使用核酸酶靶向的idlv的精确整合
技术领域：
：1.本发明涉及基因组工程和dna修复领域。2.特别地，本发明涉及能够在细胞基因组中进行精确且无毒的序列整合的idlv，其具有通过高效敲入(ki)实现的高效率。
背景技术：
：：3.对抗由功能缺失突变引起的有害细胞表型的主要治疗方法之一依赖于野生型基因拷贝的细胞内递送。对此，病毒介导的基因替代疗法作为一个快速发展的领域，已经提供了一些受限于对转基因拷贝数和表达水平的不完全控制的解决方案；此外，慢病毒和逆转录病毒载体的半随机整合可导致原癌基因的插入诱变和活化，而腺相关载体(aav)和腺病毒载体将dna作为附加体递送，其在循环细胞中被稀释。4.近年来，已经开发出一种使用具有位点特异性核酸酶的基因组dna切割来使转基因整合入选定基因座。一种途径涉及将转基因整合到其同源基因座中，例如将野生型转基因插入到内源基因座上以纠正突变基因。或者，可以将转基因插入专门选择的具有益特性(诸如永久、安全和非常高效的转基因表达)的非同源基因座。5.尽管令人感兴趣，但实现转基因的高效且无毒的递送以及高效的特异性位点整合仍然是待解决的复杂问题。6.使用工程化核酸酶的靶向基因组编辑正在革命性地改变基础生物医学研究，并为基因治疗带来巨大的潜力。但是，尽管进展迅速，但由于缺乏有效的工具，所追求的用于临床目的的靶向转基因整合(敲入，ki)的目标仍未实现。虽然已经成功描述了分裂和非分裂细胞中的ki，但是转基因递送的主要手段是质粒dna，其在原代细胞(尤其是造血干细胞，hsc)中是有毒的，因此不能靶向特定细胞，且对于体内递送也是不可行的。7.病毒载体dna递送代表质粒dna的目标替代物，特别是aav和整合缺陷型慢病毒载体(idlv)。慢病毒是 单链rna(～9.7kb)，并且一旦进入细胞核，就被逆转录以生成双链dna，其被半随机地整合到宿主细胞基因组中。idlv通过灭活整合酶蛋白而衍生自慢病毒，从而阻断它们整合到基因组中的能力。idlv基因组在缺失前以不同的分子形式持续存在于细胞核中。遗憾的是，idlv代表同源(hdr)和非同源末端连接(nhej)的低效dna底物。8.aav是单链dna病毒(～4.7kb)，并且一旦进入靶细胞的细胞核，就变成双链且成环形以作为附加体持续存在。aav是hdr介导的ki的良好底物；但是，hdr受其在大多数原代细胞中的低效率的限制，并且主要发生在细胞周期的s/g2期，使得其在非分裂细胞中是低效的。此外，对于hdr，需要用与基因组dna切割位点同源的基因组片段侧接转基因(每个～800bp)，这限制了可以通过aav递送的转基因的大小(约4.7kb的装载容量)，并且可以影响aav生产和转导(例如在二级结构的情况下)。因此，大约6％的所有人蛋白(其具有超过4kb的编码序列)与aav和表达元件(诸如启动子和聚腺苷酸化信号(polya信号))不适配，需要减小尺寸，通常限制了它们的转录强度和组织特异性(chamberlain,riyadandweber,hum.genether.methods.2016feb；27(1):1-12)。最近，不依赖同源性的ki策略被描述为在大脑和肌肉中体内进行aav的基于nhej的ki；但是，报道的效率非常低，在大多数情况下小于5％，并且整合的dna片段的大小非常小，小于700bp(suzukietal.,nature.2016dec1；540(7631):144-149)。9.对于hsc中的ki，已经采用含有同源臂的idlv和aav用于hdr介导的ki。对于idlv，仅报道了极低的离体效率和极低小鼠移植后的最小值(《1％kuoetal.cellrep.2018may29；23(9):2606-2616；～5％genoveseetal.nature.2014jun12；510(7504):235-240；almostundetectable,schirolietal.,scitranslmed.2017oct11；9(411)；《1％hoban,blood,2015,apr23；125(17):2597-604)。aav6更有希望，且最新报道显示其体外ki效率可达30-40％；但是，aav对干细胞也有毒性，因为它们诱导p53活化和细胞凋亡(hirsch,plosone,2011；6(11):e27520)。aav6转导显示一些细胞毒性(kuoetal.cellrep.2018may29；23(9):2606-2616)和减少经修饰的造血干细胞的移植(schirolietal.,cellstemcell,2019apr4；24(4):551-565)。此外，hdr介导的ki主要发生在祖细胞中，以真正的长期hsc为代价，其靶向少～5倍(gomez-ospinaetal.,humangenome-editedhematopoieticstemcellsphenotypicallycorrectmucopolysaccharidosistypei；bioarchive；doi:https://doi.org/10.1101/408757)。最后，如上所述，aav递送受到其包装限制的影响。10.因此，需要有一种在细胞中有效、位点特异性且无毒的转基因递送方法。确实需要新的工具以允许精确、高效且无毒地向细胞递送目标序列。特别地，所述方法和工具允许递送具有显著可变大小的目标序列，特别是允许递送具有至少1kb(千碱基)，特别是几kb大小的序列。11.本文所述的发明目的是满足上述需要。技术实现要素：12.首先，本发明涉及包含核酸的整合缺陷型慢病毒载体(idlv)，所述核酸在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含：13.a.至少一个核输出信号序列，特别是至少一个hiv-1rev应答元件(rre)，特别是一个rre，14.b.至少一个选自下组的目标核酸序列：polya信号；剪接信号序列；dna或rna结合位点；启动子；和编码治疗性蛋白或者是治疗性核糖核酸的转基因或其片段，15.c.至少一个核酸酶位点，特别是至少一个引导核酸靶向序列(grna-t)，16.d.任选地，至少一个同源臂序列，其包括与细胞基因组中的目标内源基因组位点的一部分同源的序列；和17.e.任选地，至少一个允许增强至少一个目标核酸序列的稳定表达的序列，特别是至少一个土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)序列。18.事实上，本发明人设法产生能够在细胞基因组中进行精确且无毒的序列整合的新型idlv，其通过有效的ki实现高效率，即使整合的序列具有相当长的长度(～9kb)。19.本发明特别涉及包含核酸的整合缺陷型慢病毒载体(idlv)，所述核酸在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含：20.a.至少一个核输出信号序列，特别是至少一个hiv-1rev应答元件(rre)，特别是一个rre，21.b.至少一个选自下组的目标核酸序列：polya信号；剪接信号序列；dna或rna结合位点；启动子；和编码治疗性蛋白或者是治疗性核糖核酸的转基因或其片段，22.c.至少一个核酸酶位点，特别是至少一个引导核酸靶向序列(grna-t)，23.d.至少一个同源臂序列，其包括与细胞基因组中的目标内源基因组位点的一部分同源的序列；和24.e.任选地，至少一个允许增强至少一个目标核酸序列的稳定表达的序列，特别是至少一个土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)序列。25.事实上，在具体实施方案中，根据本发明的idlv包含：26.d.至少一个同源臂序列，其包括与细胞基因组中的目标内源基因组位点的一部分同源的序列。27.根据具体实施方案，idlv是圆形或线性的，特别是圆形的。28.根据本发明的实施方案，idlv包含至少两个相同或不同的核酸酶位点，特别是至少两个相同或不同的grna-t序列，特别是两个相同或不同的grna-t序列。特别地，至少一个目标核酸序列包含在所述idlv的至少两个，特别是两个核酸酶位点之间。29.根据本发明的实施方案，本发明的idlv的至少一个核酸酶位点与包含在d点的细胞基因组中的目标内源基因组位点中的内源核酸酶位点相同或不同。30.在具体实施方案中，本发明的idlv的至少一个目标核酸序列是编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因或其片段。31.特别地，治疗性蛋白可以选自下组：细胞因子，特别是干扰素，更特别是干扰素-α、干扰素-β或干扰素-pi；激素；趋化因子；抗体(包括纳米抗体)；抗血管生成因子；用于替代治疗的酶，例如腺苷脱氨酶、α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-l-尿素酶和β-葡糖苷酶；白细胞介素；胰岛素；g-csf；gm-csf；hpg-csf；m-csf；凝血因子，诸如因子viii、因子ix、tpa、因子v、因子vii、因子x、因子xi、因子xii或因子xiii；跨膜蛋白，诸如神经生长因子受体(ngfr)；溶酶体酶，诸如α-半乳糖苷酶(gla)、α-l-艾杜糖苷酶(idua)、溶酶体酸性脂肪酶(lal)和半乳糖胺(n-乙酰)-6-硫酸酯酶(galns)；β样珠蛋白；白介素受体，诸如il-2受体、il-3受体、il-4受体、il-5受体、il-6受体、il-7受体、il-9受体、il-11受体、il-12受体、il-13受体、il-15受体、il-21受体、il-23受体和il-27受体；wiskott-aldrich综合症蛋白(wasp)；腺苷脱氨酶、三肽基肽酶1、α-l-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、n-磺基葡糖胺磺基水解酶、半乳糖胺-6-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶a、细胞色素b-245α链、细胞色素b-245β链、嗜中性粒细胞胞质因子1、嗜中性粒细胞胞质因子2和嗜中性粒细胞胞质因子4；可以被工程化为分泌的并最终被非修饰细胞摄取的任何蛋白质，及其组合。32.在本发明的实施方案中，所述idlv包含至少两个同源臂序列，特别是两个，每个都彼此不同，并且包括与细胞基因组中的目标内源基因组位点的至少两个，特别是两个不同部分同源的序列。33.在具体实施方案中，本发明的idlv不包含启动子。34.在本发明的实施方案中，细胞基因组中目标内源基因组位点包含在珠蛋白基因中，特别选自下组：ε珠蛋白基因、γg珠蛋白基因、γa珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、β珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、假δ珠蛋白基因、μ珠蛋白基因、假α1珠蛋白基因、α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因，特别是选自下组：γg珠蛋白基因、γa珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、β珠蛋白基因、α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因，更特别选自下组：α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因。35.在另一个实施方案中，本发明的idlv的序列a-c，以及d和e(如果存在)以下列顺序之一存在于idlv中，从5'到3'：[0036]-a，c，d，b；[0037]-a，c，d，b，e；[0038]-a，c，d，b，d，c；[0039]-a，c，d，b，d，c，e；[0040]-a，d，c，d，b；[0041]-a，d，c，d，b，e；[0042]-a，c，b，d，c，e；或[0043]-a，c，d，b，c，e。[0044]本发明的另一目的涉及包含至少一种本发明的idlv的分离细胞。[0045]特别地，所述细胞选自下组：造血干细胞；免疫系统细胞，特别是淋巴细胞；多能干细胞；胚胎干细胞；卫星细胞；神经干细胞；间充质干细胞；视网膜干细胞；和上皮干细胞，并且特别是造血干细胞。[0046]本发明的另一目的涉及包含至少一种本发明的idlv和/或至少一种本发明的分离细胞以及药学上可接受的介质的药物组合物。[0047]本发明的另一目的涉及本发明的idlv，本发明的分离细胞或本发明的药物组合物，其用于治疗：[0048]-选自下组的疾病：免疫性疾病、病毒性感染、肿瘤或血液病；和/或[0049]-在有需要的个体中因缺乏蛋白质或存在异常的非功能性蛋白质而引起的疾病。[0050]本发明的另一目的涉及用于产生car-t细胞的方法，其包括将至少一种本发明的idlv整合到淋巴细胞t细胞或造血干细胞中，[0051]所述idlv包含编码靶向癌细胞的嵌合抗原受体的转基因作为至少一个目标核酸序列。[0052]本发明的另一目的涉及用于产生表达抗体的b细胞的方法，其包括将至少一种本发明的idlv整合到淋巴细胞b细胞或造血干细胞中，[0053]所述idlv包含编码抗体的转基因作为至少一个目标核酸序列。附图说明[0054]图1a：根据本发明的idlv的示意图，其在长末端重复序列(ltr)序列之间从左到右包含rev应答元件(rre)、grna切割位点(grna-t)(grna)(核酸酶位点)、与将整合入idlv的细胞基因组中的目标内源基因组位点的一部分同源的35bp的微同源序列(mh5')(同源臂)、编码无启动子(δ)绿色荧光蛋白(gfp)的序列和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。该盒相对于ltr和rre病毒序列是有义方向。[0055]图1b：cas9切割后的细胞基因组中idlv整合的一种可能结果的示意图。内源性α-珠蛋白启动子(hs1-4)驱动gfp的表达，其被插入到α-珠蛋白启动子和α基因(hba)之间。[0056]图1c：表中显示了门控细胞的gfp 细胞的％和gfpmfi(中值荧光强度)值，其通过使用在点(a)中描述的idlv和不同的grna(hba15.1或hba16.1)将gfp整合到hba基因中之后，通过流式细胞仪分析k562-cas9细胞(稳定表达cas9的人白血病细胞系k562)中的gfp表达来测量。还测量了实施grna的两种方法的indel效率。