径为约2.8μm且密度为约1.3g/cm3的单分散超顺磁性珠。
[0178]
在一些实施方案中，将细胞与活化试剂孵育，珠与细胞的比例为或为约3∶1、2.5∶1、2∶1、1.5∶1、1.25∶1、1.2∶1、1.1∶1、1∶1、0.9∶1、0.8∶1、0.75∶1、0.67∶1、0.5∶1、0.3∶1或0.2∶1。在一些具体实施方案中，珠与细胞的比例为2.5∶1至0.2∶1、2∶1至0.5∶1、1.5∶1至0.75∶1、1.25∶1至0.8∶1、1.1∶1至0.9∶1。在一些具体实施方案中，活化试剂与细胞的比例为约1∶1或为1∶1。
[0179]
在一些具体实施方案中，刺激试剂包含寡聚物试剂(例如，链霉亲和素突变蛋白试剂)，其与能够活化tcr复合体的细胞内信号传导结构域的一种或更多种药剂(例如，配体)缀合、连接或附着。在一些实施方案中，一种或更多种药剂具有能够在特定结合位点(例如，结合位点z)处与寡聚物试剂结合的附着结合结构域或结合配偶体(例如，结合配偶体c)。在一些实施方案中，多种药剂与寡聚物试剂可逆地结合。在多个实施方案中，寡聚物试剂具有多个特定结合位点，在某些实施方案中，这些结合位点与多种药剂在结合结构域(例如，结合配偶体c)处可逆地结合。在一些实施方案中，在竞争试剂(例如，也能够与特定结合位点(例如，结合位点z)结合的试剂)的存在下结合药剂的量降低或减少。
[0180]
在一些实施方案中，刺激试剂是或包括可逆系统，其中至少一种药剂(例如，能够在例如t细胞的细胞中产生信号的药剂)与寡聚物试剂结合(例如，可逆结合)。在一些实施方案中，试剂包含能够与药剂结合(例如，可逆结合)的多个结合位点。在一些情况下，试剂为寡聚物颗粒试剂，其具有至少一种能够在例如t细胞的细胞中产生信号的附着药剂。在一些实施方案中，药剂包含至少一个可以特异性结合分子的表位或区域的结合位点(例如，结合位点b)，并且还包含与试剂的至少一个结合位点(例如，结合位点z)特异性结合的结合配
偶体(在本文中也称为结合配偶体c)。在一些实施方案中，结合配偶体c和至少一个结合位点z之间的结合相互作用是非共价相互作用。在一些情况下，结合配偶体c和至少一个结合位点z之间的结合相互作用是共价相互作用。在一些实施方案中，结合配偶体c和至少一个结合位点z之间的结合相互作用(例如非共价相互作用)是可逆的。
[0181]
可在这样的可逆系统中用作寡聚物试剂的物质是已知的，参见，例如，美国专利no.5,168,049；5,506,121；6,103,493；7,776,562；7,981,632；8,298,782；8,735,540；9,023,604；和国际公开的pct申请no.wo2013/124474和wo2014/076277。下文描述了能够形成可逆相互作用的试剂和结合配偶体以及能够逆转这样的结合的物质(例如竞争试剂)的非限制性实例。
[0182]
在一些实施方案中，寡聚物试剂是链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、亲和素、亲和素突变蛋白或类似物(例如中性亲和素)或其混合物的寡聚物，其中这样的寡聚物试剂包含一个或更多个与药剂的结合结构域(例如，结合配偶体c)可逆结合的结合位点。在一些实施方案中，药剂的结合结构域可以是生物素、生物素衍生物或类似物、或链霉亲和素结合肽、或者能够与链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、亲和素或亲和素突变蛋白或类似物特异性结合的其他分子。
[0183]
在某些实施方案中，一种或更多种药剂(例如，能够在例如t细胞的细胞中产生信号的药剂)与寡聚物试剂结合，例如与寡聚物试剂可逆地结合，例如经由寡聚物试剂上存在的多个特定结合位点(例如，结合位点z)。在一些情况下，这导致药剂彼此紧密布置，使得如果具有被药剂结合或识别的细胞表面分子(的至少两个拷贝)的靶细胞与药剂接触，则可发生亲和力效应。
[0184]
在一些实施方案中，寡聚物试剂是链霉亲和素寡聚物、链霉亲和素突变蛋白寡聚物、链霉亲和素类似物寡聚物、亲和素寡聚物、由亲和素突变蛋白或亲和素类似物(例如中性亲和素)或其混合物构成的寡聚物。在一些具体实施方案中，寡聚物试剂包含能够与药剂的结合结构域(例如，结合配偶体c)结合的特定结合位点。在一些实施方案中，结合结构域可以是生物素、生物素衍生物或类似物、或链霉亲和素结合肽、或者能够与链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、亲和素或亲和素突变蛋白或类似物特异性结合的其他分子。
[0185]
在一些实施方案中，链霉亲和素可以是野生型链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物，例如链霉亲和素样多肽。类似地，在某些方面中，亲和素包括野生型亲和素或亲和素的突变蛋白或类似物，例如中性亲和素，即带有经修饰的精氨酸的去糖基化亲和素，其通常表现出更中性的等电点(pi)，并且可作为天然亲和素的替代物。通常，去糖基化的中性形式的亲和素包括可商购的那些形式，例如可通过sigma aldrich(st.louis，mo)获得的“extravidin”，或例如可从thermo scientific(waltham，ma)或invitrogen(carlsbad，ca)获得的“neutravidin”。
[0186]
在一些实施方案中，试剂为链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白或类似物。在一些实施方案中，野生型链霉亲和素(wt-链霉亲和素)具有由argarana et al，nucleic acids res.14(1986)1871-1882公开的氨基酸序列(seq id no：1)。一般来说，链霉亲和素作为四个相同亚基的四聚体(即其是同源四聚体)天然存在，其中每个亚基包含生物素、生物素衍生物或类似物或生物素模拟物的单结合位点。链霉亲和素亚基的示例性序列为seq id no：1中所示的氨基酸序列，但这样的序列也可包括存在于来自其他链霉菌属(streptomyce)物
种的其同源物中的序列。特别地，链霉亲和素的每个亚基可表现出针对生物素的强结合亲和力，其中解离常数(kd)的数量级为约10-14
m。在一些情况下，链霉亲和素可以作为单价四聚体存在，其中四个结合位点中只有一个具有功能(howarth et al.(2006)nat.methods，3：267-73；zhang et al.(2015)biochem.biophys.res.commun.，463：1059-63)；可以作为二价四聚体存在，其中四个结合位点中的两个具有功能(fairhead et al.(2013)j.mol.biol.，426：199-214)，或者可以以单体或二聚体形式存在(wu et al.(2005)j.biol.chem.，280：23225-31；lim et al.(2010)biochemistry，50：8682-91)。
[0187]
在一些实施方案中，链霉亲和素可以是任何形式，例如野生型或未经修饰的链霉亲和素，例如来自链霉菌属物种的链霉亲和素或其功能活性片段，其包括至少一个包含生物素、生物素衍生物或类似物或生物素模拟物结合位点的功能性亚基，例如，通常包含seq id no：1中所示的来自阿维丁链霉菌(streptomyces avidinii)的野生型链霉亲和素的至少一个功能性亚基或其功能活性片段。例如，在一些实施方案中，链霉亲和素可包括在n和/或c端缩短的野生型链霉亲和素片段。这样的极小链霉亲和素包括n端开始于seq id no：1的氨基酸第10至16位的区域且c端终止于seq id no：1的氨基酸第133至142位的区域的任何链霉亲和素。在一些实施方案中，链霉亲和素的功能活性片段包含seq id no：2中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如seq id no：2中所示的链霉亲和素可在对应于ala13(编号在seq id no：1中列出)的位置处进一步含有n端甲硫氨酸。提及链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白中残基位置是提及seq id no：1中残基的编号。
[0188]
例如，在wo 86/02077、de 19641876al、us 6,022,951、wo 98/40396或wo 96/24606中提及了链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的实例。链霉亲和素突变蛋白的实例是本领域已知的，参见例如美国专利no.5,168,049；5,506,121；6,022,951；6,156,493；6,165,750；6,103,493；或6,368,813；或国际公开的pct申请no.wo2014/076277。
[0189]
在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白可含有不是未经修饰或野生型链霉亲和素的一部分的氨基酸，或者可仅包含野生型或未经修饰链霉亲和素的一部分。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有至少一个这样的亚基，所述亚基与未经修饰或野生型链霉亲和素的亚基相比(例如与seq id no：1中所示的野生型链霉亲和素亚基或其功能活性片段(例如seq id no：2中所示)相比)可具有一个更多个氨基酸替换(替代)。
[0190]
在一些实施方案中，链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白对结合结构域的结合亲和力(例如解离常数(kd))为小于1
×
10-4
m、5
×
10-4
m、1
×
10-5
m、5
×
10-5
m、1
×
10-6
m、5
×
10-6
m或1
×
10-7
m，但通常大于1
×
10-13
m、1
×
10-12
m或1
×
10-11
m。例如，肽序列(strep-标签)(例如美国专利号5,506,121中所公开的)可用作生物素模拟物并显示出对链霉亲和素的结合亲和力(例如kd为大约10-4
至10-5
m)。在一些情况下，结合亲和力可通过在链霉亲和素分子内进行突变来进一步提高，例如参见美国专利号6,103,493或国际公开的pct申请号wo2014/076277。在一些实施方案中，结合亲和力可通过本领域已知的方法(例如本文中所述的任何方法)来确定。
[0191]
在一些实施方案中，试剂例如链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白表现出对肽配体结合配偶体的结合亲和力，所述肽配体结合配偶体可以是存在于药剂(例如受体结合剂或选择剂)中的结合配偶体c。在一些实施方案中，肽序列含有具有通式his-pro-xaa的序列，其中xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或甲硫氨酸，例如含有seq id no：3中所示的序列。在一些实
施方案中，肽序列具有seq id no：4中所示的通式，或例如seq id no：5中所示的通式。在一个实施例中，肽序列是trp-arg-his-pro-gln-phe-gly-gly(也称为seq id no：6中所示)。在一个实施例中，肽序列是trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys(也称为ii，seq id no：7中所示)。在一些实施方案中，肽配体含有依次排列的至少两个链霉亲和素结合模块，其中两个模块之间的距离为至少0且不大于50个氨基酸，其中一个结合模块具有3至8个氨基酸并且至少含有序列his-pro-xaa，其中xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或甲硫氨酸，并且其中其他结合模块具有相同或不同的链霉亲和素肽配体，例如seq id no：4中所示的(参见例如国际公开的pct申请号wo02/077018；美国专利号7,981,632)。在一些实施方案中，肽配体含有具有seq id no：8或9中任一个中所示的式的序列。在一些实施方案中，肽配体具有seq id no：10至12、13至14中任一个中所示的氨基酸序列。在大多数情况下，所有这些链霉亲和素结合肽都与相同的结合位点结合，即链霉亲和素的生物素结合位点。如果将一种或更多种这样的链霉亲和素结合肽用作结合配偶体c(例如c1和c2)，则通过结合配偶体c与一种或更多种药剂结合的寡聚物颗粒试剂和/或多聚化试剂通常由一种或更多种链霉亲和素突变蛋白构成。
[0192]
在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白是如美国专利号6,103,493中所述的突变体。在一些实施方案中，基于野生型链霉亲和素的氨基酸序列(例如seq id no：1中所示)，所述链霉亲和素突变蛋白在氨基酸第44至53位的区域内含有至少一个突变。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白在一个或更多个残基44、45、46和/或47处含有突变。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有以下：疏水性脂肪族氨基酸(例如val、ala、ile或leu)对野生型链霉亲和素的第44位glu的替代、第45位的任何氨基酸、第46位的脂肪族氨基酸(例如疏水性脂肪族氨基酸)和/或第47位用碱性氨基酸(例如arg或lys，例如通常为arg)对val的替代。在一些实施方案中，ala在第46位和/或arg在第47位和/或val或ile在第44位。在一些实施方案中，链霉亲和素突变体含有残基val44-thr45-ala46-arg47，例如在含有seq id no：15或seq id no：16或17中所示的氨基酸序列的示例性链霉亲和素突变蛋白(也称为链霉亲和素突变体1，sam1)中所示的。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有残基ile44-gly45-ala46-arg47，例如含有seq id no：18、19或20中所示氨基酸序列的示例性链霉亲和素突变蛋白(也称为sam2)中所示的。在一些情况下，这样的链霉亲和素突变蛋白在例如美国专利6,103,493中描述，并且可以以商标商购获得。在一些实施方案中，突变蛋白链霉亲和素含有seq id no：21或seq id no：22中所示的氨基酸序列。在一些特定实施方案中，分子是包含seq id no：2、16、19、21、23、17或20中任一个中所示序列的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的四聚体，其作为四聚体是含有20个伯胺的分子，每个单体包含1个n端胺和4个赖氨酸。
