一种促进长枝木霉产分生孢子的液体发酵方法与流程

1.本发明属于微生物发酵工程技术领域，尤其涉及一种促进长枝木霉产分生孢子的液体发酵方法。


背景技术：

2.木霉菌(trichoderma spp.)作为一种重要的广谱拮抗生防菌，具有竞争、抗生、重寄生、诱导抗性等多种生防功能，而且对多种病原真菌均有抑制作用，比如立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、腐霉菌(pythium spp.)、镰刀菌(fusarium spp.)等。木霉菌生防制剂所采用的主要是分生孢子制剂，目前已进行大量商品化生产的主要有绿色木霉(t.viride)和哈茨木霉(t.harzianum)等，优化发酵条件，提高菌株分生孢子产孢量是开发微生物菌剂的重要研究方向。
3.长枝木霉(t.longibrachiatum)作为一种重要的生防菌，目前用于该菌的发酵方法主要是固体发酵和液体发酵。固体发酵存在发酵时间过长，杂质较多，不适用无人机航空喷洒的缺陷，而液体发酵存在分生孢子产量低的问题。王一冰等(王一冰，赵阳阳，黄亚丽等，长枝木霉菌jg9-31在防治灰霉病中的应用，2021，cn113249228a)提出了一种长枝木霉产厚垣孢子的液体发酵方法，但厚垣孢子产生条件较分生孢子更严格，在实际应用中分生孢子的利用更广泛。为了测定长枝木霉对病害的控制效果需要大量的分生孢子，而目前液体发酵产生的分生孢子浓度低，用无人机进行航空喷洒时需要比常规喷雾更高浓度的分生孢子悬浮液，现有技术无法满足试验的需求。因此亟需开发一种长枝木霉高产分生孢子的液体发酵方法，对于今后利用无人机开展飞机防治具有重要的实践应用价值。


