基于CRISPR检测脑卒中相关TYMS基因的试剂盒的制作方法

基于crispr检测脑卒中相关tyms基因的试剂盒
技术领域
1.本发明属于基因突变检测技术领域，具体涉及一种基于crispr检测脑卒中相关tyms基因突变的试剂盒。


背景技术：

2.脑卒中又称中风，是一种复杂的多因素多基因疾病，由多种基因-基因和基因-环境相互作用引起。多种因素包括高血压、糖尿病、吸烟、高脂血症和高同型半胱氨酸血症，都与较高的中风风险相关。特别是高同型半胱氨酸血症，被认为是多民族缺血性中风的一个独立的、潜在的可改变的危险因素。研究表明，高血压、空腹血糖受损和高同型半胱氨酸血症被认为是脑血管疾病的独立危险因素，而这种风险的分子基础归因于叶酸循环、蛋氨酸循环和胸苷酸合成酶(dna修复)中因子的异常功能，这些因子参与单碳代谢。例如，同型半胱氨酸(hcy)和亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)直接参与蛋氨酸的合成，并导致与高同型半胱氨酸血症相关的脑血管疾病风险。
3.最近，有研究调查了叶酸与中风的关系，在随机对照试验中，叶酸摄入有助于预防中风。因此，脑血管疾病的风险受hcy和叶酸的影响，叶酸是预防血管疾病的候选营养素。胸苷酸合成酶(thymidylate synthetase，tyms)是参与叶酸代谢的酶之一。具体而言，tyms分别催化5,10-亚甲基四氢叶酸(thf)和脱氧尿苷单磷酸(dump)转化为5-甲基thf-脱氧胸苷单磷酸(dtmp)。这种转化需要5,10-甲基thfa作为底物来生成胸苷(dtmp)，这是dna合成和修复所需的核苷酸。因此，tyms在叶酸代谢中起着至关重要的作用，而叶酸代谢是dna合成和修复的关键组成部分。编码这些因子的基因异常可导致多种问题，包括mthfr降低和胸苷酸合成酶(ts)水平升高，这可能通过同型半胱氨酸积累、叶酸缺乏或两者兼而有之导致心血管疾病。
4.由于tyms参与dna修复机制，tyms基因的遗传变异已在癌症治疗学中被报道和研究。此外，tyms基因多态性已在血管疾病中进行了研究，并显示与疾病风险相关。并且tyms基因多态性对缺血性卒中和sbi易感性及进展的影响也已被研究。研究表明tyms多态性(1100t》c[rs699517]、1170a》g[rs2790]])与缺血性中风和无症状性脑梗塞(sbi)的相关性。
[0005]
现阶段临床一般通过定量即时聚合酶链锁反应(quantitative real time polymerase chain reaction，q-pcr)、非放射性原位杂交技术(fluorescence in situhybridization，fish)、多重引物pcr(multiplex pcr)等方式对患者进行基因突变检测，然而这些检测技术均存在检测时间长过程复杂或检测成本过高等问题，导致无法应用到大规模的临床样本研究中。因此亟需提供一种温度控制简单，且灵敏度、特异性高的特异性片段检测方法。
[0006]
rna引导的成簇规则间隔短回文重复序列-crispr(crispr-cas)相关方法由于其高可靠性和特异性而在快速核酸检测方面显示出相当大的前景。目前已经开发了几种类型的cas核酸酶用于crispr-cas系统，例如cas9、cas12等。