[0193]
在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白表现出由这样的解离常数(kd)表征的结合亲和力，所述解离常数(kd)对于肽配体(trp-arg-his-pro-gln-phe-gly-gly；也称为seq id no：6中所示)为或为小于3.7
×
10-5
m，和/或对于肽配体(trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys；也称为seq id no：7中所示)为或为小于7.1
×
10-5
m，和/或对于seq id no：7、8、9、13、14、10至12、5、6、3、4中任一个中所示的肽配体中的
任一种为或为小于7.0
×
10-5
m、5.0
×
10-5
m、1.0
×
10-5
m、5.0
×
10-6
m、1.0
×
10-6
m、5.0
×
10-7
m或1.0
×
10-7
m，但通常大于1
×
10-13
m、1
×
10-12
m或1
×
10-11
m。
[0194]
在一些实施方案中，所得链霉亲和素突变蛋白表现出由这样的缔合常数(ka)表征的结合亲和力，所述缔合常数(ka)对于肽配体(trp-arg-his-pro-gln-phe-gly-gly；也称为seq id no：6中所示)为或为大于2.7
×
104m-1
，和/或对于肽配体(trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys；也称为ii，seq id no：7中所示)为或为大于1.4
×
104m-1
，和/或对于seq id no：7、8、9、13、14、10至12、5、6、3、4中任一个中所示的肽配体中的任一种为或为大于1.43
×
104m-1
、1.67
×
104m-1
、2
×
104m-1
、3.33
×
104m-1
、5
×
104m-1
、1
×
105m-1
、1.11
×
105m-1
、1.25
×
105m-1
、1.43
×
105m-1
、1.67
×
105m-1
、2
×
105m-1
、3.33
×
105m-1
、5
×
105m-1
、1
×
106m-1
、1.11
×
106m-1
、1.25
×
106m-1
、1.43
×
106m-1
、1.67
×
106m-1
、2
×
106m-1
、3.33
×
106m-1
、5
×
106m-1
、1
×
107m-1
，但通常小于1
×
10
13
m-1
、1
×
10
12
m-1
或1
×
10
11
m-1
。
[0195]
在一些特定实施方案中，本文中提供了由以下构成和/或含有以下的寡聚物颗粒试剂：多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体。在某些实施方案中，本文中提供的寡聚物颗粒试剂含有多个结合位点，所述结合位点与一种或更多种药剂，例如刺激剂和/或选择剂可逆地结合或能够可逆地结合。在一些实施方案中，寡聚物颗粒的半径(例如平均半径)为70nm至125nm(包括端值)；分子量为1
×
107g/mol至1
×
109g/mol(包括端值)；和/或为1,000至5,000链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体(包括端值)。在一些实施方案中，寡聚物颗粒试剂与一种或更多种药剂，例如与细胞表面上的分子(例如受体)结合的药剂结合(例如可逆地结合)。在某些实施方案中，一种或更多种药剂是本文中所述的药剂。在一些实施方案中，药剂是抗cd3和/或抗cd28抗体或其抗原结合片段，例如含有结合配偶体(例如链霉亲和素结合肽，例如)的抗体或其抗原片段。在一些特定实施方案中，一种或更多种药剂是含有结合配偶体(例如链霉亲和素结合肽，例如)的抗cd3和/或抗cd28 fab。
[0196]
在一些实施方案中，本文中提供了由以下构成和/或含有以下的寡聚物颗粒试剂：多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体。在某些实施方案中，本文中提供的寡聚物颗粒试剂含有多个结合位点，所述结合位点与一种或更多种药剂(例如刺激剂和/或选择剂)可逆地结合或能够可逆地结合。在一些实施方案中，寡聚物颗粒的半径(例如平均半径)为80nm至120nm(包括端值)；分子量(例如平均分子量)为7.5
×
106g/mol至2
×
108g/mol(包括端值)；和/或量(例如平均量)为500至10,000个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体(包括端值)。在一些实施方案中，寡聚物颗粒试剂与一种或更多种药剂，例如与细胞表面上的分子(例如受体)结合的药剂结合(例如可逆地结合)。在某些实施方案中，一种或更多种药剂是本文中所述的药剂。在一些实施方案中，药剂是抗cd3和/或抗cd28 fab，例如含有结合配偶体(例如链霉亲和素结合肽，例如)的fab。在一些特定实施方案中，一种或更多种药剂是含有结合配偶体(例如链霉亲和素结合肽，例如)的抗cd3和/或抗cd28 fab。
[0197]
在一些实施方案中，细胞在存在以下、为约以下、或为至少以下μg寡聚物刺激试剂/106个细胞的情况下刺激：0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.3μ
g、0.4μg、0.5μg、0.75μg、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg或10μg。在一些实施方案中，细胞在存在4μg或约4μg/106个细胞的情况下刺激。在一些特定实施方案中，细胞在存在0.8μg或约0.8μg/106个细胞的情况下刺激。在某些方面中，4μg寡聚物刺激试剂是或包含3μg寡聚物颗粒和1μg附着剂(attached agent)(例如0.5μg抗cd3 fab和0.5μg抗cd28 fab)。
[0198]
转导/转染单元操作
[0199]
下文所述的转导/转染方法被配置为当用6孔板活化细胞时运行具有48个总条件(total condition)的系统。然而，这可用不同的系统和/或系统组件进行扩展或缩小，例如t细胞活化多至待并行处理192个条件。该单元操作允许用户输入活化物质偏好的顺向处理(forward processing)或靶总有核细胞(total nucleated cell，tnc)处理。用户还输入转导孔重复数。对于reps＝1，每4
×
板需要一个24孔离心板。对于reps＝2，1
×
板需要1
×
24孔离心板。在此，将所期望的量转移至24孔平底板或24孔锥形或圆底深孔板以进行旋转孵育(spinoculation)。在转导之后，根据用户的偏好，可将细胞在24孔板中孵育以用于第二天接种，或转移至24深孔扩增板以用于接种。在此的讨论集中在病毒转导方法上，然而还考虑了以下：如将在下文更详细阐述的，用于将重组dna引入到活化的t细胞中的其他方法也涵盖在本公开内容中。例如，可依赖电穿孔、基于试剂的转染、细胞加压(cell compression)或挤压(squeezing)中的一种或更多种来将重组dna并入到活化的t细胞中，而不脱离本公开内容的范围。
[0200]
参考图17，一旦活化单元操作210结束，控制系统就启动转导/转染单元操作220。转导单元操作220从工作台设置开始。在一些实施方案中，提示用户设置具有diti、试剂槽、细胞培养基、细胞计数试剂等的工作台60。在一些实施方案中，提示用户将平衡24孔平底和24深孔板置于到工作台60上。将24孔平底板用于t细胞旋转孵育。将24深孔板用于细胞离心。在一些实施方案中，提示用户输入转导模式-设置转导tnc或顺向处理。在一些实施方案中，提示用户输入转导之后模式-转导之后接种或孵育。在一些实施方案中，提示用户输入条件数、病毒载体体积、转导重复数、旋转孵育体积、孵育/接种体积。在一些实施方案中，提示用户输入总采样和分析样品(例如氨基酸分析(aaa)/流式细胞术)体积。可提示用户实时输入这些参数，或者作为脚本的一部分，例如在启动如图17中所示的方法200的系统10之前由用户设置。在一些实施方案中，提示用户基于条件输入数设置具有“n”数目个24孔平底板的工作台60。在一些实施方案中，提示用户设置具有采样和基于条件输入数的“n”数目个板的工作台60。采样板包括96深孔板、96孔低附着板(细胞计数)和96孔圆底板(aaa/流式细胞术)。
[0201]
一旦工作台60设置完成，则由控制系统20开始采样。将板揭盖，混合每个样品孔，并且抽吸每个样品的总采样体积并将其分配到96深孔板中。将板重新加盖。然后混合分配的采样体积，并等分到细胞计数和aaa/流式细胞术板中。然后根据条件输入数将细胞计数试剂分配到低附着细胞计数板中。在某些实施方案中，用于采样板的细胞计数由细胞计数模块75自动读出。在另一些实施方案中，采样板然后被带至工作台60的前面以用于用户可达性，然后由用户从工作台60上移出以用于人工细胞计数。细胞浓度测量由系统控制器20获得，从细胞计数模块75自动获得，或者如由用户人工输入。
[0202]
一旦采样完成，控制系统20就开始准备旋转孵育。提示用户将病毒载体置入到25ml槽中。根据用户输入，然后任选地提示用户根据条件输入数将“n”数目个24深孔离心板
置于工作台60上。容器操纵模块50将离心板和板二者揭盖，然后抽吸所需的细胞数以到达转导tnc或抽吸整个样品并将其分配到离心板中。容器操纵模块50用偏心指件52将离心板加盖，然后使用指件更换系统(finger exchange system，fes)，用中心指件54替代指件。容器操纵模块50(例如rga)然后将离心板及其平衡板(仅具有奇数个24深孔离心板)垂直运输到机器人离心机65中。在离心之后，离心板返回至工作台60。容器操纵模块50(例如rga)将离心板揭盖，然后柔性液体操纵模块40(例如fca)抽吸每个条件孔的上清液。抽吸以较慢的速度且良好的偏移进行，以确保细胞沉淀不受干扰。上清液抽吸继续进行，直至每个孔中留下旋转孵育体积输入。在一些实施方案中，旋转孵育步骤在原始容器中进行并且可以没有细胞转移步骤。在这种情况下，原始容器中会发生体积减少以获得期望的细胞浓度，然后继续进行。
[0203]
一旦完成旋转孵育准备，则控制系统20就启动旋转孵育模块。容器操纵模块50(例如rga)用偏心指件52从集105获得24孔平底板并根据条件数输入所需的板数将它们置于工作台60嵌套上。柔性液体操纵模块40继续混合24深孔离心板的每个孔。然后它抽吸出孔内容物并将其分配到24孔平底板中。一旦将预定数的细胞分配到24孔平底旋转孵育板中，则根据体积输入在每孔中分配病毒载体。容器操纵模块50(例如rga)用偏心指件52将24孔平底板加盖，然后使用fes，用中心指件替代偏心指件。然后容器操纵模块50将24孔平底板及其平衡板(仅具有奇数个24孔平底板)垂直运输到机器人离心机65中以用于旋转孵育。
[0204]
一旦完成旋转孵育，如果根据用户输入在转导之后进行孵育，则由控制系统20启动转导之后的细胞孵育。在离心之后，24孔平底板返回至工作台60。容器操纵模块50将24孔平底板揭盖，然后柔性液体操纵模块40(例如fca)将新鲜培养基分配至每个条件孔以达到孵育体积。然后，柔性液体操纵模块40(例如fca)根据条件数混合板孔。容器操纵模块50(例如rga)使用偏心指件52将工作台60上的所有24孔平底板加盖。在一些实施方案中，板被自动转移至哺乳动物细胞培养箱以用于接种。在一些实施方案中，所有剩余的实验耗材都自动从工作台上移除。在一些实施方案中，提示用户将板置于到培养箱中以用于接种。在一些实施方案中，提示用户从工作台移除所有剩余的实验室器具。然后提示用户从工作台60上移除所有剩余的实验室器具。
[0205]
如果根据用户输入选择转导之后细胞接种，则在离心之后24孔平底板被返回至工作台60。然后提示用户将24深孔扩增板置于到工作台60上。容器操纵模块50(例如rga)使用偏心指件52将扩增板揭盖。柔性液体操纵模块40随后根据体积输入在每个条件下将平衡细胞培养基分配到24深孔扩增板的每个孔中。柔性液体操纵模块40(例如fca)返回至24孔平底板，根据条件数混合板孔，然后抽吸每孔的细胞培养物内容物并将其分配其到24深孔扩增板中。容器操纵模块50使用偏心指件52将工作台60上的所有24深孔扩增板加盖。在一些实施方案中，板被自动转移至哺乳动物细胞培养箱以进行接种。在一些实施方案中，所有剩余的实验室器具都自动从工作台上移除。在一些实施方案中，提示用户将板置于到培养箱中以进行接种。在一些实施方案中，提示用户从工作台60移除所有剩余的实验室器具。
[0206]
在一些实施方案中，本文中提供的方法用于转导或转染多核苷酸，例如编码重组蛋白的重组多核苷酸。在一些特定实施方案中，重组蛋白是重组受体。
[0207]
用于引入编码一种或更多种重组蛋白(例如car或tcr)的多核苷酸(例如重组多核苷酸)的多种方法是已知的并且可与所提供的系统、方法和组合物一起使用。一些示例性方
法包括用于转移编码多肽或受体的核酸的那些，包括通过病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒、非病毒载体或转座子，例如sleeping beauty转座子系统。基因转移的方法可包括转导、电穿孔或导致基因转移到细胞中的其他方法，或本文中所述的任何递送方法。用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如在wo2014055668和美国专利号7,446,190中描述的那些，其各自通过引用并入本文。
[0208]
在一些实施方案中，重组核酸通过电穿孔转移到t细胞中(参见例如chicaybam et al，(2013)plos one 8(3)：e60298和van tedeloo et al.(2000)gene therapy 7(16)：1431-1437)。在一些实施方案中，重组核酸通过转座转移到t细胞中(参见例如manuri et al.(2010)hum gene ther 21(4)：427-437；sharma et al.(2013)molec ther nucl acids 2，e74；和huang et al.(2009)methods mol biol 506：115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的另一些方法包括磷酸钙转染(例如current protocols in molecular biology，john wiley&sons，new york.n.y中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(johnston，nature，346：776-777(1990))；二乙基氨基乙基(deae)-右旋糖酐/dna转染(gulick，curr protoc cell biol.，chapter 20：unit 20.4(2003)，和磷酸锶dna共沉淀(brash et al.，mol.cell biol.，7：2031-2034(1987)，其各自均通过引用整体并入于此)。
