一种便携式阵列核酸扩增子信号检测装置的制作方法

1.本发明属于分子诊断装置技术领域，具体涉及一种便携式阵列核酸扩增子信 号检测装置。


背景技术：

2.核酸是一切生命的遗传物质，其因在物种或个体间存在显著差异，不仅可通 过分析待测核酸之间的差异，对与内源基因相关的疾病进行确诊，还可通过检测 特定目标基因实现外源生物筛查和鉴定的目的。基于此，核酸检测已在医学诊断、 法医检验、环境分析和食品检验等领域得到了应用。
3.聚合酶链式反应(pcr)是一种用于扩增特定核酸片段的核酸扩增技术，因 具有高特异性和高灵敏的优点，被应用于分子生物学、分子诊断等众多领域，同 时其也是新冠患者早期筛查最有效的手段之一。除此之外，为了减少单一核酸扩 增的应用限制，目前也发展出了多种等温扩增技术，包括环介导等温扩增 (lamp)、重组酶聚合酶扩增(rpa)等。这些技术在应用中主要是以荧光作 为核酸扩增子(目标扩增产物)的输出信号，如荧光定量pcr中的taqman探 针、rpa中的exo和fpg探针。很显然，这些技术的信号输出方式都额外需要荧 光检测部件和荧光标记探针，无疑会增加核酸检测的仪器购置和试剂使用成本， 也在一定程度上也提高了检测场所和环境的要求，不利于对核酸进行即时检测， 更难以用于基层和资源相对贫乏地区的核酸检测。因此，发展新型的高效率、廉 价、准确的扩增子检测方法和装置将是促进核酸检测技术应用和推广的关键。
4.对于核酸进行即时检测的前期研究工作表明，光敏显色技术(psa)在液相 中可以对体系中的双链dna(dsdna)进行比色定量(chemical communications., 2015,51,14465)，而对单链dna(ssdna)无明显干扰。基于此，该技术已成 功应用于检测多种核酸扩增的扩增子(ccs chemistry 2020,2,2394-2404； analytical chemistry 2020,92,9,6456
–
6461；analytical chemistry 2021,93, 6559-6566)。这种无标记psa的出现在一定程度上可以避免核酸信号输出的环 境限制因素的影响，同时也可降低试剂成本和对仪器设备的依赖。然而，液相 psa仍然存在操作步骤较多、单批次检测通量相对较低的不足。因此，简化psa 的操作、提高单批次分析核酸扩增子的通量和效率，将有望促进核酸诊断技术在 基层和资源相对贫乏地区的大规模推广和应用。


技术实现要素：

5.本发明目的是针对现有核酸扩增信号检测技术难以兼顾高效性、高通量和便 携性的特点，并限制了核酸扩增技术在基层和资源贫乏地区应用和推广的问题， 提供一种高效性、高通量和便携性的阵列核酸扩增子信号检测装置。
6.本发明提供一种便携式阵列核酸扩增子信号检测装置，其特征在于该装置包 括阵列载样板、光敏显色纸基、阵列聚光孔板、阵列透镜、阵列led、壳体、 蓄电池、变压器和电源开关，阵列载样板水平位于壳体中部，可通过壳体中部一 侧的偏平矩形孔拉出推进，光
敏显色纸基位于阵列载样板上，阵列聚光孔板、阵 列透镜、阵列led依次固定位于阵列载样板上方的壳体内，蓄电池、变压器则 固定位于阵列载样板下方的壳体内，电源开关固定位于变压器同侧壳体外侧，其 一端与阵列led相连，另一端依次与变压器、蓄电池相连。
7.以上装置中还包括一块位于阵列载样板下方的托板，该托板四周为凸起的边 框，阵列载样板匹配位于边框内，边框一侧中部还设置有一凸起的拉手，以便使 放置其上的阵列载样板能从壳体偏平矩形孔中拉出推进。
8.以上装置中所述的阵列载样板上阵列分布有圆形凹槽，光敏显色纸基位于每 一个圆形凹槽内。阵列载样板的材质可选用聚丙烯类、聚乙烯、聚苯乙烯等聚合 物材料，但不限于上述范围，且其圆形凹槽大小及阵列排布区域可根据应用需求 进行设计。该光敏显色纸基是通过预先将液体光敏显色试剂负载于纸基上，再利 用冷冻干燥的方式制成。纸基的材质可选用玻璃纤维素纸基、硝酸纤维素纸基、 醋酸纤维素纸基等，但不限于这些范围。