显示了用“无grna”作为对照获得的结果。[0057]图2a：用于分析k562-cas9细胞克隆中的idlv基因组整合的pcr示意图。双箭头表示用于扩增的引物。[0058]图2b：所分析的163个克隆的dna和facs的分析汇总表。为了确定整合是否是无缝的，发明人对pcr2的每个pcr产物进行了sanger测序。[0059]图3：用图1a所示的本发明的idlv转导k562细胞，并且在表中所示的时间量(4小时、8小时、24小时、32小时或48小时)后，使用不同的grna(hba15.1或hba16.1)用rnp(预组装的cas9/grna复合物)转染该细胞。[0060]在idlv转导2周后，在idlv和rnp递送之间间隔4小时、8小时、24小时、32小时和48小时后进行gfp表达的流式细胞术分析。没有引入rnp的情况作为对照。[0061]表中显示了门控细胞的gfp 细胞的％和gfpmfi(中值荧光强度)值。还测量了实施hba15.1grna或hba16.1grna的两种方法的indel效率。还显示了对照组获得的结果。[0062]图4a：根据本发明的idlv的示意图，其在长末端重复序列(ltr)序列之间从左到右包含rev应答元件(rre)、grna切割位点(grna-t)(grna)(核酸酶位点)、与将整合入idlv的细胞基因组中的目标内源基因组位点的一部分同源的35bp的微同源序列(mh5')(同源臂)、编码无启动子(δ)密码子的优化因子viii(fviii)(cof8)序列和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。该盒相对于ltr和rre病毒序列是有义方向。[0063]图4b：用于分析k562-cas9细胞克隆中的idlv基因组整合的pcr示意图。双箭头表示用于扩增的引物。[0064]该图还显示了cas9切割后的k562-cas9细胞基因组中idlv整合的一种可能结果的示意图。内源性α-珠蛋白启动子(hs1-4)驱动gfp的表达，其被插入到α-珠蛋白启动子和α基因(hba)之间。[0065]图4c：所分析的27个克隆的dna和elisa分析的汇总表。为了确定整合是否是无缝的，发明人对来自pcr2的每个pcr产物进行了sanger测序。[0066]图4d：对于存在于具有fviii盒的靶向整合的批量和单个k562-cas9克隆的上清液中的fviii，进行双份elisa后获得的结果(测试1和2)。[0067]自上而下：克隆12、克隆24、克隆26、克隆27、ut(未处理细胞)、cellbulk(gp34bulk)、nnf(未转染细胞-gp34nnf)。[0068]图5a：根据本发明的idlv的示意图，其在长末端重复序列(ltr)序列之间，从左到右包含grna切割位点(grna-t)(grna)(核酸酶位点)、与将整合入idlv的细胞基因组中目标内源基因组位点的一部分同源的35bp的微同源序列(mh5')(同源臂)、编码无启动子(δ)绿色荧光蛋白(gfp)的序列、聚腺苷酸化信号a(polya信号或pa)、驱动嘌呤霉素抗性基因(puro)的组成型表达的人磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子和rev应答元件(rre)。该盒相对于ltr和rre病毒序列是反义方向。[0069]在该示意图的正下方是另一个与对照盒相对应的示意图。该盒与上文所述的盒不同之处在于其不包含所述切割位点(grna-t)(grna)(核酸酶位点)和所述35bp的mh5'同源臂序列。[0070]图5b：表中显示了门控细胞的gfp 细胞的％和gfpmfi(中值荧光强度)值，其通过使用在点(a)中描述的idlv和hba15.1grna将gfp整合到k562-cas9细胞的hba基因中之后，通过流式细胞仪分析k562-cas9细胞中的gfp表达来测量。还测量了indel的效率。还显示了用“无grna-t序列”作为对照获得的结果。[0071]图6a：表中显示了门控细胞的gfp 细胞的％和gfpmfi(中值荧光强度)值，其通过使用图1a中所述的idlv和不同的grna(hba15.1或hba16.1)将gfp整合到细胞的hba基因中之后，通过流式细胞仪分析红细胞分化初级hspc中的gfp表达测得来测量。还测量了indel的效率。[0072]图6b：经编辑细胞的菌落形成单位(cfu)测定。柱状图代表具有标准偏差的两个板的平均计数。[0073]纵坐标：计数[0074]横坐标：从左到右：来自图6a的含有hba15.1(gp33hba15)的细胞；来自图6a的不含任何grna(gp33)的细胞；来自图6a的含有hba16.1(gp33hba16)的细胞，未处理的细胞(ut)。[0075]在每列中，从底部到顶部：cfu-gemm(粒细胞/巨噬细胞形成单位；bfu-e(红细胞系爆裂形成单位)和cfu-gm(粒细胞/红细胞/单核细胞/巨核细胞形成单位)。[0076]图6c：13cfu的dna分析汇总表。为了确定整合是否是无缝的，发明人对来自pcr2的每个pcr产物进行sanger测序(如图2b所示)。[0077]图7a：[0078]第一行：根据本发明的idlv(gp57)的示意图，其在长末端重复序列(ltr)序列之间从左到右包含rev应答元件(rre)、grna切割位点(grna-t)(grna)(核酸酶位点＝seqidno.67＝gtcccctccaccccacagtg)、与将整合入idlv的细胞基因组中目标内源基因组位点的一部分同源的35bp的微同源序列(mh5')(同源臂)、人磷酸甘油酸激酶启动子(pgk)、绿色荧光蛋白(gfp)和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。该盒相对于ltr和rre病毒序列是有义方向。[0079]第二行：根据本发明的idlv(gp58)的示意图，其与第一行所示的idlv的区别仅在于其不包含35bp的mh5'同源臂序列。[0080]第三行：对照组idlv(ma277)的示意图，其与第一行所示的idlv的区别仅在于其不包含35bp的mh5'同源臂序列或grna切割位点。[0081]图7b：表中显示了门控细胞的gfp 细胞的％和gfpmfi(中值荧光强度)值，其通过使用在点(a)中描述的idlv构建体和使用aavs1grna的rnp，将gfp整合到aavs1基因座之后，通过流式细胞仪分析k562细胞中的gfp表达来测量。还测量了indel的效率和载体拷贝数(vcn)。还显示了用“无-grna-t序列”对照获得的结果。[0082]图8a：用于分析实施例7中实验后获得的k562细胞克隆中靶向idlv基因组整合的pcr示意图。双箭头表示用于扩增的引物。[0083]图8b：分析365个克隆的dna的分析汇总表。为了确定整合是否是无缝的，本发明人对来自图8a中所述的第一pcr的每个pcr产物进行了sanger测序。[0084]图8c：用于分析实施例7中实验后获得的k562细胞克隆中脱靶idlv基因组整合的pcr示意图。双箭头表示用于扩增的引物。[0085]图8d：365个克隆的一项主要脱靶dna分析的汇总表。具体实施方式[0086]如上所述，本发明人设法产生能够在细胞基因组中进行精确且无毒的序列整合的idlv，其具有通过高效ki实现的高效率。此外，本发明人证明该idlv甚至允许对具有相当长度的序列进行整合。[0087]在本发明的idlv靶向的细胞核中，慢病毒rna基因组被逆转录以生成dsdna。用核酸酶靶向该dsdna将产生更易于与其它dna末端相互作用的游离dna末端。因此，如果在相同的细胞中产生基因组dna切割，本发明人得以实现目标序列ki的增加。[0088]整合缺陷型慢病毒载体[0089]本发明涉及包含核酸的整合缺陷型慢病毒载体(idlv)，所述核酸在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含：[0090]a.至少一个核输出信号序列，特别是至少一个hiv-1rev应答元件(rre)，特别是一个rre，[0091]b.至少一个选自下组的目标核酸序列：polya信号；剪接信号序列；dna或rna结合位点；启动子；和编码治疗性蛋白或者是治疗性核糖核酸的转基因或其片段，[0092]c.至少一个核酸酶位点，特别是至少一个引导核酸靶向序列(grna-t)，和[0093]d.至少一个同源臂序列，其包括与细胞基因组中的目标内源基因组位点的一部分同源的序列。[0094]在本文中，ltr表示本领域技术人员公知的“长末端重复序列”。[0095]在本文中，涉及与另一序列位置相比的序列位置的术语“上游”和“下游”应以5'至3'方向考虑：当从5'读到3'时，上游序列位于另一序列“之前”(因此是下游序列)。[0096]所谓之前，在没有相反说明的情况下，指的是紧邻的之前或者是非紧邻的之前。[0097]除了侧翼有两个长末端重复(ltr)序列的其他辅助基因外，慢病毒还具有gag、pol和env基因。[0098]与其它慢病毒一样，idlv包含重组基因组，所述重组基因组在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含慢病毒衣壳蛋白psi序列、rna核输出信号序列、目标核酸序列(例如转基因)、剪接供体/受体位点和cppt序列(dulletal.(1998)j.vir.72:8463；sirvenetal.(2000)blood,(96)203))。例如，idlv构建体的设计已经描述于shawetal.biomedecines,2014,2,14-35中。[0099]idlv的产生与本领域公知的慢病毒载体相似。本领域技术人员可以参考本领域的一般知识，特别是由mertenetal.(2016)moleculartherapy(3)16017,sharonandkamen(2017)biotechnologyandbioengineering(115)25,mertenetal.(2011)hum.genether22(3)343,schweizerandmerten(2010)cur.genether.10(6)474,ansorgeetetal.(2010).biochem.eng.j.48(3):362所代表。idlv可以例如使用慢病毒载体产生，所述慢病毒载体在自身慢病毒整合酶基因本身或在病毒ltr的整合酶识别序列中包含一个或多个突变，如yanez-munozetal.(2006)natmed12(3):348-353；nightingaleetal.(2006)molther13(6):1121-1132,w02006/010834andwo2009/019612所述。优选地，所述idlv包含防止所述基因组整合到宿主细胞基因组中的突变整合酶。在具体实施方案中，idlv携带在酶的催化结构域中具有突变d64v的缺陷型整合酶。[0100]根据本发明的idlv可以是假型化的，即其包含来自不同于衍生自病毒(该病毒不同于从中衍生出idlv的病毒)的包膜糖蛋白、经修饰的包膜糖蛋白或嵌合的包膜糖蛋白。在具体实施方案中，idlv被vsv-g、galv-tr、rd114或合胞素糖蛋白假型化。[0101]序列a：核输出信号序列[0102]如上所述，本发明的idlv的具体特征在于其在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含至少一个核酸，所述至少一个核酸包含至少一个核输出信号序列。[0103]该至少一个核输出信号序列可以在本发明的idlv中仅存在一次。[0104]更特别地，该核输出信号序列可以在上述序列b到e的上游。[0105]因此，在具体实施方案中，本发明的idlv的具体特征在于其包含含有在上述序列b到e上游的一个核输出信号序列的核酸序列。[0106]根据本发明的核输出信号序列优选是hiv-1rev应答元件(rre)。[0107]rre序列(rev应答元件)是～350个核苷酸的rna序列，特别是已知在rev蛋白结合后允许病毒信使rna从细胞核输出至细胞质溶胶，因此是病毒复制所必需的。但是，也已经证明慢病毒载体中这种元件的存在是高效的载体功能的必要条件(例如，参见ansonandfuller；j.genemed.2003；5:829-838)。[0108]在本发明的具体实施方案中，本发明的idlv的特征在于其包含含有一个rre序列的核酸，所述rre序列位于上文提及的和下文描述的序列b到e的上游。[0109]序列b：目标核酸序列[0110]如上所述，特别地，本发明的idlv的特征在于其在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含至少一个核酸，所述至少一个核酸包含至少一个目标核酸序列。[0111]目标核酸选自下组：polya信号；剪接信号序列；dna或rna结合位点；启动子；和编码治疗性蛋白或者是治疗性核糖核酸的转基因或其片段。[0112]polya信号通常是aauaaa序列，其诱导rna在所述信号下游约10-30个核苷酸处的切割。其后为多重单磷酸腺苷(amp)的序列，即仅具有腺嘌呤碱基的序列。其例如由50-300个单磷酸腺苷，特别是70-250个单磷酸腺苷构成。[0113]剪接信号序列可分为剪接位点本身序列和辅助信号，诸如外显子剪接增强子、内含子剪接增强子和外显子剪接沉默子。所有剪接位点符合共有序列，包括在内含子末端的几乎不变的二核苷酸：内含子的5'末端为gt、3'末端为ag，且通常在5'剪接位点具有序列mag|gtragt并且在3'剪接位点具有cag|g。[0114]dna或rna结合位点涉及例如转录激活物，转录阻遏物或表观遗传修饰物的结合位点以调节内源基因转录。rna结合位点可以例如用于结合蛋白的rna序列，以影响rna稳定性、rna定位、rna核输出/输入；microrna介导的转基因抑制或敲除的microrna结合位点。[0115]根据本发明的转基因编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸。[0116]在本发明的实施方案中，所述治疗性蛋白或治疗性核糖核酸可以是对其中存在idlv的细胞，特别是对其中编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的序列被整合到细胞基因组中目标内源基因组位点中的细胞提供治疗效果的任何蛋白质或核糖核酸。