[0209]
在另一个实施方案中，遗传物质在免疫细胞中的引入和表达是通过细胞递送载剂(例如阳离子脂质体)或衍生化的(例如抗体缀合的)聚赖氨酸缀合物、短杆菌肽s和/或人工病毒包膜。这样的载剂可递送并入到质粒、载体或甚至病毒dna中的核酸。
[0210]
在另一个实施方案中，可将包含目的基因的核酸分子以可溶性分子复合体的形式递送到期望细胞中。复合体可含有与包含核酸结合剂和与所期望细胞(例如t细胞)的表面分子结合的细胞特异性结合剂的载体可释放地结合的核酸，并且具有随后可被细胞内化的尺寸。这样的复合体描述于美国专利号5,166,320中，其通过引用整体并入于此。
[0211]
编码重组蛋白(例如重组受体)的核酸分子在细胞中的转导可使用许多已知载体中的任一种来进行。这样的载体包括病毒和非病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统以及基于转座子的系统例如piggybac或基于sleeping beauty的基因转移系统。一些示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(例如逆转录病毒或慢病毒等)、转导、转座子。
[0212]
在一些实施方案中，核酸通过物理递送方法引入，例如通过电穿孔、粒子枪、基于试剂的转染(例如磷酸钙转染)、细胞加压或挤压。
[0213]
在一些实施方案中，含有细胞、病毒颗粒和试剂的组合物的旋转孵育(例如离心接种)可通常以相对低的力或速度，例如以低于用于沉淀细胞中的速度，例如以100g至3200g或以约100g至3200g(例如以以下或约以下或至少以下或至少约以下：100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)旋转，如例如在室或腔的内壁或外壁处测量。术语“相对离心力”或rcf通常被理解为施加在物体或物质(例如细胞、样品或沉淀和/或室或所旋转其他容器中的点)上的相对于地球的引力相对于旋转轴在空间中的特定点的有效力。所述值可使用公知的式来确定，考虑到引力、旋转速度和旋转半径(旋转轴至正在测量rcf的物体、物质或颗粒的距离)。在一些实施方案中，细胞(例如来自cd4 t细胞或cd8 t细胞的经刺激组合物的细胞)与病毒的接触、孵育和/或改造中的至少一部分是
通过为以下的旋转进行的：100g至3200g、1000g至2000g、1000g至3200g、500g至1000g、400g至1200g、600g至800g、600至700g、或500g至700g.。
[0214]
在某些实施方案中，改造、转导和/或转染中的至少一部分通过旋转，例如旋转孵育和/或离心进行。在一些实施方案中，旋转进行以下、持续约以下或持续至少以下：5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时、2天、3天、4天、5天、6天或至少7天。
[0215]
在一些实施方案中，基因转移通过以下来完成：首先活化细胞，例如通过将细胞与诱导响应例如增殖、存活和/或活化(例如如通过细胞因子或活化标志物的表达所测量的)的刺激剂相组合，随后转导活化的细胞并在培养物中扩增至足以临床应用的数目。在某些实施方案中，基因转移通过首先在活化条件下孵育细胞，例如通过活化单元程序来完成。
[0216]
在一些实施方案中，用于转导或转染的方法通过使组合物的一种或更多种细胞与编码重组蛋白(例如重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，所述接触可通过离心，例如旋转孵育(例如离心接种)来实现。这样的方法包括如国际公开号wo2016/073602中描述的那些中的任一种。
[0217]
在某些实施方案中，细胞在存在转导辅料(例如聚阳离子)的情况下转导。在某些实施方案中，一种或更多种转导辅料的存在提高了转导效率。在一些特定实施方案中，在存在聚阳离子的情况下改造的细胞中的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％含有或表达重组多核苷酸。在一些实施方案中，与在不存在转导辅料的情况下改造细胞的替代和/或示例性方法相比，组合物的至少10％，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍更多的细胞在存在聚氧离子的情况下被改造以含有或表达重组转导辅料。
[0218]
在一些实施方案中，细胞在存在低于100μg/ml、低于90μg/ml、低于80μg/ml、低于75μg/ml、低于70μg/ml、低于60μg/ml、低于50μg/ml、低于40μg/ml、低于30μg/ml、低于25μg/m1、低于20μg/ml，或低于μg/ml，低于10μg/ml的辅料的情况下被转染和/或转导。在某些实施方案中，适合于与所提供方法一起使用的辅料包括但不限于聚阳离子、纤连蛋白或纤连蛋白来源片段或变体以及retronectin。在一些实施方案中，聚阳离子是带正电荷的。在某些实施方案中，聚阳离子降低细胞与载体(例如病毒或非病毒载体)之间的斥力，并介导载体与细胞表面的接触和/或结合。在一些实施方案中，聚阳离子是聚凝胺、deae-右旋糖酐、硫酸鱼精蛋白、聚-l-赖氨酸或阳离子脂质体。
[0219]
在一些实施方案中，细胞处于活化试剂，例如上述活化单元程序中所述的活化试剂存在下。
[0220]
在一些实施方案中，改造细胞包括与载体(例如病毒载体或非病毒载体)一起培养、与其接触或与其一起孵育。在某些实施方案中，改造包括使细胞与载体一起培养、使细胞与载体接触和/或使细胞与载体一起孵育，进行以下、进行约以下或进行至少以下时间：4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、24小时、30小时、36小时、40小时、48小时、54小时、60小时、72小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，或超过7天。在一些特定实施方案中，改造包括使细胞与载体一起培养、使细胞与载体接触和/或使细胞与载体一起孵育以下或
约以下时间：24小时、36小时、48小时、60小时或72小时，或进行以下或进行约以下时间：2天、3天、4天或5天。在一些实施方案中，改造步骤进行或进行约24小时、36小时、48小时、60小时或72小时。在某些实施方案中，改造进行或进行约2天。
[0221]
在一些实施方案中，载体包括病毒载体(例如逆转录病毒或慢病毒)、非病毒载体或转座子(例如sleeping beauty转座子系统)、来源于猿病毒40(simian virus 40，sv40)、腺病毒、腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)的载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体(例如下逆转录病毒载体)、来源于莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus，momlv)、骨髓增殖性肉瘤病毒(myeloproliferative sarcoma virus，mpsv)、鼠胚胎干细胞病毒(murine embryonic stem cell virus，mesv)、鼠干细胞病毒(murine stem cell virus，mscv)或脾病灶形成病毒(spleen focus forming virus，sffv)的逆转录病毒载体。
[0222]
在一些实施方案中，病毒载体或非病毒dna含有编码异源重组蛋白的核酸。在一些实施方案中，异源重组分子是以下或包括以下：重组受体(例如抗原受体)、sb-转座子(例如用于基因沉默)、衣壳包封的转座子、同源双链核酸(例如用于基因组重组)或报道基因(例如荧光蛋白(例如gfp)或其他报道子(例如萤光素酶))。
[0223]
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如如来源于猿病毒40(sv40)、腺病毒、腺相关病毒(aav)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(例如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到t细胞中(参见，例如koste et al.(2014)gene therapy 2014 apr 3.doi：10.1038/gt.2014.25；carlens et al.(2000)exp hematol 28(10)：1137-46；alonso-camino et al.(2013)mol thernucl acids 2，e93；park et al.，trends biotechnol.2011 november 29(11)：550-557。
[0224]
在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(long terminal repeat，ltr)(例如来源于莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)、骨髓增殖性肉瘤病毒(mpsv)、鼠胚胎干细胞病毒(mesv)、鼠干细胞病毒(mscv)、脾病灶形成病毒(sffv)或腺相关病毒(aav)的逆转录病毒载体。)大多数逆转录病毒载体来源于鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括来源于任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是兼向性的，意味着它们能够感染数种物种(包括人)的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多举例说明性逆转录病毒系统(例如美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；miller and rosman(1989)biotechniques 7：980-990；miller，a.d.(1990)human gene therapy 1：5-14；scarpa et al.(1991)virology 180：849-852；burns et al.(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90：8033-8037；和boris-lawrie and temin(1993)cur.opin.genet.develop.3：102-109)。
[0225]
慢病毒转导的方法是已知的。一些示例性方法在以下中描述：例如wang et al.(2012)j.immunother.35(9)：689-701；cooper et al.(2003)blood.101：1637-1644；verhoeyen et al.(2009)methods mol biol.506：97-114；和cavalieriet al.(2003)blood.102(2)：497-505。
[0226]
在一些实施方案中，病毒载体颗粒含有来源于基于逆转录病毒基因组的载体(例如来源于基于慢病毒基因组的载体)的基因组。在所提供的病毒载体的一些方面中，编码重组受体(例如抗原受体，例如car)的异源核酸含有在和/或位于载体基因组的5
′
ltr与3
′
ltr
序列之间。
[0227]
在一些实施方案中，病毒载体基因组是慢病毒基因组，例如hiv-1基因组或siv基因组。例如，慢病毒载体通过对毒力基因进行多重减毒来产生，例如可使基因env、vif、vpu和nef缺失，使载体安全地用于治疗目的。慢病毒载体是已知的。参见naldini et al.，(1996和1998)；zufferey et al.，(1997)；dull et al.，1998，美国专利号6,013,516；和5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于并入外源核酸、用于选择和用于将核酸转移到宿主细胞中的必需序列。已知的慢病毒可以容易地从保藏机构或保藏中心获得，例如美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)(“atcc”；10801 university blvd.，manassas，va.20110-2209)，或者使用常用技术从已知来源中分离出来。
[0228]
慢病毒载体的一些非限制性实例包括来源于慢病毒的那些，所述慢病毒例如人类免疫缺陷病毒1(human immunodeficiency virus 1，hiv-1)、hiv-2、猿免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，siv)、人类嗜t淋巴细胞病毒1(human t-lymphotropic virus 1，htlv-1)、htlv-2或马感染贫血病毒(equine infection anemia virus，e1av)。例如，慢病毒载体通过对hiv毒力基因进行多重减毒来产生，例如使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，使载体安全地用于治疗目的。慢病毒载体是本领域中已知的，参见naldini et al.，(1996和1998)；zufferey et al.，(1997)；dull et al.，1998，美国专利号6,013,516；和5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于并入外源核酸、用于选择和用于将核酸转移到宿主细胞中的必需序列。已知的慢病毒可容易地从保臧机构或保藏中心获得，例如美国典型培养物保藏中心(“atcc”；10801 university blvd.，manassas，va.20110-2209)，或者使用常用技术从已知来源中分离出来。
[0229]