技术实现要素：

4.本发明提供一种促进长枝木霉产分生孢子的液体发酵方法，旨在解决现有技术条件下该菌的分生孢子产孢量低，不能满足一般试验要求，限制了应用基础研究的发展的问题。
5.本发明是这样实现的，一种促进长枝木霉产分生孢子的液体发酵方法，包括以下步骤：
6.步骤一：根据培养基配方配制木霉的液体培养基；
7.步骤二：通过氢氧化钠溶液调整液体培养基的ph为7，并将培养基分成多份装在各个三角瓶中，然后高温高压下灭菌，即得到木霉的液体发酵培养基；
8.步骤三：将保存的长枝木霉菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化培养获得该长枝木霉菌株的菌饼；
9.步骤四：在装有培养基的三角瓶中接种长枝木霉菌株的菌饼；
10.步骤五：将接种好的培养基于25-28℃，200rpm/min条件下振荡培养4-6天，获得种子培养液。
11.步骤六：将种子培养液按1％的接种量接种到装有液体培养基的发酵罐中，在温度
为28-30℃、通气量为0.8-1.0l/l的条件下发酵48h，获得含大量分生孢子的发酵液。
12.利用该方法可获得大量的分生孢子，而且该培养方法成本低廉，发酵培养液中杂质较少，不易堵塞喷头，便于后续的剂型加工。
13.优选的，在步骤一中，培养基配方中的成分包括酵母浸粉5-6g/l，葡萄糖20g/l，硝酸钠7g/l，硫酸亚铁0.1g/l，硫酸镁1.25g/l，磷酸二氢钾4g/l。
14.优选的，在步骤二中，将配制好的液体培养基用1mol/l的氢氧化钠溶液调整溶液ph至7。
15.优选的，在步骤二中高温高压下灭菌为在121℃、105kpa下灭菌20min。
16.优选的，在步骤三中，将保存的长枝木霉菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化培养5-7d，获得该长枝木霉菌的菌饼。
17.优选的，在步骤四中，500ml三角瓶中培养基装液量为70-200ml，接种直径为6mm的菌饼2-5块。
18.优选的，500ml三角瓶中装液量为70ml，接种直径为6mm的菌饼2块。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的一种促进长枝木霉产分生孢子的液体发酵方法，包括将木霉分生孢子接种于特定培养基，在25-28℃，200rpm/min条件下振荡培养4-6d，特定培养基中的成分包括酵母浸粉5-6g，葡萄糖20g，硝酸钠7g，硫酸亚铁0.1g，硫酸镁1.25g，磷酸二氢钾4g，蒸馏水1l，调整ph到7，采用本发明提出的液体发酵方法在2天内即可获得大量的分生孢子，培养基配方成本低廉，培养液中杂质较少，不易堵塞喷头，便于后续剂型加工，为开发适用于无人机航空喷洒的专用剂型提供基础。
附图说明
20.图1为本发明的方法流程示意图；
具体实施方式
21.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
22.请参阅图1，本发明提供一种技术方案：
23.一种促进长枝木霉产分生孢子的液体发酵方法，包括以下步骤：
24.步骤一：根据培养基配方配制木霉的液体培养基。培养基配方中的成分包括酵母浸粉5-6g/l，葡萄糖20g/l，硝酸钠7g/l，硫酸亚铁0.1g/l，硫酸镁1.25g/l，磷酸二氢钾4g/l。
25.步骤二：用1mol/l氢氧化钠溶液调整液体培养基的ph为7，并将培养基分成多份装在各个三角瓶中，然后在121℃、105kpa下灭菌20min，即得到木霉的液体发酵培养基。
26.步骤三：将保存的长枝木霉菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化培养5-7d，获得该长枝木霉菌的菌饼。
27.步骤四：在装有培养基的三角瓶中接种长枝木霉菌株的菌饼。500ml三角瓶中培养基装液量为70-200ml，接种直径为6mm的菌饼2-5块。优选的，500ml三角瓶中装液量为70ml，接种直径为6mm的菌饼2块。
28.步骤五：将接种好的培养基于25-28℃，200rpm/min条件下振荡培养4-6天，获得种子培养液。
29.步骤六：将种子培养液按1％的接种量接种到装有液体培养基的发酵罐中，在温度为28-30℃、通气量为0.8-1.0l/l的条件下发酵48h，获得含大量分生孢子的发酵液。
30.采用本发明提出的液体发酵方法在2天内即可获得大量的分生孢子，培养基配方成本低廉，，培养液中杂质较少，便于后续剂型加工，实现工厂化生产。
31.在本实施方式中所用到的长枝木霉菌株都是来自本技术人从马尾松树体内分离到的菌株。
32.实施例1
33.一种促进长枝木霉产分生孢子的液体发酵方法，包括以下步骤：
34.1)根据培养基配方配制木霉的液体培养基，500ml纯水中加入酵母浸粉2.5g，葡萄糖10g，硝酸钠3.5g，硫酸亚铁0.05g，硫酸镁0.625g，磷酸二氢钾2g；
35.2)用1mol/l的氢氧化钠溶液调整溶液ph至7，将培养基分装到500ml三角瓶中，每瓶装液量为70ml，然后于121℃、105kpa下灭菌20min。
36.3)将保存的长枝木霉菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化培养5-7d，该菌的菌饼；
37.4)在装有培养基的三角瓶中接种直径为6mm的菌饼2块；
38.5)将接种好的培养基于28℃，200rpm/min条件下振荡培养5天，观察产孢量。
39.实施例2
40.一种促进长枝木霉产分生孢子的液体发酵方法，包括以下步骤：
41.1)根据培养基配方配制木霉的液体培养基，500ml纯水中加入酵母浸粉2.5g，葡萄糖10g，硝酸钠3.5g，硫酸亚铁0.05g，硫酸镁0.625g，磷酸二氢钾2g；
42.2)用1mol/l的氢氧化钠溶液调整溶液ph至7，将培养基分装到500ml三角瓶中，每瓶装液量为100ml，然后于121℃、105kpa下灭菌20min。
43.3)将保存的长枝木霉菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化培养5-7d，该菌的菌饼；
44.4)在装有培养基的三角瓶中接种直径为6mm的菌饼3块；
45.5)将接种好的培养基于28℃，200rpm/min条件下振荡培养5天，观察产孢量。
46.实施例3
47.一种促进长枝木霉产分生孢子的液体发酵方法，包括以下步骤：
48.1)根据培养基配方配制木霉的液体培养基，500ml纯水中加入酵母浸粉3g，葡萄糖10g，硝酸钠3.5g，硫酸亚铁0.05g，硫酸镁0.625g，磷酸二氢钾2g；
49.2)用1mol/l的氢氧化钠溶液调整溶液ph至7，将培养基分装到500ml三角瓶中，每瓶装液量为200ml，然后于121℃、105kpa下灭菌20min。
50.3)将保存的长枝木霉菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化培养5-7d，该菌的菌饼；
51.4)在装有培养基的三角瓶中接种直径为6mm的菌饼3块；
52.5)将接种好的培养基于28℃，200rpm/min条件下振荡培养5天，观察产孢量。
53.实施例4
54.一种促进长枝木霉产分生孢子的液体发酵方法，包括以下步骤：
55.步骤1-5同实施例3。
56.(6)将种子培养液按1％的接种量接种到装有液体培养基的发酵罐中，在温度为30℃、通气量为0.8l/l的条件下发酵48h，记录产孢量。
57.实施例5
58.一种促进长枝木霉产分生孢子的液体发酵方法，包括以下步骤：
59.步骤1-5同实施例3。
60.(6)将种子培养液按1％的接种量接种到装有液体培养基的发酵罐中，在温度为28℃、通气量为1.0l/l的条件下发酵48h，记录产孢量。
61.对比例1
62.配制马铃薯葡萄糖液体培养基，500ml三角瓶中每瓶装液量为100ml，按照实施例1的方法接种木霉菌饼，于28℃，200rpm/min条件下振荡培养5天，观察产孢量。
63.实验结果，实施例1-3中分生孢子产孢量均在1
×
108cfu/ml以上，对比例1的产孢量为1
×
105cfu/ml以下，而且菌丝生长旺盛。实施例4中木霉分生孢子的产孢量为1.45
×
109cfu/ml，实施例5中木霉分生孢子的产孢量为1.2
×
109cfu/ml。
64.本发明提出的木霉液体发酵的方法，分生孢子产孢量明显增多，在扩大再生产中产孢量可达1
×
109cfu/ml以上。
65.从而可以得出，本发明提出的液体发酵方法在2天内即可获得大量的分生孢子，培养基配方成本低廉，培养液中杂质较少，不易堵塞喷头，便于后续剂型加工。
66.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。