[0117]在本发明的另一实施方案中，所述治疗性蛋白可以是在其中存在idlv的细胞外，特别是在其中编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的序列被整合到细胞基因组中目标内源基因组位点中的细胞外提供治疗效果的任何蛋白质。所述治疗性蛋白确实可以由所述细胞分泌，或者可以部分(例如跨膜蛋白)或完全存在于所述细胞的表面上。[0118]特别地，治疗性蛋白选自下组：细胞因子，特别是干扰素，更特别是干扰素-α、干扰素-β或干扰素-pi；激素；趋化因子；抗体(包括纳米抗体)；抗血管生成因子；用于替代治疗的酶，例如腺苷脱氨酶、α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-l-尿素酶和β-葡糖苷酶；白细胞介素；胰岛素；g-csf；gm-csf；hpg-csf；m-csf；凝血因子，诸如因子viii、因子ix、tpa、因子v、因子vii、因子x、因子xi、因子xii或因子xiii；跨膜蛋白，诸如神经生长因子受体(ngfr)；溶酶体酶，诸如α-半乳糖苷酶(gla)、α-l-艾杜糖苷酶(idua)、溶酶体酸性脂肪酶(lal)和半乳糖胺(n-乙酰)-6-硫酸酯酶(galns)；β样珠蛋白；白介素受体，诸如il-2受体、il-3受体、il-4受体、il-5受体、il-6受体、il-7受体、il-9受体、il-11受体、il-12受体、il-13受体、il-15受体、il-21受体、il-23受体和il-27受体；wiskott-aldrich综合症蛋白(wasp)；腺苷脱氨酶、三肽基肽酶1、α-l-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、n-磺基葡糖胺磺基水解酶、半乳糖胺-6-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶a、细胞色素b-245α链、细胞色素b-245β链、嗜中性粒细胞胞质因子1、嗜中性粒细胞胞质因子2、嗜中性粒细胞胞质因子4；可以被工程化为分泌的并最终被非修饰细胞摄取的任何蛋白质，及其组合。[0119]本发明所述的转基因可以例如编码至少一种β样珠蛋白和/或至少一种β样珠蛋白核糖核酸，特别是编码至少一种功能性β样珠蛋白。根据本发明的β样珠蛋白基因是指选自下组的基因：ε珠蛋白(ε)、γg珠蛋白(gγ)、γa珠蛋白(aγ)、δ珠蛋白(δ)和β珠蛋白(β)基因。特别地，根据本发明的β样珠蛋白基因表示β珠蛋白基因。[0120]根据本发明的转基因可以编码一种以上的治疗性蛋白和/或治疗性核糖核酸。例如，根据本发明的转基因可以编码两种治疗性蛋白，特别是两种不同的治疗性蛋白。所述治疗性蛋白如上文所定义。在另一实施方案中，根据本发明的转基因可以编码两种治疗性核糖核酸，特别是两种不同的治疗性核糖核酸。所述治疗性核糖核酸如上文所述。在另一实施方案中，根据本发明的转基因可以编码一种治疗性蛋白和一种治疗性核糖核酸，所述治疗性蛋白和治疗性核糖核酸特别如上文所定义。[0121]本发明还涉及如上所述的转基因的片段。所述片段可以是目标治疗性蛋白的一部分，其具有与所述治疗性蛋白相同的性质，达到较高，相似或较低的强度/水平。[0122]在具体实施方案中，至少一个目标核酸序列是编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因或其片段。[0123]在具体实施方案中，根据本发明的idlv仅包含目标核酸序列。[0124]在另一实施方案中，根据本发明的idlv在目标核酸序列之前和/或之后紧邻包含至少一个本文所述的同源臂序列(序列d)。[0125]在本发明的具体实施方案中，根据本发明的idlv仅包含一个目标核酸序列和至少一个存在于所述目标核酸序列之前和/或之后紧邻的同源臂序列。[0126]在具体实施方案中，根据本发明的idlv包含两个同源臂序列，一个同源臂序列在至少一个、特别是一个目标核酸序列的上游，另一个同源臂序列在至少一个、特别是一个目标核酸序列的下游。[0127]在另一实施方案中，根据本发明的idlv包含两个同源臂序列，所述两个同源臂序列在至少一个、特别是一个目标核酸序列的上游。[0128]序列c：核酸酶位点[0129]如上所述，特别地，本发明的idlv的特征在于其在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含至少一个核酸酶位点。[0130]根据本发明的核酸酶位点是rna序列，一旦逆转录成双链dna，其将被核酸酶识别。因此，核酸酶将切割核酸的核苷酸之间的磷酸二酯键。取决于核酸酶，该作用将在单链或双链上进行，导致识别的dna序列中的单链或双链断裂。[0131]例如，所述核酸酶位点可以是一个含引导肽的核酸内切酶的识别位点，该核酸内切酶结合到选自转录激活物样效应物核酸酶(talen)或锌指核酸酶的选定靶位点。[0132]talen技术包含一个与特异性dna结合结构域融合的非特异性dna切割结构域(核酸酶)。特异性dna结合结构域由来源于转录激活物样效应物(tale)的高度保守的重复序列组成，所述转录激活物样效应物是由黄单胞菌细菌分泌以改变宿主植物细胞中基因转录的蛋白质。dna切割结构域或切割半结构域可以从foki等各种限制性核酸内切酶和/或归巢核酸内切酶(例如foki型iis限制性内切核酸酶)获得(参见wrightetal.(biochem.j.2014aug.15；462(1):15-24))。[0133]锌指核酸酶(zfn)技术包括使用由锌指dna结合结构域与dna切割结构域(核酸酶)融合产生的人工限制酶。锌指结构域特异性靶向目标dna序列，其允许相关的核酸酶靶向复杂基因组内的独特序列。[0134]锌指dna结合结构域包含双指(two-finger)模块链，每个识别dna的独特六聚体(6bp)序列。双指模块缝合在一起形成锌指蛋白。在talen技术中，dna切割结构域包含foki的核酸酶结构域(carrolld,genetics,2011aug；188(4):773-782；urnovf.d.natrevgenet.(9):636-46,(2010))。[0135]在另一个实施方案中，核酸酶位点可以是由缺乏靶标位点特异性的核酸内切酶(如rna引导的核酸内切酶)靶向的位点。该rna引导的内切核酸酶可以特别是成簇的规则间隔的短回文重复序列(crispr)相关蛋白(cas)，特别是crispr相关蛋白9(cas9)。[0136]在该实施方案中，核酸酶位点被一种或多种引导核酸，特别是引导rna(grna)识别。由引导核酸，特别是由引导rna识别的本发明所述的核酸酶位点也称为引导核酸靶向序列(grna-t)。该引导核酸特异性靶向并识别本发明所述的核酸酶位点。该引导核酸还与缺乏靶标位点特异性的核酸内切酶连接，所述核酸内切酶将切割如上所述的idlv的核酸酶位点。[0137]任何grna可用于靶向根据本发明的核酸酶位点，只要它特异性地靶向它。例如，可以使用根据本发明的grna，特别是靶向珠蛋白基因内的核酸酶位点的grna，更特别是靶向存在于选自下组的任何一种基因中的核酸酶位点的grna：ε珠蛋白基因、γg珠蛋白基因、γa珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、β珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、假δ珠蛋白基因、μ珠蛋白基因、假α1珠蛋白基因、α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因，特别是选自下组：γg珠蛋白基因、γa珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、β珠蛋白基因、α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因，更特别选自下组：α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因。[0138]上述grna可以例如选自下组：如hba-4、hba-10、hba-12、hba-14、hba19.1、hba15.1、hba16.1、hba17-g、hba20.1、hba5.1、grna2、grna3、grna11、hbaint172.1、hbaint173.2、hbaint173b.1、hbaint213.2、hbaint263.2、hbaint274.1、hbb37.1、hbb49.2、hbb53.1、hbb54.1、hbb77.1、hbbint136.2、hbbint136.2rev、hbbint147.1、hbbint148.1、hbbint2340.1、hbbint2797.1、hbbint220.1、hbbint239.2、hbbko和hbbaavs1，其靶向如下表1所示的序列。[0139][0140][0141]表1[0142]特别地，根据本发明的idlv在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含一个或两个核酸酶位点。[0143]当两个核酸酶位点存在于本发明的idlv的5'ltr序列和3'ltr序列之间时，它们可以是不同的或相同的。特别地，它们是不同的。[0144]在具体实施方案中，本发明的idlv包含至少两个相同或不同的核酸酶位点，特别是至少两个相同或不同的grna-t序列，特别是两个相同或不同的grna-t序列。[0145]根据该实施方案中，本发明的idlv的特征可以在于其包含至少一个目标核酸序列，其包含在所述idlv的至少两个，特别是两个核酸酶位点之间。[0146]在本发明的实施方案中，该至少一个核酸酶位点与d点的包含在细胞基因组中的目标内源基因组位点中的内源性核酸酶位点相同或不同。[0147]在具体实施方案中，在包含在本发明所述的idlv中的核酸的5'ltr序列和3'ltr序列之间：[0148]-当仅存在一个核酸酶位点时，其在至少一个目标核酸序列的上游；[0149]-当存在多于一个核酸酶位点时，特别是当存在两个核酸酶位点时，至少一个、特别是一个核酸酶位点在至少一个目标核酸序列的上游，并且至少一个、特别是一个核酸酶位点在至少一个目标核酸序列的下游。[0150]在具体实施方案中，在本发明的idlv中包含的核酸的5'ltr序列和3'ltr序列之间，当存在多于一个核酸酶位点时，特别是当存在两个核酸酶位点时，至少一个、特别是一个核酸酶位点在至少一个同源臂序列的上游，并且至少一个、特别是一个核酸酶位点在至少一个同源臂序列的下游。[0151]在具体实施方案中，本发明的idlv的特征在于，在5'ltr序列和3'ltr序列之间，至少一个核酸酶位点与至少一个同源臂序列直接相邻。[0152]“直接相邻”是指核酸酶位点直接位于根据本发明的核酸中同源臂序列的上游或下游。[0153]序列d：同源臂[0154]如上所述，本发明的idlv任选地包含核酸，该核酸在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含至少一个同源臂序列。在具体实施方案中，本发明的idlv包含核酸，该核酸在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含至少一个同源臂序列。[0155]该至少一个同源臂序列包括与细胞基因组中，特别是旨在将idlv整合入其中的细胞基因组中的目标内源基因组位点的一部分同源的序列。本发明的idlv中的同源臂将特别有利于将至少一个目标核酸序列定向敲入到目标内源基因组位点中。[0156]旨在将idlv整合到其中并因此其基因组包含目标内源基因组位点的这种细胞在本文中进一步描述并且也称为分离细胞。[0157]根据一个实施方案，所述细胞特别选自下组：造血干细胞；免疫系统细胞，特别是淋巴细胞；多能干细胞；胚胎干细胞；卫星细胞；神经干细胞；间充质干细胞；视网膜干细胞；和上皮干细胞，并且特别是造血干细胞。[0158]特别地，本发明的idlv在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含一个或两个同源臂序列。[0159]示例性的同源臂长度包括至少20、30、40、50、100、250、500、750、1000、2000、3000、4000或5000个核苷酸。在一些实施方案中，同源臂长度为50-100、100-250、250-500、500-750、750-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000或4000-5000个核苷酸。[0160]根据一个实施方案，同源臂序列为40个核苷酸。[0161]在具体实施方案中，本发明所述的idlv中同源臂序列的位置紧邻至少一个目标核酸序列的上游(即5')和/或紧邻其下游(即3')。[0162]因此，在本发明的实施方案中，当本发明的idlv在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含一个同源臂序列时，所述同源臂序列紧邻至少一个目标核酸序列，特别是一个目标核酸序列的上游(即5')和/或紧邻其下游(即3')。[0163]根据具体实施方案，idlv包含至少两个同源臂序列，特别是两个，每个都彼此不同，并且包括与细胞基因组中的目标内源基因组位点的至少两个，特别是两个不同部分同源的序列。[0164]当本发明的idlv在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含两个同源臂序列时，至少一个所述同源臂序列紧邻至少一个目标核酸序列，特别是一个目标核酸序列的上游(即5')和/或紧邻其下游(即3')。[0165]根据本发明的目标内源基因组位点可以是基因的外显子、基因的内含子、启动子、基因的5'utr区、基因的3'utr区或基因间序列。[0166]特别地，它可以是安全港。[0167]安全港是宿主基因组中的染色体位置，其中本发明的至少一个目标核酸序列可以以可预测的方式整合和发挥功能，而不干扰内源基因活性或促进癌症(sadelainetal.,natrevcancer.2011dec1；12(1):51-8)。安全港，也称为基因组安全港(gsh)，是细胞基因组的基因内或基因外区域，其能够适应新整合的dna的可预测表达而对宿主细胞或生物体没有不利影响。有用的安全港必须允许足够的转基因表达，以产生所需水平的本发明的至少一个目标核酸序列。