在一些实施方案中，病毒基因组载体可含有逆转录病毒(例如慢病毒)的5
′
和3
′
ltr的序列。在一些方面中，病毒基因组构建体可含有来自慢病毒的5
′
和3
′
ltr的序列，并且特别地可含有来自慢病毒的5
′
ltr的r和u5序列以及来自慢病毒的经失活的或自失活的3
′
ltr。ltr序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的ltr序列。例如，它们可以是来自hiv、siv、fiv或biv的ltr序列。通常来说，ltr序列是hiv ltr序列。
[0230]
在一些实施方案中，病毒载体(例如hiv病毒载体)的核酸缺乏另外的转录单元。载体基因组可含有经失活或自失活的3
′
ltr(zufferey et al.j virol 72：9873，1998；miyoshi et al.，j virol 72：8150，1998)。例如，用于产生病毒载体rna的核酸的3
′
ltr的u3区中的缺失可用于产生自失活(self-inactivating，sin)载体。然后可在逆转录期间将这种缺失转移至前病毒dna(proviral dna)的5
′
ltr。自失活载体通常缺失来自3
′
长末端重复(ltr)的增强子和启动子序列，其在载体整合期间被复制到5
′
ltr中。在一些实施方案中，可消除足够的序列，包括去除tata盒，以消除ltr的转录活性。这可阻止在经转导细胞中产生全长载体rna。在某些方面中，3
′
ltr的u3元件含有其增强子序列、tata盒、spl和nf-κb位点的缺失。由于自失活的3
′
ltr，在进入和逆转录之后产生的前病毒含有经失活的5
′
ltr。这可通过降低载体基因组转移(mobilization)的风险和ltr对附近细胞启动子的影响来提高安全性。自失活3
′
ltr可通过本领域已知的任何方法来构建。在一些实施方案中，这不影响载体滴度或载体的体外或体内特性。
[0231]
任选地，来自慢病毒5
′
ltr的u3序列可被病毒构建体中的启动子序列(例如异源启动子序列)替代。这可提高从包装细胞系中回收的病毒的滴度。增强子序列也可包括在内。可使用在包装细胞系中提高病毒rna基因组表达的任何增强子/启动子组合。在一个实施例中，使用了cmv增强子/启动子序列(美国专利号5,385,839和美国专利号5,168,062)。
[0232]
在某些实施方案中，可通过将逆转录病毒载体基因组(例如慢病毒载体基因组)构建为整合缺陷型来使插入诱变的风险最小化。可采用多种方法来产生非整合载体基因组。在一些实施方案中，可将突变改造到pol基因的整合酶酶组件中，使得其编码具有失活整合酶的蛋白质。在一些实施方案中，载体基因组本身可通过以下进行修饰来阻止整合：例如使一个或两个附着位点突变或缺失，或者通过缺失或修饰使3
′
ltr-近端多嘌呤束(proximal polypurine tract，ppt)无功能。在一些实施方案中，非遗传方法是可用的；这些包括抑制整合酶的一种或更多种功能的药物药剂。
[0233]
所述方法不是相互排斥的；即，一次可使用所述方法中的多于一种。例如，整合酶和附着位点二者均可以是无功能的，或者整合酶和ppt位点可以是无功能的，或者附着位点和ppt位点可以是无功能的，或者它们中的所有均可以是无功能的。这样的方法和病毒载体基因组是已知的和可获得的(参见philpott和thrasher，human gene therapy 18：483，2007；engelman et al.j virol 69：2729，1995；brown et al j virol 73：9011(1999)；wo 2009/076524；mcwilliams et al.，j virol 77：11150，2003；powell and levin j virol 70：5288，1996)。
[0234]
在一些实施方案中，载体含有用于在宿主细胞(例如原核宿主细胞)中繁殖的序列。在一些实施方案中，病毒载体的核酸含有用于在原核细胞(例如细菌细胞)中繁殖的一个或更多个复制起点。在一些实施方案中，包含原核复制起点的载体还可含有其表达赋予可检测或可选择的标志物，例如药物抗性的基因。
[0235]
病毒载体基因组通常以可转染到包装或生产细胞系中的质粒形式构建。多种已知方法中的任一种都可用于产生其基因组含有病毒载体基因组的rna拷贝的逆转录病毒颗粒。在一些实施方案中，至少两种组件参与制备基于病毒的基因递送系统：首先，包装质粒，涵盖产生病毒载体颗粒所必需的酶以及结构蛋白；以及其次，病毒载体本身，即待转移的遗传物质。可在这些组件的一个或两个的设计中引入生物安全保护措施。
[0236]
在一些实施方案中，包装质粒可含有除包膜蛋白之外的所有逆转录病毒(例如hiv-1)蛋白(naldini et al.，1998)。在另一些实施方案中，病毒载体可缺乏另外的病毒基因，例如与毒力相关的那些，例如vpr、vif、vpu和nef和/或tat，hiv的主要反式活化因子。在一些实施方案中，慢病毒载体(例如基于hiv的慢病毒载体)仅包含亲本病毒的三个基因：gag、pol和rev，这降低或消除了通过重组重建野生型病毒的可能性。
[0237]
在一些实施方案中，病毒颗粒以病毒载体颗粒或其感染单位(infectiousunit，iu)的拷贝数/待转导的细胞总数(iu/细胞)的一定比例提供。例如，在一些实施方案中，病毒颗粒在接触期间以为以下或约以下或至少以下或至少约以下iu病毒载体颗粒/细胞之一存在：0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、或60iu。
[0238]
在一些实施方案中，病毒载体颗粒的滴度为或为约1
×
106iu/ml至1
×
108iu/ml，例如为或为约5
×
106iu/ml至5
×
107iu/ml，例如至少6
×
106iu/ml、7
×
106iu/ml、8
×
106iu/ml、9
×
106iu/ml、1
×
107iu/ml、2
×
107iu/ml、3
×
107iu/ml、4
×
107iu/ml或5
×
107iu/ml。
[0239]
在一些实施方案中，可在小于100，例如通常小于60、50、40、30、20、10、5或更小的感染复数(multiplicity of infection，moi)下实现转导。
[0240]
在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与病毒颗粒接触或使二者一起孵育。在一些实施方案中，接触持续30分钟至72小时，例如30分钟至48小时、30分钟至24小时或1小时至24小时，例如至少或约至少30分钟、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、36小时或更长时间。
[0241]
在某些实施方案中，输入细胞用包含结合分子的颗粒处理或使输入细胞与包含结合分子的颗粒一起孵育或使输入细胞与包含结合分子的颗粒接触，所述结合分子结合或识别由病毒dna编码的重组受体。
[0242]
在一些实施方案中，细胞与病毒载体颗粒的孵育导致或产生包含用病毒载体颗粒转导的细胞的输出组合物。
[0243]
接种单元操作
[0244]
一旦转导单元操作220结束，控制系统就启动接种单元操作230。下文阐述的接种方法被配置为在转导方法中基于使用的重复孔数目一次运行具有72个条件的系统。然而，这可以用不同的系统和/或系统组件扩展或缩小，例如通过允许在方法中使用重复数1来处理192个条件。在此，经转导的细胞被转移到哺乳动物细胞深孔板中以用于扩增，并提示用户输入对顺向处理或靶向接种tnc的偏好。
[0245]
接种单元操作230以工作台设置开始。在一些实施方案中，提示用户设置具有diti、试剂槽、细胞培养基、细胞计数试剂的工作台60。在一些实施方案中，提示用户输入接种模式-基于期望的tnc的顺向处理或靶向接种。在一些实施方案中，提示用户输入条件数、重复数(基于转导方法)、孵育体积(基于转导接种体积)。在一些实施方案中，提示用户输入总采样和aaa/流式细胞术体积。在一些实施方案中，可提示用户实时输入这些参数，或者作为脚本的一部分，例如在启动如图17中所示的方法200的系统10之前由用户设置。在一些实施方案中，提示用户基于条件输入数来设置具有采样和接种板的工作台60。采样板包括96深孔板、96孔低附着板(细胞计数)和96孔圆底板(aaa/流式细胞术)。
[0246]
一旦工作台60设置完成，控制系统20就开始采样。将板揭盖。如果重复数＝2，则柔性液体操纵模块40就继续将重复孔组合成单个孔。混合每个组合的样品孔，然后每个样品抽吸总采样体积并将其分配到96深孔板中。将板重新加盖。然后混合分配的采样体积，并等分到细胞计数和分析样品板(例如aaa/流式细胞术板)中。在一些实施方案中，然后根据条件输入数将细胞计数试剂分配到低附着细胞计数板中。在某些实施方案中，采样板的细胞计数由细胞计数模块75自动读出。在另一些实施方案中，采样板然后被带至工作台60的前面以用于用户可达性，然后由用户从工作台60上移出以用于人工细胞计数。细胞浓度测量由系统控制器20获得，或者从细胞计数模块75自动获得，或者由用户人工输入获得。
[0247]
一旦采样完成，控制系统20就开始接种。如果选择了靶向接种，则提示用户输入测量的vcc、期望的接种tnc和vcc。基于当前vcc，计算达到目标tnc所需的细胞体积和达到期望的接种vcc所需的平衡培养基体积。如果选择顺向处理，则不会提示用户输入其测量的vcc值，并且可直接进行接种。然后基于用户输入，提示用户根据条件输入数放置“n”数目个24深孔扩增板。容器操纵模块50将扩增板和扩增板二者揭盖，然后根据用户输入分配达到接种tnc所需的扩增细胞材料或整个扩增板内容物。柔性液体操纵模块40随后根据条件将
平衡细胞培养基分配到24深孔扩增板的每个孔中以达到3ml的最终接种体积。容器操纵模块50使用偏心指件52将工作台60上的所有24深孔扩增板加盖。在一些实施方案中，板被自动转移至哺乳动物细胞培养箱中以用于接种。在一些实施方案中，所有剩余的实验室器具都被自动从工作台上移除。在一些实施方案中，提示用户将板置于到培养箱中以用于接种。在一些实施方案中，提示用户从工作台移除所有剩余的实验室器具。然后提示用户从工作台60上移除所有剩余的实验室器具。
[0248]
扩增单元操作
[0249]
参考图17，一旦接种单元操作230结束，控制系统就启动扩增单元操作240。在一些实施方案中，基于正在进行的规模缩减的过程，接种单元操作230和扩增单元操作240被例如约1天至约3天的孵育期隔开。扩增单元操作240从工作台设置开始。在一些实施方案中，提示用户设置具有diti、试剂槽、细胞培养基、细胞计数试剂的工作台60。提示用户将平衡24深孔扩增板置于到工作台60上。24深孔平衡扩增板用于细胞离心。在一些实施方案中，提示用户输入条件数和扩增体积。提示用户输入总采样和aaa/流式细胞术体积。在一些实施方案中，提示用户基于条件输入数设置具有采样和“n”数目个24深孔扩增板的工作台60。采样板包括96深孔板、96孔低附着板(细胞计数)和96孔圆底板(aaa/流式细胞术)。在一些实施例中，可自动进行上述步骤中的一个或更多个，而不脱离本公开内容的范围。
[0250]
一旦工作台60设置完成，则控制系统20就启动采样。将扩增板揭盖，然后每个样品抽吸总样品体积并将其分配到96深孔板中。使用容器操纵模块50将扩增板重新加盖。然后混合分配的采样体积，并等分到细胞计数板和aaa/流式细胞术板中。然后根据条件输入数将细胞计数试剂分配到低附着细胞计数板中。在某些实施方案中，采样板的细胞计数由细胞计数模块75自动读出。在另一些实施方案中，采样板然后被带至工作台60的前面以用于用户可达性，然后由用户从工作台60上移出以用于人工细胞计数。细胞浓度测量由系统控制器20获得，或者从细胞计数模块75自动获得，或者由用户人工输入获得。当前扩增方法使用每个条件测量的vcc，以允许所述方法独立于细胞计数进行(例如系统可独立于细胞计数顺向处理)。
[0251]
一旦采样完成，控制系统20就启动模拟灌注/细胞培养基更换。容器操纵模块50使用中心指件54将扩增板及其平衡板(仅具有奇数个24深孔离心板)垂直运输到机器人离心机65中。在离心之后，容器操纵模块50使24深孔离心板返回至工作台60。使用fes，容器操纵模块50用偏心指件52替代中心指件54，并将扩增板揭盖。柔性液体操纵模块40(例如fca)然后可移除扩增体积的细胞培养物上清液级分，而不会移出下面的细胞沉淀。这是根据条件输入数每孔进行的。柔性液体操纵模块40(例如fca)随后根据条件将新鲜细胞培养基分配到24深孔扩增板的每个孔中以达到输入的最终扩增体积。容器操纵模块50使用偏心指件52将工作台60上的所有24深孔扩增板加盖。在一些实施方案中，板被自动转移至哺乳动物细胞培养箱。在一些实施方案中，所有剩余的实验室器具都被自动从工作台上移除。在一些实施方案中，提示用户将板置于到培养箱中用于。在一些实施方案中，提示用户从工作台移除所有剩余的实验室器具。然后提示用户从工作台60移除所有剩余的实验室器具。
[0252]
下面阐述的扩增方法被配置为一次运行具有多至192个条件的系统。该方法进行采样和模拟灌注步骤。在某些实施方案中，模拟灌注通过扩增板的离心，随后进行培养基更换来进行。在某些实施方案中，细胞传代策略将基于每个条件孔的vcc来限定。
[0253]
在一些实施方案中，细胞在促进增殖和/或扩增的条件下培养。在一些实施方案中，这样的条件可设计为诱导群体中细胞的增殖、扩增、活化和/或存活。在一些特定实施方案中，活化条件可包括以下中的一种或更多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、试剂，例如营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子，例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和旨在促进细胞生长、分裂和/或扩增的任何其他试剂。
[0254]
在一些实施方案中，培养在这样的条件下进行，所述条件通常包括适合于原代免疫细胞(例如人t淋巴细胞)生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常至少约30度，并且通常在或在约37摄氏度。在一些实施方案中，经富集t细胞的组合物在25至38℃，例如30至37℃，例如在或在约37℃
±
2℃的温度下孵育。在一些实施方案中，孵育进行一段时间直至培养(例如培养或扩增)产生期望的或阈值的密度、数目或剂量的细胞。在一些实施方案中，孵育大于或大于约或进行约或24小时、48小时、72小时、96小时、5天、6天、7天、8天、9天或更长时间。
[0255]