技术实现要素：

[0007]
有鉴于此，本发明的目的在于解决现有技术中检测时间长、成本过高和准确性不高以致无法大规模检测临床样本基因突变的问题，提供了一种基于crispr技术检测与脑卒中相关的tyms基因是否存在rs699517和/或rs2790目标突变位点和检测该靶核酸在目标区域是否存在突变的试剂盒。
[0008]
为了实现上述目的，本发明具体采用以下技术方案：
[0009]
一种检测试剂盒，该试剂盒包括突变型crdna或突变型crrna；
[0010]
所述突变型crdna为如下任一：
[0011]
a1).rs699517突变型crdna，其序列如seq id no.1所示；
[0012]
a2).rs2790突变型crdna，其序列如seq id no.2所示；
[0013]
a3).a1)和a2)；
[0014]
所述突变型crrna为如下任一：
[0015]
b1).rs699517突变型crrna，其序列如seq id no.3所示；
[0016]
b2).rs2790突变型crrna，其序列如seq id no.4所示；
[0017]
b3).b1)和b2)。
[0018]
优选地，所述试剂盒包括以下任一：
[0019]
c1).用于特异性扩增tyms基因上rs699517多态性位点的引物对，具体为：
[0020]
rs699517-f，其序列如seq id no.5所示；
[0021]
rs699517-r，其序列如seq id no.6所示；
[0022]
c2).用于特异性扩增tyms基因上rs2790多态性位点的引物对，具体为：
[0023]
rs2790-f，其序列如seq id no.7所示；
[0024]
rs2790-r，其序列如seq id no.8所示；
[0025]
c3).c1)和c2)。
[0026]
可以理解的是，引物对的选择依据试剂盒中突变型crdna或突变型crrna的序列而定。
[0027]
优选地，所述试剂盒包括荧光探针和cas12a蛋白；更加优选地，所述cas12a蛋白为fncas12a蛋白。
[0028]
优选地，所述试剂盒包括荧光探针，所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，所述荧光探针的3’端标记有荧光猝灭基团；更加优选地，所述荧光报告基团选自fam、vic、hex、trt、cy3、cy5、rox、joe、texas red中的任意一种，所述荧光猝灭基团选自tamra、dabcyl、mgb、bhq1、bhq2、bhq3中的任意一种。
[0029]
优选地，所述试剂盒包括dna酶抑制剂和无酶水。
[0030]
优选地，所述试剂盒中包括阴性对照物，所述阴性对照物为野生型crdna或野生型crrna；
[0031]
所述野生型crdna为如下任一：
[0032]
d1).rs699517野生型crdna，其序列如seq id no.9所示；
[0033]
d2).rs2790野生型crdna，其序列如seq id no.10所示；
[0034]
d3).d1)和d2)；
[0035]
所述野生型crrna为如下任一：
[0036]
e1).rs699517野生型crrna，其序列如seq id no.11所示；
[0037]
e2).rs2790野生型crrna，其序列如seq id no.12所示；
[0038]
e3).e1)和e2)。
[0039]
可以理解的是，阴性对照物的选择依据试剂盒中突变型crdna或突变型crrna的序列而定。
[0040]
本发明还提供了上述检测试剂盒在检测与脑卒中相关的tyms基因突变中的应用。
[0041]
优选地，所述应用的过程具体为：对待测dna样品进行pcr扩增，扩增完成后加入检测混合液反应，并采集荧光变化；所述检测混合液含有荧光探针和所述突变型crrna；所述突变型crdna在t7 rna聚合酶作用下生成rna，经回收纯化得到对应的crrna。
[0042]
更加优选地，所述pcr扩增的程序为：95℃3min进行预变性；95℃10s，60℃20s，循环30次；最后降温至25℃，反应结束。
[0043]
更加优选地，所述检测混合液共50ul，具体为：250～500nm纯化的cas12a蛋白，250～500nm突变型crrna，1～5μl荧光探针，2μl dna酶抑制剂，无酶水余量。
[0044]
本发明的有益效果有：针对tyms基因的rs699517和rs2790位点设计突变型crdna和突变型crrna，筛选得到的突变型crrna的荧光值相较于野生型变化显著，灵敏度高；使用所述突变型crrna判断样本是否存在待检基因突变时，检测结果与临床诊断结果基本一致，准确率高。另外，本发明基于crispr-cas12a系统设计crrna，cas12a核酸酶与crrna配合，对dna切割的效率更高、更精确，且构建方式简单、转化效率高。
附图说明
[0045]
图1为tyms基因中rs699517位点的crrna荧光检测结果图；
[0046]
图2为tyms基因中rs2790位点的crrna荧光检测结果图。
具体实施方式
[0047]
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例进一步阐明本发明的内容，但以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0048]
实施例1靶向基因突变位点crrna的设计及获得
[0049]
(1)靶向基因突变位点crrna设计原则
[0050]
由于crispr-cas12a系统是一种新型的靶向dna基因编辑系统，其中cas12a与crrna结合形成监测复合物，crrna的向导区域用互补序列识别目标dna，并且cas12a降解目标dna链。其中所述crrna设计要求：crrna包括蛋白锚定序列和向导序列，序列格式为：5`-与cas12a蛋白结合的锚定序列-crrna向导序列-3`，蛋白锚定序列需要根据cas12a蛋白来确定，使其能够与选定的cas12a蛋白匹配并结合；向导序列则与靶向dna中的片段匹配。