[0168]作为可以在人细胞中用作安全港的人基因组的特定基因内位点，可以提及例如腺相关病毒位点1(aavs1)(染色体19位置19q13.42)、趋化因子(cc基序)受体5(ccr5)基因位点(染色体3位置3q21.31)和小鼠rosa26基因位点的人直向同源基因(染色体3位置3q25.3)。[0169]在具体实施方案中，细胞基因组中目标内源基因组位点包含在珠蛋白基因中，特别是选自下组：ε珠蛋白基因、γg珠蛋白基因、γa珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、β珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、假δ珠蛋白基因、μ珠蛋白基因、假α1珠蛋白基因、α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因，特别是选自下组：γg珠蛋白基因、γa珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、β珠蛋白基因、α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因，更特别选自下组：α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因。[0170]在具体实施方案中，根据本发明的目标内源基因组位点在旨在被本发明的至少一个目标核酸序列完全或部分替代的基因中。实际上，根据本发明的转基因可以整合到其同源基因座中，例如将野生型转基因插入到内源基因座中以纠正突变基因。[0171]在另一实施方案中，根据本发明的内源目的基因组位点是t细胞中的t细胞受体编码基因。根据该实施方案，根据本发明的目标内源基因组位点可特别编码嵌合抗原受体(car，也称为嵌合免疫受体，人工t细胞受体或嵌合t细胞受体)，其能够靶向靶标，同时当与所述靶标(抗原)结合时能够激活t细胞免疫功能。相应获得的car-t细胞(嵌合抗原受体t细胞)是本领域众所周知的，用于治疗许多疾病，特别是用于治疗癌症(rajeetal.n.engl.j.med.380；18；1726-1737)。[0172]在另一实施方案中，根据本发明的内源目的基因组位点是b细胞中的免疫球蛋白编码基因。根据该实施方案，根据本发明的目标内源基因组位点可特别编码治疗性蛋白，更特别是免疫球蛋白或其片段(vossetal.elife2019；8:e42995andt-ccheong；natcommun.2016mar9；7:10934)。[0173]在另一实施方案中，根据本发明的目标内源基因组位点是造血干细胞(hsc)中的t细胞受体编码基因或免疫球蛋白编码基因。[0174]序列e：增强目标核酸序列(序列b)稳定表达的序列[0175]如上所述，本发明的idlv在5'ltr序列和3'ltr序列之间可包含至少一个允许增强至少一个目标核酸序列的稳定表达的序列。[0176]特别地，该允许增强至少一个目标核酸序列的稳定表达的至少一种序列是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)序列。[0177]土拨鼠肝炎病毒(whp)转录后调控元件(wpre)是597个核苷酸或更少的序列(schambachetal.,genether.2006apr；13(7):641-5)，其转录时产生增强表达的三级结构。该序列在分子生物学领域常用于增强由病毒载体递送的基因的表达。wpre是具有γ、α和β组分的三部分调节元件。α组分长80bp，可单独使用，但优选与γ和β组分组合使用。[0178]在具体实施方案中，本发明的idlv仅包含一种允许增强至少一个目标核酸序列的稳定表达的序列。[0179]在具体实施方案中，本发明的idlv仅包含一个土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)序列。[0180]在本发明的具体实施方案中，本发明的idlv的特征在于，在5'ltr序列和3'ltr序列之间，该允许增强至少一个目标核酸序列的稳定表达的至少一个序列在上述序列a-d的下游。[0181]在本发明的具体实施方案中，本发明的idlv的特别在于，在5'ltr序列和3'ltr序列之间，至少一个、特别是一个wpre序列在上述序列a-d的下游。[0182]在具体实施方案中，如上定义的序列a-c，以及d和e(如果存在)以下列顺序之一存在于idlv中，从5'至3'：[0183]-a，c，d，b；[0184]-a，c，d，b，e；[0185]-a，c，d，b，d，c；[0186]-a，c，d，b，d，c，e；[0187]-a，d，c，d，b；[0188]-a，d，c，d，b，e；[0189]-a，c，b，d，c，e；或[0190]-a，c，d，b，c，e。[0191]根据具体实施方案，根据本发明的idlv是圆形或线性的，特别是圆形的。更特别地，根据具体实施方案，根据本发明的idlv的胞内形式是圆形或线性的，特别是圆形的。[0192]根据另一个实施方案，本发明的idlv是线性的。特别地，根据另一个实施方案，本发明的idlv的胞内形式是线性的。[0193]根据具体实施方案，idlv不包含启动子。[0194]分离细胞[0195]如上所述，本发明还涉及包含至少一种根据本发明所定义的idlv的分离细胞。[0196]根据具体实施方案，分离细胞选自下组：造血干细胞(hsc)；免疫系统细胞，特别是淋巴细胞；诱导的多能干细胞；胚胎干细胞；卫星细胞；神经干细胞；间充质干细胞；视网膜干细胞；和上皮干细胞，并且特别是造血干细胞。[0197]在本发明的具体实施方案中，分离细胞不同于胚胎干细胞。[0198]hsc是能够自我更新的多能干细胞，其特征在于它们具有在适合条件下产生造血系统的所有细胞类型的能力。hsc不是全能细胞，即它们不能发育成完整的生物体。[0199]在具体实施方案中，根据本发明的hsc来源于胚胎干细胞，特别是来源于人胚胎干细胞，并且因此是胚胎造血干细胞。[0200]胚胎干细胞(esc)是衍生自胚胎的未分化内团细胞并能够自我更新的干细胞。在合适条件下，这些多能干细胞能够在成体(adultbody)中的超过220种细胞类型中的任一种中分化。esc不是全能细胞，即它们不能发育成完整的生物体。esc可以根据youngchung等人所述方法获得(youngchungetal.cellstemcell2,2008february7；2(2):113-7)。[0201]在另一具体实施方案中，根据本发明的hsc是诱导性多能干细胞，更特别是人诱导性多能干细胞(hipscs)。因此，根据具体实施方案，本文所述的hsc是造血诱导性多能干细胞。[0202]hipsc是表现出类似于esc的多能干细胞样状态的遗传重编程成体细胞。它们是人工培育的干细胞，已知它们不存在于人体中，但表现出与esc相似的性质。如yingwang等人(https://doi.org/10.1101/050021)和lapillonneh等人(haematologica.2010；95(10))和j.dias等人(stemcellsdev.2011；20(9):1639-1647)所述，产生所述细胞的方法是本领域的公知常识。[0203]“自我更新”是指细胞分裂并产生至少一个具有与亲代细胞相同(例如，自我更新)特征的子代细胞的能力。第二子代细胞可以定向于特定的分化途径。例如，自我更新hsc可以分裂并形成一个子干细胞和另一个在骨髓或淋巴途径中起分化作用的子细胞。自我更新提供了用于补充造血系统的未分化干细胞的连续来源。[0204]用于鉴定hsc的标记表型是本领域公知的。对于人hsc，细胞标记表型优选包括cd34 cd38low/-cd49f cd59 cd90 cd45ra-thy1 c-kit lin-的任意组合(nottaf,science.333(6039):218-21(2011))。对于小鼠hsc，细胞标记物表型可以示例性地为cd34low/-sca-1 c-kit 和lin-cd150 cd48-cd90.1.thy1 /lowflk2/flt3-和cd117 的任意组合(参见例如frascolietal.(j.vis.exp.2012jul8；(65).pii:3736)。[0205]免疫系统的细胞是宿主防御系统的一部分，其包括生物体内的许多防止疾病的生物结构和过程。根据本发明，免疫系统的细胞包括先天免疫系统的细胞和适应性免疫系统的细胞。[0206]先天免疫系统的细胞的实例包括白细胞，诸如吞噬细胞(巨噬细胞，嗜中性粒细胞和树突细胞)、先天淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和天然杀伤细胞。[0207]适应性免疫系统的细胞的实例包括淋巴细胞，特别是b细胞和t细胞，诸如杀伤性t细胞、辅助性t细胞。[0208]根据具体实施方案中，根据本发明的分离细胞是淋巴细胞。[0209]卫星细胞，也称为肌卫星细胞或肌肉干细胞，是在成熟肌肉中发现的具有极少细胞质的小多能细胞。卫星细胞是骨骼肌细胞的前体，能够产生卫星细胞或分化的骨骼肌细胞。它们具有向其母体肌纤维提供额外肌核或返回静止状态的潜力。更具体地，通过活化，卫星细胞可重新进入细胞周期以增殖和分化为成肌细胞。[0210]神经干细胞(nsc)是自我更新的多能细胞，其首先产生放射状神经胶质祖细胞，其在胚胎发育期间产生所有动物的神经系统的神经元和神经胶质。一些神经祖干细胞持续存在于成年脊椎动物脑中高度受限的区域，并在整个生命中持续产生神经元。[0211]间充质干细胞是能分化为多种细胞类型的多能基质细胞，包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。由于这些细胞是传统上在骨髓中发现的成体干细胞，它们也称为骨髓基质细胞。但是，它们也可以分离自其它组织，包括脐带血、外周血、输卵管、胎儿肝和肺。[0212]视网膜干细胞，也称为视网膜祖细胞，是能够分化成视网膜中存在的不同细胞类型的多能细胞。[0213]诱导多能干细胞(ipsc)是一类多能干细胞，其可以直接从如上所述的成体细胞产生。因为它们可以无限繁殖，以及在体内产生所有其他细胞类型(诸如神经元、心脏、胰腺和肝细胞)，所以它们代表可用于替代那些因损伤或疾病而损失的细胞的单一来源。获得诱导多能干细胞的方法属于本领域技术人员的常识。[0214]上皮干细胞在组织稳态、伤口修复和癌发生中起重要作用。已经证实角膜上皮干细胞存在于角膜缘上皮中，而结膜的穹窿区似乎是结膜上皮干细胞的主要部点。角膜和结膜上皮以及毛囊和滤泡间表皮的干细胞共有重要特征：它们能够自我更新；它们相对静止(慢循环)；能够诱导它们增殖；并且它们是多能性的。显然，在角膜和毛囊角质细胞之间存在一定程度的柔性。[0215]优选纯化本文所述的分离细胞。[0216]如本文所用，“纯化的细胞”是指所述细胞占纯化样品中细胞的至少50％；更优选地，纯化样品中细胞的至少51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。[0217]细胞的选择和/或纯化可包括阳性和阴性选择方法，以获得基本上纯的细胞群。[0218]在一个方面，荧光激活细胞分选(facs)作为一种流式细胞术技术，可用于分选和分析不同的细胞群。具有特定细胞标记的细胞被抗体标记，或典型地是与细胞标记结合的抗体混合物。针对不同标记物的每种抗体与可检测分子，特别是荧光染料缀合，所述荧光染料可与偶联于其它抗体的其它荧光染料区分。使染色的细胞流通过激发荧光染料的光源，并且来自细胞的发射光谱检测特定标记抗体的存在。通过同时检测不同的荧光染料，显示不同组细胞标记的细胞被鉴定并与群体中的其它细胞分离。其它facs参数，包括但不限于如侧向散射(ssc)、前向散射(fsc)和活性染料染色(例如，用碘化丙啶)可以基于大小和生存力选择细胞。[0219]在另一个方面，免疫磁性标记可用于分选不同的细胞群。该方法基于通过抗体或凝集素将小的可磁化颗粒附着到细胞上。当将混合的细胞群置于磁场中时，附着有磁珠的细胞将被磁体吸引从而与未标记的细胞分离。[0220]根据具体实施方案中，根据本发明进行遗传修饰的hsc呈现β-血红蛋白病表型，即与健康的相应细胞相比呈现β样珠蛋白的表达减少。特别地，根据本发明进行遗传修饰的hsc细胞呈现β-地中海贫血或镰状细胞病表型。[0221]在具体实施方案中，本文所述的分离细胞，特别是hsc是哺乳动物细胞，特别是人细胞。[0222]在具体实施方案中，分离细胞的初始群体可以是自体的。[0223]“自体的”是指衍生自或来源于同一患者或个体。“自体移植”是指受试者自身细胞或器官的采集和再输注或移植。单独或补充使用自体细胞可以消除或减少将细胞回输宿主的许多副作用，特别是移植物抗宿主反应。[0224]在这种情况下，从所述个体收集分离细胞，根据本文所述的方法进行离体或体外遗传修饰，并施用于同一个体。[0225]在另一实施方案中，分离细胞的初始群体可以衍生自同种异体供体或来自多个同种异体供体。供体可以彼此相关或不相关，并且在移植情况下，与受体(或个体)相关或不相关。[0226]因此，如本文所述的待修饰的分离细胞对于需要治疗的个体可以是外源性的。[0227]本文所述的分离细胞可重悬于药学上可接受的载体中并直接使用，或可通过本领域技术人员可选的各种细胞纯化技术进行处理，诸如facs分选、磁性亲和分离和免疫亲和柱。[0228]药物组合物[0229]本发明还涉及药物组合物，其包含至少一种如本文所述的idlv和/或至少一种如本文所述的分离细胞，以及药学上可接受的介质。[0230]如本文所述的药学上可接受的介质特别适合施用于哺乳动物个体。[0231]“药学上可接受的介质”包括本领域普通技术人员在配制药物组合物时已知的任何标准的药学上可接受的介质，例如盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、乙醇水溶液或葡萄糖溶液、甘露醇、葡聚糖、丙二醇、油类(例如植物油、动物油、合成油等)、微晶纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸钙、明胶或聚山梨醇酯80等。[0232]如本文所述的药物组合物通常还包含一种或多种缓冲剂(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)；碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)；甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基苯甲醚等)；抑菌剂；螯合剂，诸如edta或谷胱甘肽；使制剂与受体血液等渗、低渗或弱高渗的溶质；悬浮剂；增稠剂和/或防腐剂。