在一些实施方案中，活化试剂在培养之前从细胞中移除和/或分离。在一些实施方案中，活化试剂是活化单元程序中所述的活化试剂。在一些实施方案中，在培养之后或培养期间从细胞中移除和/或分离活化试剂。
[0256]
在一些特定实施方案中，细胞在存在一种或更多种细胞因子的情况下培养。在某些实施方案中，一种或更多种细胞因子是重组细胞因子。在一些特定实施方案中，一种或更多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，一种或更多种细胞因子与由t细胞表达和/或为t细胞内源的受体结合和/或能够结合。在一些特定实施方案中，一种或更多种细胞因子是或包括4-α-螺旋束细胞因子家族的成员。在一些实施方案中，4-α-螺旋束细胞因子家族的成员包括但不限于白介素-2(il-2)、白介素-4(il-4)、白介素-7(il-7)、白介素9(il-9)、白介素12(il-12)、白介素15(il-15)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，g-csf)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，gm-csf)。在一些实施方案中，一种或更多种细胞因子是或包括il-15。在一些特定实施方案中，一种或更多种细胞因子是或包括il-7。在一些特定实施方案中，一种或更多种细胞因子是或包括重组il-2。
[0257]
在一些实施方案中，培养进行细胞达到阈值量、密度和/或扩增所需的时间量。在一些实施方案中，培养进行以下或进行约以下或进行少于以下时间：6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、1周、2周、3周或4周。
[0258]
脱珠单元操作
[0259]
参考图17，一旦扩增单元操作240结束，控制系统就启动脱珠单元操作250。脱珠单元操作250从工作台设置开始。在一些实施方案中，提示用户设置具有diti、试剂槽、细胞培养基、细胞计数试剂的工作台60。在一些实施方案中，提示用户将有缘磁铁(skirted magnet)置于到工作台60上。在一些实施方案中，提示用户输入条件数和扩增体积。在一些实施方案中，提示用户输入总采样和分析样品体积，例如aaa/流式细胞术体积。在一些实施方案中，还提示用户输入在脱珠之后是否期望第二采样步骤。在一些实施方案中，提示用户基于条件输入数设置具有采样和“n”数目个24深孔扩增板的工作台60。采样板包括96深孔
板、96孔低附着板(细胞计数)和96孔圆形底板(分析样品板，例如aaa/流式细胞术样品板)。在一些实施例中，可自动进行上述步骤中的一个或更多个，而不脱离本公开内容的范围。
[0260]
一旦工作台60设置模块完成，则控制系统20就启动采样。将扩增板揭盖，然后每个样品抽吸总样品体积并将其分配到96深孔板中。将扩增板重新加盖。然后混合分配的采样体积，并等分到细胞计数和aaa/流式细胞术板中。然后根据条件输入数将细胞计数试剂分配到低附着细胞计数板中。在某些实施方案中，采样板的细胞计数由细胞计数模块75自动读出。在另一些实施方案中，采样板然后被带至工作台60的前面以用于用户可达性，然后由用户从工作台60上移出以用于人工细胞计数。细胞浓度测量由系统控制器20获得，或者从细胞计数模块75自动获得，或者由用户人工输入获得。脱珠方法使用每个条件测量的vcc作为fio，因此允许所述方法独立于细胞计数进行。
[0261]
一旦采样完成，则控制系统20就启动脱珠。在一些实施方案中，提示用户基于条件输入数将“n”数目个新24深孔扩增板置于到工作台60上。容器操纵模块50使用偏心指件52，将原始的和新24深孔扩增板揭盖。使用fes，容器操纵模块50替代偏心指件52用于中心，并继续将原始扩增板置于到有缘磁铁上。所述方法暂停5分钟以允许脱珠发生。然后柔性液体操纵模块40抽吸脱珠的产物并将其分配到新的24深孔扩增板中。抽吸伴随x偏移发生，以免破坏下面的珠粒(bead pellet)。容器操纵模块50(例如rga)使用偏心指件52，将所有24深孔扩增板重新加盖。
[0262]
一旦脱珠完成，控制系统20就开始第二次采样。然后提示用户从工作台60上移除所有实验室器具并准备收获或接种。
[0263]
脱珠单元程序250适用于在接种之前处理t细胞和在收获之前处理t细胞二者。在此，24深孔扩增板将被置于台(deck)上，采样、计数、置于台上的磁铁上并转移至24深孔扩增板。由于方法执行所需的工作台60的差异，脱珠是自收获或接种的独立方法。该方法允许2个采样步骤。一个在脱珠之前，而另一个直接在脱珠之后。第二个采样步骤出于两个目的。第一个是允许用户确定脱珠细胞产率，另一个是提供在脱珠之后更新的细胞测量，其将用于告知收获方法处理。
[0264]
收获单元操作
[0265]
一旦脱珠单元操作250结束，控制系统就启动收获单元操作260。
[0266]
收获单元操作260以工作台设置开始。在一些实施方案中，提示用户设置具有diti、试剂槽和冷冻保存培养基的工作台60。在一些实施方案中，工作台还包括冷却装置61以在用于所述方法之前冷却试剂。冷却装置61可以是热电冷却器、依赖于制冷剂的冷却器、依赖于绝缘凝胶或其他绝缘材料的冷却器、与液氮、干冰和/或水冻冰块(water ice)中的一种或更多种一起使用的冷却器等。在一些实施方案中，提示用户将平衡24深孔扩增板置于到工作台60上。24深孔扩增平衡板用于细胞离心。在一些实施方案中，提示用户输入条件数、扩增培养体积和脱珠采样体积。在一些实施方案中，提示用户将vcc和每个条件待冷冻保存的瓶的数目输入到收获excel工作簿中。基于当前的vcc，以及每个冷冻管期望的vcc和tnc，计算所需的脱珠的产物体积和冷冻保存培养基。每个条件的瓶数目将用作用于分析测试的重复瓶。在一些实施方案中，提示用户通过根据输入来添加设定数目的未加盖冷冻管(uncapped cryovial)来设置工作台60。在一些实施方案中，然后提示用户将他们的脱珠产物板置于到工作台60上。
[0267]
一旦工作台60设置完成，控制系统20就启动对细胞样品的冷冻保存。容器操纵模块50用中心指件54将扩增板及其平衡板垂直运输到机器人离心机65中。在离心之后，脱珠产物板返回至工作台60。容器操纵模块50将脱珠产物板揭盖，随后柔性液体操纵模块40，例如fca抽吸每个条件孔的上清液。抽吸以降低的速度以良好的偏移进行以确保细胞沉淀不受干扰。柔性液体操纵模块40分配达到如输入所期望的冷冻保存的vcc所需的平衡冷冻培养基体积。柔性液体操纵模块40(例如fca)随后根据条件输入数将可变体积的冷冻保存培养基分配到脱珠产物板的每个孔中。柔性液体操纵模块40(例如fca)然后进行2个混合循环以确保冷冻保存培养基和沉淀细胞的完全混合。然后，柔性液体操纵模块40抽吸每个冷冻管的满足期望的vcc输入所需的期望的tnc。对于每个条件，基于每个条件分配的冷冻管的数目将细胞分配到冷冻管中。容器操纵模块50使用管指件56，基于如输入所需的总冷冻管将每个冷冻管加盖。在一些实施方案中，然后提示用户将冷冻管置于到细胞冷冻容器或可控速率冷冻器(controlled rate freezer，crf)中。容器操纵模块50用偏心指件52将脱珠产物板重新加盖并提示用户从工作台60上移除所有实验室器具。
[0268]
所述的收获方法目前可处理多至24个细胞培养条件并且一次冷冻保存多至96个瓶。基于脱珠方法期间测量的vcc，用户能够以期望的细胞密度冷冻保存细胞。
[0269]
重组蛋白
[0270]
在一些实施方案中，本文中公开的方法和系统用于产生细胞，例如t细胞，例如cd4 和/或cd8 t细胞，其含有或表达或被改造以含有或表达重组蛋白，例如重组受体(例如嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr))。在某些实施方案中，本文中提供的方法产生和/或能够产生细胞或含有和/或富含细胞的群体或组合物，所述细胞被改造以表达或含有重组蛋白。
[0271]
细胞通常表达重组受体例如抗原受体，包括功能性非tcr抗原受体(例如嵌合抗原受体(car))和其他抗原结合受体例如转基因t细胞受体(tcr)。在受体中，还有其他嵌合受体。
[0272]
嵌合抗原受体
[0273]
在所提供的方法和用途的一些实施方案中，嵌合受体(例如嵌合抗原受体)含有一个或更多个结构域，所述结构域组合了对期望的抗原(例如肿瘤抗原)提供特异性的配体结合结构域(例如抗体或抗体片段)与胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域是激活的胞内结构域部分(例如t细胞激活结构域)，提供了初级激活信号。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域含有或另外含有共刺激信号传导结构域以促进效应物功能。在一些实施方案中，嵌合受体在遗传改造到免疫细胞中时可调节t细胞活性，并且在一些情况下可调节t细胞分化或稳态，从而得到具有改善的寿命、存活和/或体内持久性的经遗传改造的细胞，例如以用于过继性细胞治疗方法。
[0274]
示例性抗原受体(包括car)以及用于将这样的受体改造和引入到细胞中的方法，包括例如在以下中描述的那些：国际专利申请公开号wo200014257、wo2013126726、wo2012/129514、wo2014031687、wo2013/166321、wo2013/071154、wo2013/123061、美国专利申请公开号us2002131960、us2013287748、us20130149337，美国专利号：6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118和欧洲专利申请号ep2537416，和/或以下描述的那
些：sadelain et al.，cancer discov.2013april；3(4)：388-398；davila et al.(2013)plos one 8(4)：e61338；turtle et al.，curr.opin.immunol.，2012october；24(5)：633-39；wu et al.，cancer，2012march 18(2)：160-75。在一些方面中，抗原受体包括如美国专利号：7,446,190中描述的car和国际专利申请公开号：wo/2014055668a1中描述的那些。car的一些实例包括如在前述公开中任一者中公开的car，所述公开例如wo2014031687、us 8,339,645、us 7,446,179、us 2013/0149337、美国专利号：7,446,190、美国专利号：8,389,282，kochenderfer et al.，2013，nature reviews clinical oncology，10，267-276(2013)；wang et al.(2012)j.immunother.35(9)：689-701；和brentjens et al.，sci transl med.2013 5(177)。还参见wo2014031687、us 8,339,645、us 7,446,179、us 2013/0149337、美国专利号：7,446,190和美国专利号：8,389,282。
[0275]
嵌合受体(例如car)通常包含胞外抗原结合结构域，例如抗体分子的一部分，通常是抗体(例如scfv抗体片段)的可变重(variable heavy，vh)链区和/或可变轻(variable light，vl)链区。
[0276]
在一些实施方案中，受体靶向的抗原是多肽。在一些实施方案中，其是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞(例如肿瘤或病原细胞)上选择性表达或过表达。在另一些实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在经改造细胞上表达。
[0277]
在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与b细胞恶性肿瘤相关的抗原，例如许多已知b细胞标志物中的任一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是cd20、cd19、cd22、ror1、cd45、cd21、cd5、cd33、igκ、igλ、cd79a、cd79b或cd30。
[0278]
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括含有抗体或抗体片段的胞外部分。在一些方面中，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的胞外部分和胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scfv。
[0279]
在一些实施方案中，重组受体(例如car)的抗体部分还包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，例如铰链区(例如igg4铰链区)，和/或ch1/cl和/或fc区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人igg的，例如igg4或igg1。在一些方面中，恒定区的一部分用作抗原识别组分(例如scfv)和跨膜结构域之间的间隔区。与不存在间隔子的情况相比，间隔子可具有提供抗原结合之后细胞的响应性提高的长度。一些示例性间隔子包括但不限于以下描述的那些：hudecek et al.(2013)clin.cancer res.，19：3153，国际专利申请公开号wo2014031687，美国专利号8,822,647或公开申请号us2014/0271635。
[0280]
在一些实施方案中，恒定区或部分是人igg的，例如igg4或iggl的。
[0281]
在一些实施方案中，抗原受体包含与胞外结构域直接或间接连接的胞内结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含连接胞外结构域和胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)。例如，在一些方面中，抗原识别结构域(例如胞外结构域)通常与一种或更多种胞内信号传导组分连接，所述胞内信号传导组分例如模拟在car的情况下通过抗原受体复合体(例如tcr复合体)和/或通过另一种细胞表面受体的信号激活的信号传导组分。在一些实施方案中，嵌合受体包含连接或融合在胞外结构域(例如scfv)与胞内信号传导结构域之间的跨膜结构域。因此，在一些实施方案中，抗原结合组分(例如抗体)与一个或更多个跨膜和胞内信
号结构域连接。
[0282]