9.以上装置中所述的阵列聚光孔板上阵列分布有圆形通孔，每个圆形通孔与阵 列载样板上阵列分布的圆形凹槽一一垂直对应，且每个圆形通孔上半部内壁上有 一环形台阶，阵列透镜中的各个透镜均位于该环形台阶上，并与台阶以上的内壁 形成紧配合。阵列透镜可选择平凸透镜或凹透镜等。
10.以上装置中所述的阵列led中每个led光源均垂直对应位于阵列透镜中的 各个透镜的上方，并固定在一块与电源开关相连的铝基板上，再通过铝基板上铺 设的导电通路依次与变压器、蓄电池相连，而铝基板又通过壳体内壁上设置的台 阶支撑，使之其上的led光源能悬置于透镜上方。
11.以上装置中所述的壳体由下壳体、中壳体和上盖板三部分构成，下壳体为一 截面呈凹形的矩形盒，其正面一侧壳体壁低于其余三面的壳体壁，以与中壳体同 侧壳壁的下端面结合形成偏平矩形孔，且沿该侧壳体壁高度水平于相邻两侧壳体 壁内侧还平行延伸设置有两支撑台阶，以支撑阵列载样板下方的托板在其上端面 拉出推进；中壳体为一与下壳体大小匹配的矩形框体，其下端缘均向内延伸形成 一矩形台阶，以支撑安放阵列聚光孔板，且框体后侧延伸形成一扁长形框，以使 与电源开关相连的导线能穿过其中与位于阵列聚光孔板上方的导电板相连；上盖 板为一与中壳体大小匹配的矩形平板。
12.为了读取经以上装置获得的光敏显色信息，可以配备拍照器材和信号读取设 备，如拍照器材优选携带方便、拍照快捷的智能手机；信号读取设备为安装有能 读取照片信息软件的智能手机或小型计算机。
13.以上装置中光敏显色纸基所用的液体光敏显色剂为由核酸染料、3,3',5,5'-四 甲基联苯胺(tmb)、海藻糖、柠檬酸钠和氯化镁配制的溶液，具体来说，就 是将核酸染料、tmb、海藻糖、柠檬酸钠、氯化镁直接在室温搅拌溶解即可。 核酸染料可选用来自赛默飞世尔科技公司生产的sybr green i、sybr green ii、 toto-1或toto-3等。
14.使用时，首先将待测的核酸扩增子溶液转移至位于阵列载样板凹槽内的光敏 显色纸基上，然后放在已拉出并位于壳体中部的托板上再推进；其次开启电源开 关，蓄电池的电通过变压器变压传输至固定于电路板上的阵列led光源，led 光源的光照通过位于阵列聚光孔板以及其内的阵列透镜照射在承载有核酸扩增 子溶液的光敏显色纸基上，直接光照至少2min，使无色tmb氧化至蓝色；完 成光照后，利用托板外侧凸起的拉手将阵列载样板拉出，用智能手机对其拍照， 并将照片传至手机软件或电脑软件对照片样品区域的三原
色(rgb)信号值进行 快速读取，最终以获取的蓝色信号和红色信号的比值作为核酸扩增子输出信号。
15.本发明与现有技术相比，具有以下积极效果：
16.1、由于本发明提供的检测装置不仅采用了固相的光敏显色技术(psa)， 且设计了阵列型的检测结构，因而操作步骤简单、单批次检测通量大，大大提高 了单批次分析核酸扩增子的通量和效率，将有望促进核酸诊断技术在基层和资源 相对贫乏地区的大规模推广和应用。
17.2、由于本发明提供的检测装置不仅将液体psa转换成纸基psa，且还设计 了阵列载样板，因而为实现了核酸扩增子信号的高通量和高效输出奠定了检测基 础，解决了现有技术存在的检测通量小，效率低的问题。
18.3、由于本发明提供的检测装置还设计了与阵列载样板匹配的阵列led作为 照射psa的光源，并同时利用阵列聚光孔板中抛光的通孔和位于其中的透镜对 光线方向的调节作用，因而能够获得光通量相对一致、光照度均匀的阵列光敏显 色光源，以更能提高检测的高效和准确性。
19.4、由于本发明提供的检测装置可通过拍照和软件处理，快速获得和处理核 酸扩增子定量转化的光敏显色信号，因而可快速实现核酸扩增子信号的高效、高 通量检测。
20.5、由于本发明提供的检测装置不仅体积小，轻巧便携、廉价，且负载的光 敏显色纸基也易于携带、储存，因而整个检测装置完全能够满足基层和资源相对 贫乏地区环境条件和核酸筛查需求，便于推广应用。
附图说明
21.图1为本发明提供的检测装置的剖面结构示意图；
22.图2为图1的俯视结构示意图；
23.图3为图1a的局部结构放大示意图；
24.图4为本发明提供的检测装置的上壳体的结构示意图；
25.图5为本发明提供的检测装置的中壳体的结构示意图；
26.图6为本发明提供的检测装置的工作原理方框示意图。