[0233]当然，载体的类型典型地会根据施用方式而有所不同。[0234]在一个实施方案中，本文所述的idlv和/或分离细胞可以与治疗化合物组合用于组合物中，其有效地治疗：[0235]-选自下组的疾病：免疫疾病、病毒感染、肿瘤和血液疾病；和/或[0236]-因缺乏蛋白质或在有需要的个体中存在异常的非功能性蛋白质而引起的疾病。[0237]在一个实施方案中，本文所述的idlv和/或分离细胞可以与不同于本发明的idlv和/或不包含根据本发明的idlv的分离细胞组合用于本文所述的组合物中。[0238]在一个实施方案中，本文所述的idlv和/或分离细胞可以与增强所施用的idlv和/或细胞的治疗效果的其他试剂和化合物组合用于本发明的组合物中。[0239]用作药物的idlv和分离细胞[0240]本发明的另一个目的是上文定义的idlv或分离细胞或药物组合物，其用作药物。[0241]如本文所述的idlv、分离细胞和药物组合物通过任何合适的途径(诸如静脉内、心内、鞘内、肌内、关节内或骨髓内)注射并且以足以提供治疗益处的量施用至受试者。[0242]实现治疗效果所需的idlv或分离细胞的量将根据用于具体目的的常规程序凭经aspergillosis)；斑秃——不是一种罕见的疾病(alopeciaareata–notararedisease)；全秃(alopeciatotalis)；普秃(alopeciauniversalis)；淀粉样变性aa(amyloidosisaa)；家族性内脏淀粉样变性病(amyloidosisfamilialvisceral)；共济失调毛细血管扩张症(ataxiatelangiectasia)；自身免疫性淋巴增生综合征(autoimmunelymphoproliferativesyndrome)；ctla4单倍体不足引起的自身免疫性淋巴组织增生综合征(autoimmunelymphoproliferativesyndromeduetoctla4haploinsuffiency)；自身免疫性多腺综合征1型(autoimmunepolyglandularsyndrometype1)；常染色体显性高ige综合征(autosomaldominanthyperigesyndrome)；常染色体隐性早发性炎症性肠病(autosomalrecessiveearly-onsetinflammatoryboweldisease)；常染色体隐性遗传高ige综合征(autosomalrecessivehyperigesyndrome)；裸淋巴细胞综合征2(barelymphocytesyndrome2)；巴特综合征(barthsyndrome)；布劳综合征(blausyndrome)；布鲁姆综合征(bloomsyndrome)；闭塞性细支气管炎(bronchiolitisobliterans)；c1q缺乏症(c1qdeficiency)；念珠菌病家族性慢性皮肤粘膜，常染色体隐性遗传(candidiasisfamilialchronicmucocutaneous,autosomalrecessive)；软骨毛发发育不全(cartilage-hairhypoplasia)；charge综合征(chargesyndrome)；chediak-higashi综合征(chediak-higashisyndrome)；家族性巨颌症(cherubism)；伴有脂肪营养不良和体温升高的慢性非典型中性粒细胞性皮肤病(chronicatypicalneutrophilicdermatosiswithlipodystrophyandelevatedtemperature)；慢性移植物抗宿主病(chronicgraftversushostdisease)；慢性肉芽肿病(chronicgranulomatousdisease)；科恩综合征(cohensyndrome)；联合免疫缺陷伴皮肤肉芽肿(combinedimmunodeficiencywithskingranulomas)；普通变异免疫缺陷(commonvariableimmunodeficiency)；补体成分2缺乏(complementcomponent2deficiency)；补体成分8缺乏1型(complementcomponent8deficiencytype1)；补体成分8缺乏2型(complementcomponent8deficiencytype2)；先天性肺泡蛋白沉积症(congenitalpulmonaryalveolarproteinosis)；冷球蛋白血症(cryoglobulinemia)；皮肤肥大细胞瘤(cutaneousmastocytoma)；周期性中性粒细胞减少症(cyclicneutropenia)；白细胞介素-1受体拮抗剂缺乏症(deficiencyofinterleukin-1receptorantagonist)；树突状细胞、单核细胞、b淋巴细胞和自然杀伤淋巴细胞缺乏症(dendriticcell,monocyte,blymphocyte,andnaturalkillerlymphocytedeficiency)；先天性角化不良(dyskeratosiscongenita)；先天性角化不良常染色体显性遗传(dyskeratosiscongenitaautosomaldominant)；先天性角化不良常染色体隐性遗传(dyskeratosiscongenitaautosomalrecessive)；x连锁的先天性角化不良(dyskeratosiscongenitax-linked)；疣状表皮发育不良(epidermodysplasiaverruciformis)；家族性淀粉样变性，finnish型(familialamyloidosis,finnishtype)；家族性感冒自身炎症综合征(familialcoldautoinflammatorysyndrome)；家族性地中海热(familialmediterraneanfever)；家族性混合冷球蛋白血症(familialmixedcryoglobulinemia)；常见的慢性皮肤黏膜念珠菌病(familiarchronicmucocutaneouscandidiasis)；费尔蒂综合征(felty’ssyndrome)；1b型糖原贮积病(glycogenstoragediseasetype1b)；griscelli综合征2型(griscellisyndrometype2)；桥本脑病(hashimotoencephalopathy)；桥本氏综合症(hashimoto’ssyndrome)；噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(hemophagocyticlymphohistiocytosis)；亨内卡姆综合征(hennekamsyndrome)；伴有免疫缺陷的肝静脉闭塞性疾病(hepaticvenoocclusivediseasewithimmunodeficiency)；遗传性叶酸吸收不良(hereditaryfolatemalabsorption)；hermanskypudlak综合征2(hermanskypudlaksyndrome2)；单纯疱疹脑炎(herpessimplexencephalitis)；hoyeraalhreidarsson综合征(hoyeraalhreidarssonsyndrome)；高ige综合征(hyperigesyndrome)；高igd综合征(hyper-igdsyndrome)；icf综合征(icfsyndrome)；特发性急性嗜酸性粒细胞肺炎(idiopathicacuteeosinophilicpneumonia)；特发性cd4阳性t淋巴细胞减少症(idiopathiccd4positivet-lymphocytopenia)；il12rb1缺乏(il12rb1deficiency)；胸腺缺失导致的免疫缺陷(immunedefectduetoabsenceofthymus)；钙进入缺陷导致t细胞失活的免疫功能障碍1(immunedysfunctionwitht-cellinactivationduetocalciumentrydefect1)；钙进入缺陷导致t细胞失活的免疫功能障碍2(immunedysfunctionwitht-cellinactivationduetocalciumentrydefect2)；高igm1型免疫缺陷(immunodeficiencywithhyperigmtype1)；高igm2型免疫缺陷(immunodeficiencywithhyperigmtype2)；高igm3型免疫缺陷(immunodeficiencywithhyperigmtype3)；高igm4型免疫缺陷(immunodeficiencywithhyperigmtype4)；高igm5型免疫缺陷(immunodeficiencywithhyperigmtype5)；胸腺瘤免疫缺陷(immunodeficiencywiththymoma)；无汗性外胚层发育不良伴免疫缺陷(immunodeficiencywithoutanhidroticectodermaldysplasia)；免疫失调、多内分泌病和x连锁肠病(immunodysregulation,polyendocrinopathyandenteropathyx-linked)；免疫球蛋白a缺乏症2(immunoglobulinadeficiency2)；肠闭锁多发(intestinalatresiamultiple)；irak-4缺乏症(irak-4deficiency)；孤立生长激素缺乏症3型(isolatedgrowthhormonedeficiencytype3)；川崎病(kawasakidisease)；大颗粒淋巴细胞白血病(largegranularlymphocyteleukemia)；白细胞粘附缺陷1型(leukocyteadhesiondeficiencytype1)；lrba缺乏症(lrbadeficiency)；狼疮(lupus)；淋巴细胞性垂体炎(lymphocytichypophysitis)；马吉德综合征(majeedsyndrome)；melkersson-rosenthal综合征(melkersson-rosenthalsyndrome)；mhc1类缺乏症(mhcclass1deficiency)；muckle-wells综合征(muckle-wellssyndrome)；多灶性纤维硬化(multifocalfibrosclerosis)；多发性硬化症(multiplesclerosis)；myd88缺乏症(myd88deficiency)；新生儿多系统炎症性疾病(neonatalonsetmultisysteminflammatorydisease)；新生儿系统性红斑狼疮(neonatalsystemiclupuserythematosus)；内瑟顿综合征(nethertonsyndrome)；中性粒细胞特异性颗粒缺乏症(neutrophil-specificgranuledeficiency)；nijmegen断裂综合征(nijmegenbreakagesyndrome)；联合免疫缺陷病(omennsyndrome)；骨硬化症常染色体隐性遗传7(osteopetrosisautosomalrecessive7)；复发性风湿病(palindromicrheumatism)；papillonlefevre综合征(papillonlefevresyndrome)；部分雄激素不敏感综合征(partialandrogeninsensitivitysyndrome)；帕斯利病(paslidisease)；皮尔逊综合征(pearsonsyndrome)；小儿多发性硬化症(pediatricmultiplesclerosis)；周期性发热、口疮性口炎、咽炎和腺炎(periodicfever,aphthousstomatitis,pharyngitisandadenitis)；pgm3-cdg；中性粒细胞减少症(poikilodermawithneutropenia)；妊娠瘙痒性荨麻疹丘疹斑块(pruriticurticarialpapulesplaquesofpregnancy)；嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症(purinenucleosidephosphorylasedeficiency)；化脓性关节炎、坏疽性脓皮病和痤疮(pyogenicarthritis,pyodermagangrenosumandacne)；复发性多软骨炎(relapsingpolychondritis)；网状发育不全(reticulardysgenesis)；结节病(sarcoidosis)；saybarbermillersyndrome；schimke免疫骨发育不良(schimkeimmunoosseousdysplasia)；施尼茨勒综合征(schnitzlersyndrome)；选择性iga缺乏症(selectiveigadeficiency)；选择性igm缺乏症(selectiveigmdeficiency)；严重的联合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficiency)；由于完全rag1/2缺乏导致的严重联合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficiencyduetocompleterag1/2deficiency)；对电离辐射敏感的严重联合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficiencywithsensitivitytoionizingradiation)；严重联合免疫缺陷，非典型(severecombinedimmunodeficiency,atypical)；重度先天性中性粒细胞减少症常染色体隐性遗传3(severecongenitalneutropeniaautosomalrecessive3)；严重的先天性中性粒细胞减少症x连锁(severecongenitalneutropeniax-linked)；伴有严重联合免疫缺陷的短肢骨骼发