在一个实施方案中，使用与受体(例如car)中的结构域之一天然缔合的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域通过氨基酸替换来选择或修饰以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合体的其他成员的相互作用最小化。
[0283]
在一些实施方案中，跨膜结构域来源于天然来源或合成来源。在来源是天然的情况下，在一些方面中，结构域来源于任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区包括来源于以下的那些(即，包含至少以下的跨膜区)：t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154。或者，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面中，合成跨膜结构域主要包含疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将存在于合成跨膜结构域的每一端。在一些实施方案中，连接通过接头、间隔子和/或跨膜结构域来进行。在一些方面中，跨膜结构域含有cd28的跨膜部分。
[0284]
在一些实施方案中，胞外结构域和跨膜结构域可直接或间接连接。在一些实施方案中，胞外结构域和跨膜结构域通过间隔子，例如本文中所述的任一种来连接。在一些实施方案中，受体含有跨膜结构域所来源的分子的胞外部分，例如cd28胞外部分。
[0285]
胞内信号传导结构域中是模拟或模仿通过天然抗原受体的信号、通过与共刺激受体组合的这样的受体的信号、和/或通过单独的共刺激受体的信号的那些。在一些实施方案中，存在短的寡聚或多肽接头，例如长度为2至10个氨基酸的接头，例如含有甘氨酸和丝氨酸(例如甘氨酸-丝氨酸双联体)的接头，并在car的跨膜结构域与细胞质信号传导结构域之间形成连接。
[0286]
在一些方面中，t细胞活化被描述为由两类细胞质信号传导序列介导：通过tcr启动抗原依赖性初级活化的那些(初级细胞质信号传导序列)，以及以抗原非依赖性方式发挥作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级细胞质信号传导序列)。在一些方面中，car包括这样的信号传导组分之一或二者。
[0287]
受体(例如car)通常包含至少一种胞内信号传导组分或多种组分。在一些方面中，car包含调节tcr复合体初级活化的初级细胞质信号传导序列。以刺激性方式发挥作用的初级细胞质信号传导序列可含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam的信号传导基序。含有itam的主要细胞质信号传导序列的一些实例包括来源于cd3ζ链、fcrγ、cd3γ、cd3δ和cd3ε的那些。在一些实施方案中，car中的细胞质信号传导分子含有细胞质信号传导结构域、其部分或来源于cd3ζ的序列。
[0288]
在一些实施方案中，受体包含tcr复合体的胞内组分，例如介导t细胞活化和细胞毒性的tcr cd3链(例如cd3ζ链)。因此，在一些方面中，抗原结合部分与一种或更多种细胞信号传导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括cd3跨膜结构域、cd3胞内信号传导结构域和/或其他cd3跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如car)还包括一种或更多种另外的分子(例如fc受体、cd8、cd4、cd25或cd16)的一部分。例如，在一些方面中，car或其他嵌合受体包括cd3-ζ(cd3-)或fc受体与cd8、cd4、cd25或cd16之间的嵌合分子。
[0289]
在一些实施方案中，在连接car或其他嵌合受体之后，受体的细胞质结构域或胞内信号传导结构域激活免疫细胞(例如经改造以表达car的t细胞)的正常效应物功能或应答
中的至少一种。例如，在一些情况下，car诱导t细胞的功能，例如细胞溶解活性或t辅助活性，例如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的胞内信号传导结构域的截短部分代替完整的免疫刺激链，例如如果其转导效应物功能信号。在一些实施方案中，一个或更多个胞内信号传导结构域包含t细胞受体(tcr)的细胞质序列，并且在一些方面中也包含在天然环境中与这样的受体协同作用以启动抗原受体接合之后信号转导的共受体的那些。
[0290]
在天然tcr的情况下，完全激活通常不仅需要通过tcr的信号传导，而且也需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于产生次级或共刺激信号的组分也包括在car中。在另一些实施方案中，car不包括用于产生共刺激信号的组分。在一些方面中，另外的car在相同细胞中表达并提供用于产生次级或共刺激信号的组分。
[0291]
在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有t细胞共刺激分子的胞内结构域。在一些实施方案中，car包含共刺激受体(例如cd28、4-1bb、ox40、dap10和icos)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面中，同一car包含激活和共刺激组分二者。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有来源于t细胞共刺激分子或其功能变体的胞内结构域，例如在跨膜结构域和胞内信号传导结构域之间。在一些方面中，t细胞共刺激分子是cd28或41bb。
[0292]
在一些实施方案中，激活结构域包含在一个car内，而共刺激组分由识别另一抗原的另一car提供。在一些实施方案中，car包括激活或刺激性car、共刺激性car，二者均在相同细胞上表达(参见wo2014/055668)。在一些方面中，细胞包括一种或更多种刺激或活化car和/或共刺激car。在一些实施方案中，细胞还包括抑制性car(icar，参见fedorov et al.，sci.transl.medicine，5(215)(december，2013)，例如识别除与疾病或病症相关和/或特异于疾病或病症的抗原之外的抗原的car，由此通过抑制性car与其配体的结合减弱或抑制了通过疾病靶向car递送的激活信号(例如以降低脱靶作用)。
[0293]
在某些实施方案中，胞内信号传导结构域包含与cd3(例如cd3-ζ)胞内结构域连接的cd28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含与cd3ζ胞内结构域连接的嵌合cd28和cd137(4-1bb，tnfrsf9)共刺激结构域。
[0294]
在一些实施方案中，在细胞质部分中，car涵盖一个或更多个(例如两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如初级激活结构域)。示例性car包括cd3-ζ、cd28和4-1bb的胞内组分。
[0295]
在一些实施方案中，抗原受体还包括标志物和/或表达car的细胞，或者其他抗原受体还包括替代标志物，例如细胞表面标志物，其可用于确定细胞表达受体的转导或改造。在一些方面中，标志物包括cd34、ngfr或表皮生长因子受体的全部或部分(例如截短形式)，例如这样的细胞表面受体(例如tegfr)的截短形式。在一些实施方案中，编码标志物的核酸与编码接头序列(例如可切割的接头序列，例如t2a)的多核苷酸可操作地连接。例如，标志物和任选的接头序列可以是如公开的专利申请号wo2014031687中公开的任一种。例如，标志物可以是截短的egfr(tegfr)，其任选地与接头序列(例如t2a可切割接头序列)连接。
[0296]
在一些实施方案中，标志物是并非天然地存在于t细胞上或并非天然地存在于t细胞表面上的分子(例如细胞表面蛋白)或其部分。
[0297]
在一些实施方案中，分子是非自身分子(例如非自身蛋白)，即不被细胞将被过继转移到其中的宿主的免疫系统识别为“自身”的分子。
[0298]
在一些实施方案中，标志物不提供治疗功能和/或不产生除了待用作用于遗传改造，例如用于选择成功改造的细胞的标志物的作用。在另一些实施方案中，标志物可以是治疗性分子或以其他方式发挥一些期望作用的分子，例如用于体内待相遇的细胞的配体，例如在过继转移和与配体相遇时增强和/或抑制细胞应答的共刺激或免疫检查点分子。
[0299]
在一些情况下，car被称为第一代、第二代和/或第三代car。在一些方面中，第一代car是在抗原结合时仅提供经cd3链诱导的信号的car；在一些方面中，第二代car是提供信号和共刺激信号的car，例如包括来自共刺激受体(例如cd28或cd137)的胞内信号传导结构域的car；在一些方面中，第三代car是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的car。
[0300]
例如，在一些实施方案中，car含有抗体，例如抗体片段、是或含有cd28或其功能变体的跨膜部分的跨膜结构域，以及含有cd28或其功能变体的信号传导部分和cd3ζ或其功能变体的信号传导部分的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，car含有抗体(例如抗体片段)、是或含有cd28或其功能变体的跨膜部分的跨膜结构域，以及含有4-1bb或其功能变体的信号传导部分和cd3ζ或其功能变体的信号传导部分的胞内信号传导结构域。在一些这样的实施方案中，受体还包含含有ig分子(例如人ig分子，例如ig铰链(例如igg4铰链))的一部分的间隔子，例如仅铰链间隔子。
[0301]
在一些实施方案中，重组受体(例如car)的跨膜结构域是或包含人cd28(例如登记号p01747.1)或其变体的跨膜结构域。在一些实施方案中，重组受体(例如car)的胞内信号传导组分含有人cd28或其功能变体或部分的胞内共刺激信号传导结构域，例如在天然cd28蛋白的第186至187位具有ll至gg替换的结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含4-1bb(登记号q07011.1)或其功能变体或部分的胞内共刺激信号传导结构域。
[0302]
在一些实施方案中，重组受体(例如car)的胞内信号传导结构域包含人cd3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，例如人cd3(登记号：p20963.2)同种型3的112aa细胞质结构域或如美国专利号：7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的cd3ζ信号传导结构域。
[0303]
在一些方面中，间隔子仅含有igg的铰链区，例如仅igg4或iggl的铰链区，例如仅铰链的间隔子。在另一些实施方案中，间隔子是或含有任选地与ch2和/或ch3结构域连接的ig铰链(例如igg4来源铰链)。在一些实施方案中，间隔子是与ch2和ch3结构域连接的ig铰链(例如igg4铰链)。在一些实施方案中，间隔子是仅与ch3结构域连接的ig铰链(例如igg4铰链)。在一些实施方案中，间隔子是或包含甘氨酸-丝氨酸富集序列或其他柔性接头，例如已知柔性接头。
[0304]
例如，在一些实施方案中，car包括抗体(例如抗体片段)，包括scfv、间隔子(例如含有免疫球蛋白分子的一部分(例如重链分子的一个或更多个恒定区和/或铰链区)的间隔子，例如含有ig铰链的间隔子)、含有cd28来源跨膜结构域的全部或部分的跨膜结构域、cd28来源胞内信号传导结构域和cd3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，car包括抗体或片段，例如scfv、间隔子(例如含有ig铰链的间隔子中的任一种)、cd28来源跨膜结构域、4-1bb来源胞内信号传导结构域和cd3ζ-来源信号传导结构域。
[0305]
在一些实施方案中，编码这样的car构建体的核酸分子还包含编码t2a核糖体跳读元件(skip element)的序列和/或tegfr序列(例如编码car的序列的下游)。在一些实施方案中，还可产生表达抗原受体(例如car)的t细胞以表达截短egfr(egfrt)作为非免疫原性选择表位(例如通过引入编码car和egfrt的构建体，所述car和egfrt由t2a核糖体开关件
et al.，embo j.7：3745，1988；也参见lefranc et al.，dev.comp.immunol.27：55，2003)。在一些实施方案中，cdr3是负责抗原结合或特异性的主要cdr，或者是给定tcr可变区上的三个cdr中对于抗原识别和/或对于与肽-mhc复合体的经加工肽部分相互作用是最重要的。在一些情况下，α链的cdr1可与某些抗原肽的n端部分相互作用。在一些情况下，β链的cdr1可与肽的c末端部分相互作用。在一些情况下，cdr2对于以下贡献最强或者是负责以下的主要cdr：与mhc-肽复合体的mhc部分相互作用或识别mhc-肽复合体的mhc部分。在一些实施方案中，链的可变区可含有另外的高变区(cdr4或hvr4)，其通常参与超抗原结合而不是抗原识别(kotb(1995)clinical microbiology reviews，8：411-426)。
[0312]
在一些实施方案中，tcr也可含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾区(参见例如janeway et al.，immunobiology：the immune system in health and disease，3rd ed.，current biology publications，p.4：33，1997)。在一些方面中，tcr的每条链可具有一个n端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、一个跨膜区和一个位于c端末端的短胞质尾区。在一些实施方案中，tcr与参与介导信号转导的cd3复合体的不变蛋白质缔合。
[0313]
在一些实施方案中，tcr链含有一个或更多个恒定结构域。例如，给定tcr链(例如α链或β链)的胞外部分可含有两个免疫球蛋白样结构域，例如可变结构域(例如vα或vβ；通常基于kabat编号的氨基酸第1至116位kabat et al.，
″