27.图中：1-阵列载样板；2-圆形凹槽；3-光敏显色纸基；4-托板；5-拉手；6
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阵列聚光孔板；7-圆形通孔；8-环形台阶；9-阵列透镜；10-阵列led；11-铝基 板；12-壳体；13-下壳体；14-扁平矩形孔；15-支撑台阶；16-中壳体；17-矩形台 阶；18-扁长形框；19-上盖板；20-蓄电池；21-变压器；22-电源开关。
具体实施方式
28.下面通过实施例对本发明进行清楚完整的描述。有必要在此指出的是，以下 实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制， 该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调 整，这些非本质的改进和调整仍应属于本发明的保护范围。
29.实施例1
30.如图1、2所示，本实施例给出的便携式阵列核酸扩增子信号检测装置包括 阵列载
样板1、光敏显色纸基3、托板4、阵列聚光孔板6、阵列透镜9、阵列 led10、壳体12、蓄电池20、变压器21和电源开关22。
31.阵列载样板1为一平板，其上阵列分布有圆形凹槽2，本实施例阵列分布的 圆形凹槽2为12
×
8＝96个，但本发明不限于此。使用时在位于该圆形凹槽2内 的光敏显色纸基3上放置了核酸扩增子后可水平置于壳体12中部的托板4上， 并可通过托板4在壳体12中部一侧的偏平矩形孔14中拉出推进。
32.光敏显色纸基3是使用前预制的，具体制备方法如下：
33.(1)先将柠檬酸钠500mm，核酸染料4
×
，tmb 2mm，氯化镁1mm，海 藻糖2mm，ph为4.0，本实施例核酸染料选用的sybr green i；
34.(2)先用打孔器将玻璃纤维素纸制成直径为6mm的圆形纸基，然后将20 μl光敏显色液滴在每一片纸基上进行冷冻干燥，即可制成光敏显色纸基。
35.制备好的光敏显色纸基3使用时，一片一片的放置于阵列载样板1的圆形凹 槽2内，如图3所示。
36.托板4位于阵列载样板1下方，该托板4四周为凸起的边框，阵列载样板1 匹配位于边框内，边框一侧中部还设置有一凸起的拉手5，以便使放置其上的阵 列载样板1能从壳体12一侧的偏平矩形孔14中拉出推进。
37.阵列聚光孔板6外形为一矩形的立方体块，其上开有与阵列载样板1上圆形 凹槽2位置一一垂直对应的阵列圆形通孔7，且每个圆形通孔7上半部内壁上有 一环形台阶8，阵列透镜9中的各个透镜均位于该环形台阶8上，并与台阶以上 的内壁形成紧配合，如图3所示。阵列聚光孔板6上分布的圆形通孔7其内表面 是进行了抛光加工，其作用是阻断单个led光源之间的交叉影响，并通过内表 面反射达到聚光作用，以确保阵列载样板中的不同样品获得一致的光通量。阵列 透镜9为平凸透镜或凹透镜等。
38.阵列led10中每个led光源均垂直对应位于阵列透镜9中的各个透镜的上 方，并按阵列固定在一块与电源开关22相连的铝基板11上，再通过铝基板11 上铺设的导电通路依次与变压器21、蓄电池20相连，而铝基板11又通过壳体 12内壁上设置的矩形台阶15支撑，使之其上的led光源10能对应悬置于透镜 上方。led光源为发光二极管，其波长范围420-495nm。
39.壳体12由下壳体13、中壳体16和上盖板19三部分构成，下壳体13为一 截面呈凹形的矩形盒，其正面一侧壳体壁低于其余三面的壳体壁，以与中壳体 16同侧壳壁的下端面结合形成扁平矩形孔14，且沿该侧壳体壁高度水平于相邻 两侧壳体壁内侧还平行延伸设置有两支撑台阶15，以支撑阵列载样板1下方的 托板4在其上端面拉出推进，如图4所示。中壳体16为一与下壳体13大小匹配 的矩形框架，其下端缘均向内延伸形成一矩形台阶17，以支撑安放阵列聚光孔 板6，且框体后侧延伸形成一扁长形框18，以使与电源开关22相连的导线能穿 过其中与位于阵列聚光孔板6上方的铝基板导电通路相连，如图5所示。上盖板 19为一与中壳体16大小匹配的矩形平板。下壳体13、中壳体16和上盖板19 可通过边框用连接件连为一体。