[0051]
(2)crdna序列的选择
[0052]
本实施例中选用的cas12a蛋白为fncas12a，因此选定与cas12a蛋白结合的锚定序列为aauuucuacuguuguagau，所述crrna序列根据现有技术已知的tyms基因rs699517和rs2790两个突变位点区域设计，每个突变位点设计了一个相应的crdna，其序列具体为：
[0053]
tyms基因rs699517突变位点1个crdna：其序列如seq id no.1所示；
[0054]
tyms基因rs2790突变位点1个crdna：其序列如seq id no.2所示。
[0055]
(3)crrna的获得
[0056]
使用t7高产量转录试剂盒(neb)将crdna用作crrna生物合成的模板，转录反应体系如表1所示。在37℃下孵育12h后，将dnase i添加到反应溶液中，并在37℃下孵育30min以消化剩余的dna片段。使用rna纯化试剂盒纯化转录的crrna，并储存在-80℃。
[0057]
表1转录反应体系
[0058][0059]
所得crrna为：
[0060]
tyms基因rs699517突变位点1个crrna：其序列如seq id no.3所示；
[0061]
tyms基因rs2790突变位点1个crrna：其序列如seq id no.4所示。
[0062]
实施例2脑卒中相关tyms基因突变位点的检测试剂盒及检测方法
[0063]
1、用于tyms基因与脑卒中相关突变位点检测的试剂盒的组成
[0064]
1)2个突变型crrna(如实施例1所示获得)，其序列如seq id no.3～4所示；
[0065]
或2个突变型crdna(当试剂盒中为crdna时，需要使用者先将crdna片段分别在t7 rna聚合酶作用下生成rna，回收纯化得到crrna，具体见实施例1)，其序列如seq id no.1～2所示。
[0066]
2)一条特异性荧光探针，在本实施例中，荧光探针具体为表2中任一：
[0067]
表2荧光探针序列
[0068][0069][0070]
3)cas12a蛋白，在本实施例中，采用fncas12a。
[0071]
4)无酶水和dna酶抑制剂。
[0072]
5)用于特异性扩增tyms基因上rs699517和rs2790多态性位点的引物对，所述引物对序列如下所示：
[0073]
rs699517-f，其序列如seq id no.5所示；
[0074]
rs699517-r，其序列如seq id no.6所示；
[0075]
rs2790-f，其序列如seq id no.7所示；
[0076]
rs2790-r，其序列如seq id no.8所示。
[0077]
6)阴性对照物，具体为野生型crdna或野生型crrna；
[0078]
所述野生型crdna包括：
[0079]
rs699517野生型crdna，其序列如seq id no.9所示；
[0080]
rs2790野生型crdna，其序列如seq id no.10所示；
[0081]
所述野生型crrna包括：
[0082]
rs699517野生型crrna，其序列如seq id no.11所示；
[0083]
rs2790野生型crrna，其序列如seq id no.12所示。
[0084]
实施例3与脑卒中相关的tyms基因突变位点的检测
[0085]
1)取10～50ng待测样本dna，加入如表3所示扩增体系中，其中所述引物为如seq id no.5～8所示对应的扩增引物对。
[0086]
表3pcr扩增体系
[0087][0088][0089]
2)将所述得到的扩增产物加入检测混合液(混合液中包含100～200nm纯化的fncas12a，100～200nm crrna，1～5μl合成的荧光探针，2μl dna酶抑制剂和无酶水)，在检测缓冲液(nebuffer 2.1)37℃孵育0.5～1h，检测体系如表4所示:
[0090]
表4检测体系
[0091][0092]
将所述检测体系孵育后利用荧光检测仪持续测定荧光值，同时采用野生型crrna设立阴性对照组，根据阴性阈值判断待测待测样本dna中是否存在相应的脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变。
[0093]
rs699517位点和rs2790位点合成野生株(wt)和突变株(mut)的靶序列，分别利用
实施例1设计的crrna构建检测体系进行检测筛选，其中rs699517突变型crrna，其序列如seq id no.3所示；rs2790突变型crrna，其序列如seq id no.4所示。检测结果如图1、2所示，根据检测结果，突变株中荧光值相较于野生株变化显著，灵敏度高，验证了所使用的crrna效果优异。
[0094]
实施例4试剂盒在临床样本中的检测
[0095]
根据实施例3的方法和结果，选择多例临床样本检测rs699517和rs2790突变位点，并对结果进行汇总比对。
[0096]
一、检测方法
[0097]
1、利用dna提取试剂盒提取患者血液样本的dna，操作步骤严格按照说明书进行；
[0098]
2、利用实施例1设计的crrna构建检测体系，按实施例3所述的检测方法进行扩增及检测反应，最后通过荧光值判断检测结果。
[0099]
二、检测结果
[0100]
检测结果如表5所示：
[0101]
表5 15例脑卒中临床样本检测结果
[0102]
[0103][0104]
由上述结果可知，本发明实施例提供的试剂盒能有效实现脑卒中相关tyms基因rs699517和rs2790位点的突变筛查检测，判断标本是否存在待检基因突变。且检测结果与临床诊断结果基本一致，正确率高达93.3％。
[0105]
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定；任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。