sequences of proteins of immunological interest，us dept.health and human services，public health service national institutes of health，1991，5th ed)和与细胞膜相邻的恒定结构域(例如α和/或β链恒定结构域或c，通常基于kabat编号的链的第117至259位或者链恒定结构域或c，通常基于kabat的链的第117至295位)。例如，在一些情况下，由两条链形成的tcr的胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，所述可变结构域各自含有cdr。tcr的恒定结构域可含有其中半胱氨酸残基形成二硫键的短连接序列，从而连接tcr的两条链。在一些实施方案中，tcr可在每个恒定结构域中具有另外的半胱氨酸残基，使得tcr在恒定结构域中含有两个二硫键。
[0314]
在一些实施方案中，tcr链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，tcr链含有胞质尾区。在一些情况下，所述结构允许tcr与其他分子如cd3及其亚基缔合。例如，含有具有跨膜区的恒定结构域的tcr可将蛋白质锚固在细胞膜中并与cd3信号传导装置或复合体的不变亚基缔合。cd3信号传导亚基(例如cd3γ、cd3δ、cd3ε和cd3ε链)的胞内尾含有参与tcr复合体的信号传导能力的一个或更多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam。
[0315]
在一些实施方案中，tcr可以是两条链的异二聚体和/或其可以是单链tcr构建体。在一些实施方案中，tcr是含有两条分离的链的异二聚体，所述两条分离的链例如通过一个或更多个二硫键连接。
[0316]
在一些实施方案中，tcr可从已知tcr序列(例如可变(v)链的序列)产生，对于所述序列，基本上全长的编码序列是容易获得的。用于从细胞来源获得包含v链序列的全长tcr序列的方法是公知的。在一些实施方案中，编码tcr的核酸可从多种来源获得，例如通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction，pcr)扩增在一种或更多种给定细胞内的或从一种或更多种给定细胞中分离的tcr编码核酸，或者合成可公开获得的tcr dna序列。
[0317]
在一些实施方案中，tcr获自生物来源，例如获自细胞，例如获自t细胞(例如细胞毒性t细胞)、t细胞杂交瘤或其他可公开获得的来源。在一些实施方案中，t细胞可从体内分离的细胞中获得。在一些实施方案中，tcr是胸腺选择的tcr。在一些实施方案中，tcr是新表位限制性tcr。在一些实施方案中，t细胞可以是经培养的t细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，tcr或其抗原结合部分或其抗原结合片段可根据tcr序列的知识合成产生。
[0318]
在一些实施方案中，tcr从针对靶多肽抗原或其靶t细胞表位筛选候选tcr文库中鉴定或选择的tcr产生。tcr文库可通过扩增来自从对象分离的t细胞(包括存在于pbmc、脾或其他淋巴器官中的细胞)的v链库来产生。在一些情况下，t细胞可从肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte，til)中扩增。在一些实施方案中，tcr文库可从cd4 或cd8 t细胞产生。在一些实施方案中，tcr可从正常的健康对象的t细胞来源(即正常的tcr文库)中扩增。在一些实施方案中，tcr可从患病对象的t细胞来源(即患病tcr文库)中扩增。在一些实施方案中，简并引物用于扩增v链序列的基因库，例如通过在从人获得的样品(例如t细胞)中进行rt-pcr。在一些实施方案中，sctv文库可从初始v链文库组装，其中扩增产物被克隆为或组装为被接头分离。根据对象和细胞的来源，文库可以是hla等位基因特异性的。或者，在一些实施方案中，tcr文库可通过亲本或支架tcr分子的诱变或多样化来产生。在一些方面中，tcr经受定向进化，例如通过诱变，例如α或β链的诱变。在一些方面中，tcr的cdr中的特定残基被改变。在一些实施方案中，可通过亲和力成熟来修饰选定的tcr。在一些实施方案中，可例如通过筛选来选择抗原特异性t细胞以评估针对肽的细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxic t lymphocyte，ctl)活性。在一些方面中，可例如通过结合活性(例如对抗原的特定亲和力或亲合力)来选择tcr(例如存在于抗原特异性t细胞上)。
[0319]
在一些实施方案中，tcr或其抗原结合部分是经修饰或经改造的tcr或其抗原结合部分。在一些实施方案中，定向进化方法用于产生具有改变的特性(例如具有对特异性mhc-肽复合体更高的亲和力)的tcr。在一些实施方案中，定向进化通过展示方法来实现，所述展示方法包括但不限于酵母展示(holler et al.(2003)nat immunol，4，55-62；holler et al.(2000)proc natl acad sci u s a，97，5387-92)、噬菌体展示(li et al.(2005)nat biotechnol，23，349-54)或t细胞展示(chervin et al.(2008)j immunol methods，339，175-84)。在一些实施方案中，展示方法涉及改造或修改已知的亲本或参考tcr。例如，在一些情况下，野生型tcr可用作用于产生其中cdr的一个或更多个残基被突变的经诱变tcr的模板，并且选择具有期望的改变的特性(例如对期望的靶抗原更高的亲和力)的突变体。
[0320]
在一些实施方案中，用于产生或生成目的tcr的靶多肽的肽是已知的或者可容易地鉴定。在一些实施方案中，适合于用于产生tcr或抗原结合部分的肽可基于目的靶多肽(例如下文描述的靶多肽)中hla限制性基序的存在来确定。在一些实施方案中，使用可用的计算机预测模型来鉴定肽。在一些实施方案中，对于预测mhc i类结合位点，这样的模型包括但不限于propred1(singh和raghava(2001)bioinformatics 17(12)：1236-1237，以及syfpeithi(参见schuler et al.(2007)immunoinformatics methods in molecular biology，409(1)：75-932007)。在一些实施方案中，mhc限制性表位是hla-a0201，其在所有高加索人(caucasians)中约39至46％中表达，并因此代表了用于制备tcr或其他mhc-肽结合分子的mhc抗原的合适选择。
[0321]
使用计算机预测模型的用于蛋白酶体和免疫蛋白酶体的hla-a0201结合基序和切
割位点是已知的。对于预测mhc i类结合位点，这样的模型包括但不限于propred1(在singh和raghava，propred：prediction of hla-dr binding sites.bioinformatics 17(12)：1236-1237 2001中更详细地描述)，和syfpeithi(参见schuler et al.syfpeithi，database for searching and t-cell epitope prediction.immunoinformatics methods in molecular biology，vol 409(1)：75-932007)。
[0322]
在一些实施方案中，tcr或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白质或其突变形式，其中一种或更多种特性(例如结合特性)已经改变。在一些实施方案中，tcr可来源于多种动物物种之一，例如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。tcr可以是细胞结合的或为可溶性形式。在一些实施方案中，出于所提供方法的目的，tcr是以在细胞表面上表达的细胞结合的形式。
[0323]
在一些实施方案中，tcr是全长tcr。在一些实施方案中，tcr是抗原结合部分。在一些实施方案中，tcr是二聚体tcr(dtcr)。在一些实施方案中，tcr是单链tcr(sc-tcr)。在一些实施方案中，dtcr或sctcr具有如以下中描述的结构：wo 03/020763、wo 04/033685、wo2011/044186。
[0324]
在一些实施方案中，tcr含有对应于跨膜序列的序列。在一些实施方案中，tcr确实含有对应于细胞质序列的序列。在一些实施方案中，tcr能够与cd3形成tcr复合体。在一些实施方案中，任何tcr(包括dtcr或sctcr)可与在t细胞表面上产生活性tcr的信号传导结构域连接。在一些实施方案中，tcr在细胞表面上表达。
[0325]
在一些实施方案中，dtcr含有其中对应于tcr链可变区序列的序列与对应于tcr链恒定区胞外序列的序列的n端融合的第一多肽和其中对应于tcr链可变区序列的序列与对应于tcr链恒定区胞外序列的序列的n端融合的第二多肽，第一多肽和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，所述键可对应于存在于天然二聚体tcr中的天然链间二硫键。在一些实施方案中，链间二硫键不存在于天然tcr中。例如，在一些实施方案中，可将一个或更多个半胱氨酸并入到dtcr多肽对的恒定区胞外序列中。在一些情况下，可能期望天然和非天然二硫键二者。在一些实施方案中，tcr含有锚固至膜的跨膜序列。
[0326]
在一些实施方案中，dtcr包含含有可变结构域、恒定结构域和与恒定结构域c端连接的第一二聚化基序的tcr链，以及含有可变结构域、恒定结构域和与恒定结构域c端连接的第一二聚化基序的tcr链，其中第一二聚化基序和第二二聚化基序容易相互作用以在第一二聚化基序中的氨基酸与第二二聚化基序中的氨基酸之间形成共价键，将tcr链和tcr链连接在一起。
[0327]
在一些实施方案中，tcr是sctcr。通常来说，sctcr可使用已知方法来产生，参见例如soo hoo，w.f.et al.pnas(usa)89，4759(1992)；w
ü
lfing，and pl
ü
ckthun，a.，j.mol.biol.242，655(1994)；kurucz，i.et al.pnas(usa)90 3830(1993)；国际公开的pct号wo 96/13593、wo 96/18105、wo99/60120、wo99/18129、wo 03/020763、wo2011/044186；和schlueter，c.j.et al.j.mol.biol.256，859(1996)。在一些实施方案中，sctcr含有引入的非天然二硫链间键以促进tcr链的缔合(参见例如国际公开的pct号wo 03/020763)。在一些实施方案中，sctcr是非二硫键连接的截短tcr，其中与其c端融合的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如国际公开的pct号wo99/60120)。在一些实施方案中，sctcr含有通过肽接头与tcr可变结构域共价连接的tcr可变结构域(参见例如国际公开的pct号wo99/18129)。
[0328]
在一些实施方案中，sctcr含有由对应于tcr链可变区的氨基酸序列构成的第一区段，由与对应于tcr链恒定结构域胞外序列的氨基酸序列的n端融合的对应于tcr链可变区序列的氨基酸序列构成的第二区段，以及将第一区段的c端与第二区段的n端连接的接头序列。
[0329]
在一些实施方案中，sctcr含有由与链胞外恒定结构域序列的n端融合的链可变区序列构成的第一区段，和由与序列链胞外恒定和跨膜序列的n端融合的链可变区序列构成的第二区段，以及任选地将第一区段的c端与第二区段的n端连接的接头序列。
[0330]
在一些实施方案中，sctcr含有由与链胞外恒定结构域序列的n端融合的tcr链可变区序列构成的第一区段，和由与序列链胞外恒定和跨膜序列的n端融合的链可变区序列构成的第二区段，以及任选地将第一区段的c端与第二区段的n端连接的接头序列。
[0331]
在一些实施方案中，连接第一和第二tcr区段的sctcr的接头可以是在保持tcr结合特异性的同时能够形成单个多肽链的任何接头。在一些实施方案中，接头序列可例如具有式-p-aa-p-，其中p是脯氨酸并且aa代表其中氨基酸是甘氨酸和丝氨酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一区段和第二区段配对，使得其可变区序列被定向用于这样的结合。因此，在一些情况下，接头具有足够的长度以从第一区段的c端跨至第二区段的n端，或反之亦然，但不会太长而阻断或降低sctcr与靶配体的键合。在一些实施方案中，接头可含有或含有约10至45个氨基酸，例如10至30个氨基酸或26至41个氨基酸残基，例如29、30、31或32个氨基酸。
[0332]
在一些实施方案中，sctcr含有将链的恒定结构域的免疫球蛋白区的残基与链的恒定结构域的免疫球蛋白区的残基连接的共价二硫键。在一些实施方案中，天然tcr中的链间二硫键不存在。例如，在一些实施方案中，一个或更多个半胱氨酸可并入到sctcr多肽的第一区段和第二区段的恒定区胞外序列中。在一些情况下，可能期望天然和非天然二硫键二者。
[0333]
在含有引入的链间二硫键的dtcr或sctcr的一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，形成天然链间二硫键的一个或更多个天然半胱氨酸被替换为另一残基，例如被替换为丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，引入的二硫键可通过将第一区段和第二区段上的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成。
[0334]
tcr的一些示例性非天然二硫键描述于公开的国际pct号wo2006/000830中。
[0335]
在一些实施方案中，tcr或其抗原结合片段表现出对靶抗原的平衡结合常数为或为约10-5
至10-12
m以及其中的所有单独值和范围的亲和力。在一些实施方案中，靶抗原是mhc-肽复合体或配体。
[0336]
在一些实施方案中，编码tcr或其部分的一个或更多个核酸可通过pcr、克隆或其他合适的手段扩增并克隆到合适的一种或更多种表达载体中。表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或二者的那些，例如质粒和病毒。
[0337]