40.蓄电池20本实施例市购的是迈阔者、12v、4800ma的蓄电池；变压器21 本实施例市购的是佰锐科技、dm02-28033024ds的变压器，该变压器可将蓄电 池电压由12v转换为3v，以匹配阵列led适应电压。值得说明的是，本发明 设计的电路和所需组件及尺寸可根据阵
列led的参数和检测环境提供的电源， 如家用电源、车载电源或自带蓄电池电源进行相应的更改和优化，不局限于于此。
41.为了验证本发明装置的技术效果，本实施例利用pcr扩增试剂盒(宝生物： r090s)，以商品化的沙门氏菌基因组的inva基因为目标核酸，其中正向引物 序列为：gtagcgccgccaaacctaa，反向引物序列为： cgagatcgccaatcagtcct，模板基因数量为1000拷贝数，对pcr扩增35 个循环，获得目标核酸扩增子。
42.检测时，其检测原理如图6所示，首先将获得的目标核酸扩增子溶液18μl 转移至位于阵列载样板凹槽2内的光敏显色纸基3上，然后放在已拉出并位于壳 体12中部的托板4上再推进；其次开启电源开关22，蓄电池20的电通过变压 器21变压传输至固定于铝基板11上的阵列led光源10，led光源10放射出 的光通过位于阵列聚光孔板6以及其内的阵列透镜9照射在承载有核酸扩增子溶 液的光敏显色纸基3上2分钟，使无色tmb氧化至蓝色；完成光照后，利用托 板4外侧凸起的拉手5将阵列载样板1拉出，用智能手机对其拍照，并将照片传 至手机软件或电脑软件对照片样品区域的三原色(rgb)信号值进行快速读取， 最终以获取的蓝色信号和红色信号的比值作为核酸扩增子输出信号。
43.实施例2-5
44.本组实施例均采用实施例1所给出的装置、检测方法和商品化的沙门氏菌基 因组的inva基因为目标核酸进行检测，不同的是所用的核酸染料的种类不同， 具体的检测结果见表1。
45.对比例1-4
46.本组对比例也采用实施例1所给出的装置、检测方法，所不同的是：在检测 时不加目标核酸；所用的核酸染料的种类与实施例2-5对应，具体的检测结果见 表1。
47.表1
[0048][0049]
实施例6-8
[0050]
本组实施例也采用实施例1所给出的装置、检测方法，不同的是：
[0051]
实施例6是采用pcr扩增试剂盒(宝生物：r090s)来对沙门氏菌基因组 的inva基因
进行扩增，扩增也是35个循环，获得pcr的目标核酸扩增子；
[0052]
实施例7却是采用lamp扩增试剂盒(neb：e1700s)来对沙门氏菌基因 组的inva基因为目标核酸进行扩增，lamp扩增试剂盒中fip序列为：gac gac tgg tac tga tcg ata gtt ttt caa cgt ttc ctg cgg，bip序列为：ccg gtg aaa tta tcg cca cac aaa acc cac cgc cag g，f3序列为：ggc gat att ggt gtt tat ggg g，b3序列为：aac gat aaa ctg gac cac gg，loop-f序列为：gac gaa aga gcg tgg taa tta ac，loop-b序列为：ggg caa ttc gtt att ggc gat ag，模板基因数量为5000拷贝数，扩增时 间为30分钟，获得lamp的目标核酸扩增子；
[0053]
实施例8则是采用的rpa扩增试剂盒(twistdx：tabas03kit)来对沙门 氏菌基因组的inva基因为目标核酸进行扩增，rpa扩增试剂盒中正向引物序列： aag caa aac gta gcg ccg cca aac cta a，反向引物序列：cac tcgcat caa atc aaa ata gac cgt a，模板基因数量为5000拷贝数，扩增时间 为15分钟，获得rpa的目标核酸扩增子。
[0054]
检测结果见表2。
[0055]
对比例5-7
[0056]
本组对比例也采用实施例1所给出的装置、检测方法，所不同的是：在检测 时不加目标核酸；所用的核酸染料的种类与实施例6-8对应，具体的检测结果见 表2。
[0057]
表2
[0058]