育不良(short-limbskeletaldysplasiawithseverecombinedimmunodeficiency)；shwachman-diamond综合征(shwachman-diamondsyndrome)；singleton-merten综合征(singleton-mertensyndrome)；slc35c1-cdg(cdg-iic)；特异性抗体缺乏症(singleton-mertensyndrome)；脊椎软骨发育不良(spondyloenchondrodysplasia)；stevens-johnson综合征/中毒性表皮坏死松解症(stevens-johnsonsyndrome/toxicepidermalnecrolysis)；t细胞免疫缺陷、先天性脱发和指甲营养不良(t-cellimmunodeficiency,congenitalalopeciaandnaildystrophy)；tarp综合征(tarpsyndrome)；trichohepatoenteric综合征(trichohepatoentericsyndrome)；肿瘤坏死因子受体相关周期性综合征(tumornecrosisfactorreceptor-associatedperiodicsyndrome)；双胞胎输血综合征(twintotwintransfusionsyndrome)；维西综合征(vicisyndrome)；whim综合征(whimsyndrome)；wiskottaldrich综合征(wiskottaldrichsyndrome)；伍兹布莱克诺伯里综合征(woodsblacknorburysyndrome)；x连锁无丙种球蛋白血症(x-linkedagammaglobulinemia)；x连锁免疫缺陷与镁缺陷、爱泼斯坦-巴尔病毒感染和瘤形成(x-linkedimmunodeficiencywithmagnesiumdefect,epstein-barrvirusinfectionandneoplasia)；x连锁淋巴增生综合征(x-linkedlymphoproliferativesyndrome)；x连锁淋巴增生综合征1(x-linkedlymphoproliferativesyndrome1)；x连锁淋巴增生综合征2(x-linkedlymphoproliferativesyndrome2)；x连锁严重联合免疫缺陷和zap-70缺乏症(x-linkedseverecombinedimmunodeficiencyandzap-70deficiency)。[0258]如上所述的血液病可以例如选自下组：5q-综合征(5q-syndrome)；aagenaes综合征(aagenaessyndrome)；腹主动脉瘤(abdominalaorticaneurysm)；无β脂蛋白血症(abetalipoproteinemia)；缺过氧化氢酶血(acatalasemia)；铜蓝蛋白血症(aceruloplasminemia)；获得性粒细胞缺乏症(acquiredagranulocytosis)；获得性血友病(acquiredhemophilia)；获得性血友病a(acquiredhemophiliaa)；获得纯红细胞再生thrombocytopenia)；先天性白蛋白血症(congenitalanalbuminemia)；先天性红细胞生成异常性贫血1型(congenitaldyserythropoieticanemiatype1)；先天性红细胞生成异常性贫血2型(congenitaldyserythropoieticanemiatype2)；先天性红细胞生成异常性贫血3型(congenitaldyserythropoieticanemiatype3)；先天性红细胞生成性卟啉病(congenitalerythropoieticporphyria)；先天性肌无力综合征伴发作性呼吸暂停(congenitalmyasthenicsyndromewithepisodicapnea)；先天性肺淋巴管扩张症(congenitalpulmonarylymphangiectasia)；先天性血栓性血小板减少性紫癜(congenitalthromboticthrombocytopenicpurpura)；皮肤肥大细胞瘤(cutaneousmastocytoma)；皮肤松弛，常染色体隐性遗传1型(cutislaxa,autosomalrecessivetype1)；cutismarmoratatelangiectaticacongenita；周期性中性粒细胞减少症(cyclicneutropenia)；周期性血小板减少症(cyclicthrombocytopenia)；主动脉囊性内侧坏死(cysticmedialnecrosisofaorta)；dahlbergborer新人综合征(dahlbergborernewcomersyndrome)；耳聋-淋巴水肿-白血病综合征(deafness-lymphedema-leukemiasyndrome)；脱水遗传性口细胞增多症(dehydratedhereditarystomatocytosis)；脱水遗传性口细胞增多症假性高钾血症和围产期水肿(dehydratedhereditarystomatocytosispseudohyperkalemiaandperinataledema)；diamond-blackfan贫血症(diamond-blackfananemia)；diamond-blackfan贫血2(diamond-blackfananemia2)；diamond-blackfan贫血3(diamond-blackfananemia3)；异常纤维蛋白原血症(dysfibrinogenemia)；先天性角化不良(dyskeratosiscongenita)；先天性角化不良常染色体显性遗传(dyskeratosiscongenitaautosomaldominant)；先天性角化不良常染色体隐性遗传(dyskeratosiscongenitaautosomalrecessive)；x连锁的先天性角化不良(dyskeratosiscongenitax-linked)；ehlers-danlos综合征，纤维连接异常型(ehlers-danlossyndrome,dysfibronectinemictype)；嗜酸性肉芽肿伴多血管炎(eosinophilicgranulomatosiswithpolyangiitis)；持久隆起性红斑(erythemaelevatumdiutinum)；原发性血小板增多症(essentialthrombocythemia)；埃文斯综合征(evanssyndrome)；结外鼻nk/t细胞淋巴瘤(extranodalnasalnk/tcelllymphoma)；法布里病(fabrydisease)；因子v缺乏症(factorvdeficiency)；因子v莱顿易栓症(factorvleidenthrombophilia)；因子vii缺乏症(factorviideficiency)；因子x缺乏症(factorxdeficiency)；因子xi缺乏症(factorxideficiency)；因子xii缺乏症(factorxiideficiency)；因子xiii缺乏症(factorxiiideficiency)；tsh受体突变引起的家族性甲状腺功能亢进症(familialhyperthyroidismduetomutationsintshreceptor)；家族性lcat缺乏症(familiallcatdeficiency)；伴有髓系恶性肿瘤的家族性血小板疾病(familialplateletdisorderwithassociatedmyeloidmalignancy)；家族性胸主动脉瘤和夹层(familialthoracicaorticaneurysmanddissection)；范可尼贫血(fanconianemia)；胎儿和新生儿同种免疫性血小板减少症(fetalandneonatalalloimmunethrombocytopenia)；纤维肌肉发育不良(fibromusculardysplasia)；滤泡性淋巴瘤(follicularlymphoma)；真正的弥漫性静脉扩张症(genuinediffusephlebectasia)；巨细胞动脉炎(giantcellarteritis)；巨血小板综合征(giantplateletsyndrome)；格兰兹曼血小板无力症(glanzmannthrombasthenia)；糖皮质激素可治疗的醛固酮增多症(glucocorticoid-remediablealdosteronism)；谷氨酸甲亚氨基转移酶缺乏症(glutamateformiminotransferasedeficiency)；糖原贮积病12型(glycogenstoragediseasetype12)；糖原贮积病7型(glycogenstoragediseasetype7)；糖蛋白vi缺乏症(glycoproteinvideficiency)；goodpasture综合征(goodpasturesyndrome)；戈勒姆病(gorham’sdisease)；韦格纳肉芽肿(granulomatosiswithpolyangiitis)；肉芽肿性皮肤松弛病(granulomatousslackskindisease)；灰色血小板综合征(grayplateletsyndrome)；毛细胞白血病(hairycellleukemia)；桥本-普利兹克综合征(hashimoto-pritzkersyndrome)；亨氏体贫血(heinzbodyanemias)；血管瘤血小板减少综合征(hemangiomathrombocytopeniasyndrome)；血色病-非罕见病(hemochromatosis-notararedisease)；2型血色素沉着症(hemochromatosistype2)；3型血色素沉着症(hemochromatosistype3)；4型血色素沉着症(hemochromatosistype4)；血红蛋白c病(hemoglobincdisease)；血红蛋白e病(hemoglobinedisease)；血红蛋白sc病(hemoglobinscdisease)；血红蛋白se病(hemoglobinsedisease)；溶血性贫血致死性先天性非球形红细胞性生殖器和其他异常(hemolyticanemialethalcongenitalnonspherocyticwithgenitalandotherabnormalities)；溶血性尿毒症综合征(hemolyticuremicsyndrome)；血友病a(hemophiliaa)；血友病b(hemophiliab)；失血性休克和脑病综合征(hemorrhagicshockandencephalopathysyndrome)；亨内卡姆综合征(hennekamsyndrome)；过敏性紫癜(henoch-schonleinpurpura)；肝素诱导的血小板减少症(heparin-inducedthrombocytopenia)；遗传性抗凝血酶缺乏症(hereditaryantithrombindeficiency)；遗传性椭圆形红细胞增多症(hereditaryelliptocytosis)；遗传性叶酸吸收不良(hereditaryfolatemalabsorption)；遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditaryhemorrhagictelangiectasia)；遗传性出血性毛细血管扩张症2型(hereditaryhemorrhagictelangiectasiatype2)；遗传性出血性毛细血管扩张症3型(hereditaryhemorrhagictelangiectasiatype3)；遗传性出血性毛细血管扩张症4型(hereditaryhemorrhagictelangiectasiatype4)；遗传性淋巴水肿ii型(hereditarylymphedematypeii)；遗传性高铁血红蛋白血症(hereditarymethemoglobinemia)；遗传性副神经节瘤-嗜铬细胞瘤(hereditaryparaganglioma-pheochromocytoma)；遗传性球形红细胞增多症(hereditaryspherocytosis)；hermanskypudlak综合征2(hermanskypudlaksyndrome2)；高分子量激肽原缺乏症(highmolecularweightkininogendeficiency)；组织细胞增多症-淋巴结病加综合征(histiocytosis-lymphadenopathyplussyndrome)；hoyeraalhreidarsson综合征(hoyeraalhreidarssonsyndrome)；糖基磷脂酰肌醇缺乏引起的高凝综合征(hypercoagulabilitysyndromeduetoglycosylphosphatidylinositoldeficiency)；嗜酸性粒细胞增多综合征(hypereosinophilicsyndrome)；过敏性血管炎(hypersensitivityvasculitis)；低补体性荨麻疹性血管炎(hypocomplementemicurticarialvasculitis)；低纤维蛋白原血症，家族性(hypofibrinogenemia,familial)；少毛症-淋巴水肿-毛细血管扩张综合征(hypotrichosis-lymphedema-telangiectasiasyndrome)；特发性中性粒细胞减少症(idiopathicneutropenia)；特发性血小板减少性紫癜(idiopathicthrombocytopenicpurpura)；imerslund-grasbeck综合征(imerslund-grasbecksyndrome)；包涵体肌病2(inclusionbodymyopathy2)；遗传性骨髓衰竭综合征(inheritedbonemarrowfailuresyndromes)；颈内动脉发育不全(internalcarotidagenesis)；内在因素缺乏症(intrinsicfactordeficiency)；铁难治性缺铁性贫血(iron-refractoryirondeficiencyanemia)；雅各布森综合征(jacobsensyndrome)；幼年型粒单核细胞白血病(juvenilemyelomonocyticleukemia)；少年颞动脉炎(juveniletemporalarteritis)；神崎病(kanzakidisease)；卡波西肉瘤(kaposisarcoma)；卡波西样血管内皮瘤(kaposiformhemangioendothelioma)；卡波西样淋巴管瘤病(kaposiformlymphangiomatosis)；川崎病(kawasakidisease)；klippel-trenaunay综合征(klippel-trenaunaysyndrome)；朗格汉斯细胞肉瘤(langerhanscellsarcoma)；大颗粒淋巴细胞白血病(largegranularlymphocyteleukemia)；leschnyhan综合征(leschnyhansyndrome)；利德尔综合征(liddlesyndrome)；水肿(lipedema)；无脑畸形2(lissencephaly2)；loeys-dietz综合征(loeys-dietzsyndrome)；loeys-dietz综合征1型(loeys-dietzsyndrometype1)；loeys-dietz综合征2型(loeys-dietzsyndrometype2)；loeys-dietz综合征3型(loeys-dietzsyndrometype3)；loeys-dietz综合征4型(loeys-dietzsyndrometype4)；淋巴水肿和脑动静脉异常(lymphedemaandcerebralarteriovenousanomaly)；淋巴水肿-分离综合征(lymphedema-distichiasissyndrome)；淋巴瘤样丘疹病(lymphomatoidpapulosis)；马富奇综合征(maffuccisyndrome)；马吉德综合征(majeedsyndrome)；套细胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma)；麦克劳德神经棘红细胞增多症综合征(mcleodneuroacanthocytosissyndrome)；巨脑-毛细血管畸形综合征(megalencephaly-capillarymalformationsyndrome)；二氢叶酸还原酶缺乏引起的巨幼细胞性贫血(megaloblasticanemiaduetodihydrofolatereductasedeficiency)；高铁血红蛋白血症，β-珠蛋白型(methemoglobinemia,beta-globintype)；甲钴胺缺乏cblg型(methylcobalamindeficiencycblgtype)；甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症cblx型(methylmalonicacidemiaandhomocysteinemiatypecblx)；甲基丙二酸血症伴同型胱氨酸尿症cblc型(methylmalonicacidemiawithhomocystinuriatypecblc)；甲基丙二酸血症伴高胱氨酸尿症cbld型(methylmalonicacidemiawithhomocystinuriatypecbld)；甲基丙二酸血症伴高胱氨酸尿症cblf型(methylmalonicacidemiawithhomocystinuriatypecblf)；甲基丙二酸血症伴高胱氨酸尿症cblj型(methylmalonicacidemiawithhomocystinuriatypecblj)；微囊性淋巴管畸形(microcysticlymphaticmalformation)；显微镜下多血管炎(microscopicpolyangiitis)；米罗伊病(milroydisease)；mpi-cdg(cdg-ib)；multicentriccastleman病(multicentriccastlemandisease)；多灶性淋巴管内皮瘤病伴血小板减少症(multifocallymphangioendotheliomatosiswiththrombocytopenia)；多发性骨髓瘤(multiplemyeloma)；多系统平滑肌功能障碍综合征(multisystemicsmoothmuscledysfunctionsyndrome)；骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndromes)；骨髓纤维化(myelofibrosis)；骨髓肉瘤(myeloidsarcoma)；myh9相关的血小板减少症(myh9relatedthrombocytopenia)；新生儿血色素沉着症(neonatalhemochromatosis)；中性粒细胞减少症慢性家族性(neutropeniachronicfamilial)；先天性嗜中性粒细胞减少症致死性嗜酸性粒细胞增多症(neutropenialethalcongenitalwitheosinophilia)；先天性不消退型血管瘤(non-involutingcongenitalhemangioma)；由于己糖激酶缺乏导致的非球形红细胞性溶血性贫血(nonspherocytichemolyticanemiaduetohexokinasedeficiency)；努南综合征(noonansyndrome)；努南综合征1(noonansyndrome1)；努南综合征2(noonansyndrome2)；努南综合征3(noonansyndrome3)；努南综合征4(noonansyndrome4)；努南综合征5(noonansyndrome5)；努南综合征6(noonansyndrome6)；乳清酸尿症1型(oroticaciduriatype1)；巴黎-特鲁索血小板减少症(paris-trousseauthrombocytopenia)；帕克斯韦伯综合征(parkeswebersyndrome)；阵发性冷血红蛋白尿(paroxysmalcoldhemoglobinuria)；阵发性夜间血红蛋白尿(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria)；皮尔逊综合征(pearsonsyndrome)；peho综合征(pehosyndrome)；phace综合征(phacesyndrome)；嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)；磷酸甘油酸激酶缺乏症(phosphoglyceratekinasedeficiency)；浆母细胞淋巴瘤(plasmablasticlymphoma)；纤溶酶原激活物抑制剂1型缺乏症(plasminogenactivatorinhibitortype1deficiency)；血小板储存池不足(plateletstoragepooldeficiency)；普卢默文森综合征(plummervinsonsyndrome)；poems综合征(poemssyndrome)；中性粒细胞减少症(poikilodermawithneutropenia)；真性红细胞增多症(polycythemiavera)；先天性前激肽释放酶缺乏症(prekallikreindeficiency,congenital)；中枢神经系统原发性血管炎(primaryangiitisofthecentralnervoussystem)；原发性中枢神经系统淋巴瘤(primarycentralnervoussystemlymphoma)；原发性家族性和先天性红细胞增多症(primaryfamilialandcongenitalpolycythemia)；原发性肠淋巴管扩张症(primaryintestinallymphangiectasia)；血小板原发性释放障碍(primaryreleasedisorderofplatelets)；脯氨酸酶缺乏症(prolidasedeficiency)；蛋白质c缺乏症(proteincdeficiency)；蛋白质s缺乏症(proteinsdeficiency)；变形杆菌综合征(proteussyndrome)；凝血酶原缺乏症(prothrombindeficiency)；假性冯维勒布兰德病(pseudo-vonwillebranddisease)；假性高钾血症卡迪夫(pseudohyperkalemiacardiff)；弹力纤维性假黄瘤(pseudoxanthomaelasticum)；肺动静脉瘘(pulmonaryarterio-veinousfistula)；肺动脉闭锁伴完整的室间隔(pulmonaryatresiawithintactventricularseptum)；肺静脉狭窄(pulmonaryveinstenosis)；单纯性紫癜(purpurasimplex)；pyropoikilocytosishereditary；丙酮酸激酶缺乏症(pyruvatekinasedeficiency)；魁北克血小板疾病(quebecplateletdisorder)；红细胞磷脂缺陷伴溶血(redcellphospholipiddefectwithhemolysis)；难治性血细胞减少症伴单系发育不良(refractorycytopeniawithunilineagedysplasia)；revesz综合征(reveszsyndrome)；雷诺氏综合症(reynoldssyndrome)；rh缺乏综合征(rhdeficiencysyndrome)；罗赛-多夫曼病(rosai-dorfmandisease)；rotor综合征(rotorsyndrome)；斯科特综合征(scottsyndrome)；重度先天性中性粒细胞减少症常染色体显性遗传(severecongenitalneutropeniaautosomaldominant)；重度先天性中性粒细胞减少症常染色体隐性遗传3(severecongenitalneutropeniaautosomalrecessive3)；塞萨里综合征(sezarysyndrome)；shwachman-diamond综合征(shwachman-diamondsyndrome)；镰状β地中海贫血(sicklebetathalassemia)；镰状细胞-血红蛋白d病(sicklecell-hemoglobinddisease)；镰刀型细胞贫血症(sicklecellanemia)；铁粒幼细胞性贫血(sideroblasticanemia)；铁粒幼细胞性贫血和线粒体肌病(sideroblasticanemiaandmitochondrialmyopathy)；铁粒幼细胞性贫血吡哆醇难治性常染色体隐性遗传(sideroblasticanemiapyridoxine-refractoryautosomalrecessive)；铁粒幼细胞性贫血吡哆醇反应性常染色体隐性遗传(sideroblasticanemiapyridoxine-responsiveautosomalrecessive)；慢通道先天性肌无力综合征(slow-channelcongenitalmyasthenicsyndrome)；斯奈登综合征(sneddonsyndrome)；口细胞增多症i(stomatocytosisi)；口细胞增多症ii(stomatocytosisii)；sturge-weber综合征(sturge-webersyndrome)；脐上腹中缝和面部海绵状血管瘤(supraumbilicalmidabdominalrapheandfacialcavernoushemangiomas)；瓣上主动脉瓣狭窄(supravalvularaorticstenosis)；苏萨克综合征(susacsyndrome)；swyer综合征(swyersyndrome)；系统性肥大细胞增多症(systemicmastocytosis)；富含t细胞/组织细胞的大b细胞淋巴瘤(t-cell/histiocyterichlargebcelllymphoma)；高安动脉炎(takayasuarteritis)；tar综合征(tarsyndrome)；地中海贫血(thalassemia)；硫胺素反应性巨幼细胞性贫血综合征(thiamineresponsivemegaloblasticanemiasyndrome)；胸喉骨盆发育不良(thoracolaryngopelvicdysplasia)；血小板病无脾缩小(thrombocytopathyaspleniamiosis)；血小板减少症2(thrombocytopenia2)；伴有血清iga升高和肾脏疾病的血小板减少症(thrombocytopeniawithelevatedserumigaandrenaldisease)；血栓调节蛋白异常，家族性(thrombomodulinanomalies,familial)；获得性血栓性血小板减少性紫癜(thromboticthrombocytopenicpurpura,acquired)；儿童短暂性红细胞减少症(transienterythroblastopeniaofchildhood)；一过性骨髓增生综合征(transientmyeloproliferativesyndrome)；磷酸丙糖异构酶缺乏症(triosephosphateisomerasedeficiency)；结节性硬化症(tuberoussclerosis)；簇状血管瘤(tuftedangioma)；双胞胎输血综合征(twintotwintransfusionsyndrome)；1型纤溶酶原缺乏症(type1plasminogendeficiency)；unicentriccastleman病(unicentriccastlemandisease)；血管ehlers-danlos综合征(vascularehlers-danlossyndrome)；盖伦动脉瘤静脉(veinofgalenaneurysm)；vonhippel-lindau病(vonhippel-lindaudisease)；冯维勒布兰德病(vonwillebranddisease)；温抗体溶血性贫血(warmantibodyhemolyticanemia)；白血小板综合征(whiteplateletsyndrome)；威廉姆斯综合征(williamssyndrome)；wiskottaldrich综合征(wiskottaldrichsyndrome)；wt肢体血液综合征(wtlimbbloodsyndrome)；wyburn-mason综合征(wyburn-masonsyndrome)；x连锁铁粒幼细胞性贫血(x-linkedsideroblasticanemia)；x连锁血小板减少症和黄指甲综合征(x-linkedthrombocytopeniaandyellownailsyndrome)。