在一些实施方案中，载体可以是puc系列(fermentas life sciences)、pbluescript系列(stratagene，lajolla，calif.)、pet系列(novagen，madison，wis.)、pgex系列(pharmacia biotech，uppsala，sweden)，或pex系列(clontech，palo alto，calif.)的载体。在一些情况下，也可使用噬菌体载体，例如g10、gt11、zapii(stratagene)、embl4和
nm1149。在一些实施方案中，可使用植物表达载体并且包括pbi01、pbi101.2、pbi101.3、pbi121和pbin19(clontech)。在一些实施方案中，动物表达载体包括peuk-cl、pmam和pmamneo(clontech)。在一些实施方案中，使用病毒载体，例如逆转录病毒载体。
[0338]
在一些实施方案中，可使用标准重组dna技术来制备重组表达载体。在一些实施方案中，载体可含有调节序列(例如转录和翻译起始和终止密码子)，其对载体待引入到其中的宿主类型(例如细菌、真菌、植物或动物)呈特异性，这视情况而定并考虑载体是基于dna还是基于rna的。在一些实施方案中，载体可含有与编码tcr或抗原结合部分(或其他mhc-肽结合分子)的核苷酸序列可操作地连接的非天然启动子。在一些实施方案中，启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(cmv)启动子、sv40启动子、rsv启动子和存在于鼠干细胞病毒的长末端重复中的启动子。也考虑了其他已知的启动子。
[0339]
在一些实施方案中，为了产生编码tcr的载体，从自表达目的tcr的t细胞克隆分离的总cdna中pcr扩增α和β链(例如)，并将其克隆到表达载体中。在一些实施方案中，α和β链(例如)被克隆到同一载体中。在一些实施方案中，α和β链被克隆到不同的载体中。在一些实施方案中，将产生的链并入到逆转录病毒(例如慢病毒载体)中。
[0340]
液体类别确定
[0341]
液体类别是移液液体所需参数的集合。在所公开的系统10中存在与液体转移相关的两组参数。这些是移液参数和校准参数。与准确度相比，移液参数与精确度更相关，并且包括因素例如分配期间的抽吸和分配速度、气隙或液体接触。与精确度相比，校准参数与准确度更相关，并定义了特定液体类别的校准曲线的斜率和偏移。作为针对每个新的液体类别优化两组参数的替代，确定了用于确定具有用于精确移液的最佳参数的默认类别的筛选的预定义的液体类别，然后调整校准设置以提高移液准确度。
[0342]
移液和校准参数的值取决于液体的物理特征。这些根据液体类型和移液管模式(即，单移液管vs多移液管；自由vs湿接触分配等)来限定。一个液体类别涵盖了fca和mca 384二者的整个体积范围。在每个液体类别中，都创建了子类别。子类别基于臂和尖端类型来限定。在这些子类别中限定了移液参数和校准参数。
[0343]
在开发液体类别时采用重量法(gravimetric approach)。将来自mettler toledo的称重模块(0.01mg分辨率)用作面板上天平(on-deck balance)。该天平与控制系统20整合以允许自动调零(automated zero)和测量命令(measure command)。液体类别筛选、优化和确定均以自动化方式进行，而每个步骤有独立的方法。
[0344]
液体类别使得能够通过将人工移液步骤转化为自动化过程来移液自动化。通常来说，移液受到数个校准参数例如体积、温度、密度和黏度，以及数个移液参数例如气隙、延迟和移液速度的影响。与较不具黏性的液体(例如水)相比，更具黏性的液体(例如dmso(用于细胞冷冻保存中的液体))通常需要更慢的移液速度和延迟以提高移液的准确度和精确度，而所述较不具黏性的液体(例如水)通常可以以更快的速度和更短的延迟以高精确度和准确度进行。多种溶液的不准确移液可对整个过程产生复合作用，影响结果分析。在自动化规模缩减模型方法中，每个抽吸和分配液体转移步骤都需要开发的液体类别。该液体类别限定了用每种尖端类型将如何抽吸/分配特定液体，以及其在方法执行期间如何响应于错误。液体类别也将用于基于测量的准确度和精确度为给定液体的每种移液管尖端类型告知适当的工作体积范围。
[0345]
液体类别组件和参数
[0346]
有用于开发液体类别的四种主要组件。这些包括易于控制、检测和定位、式(formulas)和微脚本命令。
[0347]
易于控制
[0348]
易于控制组件是允许易于控制用于抽吸和分配的关键参数的图形编辑器。在易于控制中，可调整参数(例如体积)以显现使用移液管尖端类型移液一定体积可能需要的可能气隙、延迟和速度。
[0349]
检测和定位
[0350]
检测和定位组件允许用户设置用于电容式液位检测(capacitive liquid level detection，clld)、追踪选项、错误处理的参数以及用于抽吸和分配的收回特性(retract property)。clld是液体处理器感知实验室器具中液体的存在和高度的手段。使用接地的工作台60和导电移液尖端，液体处理器响应于空气/液体界面处的电容变化。clld针对所有自动化规模缩减模型应用开启。clld从z
起始
开始，并持续直至z
最大
。z
行进
指示移液管尖端在自由运动时可靠近实验室器具的距面板的最小距离。z
起始
是在抽吸步骤开始期间实验室器具内超过液位的距离。z
起始
由实验室器具定义来定义。设置z
最大
使移液管尖端不会撞到实验室器具底部，并且z
最大
也由实验室器具定义来定义。根据液体类别，如果选择clld，则输入测量的灵敏度组和尖端浸没深度。
[0351]
当液体被抽吸时，如果clld和追踪被开启，则移液管尖端将进入液体并继续进入到设定的浸没深度。然后它将以液体抽吸的速率向下移动，以便在抽吸液体时维持浸没深度。自动化规模缩减模型方法中的所有抽吸步骤均开启追踪。收回特性和监督允许系统监测移液管尖端从液体中的退出，并在尖端收回期间告知用户是否发生错误。错误处理部分限定了液体处理器如何响应于实验期间发生的错误。这是根据液体类别确定的。通常来说，根据液体类别选择“用户提示”，从而允许用户在方法执行期间看到错误消息并可以直接响应。
[0352]
式
[0353]
式提供了将液体处理参数作为函数输入的方式。这些式可使用固定值或移液体积依赖性式针对抽吸和分配二者进行编辑。对于特定于液体类别的移液准确度，不同体积的液体将具有不同的偏移。在液体类别开发期间调整这些偏移。
[0354]
微脚本
[0355]
微脚本是抽吸、分配和混合期间的基本动作序列(underlying sequence of action)。在抽吸脚本中，为体积(包括来自准确度调整的偏移)、加速和减速设置了一些变量。将三通止回阀(three way check valve)转至移液管尖端位置以允许抽吸液体。抽吸初始前导气隙(initial leading airgap)，并随后将液体预润湿至变量部分中设置的循环设置数。软件检查clld是否开启或关闭以确定其抽吸模式。在有或没有clld的情况下抽吸液体之后，抽吸尾气隙(trailing airgap)。在分配液体期间，脚本设置体积变量(包括来自准确度调整的偏移)。所述软件会检查来察看是否开启或关闭了多移液。然后它将三通止回阀移回移液管尖端位置以允许分配液体。所述软件再次检查来察看clld是否开启或关闭。然后，它以适当的设置分配液体(在具有或不具有多移液的情况下以及在具有或不具有clld的情况下)。如果设置了延迟，则移液管尖端将等待设定量的时间，然后从实验室器具中收
回。然后它将移动到设定的z位置。如果设置了尾气隙，则然后它将抽吸空气，然后移动移液管尖端。
[0356]
细胞培养受试液体
[0357]
细胞培养液体
[0358]
培养基
[0359]
基础培养基
[0360]
完全(complete)
[0361]
细胞溶液
[0362]
细胞 培养基
[0363]
细胞 cryostor/plasmalyte/hsa
[0364]
cryostor/plasmalyte/hsa
[0365]
臂类型(arms type)
[0366]
fca
[0367]
mca384
[0368]
fca子类别
[0369]
5000μl diti
[0370]
1000μl diti
[0371]
200μl diti
[0372]
50μl diti
[0373]
10μl diti
[0374]
mca子类别
[0375]
50μl diti
[0376]
150μl diti
[0377]
接触分配
[0378]
自由
[0379]
接触
[0380]
分配类型
[0381]
单
[0382]
多
[0383]
混合
[0384]
培养基
[0385]
细胞 培养基
[0386]
细胞 cryostor/plasmalyte/has
[0387]
方法
[0388]
为每种受试液体创建了液体类别工作簿。
[0389]
使用densito 30px，测量受试液体的密度并记录在液体类别工作簿中的“液体详细信息”表(tab)中。所有另外的30px液体详细信息均在“液体详细信息”表中报告。
[0390]
使用检测灵敏度命令来验证每种受试液体的clld灵敏度组(低、中、高)。敏感度组记录在液体类别工作簿中的“液体详细信息”表中。
[0391]
理想地，为每种受试液体确定自由/单分配默认液体类别。该默认液体类别也用作多分配和mca液体类别二者的默认项。然后优化所有默认液体类别以提高移液准确度。如果自由/单分配默认液体类别对多分配和mca液体类别产生低精确度，则针对受试液体优化移液参数。
[0392]
柔性通道臂液体类别
[0393]
自由单分配
[0394]
液体类别筛选
[0395]
新的细胞培养液体
[0396]
针对5个已建立的液体类别筛选每种新液体。将500μl用作用于确定默认液体类别的筛选体积。分配体积的最小、最大、平均值、准确度和精确度根据每种受试的液体类别类型来计算。默认类别被确定为具有最高精确度(％cv)和准确度(％dev)的类别。对于高黏性液体，针对已建立的接触液体类别对液体进行另外的筛选。如果使用接触，则会创建分离的接触液体类别。如果所有液体类别均产生差的准确度和精确度，则调整移液参数。使用所有8个fca通道获得体积测量，然而所有统计均仅使用1.25ml注射器来计算。为了防止蒸发，每个移液循环使用一个移液管尖端。非黏性液体的液体类别筛选以自由和单分配模式进行。
[0397]“已知”细胞培养液体
[0398]
具有与先前建立的液体类别相似物理特性的液体可跳过筛选步骤并且可采用建立的液体类别作为其默认(起始)液体类别，即培养基配方(media formulation)。
[0399]
液体类别优化
[0400]
为了优化受试液体的默认液体类别，创建了从液体类别筛选步骤获得的默认液体类别的重复。每个diti子类别评估了6个受试体积，以创建具有高精确度和准确度的经优化受试液体类别。
[0401]
10至1000μl diti受试体积fca 1-4
[0402]
如表1中所示，使用5个液体子类别(fca 1-5)执行液体类别优化。在每个子类别中，测试6个体积以评估移液准确度。液体子类别和受试体积在液体类别工作簿中的“受试体积”表中报告。每个受试体积有8个重复，每个通道具有1个重复。从每个通道分配的测量的体积报告在“opt fca”表中。使用所有8个fca通道获得体积测量，然而所有统计均仅使用1.25ml注射器来计算。计算每个受试体积的分配体积的最小、最大、平均值、准确度(％dev)和精确度(％cv)。如果％dev和％cv在接受标准内，则启动确定运行。如果它们高于接受标准，则进行另外的迭代。为了防止蒸发，每个移液循环使用一个移液管尖端。
[0403]
5000μl diti受试体积fca 5
[0404]
每个受试体积具有6个重复，每个通道3个重复。从每个通道分配的测量的体积报告在“opt fca 5”表中。计算每个受试体积的分配体积的最小、最大、平均值、准确度(％dev)和精确度(％cv)。如果％dev和％cv在接受标准内，则可启动确定运行。如果它们高于接受标准，则进行另外的迭代。
[0405]
表1.柔性通道臂：单分配
[0406][0407]
确定运行
[0408]
实验和数据包与液体类别优化步骤保持相同，然而每个体积在最终准确度调整下测试3
×
。从1.25ml(3
×
61.25ml注射器)和5ml(9
×
25ml注射器)注射器二者的18次测量计算最终平均值、cv和％dev。如果％cv和％dev保持在接受标准内，则液体类别已完成。
[0409]
多分配
[0410]
液体类别优化
[0411]
对于多分配液体类别，跳过筛选步骤并直接进行优化(如果维持良好的精确度)。每个受试多分配液体类别均作为已针对受试液体优化的默认多分配液体类别的重复创建(即默认液体类别的“多”版本)。为每个多分配液体类别建立了3个液体子类别(fca3-5m)，如表2中所示。与单分配液体类别不同，只有一个通道用于多分配液体类别。
[0412]
对于每个子类别，测试6个体积以评估移液准确度。液体子类别和受试体积报告于表2中和液体类别工作簿中的“受试体积”表中。每个受试体积有8个重复，在1个通道下进行8个重复。在“opt fca m”表中报告了从每次分配所分配的测量的体积。计算每个受试体积的分配体积的最小、最大、平均值、准确度(％dev)和精确度(％cv)。如果％dev和％cv在接受标准内，则可启动确定运行。如果它们高于接受标准，则可进行另外的迭代。
[0413]
表2.柔性通道臂：多分配
[0414][0415]
确定运行
[0416]
实验和数据包与液体类优化步骤保持相同，然而每个体积在最终准确度调整下测试3
×
。从1.25ml和5ml注射器二者的24次测量计算最终平均值、cv和％dev。如果cv和dev保持在接受标准内，则液体类别已完成。
[0417]
另外的设备
[0418]
表3.重量液体类别开发的示例性设备
[0419][0420]
序列
[0421]
[0422]
[0423]
[0424][0425]
尽管上面已经描述了一些具体实施方案，但是这些实施方案并不旨在限制本公开内容的范围，即使在针对特定特征仅描述了单个实施方案的情况下。除非另有说明，否则本公开内容中提供的特征的实施例旨在是举例说明性的而非限制性的。以上描述旨在涵盖对受益于本公开内容的本领域技术人员将明显的这样的替代方案、修改方案和等同方案。
[0426]
本公开内容的范围包括本文中公开的任何特征或特征组合(明确地或隐含地)或其任何概括，无论其是否减轻了本文中所解决的任何或所有问题。因此，在对任何这样的特征组合进行本技术(或要求保护其优先权的申请)期间，可提出新的权利要求。特别地，参考所附权利要求书，来自从属权利要求的特征可与独立权利要求的那些组合，并且来自各个独立权利要求的特征可以以任何合适的方式组合，并且不仅是以所附权利要求书中列举的特定组合。
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