[0259]溶酶体贮积症可以例如选自戈谢病(gaucher’sdisease)(葡萄糖脑苷脂酶缺乏-基因名称：gba)、法布里病(fabry’sdisease)(α-半乳糖苷酶缺乏-gla)、亨特病(hunter'sdisease)(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶缺乏-ids)、hurler病(hurler'sdisease)(α-l艾杜糖醛酸酶缺乏症-idua)和尼曼-皮克病(niemann-pick'sdisease)(鞘磷脂磷酸二酯酶1缺乏症-smpd1)。[0260]在具体实施方案中，由个体中缺乏蛋白质或存在异常的非功能性蛋白质引起的疾病可以选自下组：血友病b(hemophiliab)、血友病a(hemophiliaa)、腺苷脱氨酶缺乏症(adenosinedeaminasedeficiency)、β-地中海贫血(beta-thalassemia)、镰刀形红细胞贫血症(sicklecellanemia)、wiskottaldrich综合征(wiskottaldrichsyndrome)、x连锁无丙种球蛋白血症(x-linkedagammaglobulinemia)、慢性肉芽肿病(cgd)(chronicgranulomatousdisease)、普通变异免疫缺陷(commonvariableimmunodeficiency)、x连锁scid(x-linkedscid)、ada缺陷型scid(ada-deficientscid)、共济失调毛细血管扩张症(ataxiatelangiectasia)、omenn综合征(omennsyndrome)、范可尼贫血(fanconianemia)、whim综合征(whimsyndrome)、法布里病(fabrydisease)、沃尔曼病(wolmandisease)、因子v缺乏症(factorvdeficiency)、因子v莱顿易栓症(factorvleidenthrombophilia)、因子vii缺乏症(factorviideficiency)、因子x缺乏症(factorxdeficiency)、因子xi缺乏症(factorxideficiency)、因子xii缺乏症(factorxiideficiency)、因子xiii缺乏症(factorxiiideficiency)。[0261]在另一实施方案中，本文所述的idlv、分离细胞或药物组合物可用于治疗选自下组的疾病：免疫疾病、病毒感染、肿瘤和血液疾病。[0262]实际上，根据本发明的实施方案，本发明的治疗性蛋白质可以是可用于中和靶蛋白(如细菌毒素)或直接引起疾病的蛋白质(例如黄斑变性中的vegf)以及高度选择性地杀死其持久性和复制危及宿主的细胞(例如癌细胞，以及自身免疫性疾病中的某些免疫细胞)的蛋白质的治疗性抗体。[0263]本发明还涉及用于预防和/或治疗以下的方法：[0264]-选自下组的疾病：免疫疾病、病毒感染、肿瘤和血液疾病；和/或[0265]-因缺乏蛋白质或在有需要的个体中存在异常的非功能性蛋白质而引起的疾病；[0266]包括向有需要的个体施用至少根据本发明的idlv。[0267]本发明还涉及用于预防和/或治疗以下的方法：[0268]-选自下组的疾病：免疫疾病、病毒感染、肿瘤和血液疾病；和/或[0269]-因缺乏蛋白质或在有需要的个体中存在异常的非功能性蛋白质而引起的疾病；[0270]包括向有需要的个体施用至少根据本发明的分离细胞。[0271]本发明还涉及用于预防和/或治疗以下的方法：[0272]-选自下组的疾病：免疫疾病、病毒感染、肿瘤和血液疾病；和/或[0273]-因缺乏蛋白质或在有需要的个体中存在异常的非功能性蛋白质而引起的疾病；[0274]包括向有需要的个体施用至少根据本发明的药物组合物。[0275]本发明进一步涉及本发明的idlv、本发明的分离细胞或本发明的药物组合物在制备用于预防和/或治疗以下的药物中的用途：[0276]-选自下组的疾病：免疫疾病、病毒感染、肿瘤和血液疾病；和/或[0277]-因缺乏蛋白质或在有需要的个体中存在异常的非功能性蛋白质而引起的疾病。[0278]根据本发明产生car-t细胞的方法[0279]根据本发明还提供用于产生car-t细胞的方法。[0280]本发明实际上还涉及用于产生car-t细胞的方法，该方法包括将至少一种如上定义的idlv整合到淋巴细胞t细胞中，[0281]所述idlv包含编码靶向癌细胞的嵌合抗原受体的转基因作为至少一个目标核酸序列。idno：76))进行了定性pcr(pcr2)(kapa2gfastreadymix；kapabiosystem)，产生了823bp的扩增产物。[0309]对pcr2产物进行sanger测序并与基因组序列比较以评估是否存在任何错配。[0310]84％整合供体dna表达了gfp(62个克隆中的52个)，其中85％是作为切割idlv插入的(52个克隆中的44个)。由于存在mh序列，100％的切割idlv以无缝方式整合，与野生型基因组序列相比没有核苷酸变化。图2b是克隆的分子分析的汇总表。[0311]实施例3：idlv转导和核酸酶切割之间的最佳时机[0312]随后，发明人进行了另外的实验以寻找idlv转导和核酸酶切割之间的最佳时机，使得idlvki的效率达到最高。[0313]为此，发明人用gp33idlv转导野生型k562(如实施例1)，并在不同时间点用体外预组装的cas9/grna复合物(rnp)转染细胞。在每个指定的时间点，用18μlsfcellline4d-nucleofector试剂盒使用nucleofectoramaxa4d(lonza)和2.75μl所述hba15.1或hba16.1rnp对2×105个转导的细胞进行洗涤和核转染。cas9与grna(hba15.1或hba16.1)的组装通过混合30μm经细菌纯化的cas9蛋白和45μm的synthego的合成grna引导物(比例分别为1:1.5)使用适当体积的缓冲液10x在室温下混合10分钟来进行。[0314]2周后，发明人通过facs评估了gfp表达，并观察到idlv和rnp递送之间延迟24-32小时可以保证最佳的gfp表达，其中切割后的idlv比未切割的idlv性能提高约10倍(图3)。ki的更高效率可以用rnp技术更高的切割性能来解释；事实上，rnp结果的indel频率远高于使用grna质粒获得的效率(图1)。[0315]实施例4：经idlv转导的bddfviii敲入[0316]由于目前hsc基因组编辑技术的问题之一是可以整合的dna的大小，本发明人决定通过在idlv中插入大的治疗相关转基因来挑战他们的方法。因此，它们将gfp(大约700ntd)与bddfviii编码序列交换：cof8(～4400ntd；参考)(图4a)。[0317]如实施例1，发明人用idlvfviii转导k562-cas9，然后用编码靶向idlv和基因组dna的grna的质粒(hba15.1)转染它们。为了测定idlvki的效率和精确度，他们对从k562-cas9单细胞克隆中提取的基因组dna进行pcr分析(图4b)。[0318]对于pcr1，使用kapa2gfastreadymix(kapabiosystem)对是否存在整合的cofviii盒进行pcr筛选(正向：gagctgtcctgggactacat(seqidno：77)，反向：gtgatcaccacggtgtcgta(seqidno：78)，扩增子230bp)。[0319]为了证实合适的5'基因组dna-idlv连接，发明人使用基因组特异性引物(tatcgccagagggaaaggga(seqidno：79)和cofviii7r(gggttttcttgtacaccacgc(seqidno：80)引物、845bp的扩增子进行定性pcr(pcr2)(kapa2gfastreadymix；kapabiosystem)。[0320]82％的整合供体dna作为切割idlv插入(11个克隆中的9个)。由于存在mh序列，100％的切割idlv以无缝方式整合，与野生型基因组序列相比没有核苷酸变化。图4c是克隆的分子分析的汇总表。[0321]两周后，发明人通过elisa分析大量群体和细胞上清液中的5个克隆的fviii表达(asserachromviii：ag(stago)elisa试剂盒)。由于idlvfviii无启动子，仅在以下情况下获得表达：i)将idlv以正确的方向和作用方式整合在预期的基因座处；ii)k562细胞能够产生和分泌功能完全的fviii。fviii产量表示为24h中通过2×106个细胞产生的fviii量(图4d)。[0322]总之，该数据表明根据本发明的idlv可以有效地递送fviii并在内源启动子的控制下整合它。产生的fviii被细胞有效地分泌，并保持其酶活性。[0323]实施例5：经idlv转导的gfp敲入(idlvgp35)[0324]本发明人进一步设计了在不同位置具有grna-t的idlv(gp35)以允许其设计的更多灵活性。为此，它们插入表达盒，所述表达盒按从5'到3'的顺序含有：i)grna-t；ii)无启动子的gfp；iii)pgk驱动的嘌呤霉素转基因。该盒以相对于载体ltr的反义方向插入。作为对照，发明人设计了缺失grna-t序列以及gfp上游的mh5'序列的类似idlv(图5a)。[0325]用这些idlv转导k562-cas9细胞，24h后，用hba15.1grna编码质粒转染。[0326]gfp表达分析再次显示，与对照idlv相比，grna-t的存在使idlvki增加了几乎8倍(图5b)。[0327]indel的％与已经被cas9切割的基因组等位基因的百分比相关。[0328]实施例6：[0329]最后，本发明人证实根据本发明的方法也可用于修饰临床相关细胞，如cd34 人hspc。[0330]发明人培养hsc48小时，用gfpidlv(gp33)转导它们，24小时后用rnp(hba15.1)转染它们。[0331]作为对照，本发明人使用仅切割基因组dna而不切割idlv的hba16.1。然后，细胞向红细胞系分化以诱导α-珠蛋白表达。[0332]为此，将动员的外周血hspc(所有细胞)解冻并在预刺激培养基中培养48h(stemspan，干细胞技术；rhscf300ng/ml，flt3-l300ng/ml，rhtpo100ng/ml和il-320ng/ml，cellgenix)。在预刺激培养基中存在硫酸鱼精蛋白(4μg/ml)的情况下，在涂有逆转录酶的板(5μg/孔)上用idlvgp33转导hspc。[0333]转导后24小时，洗涤细胞并用rnp电穿孔(cas9:grnahba15.1；如实施例3)。使用p3原代细胞4d-nucleofector试剂盒(lonza)，用rnp复合物对每种条件的2×105个细胞进行核转染。[0334]将hspc在红细胞分化培养基中培养14天(stemspan，干细胞技术；rhscf20ng/ml，epo1u/ml，il35ng/ml，地塞米松2μm和β雌二醇1μm)。通过流式细胞术在分化过程中监测gfp表达。[0335]尽管两种grna的切割效率相似(indel效率)，但facs分析表明，靶向idlv的核酸酶产生的gfp阳性细胞比标准idlv多10倍(图6a)。[0336]发明人将hspc铺板在甲基纤维素中以获得单细胞集落并在体外监测hspc多能性。在核转染后，将每种条件的103个细胞与3ml甲基纤维素培养基(h3434，干细胞技术)混合用于菌落形成单位(cfc)测定。[0337]14天后，计数菌落并根据其外观评分。将菌落记为粒细胞/红细胞/单核细胞/巨核细胞形成单位(cfu-gemm)、粒细胞/巨噬细胞形成单位(cfu-gm)或红细胞爆裂形成单位(bfu-e)。[0338]重要的是，与未处理的对照相比，ki方法对祖细胞没有毒性或没有任何谱系偏移(图6b)。[0339]在倒置荧光显微镜下挑选单个gfp阳性克隆。在标准条件下用蛋白酶k(thermofisherscientific)裂解后提取dna。如实施例2所述对基因组dna进行分子分析。[0340]本发明人观察到gfp在红细胞(bfu；99个中的13个)中的表达，但在粒细胞/巨噬细胞菌落中没有，这再次表明gfp表达是由红细胞特异性的α-珠蛋白启动子驱动的。为了进一步确认idlvki的精确性，他们对从gfp 单个菌落中提取的基因组dna进行了pcr分析，以确认靶向(on-target)供体dna的整合。[0341]100％插入的idlv被切割，并且由于mh序列的存在，90％被切割的idlv以无缝方式整合，与野生型基因组序列相比没有核苷酸变化(图6c)。[0342]实施例7：[0343]发明人根据本发明产生了编码hpgk、gfp的idlv(称为gp57)，并在hpgk的5'处插入grna靶向序列(grna-t)以切割idvl，以及与目标基因组位点同源的～40bp的短同源序列(微同源，mh)。类似地，他们产生了另外两个idlv(根据本发明的gp58和ma277对照)，它们分别缺乏mh或mh和grna-t(图7a)。[0344]为此，发明人用每个指定的idlv转导野生型k562细胞(如实施例1)并且，24小时后，用18μlsfcellline4d-nucleofector试剂盒使用nucleofectoramaxa4d(lonza)和2.75μl所述hba15.1rnp对2×105个转导的细胞进行转染。cas9与grna(hba15.1)的组装是通过将30μm的细菌纯化的2-nlscas9蛋白和45μm的synthego的合成grna引导物(比例分别为1:1.5)使用适当体积的缓冲液10x在室温下混合10分钟。[0345]2周后，发明人通过facs评估gfp的表达，并且观察到切割idlvdna后，阳性细胞的比例增加了约4倍，表明与对照idlv相比，对于根据本发明的两种idlv构建体(有和没有同源臂序列)，基因组dna中的gfpki更有效率。vcn(载体拷贝数)与gfp 细胞的％相关。indel的％与被cas9切割的基因组等位基因的百分比相关。(图7b)。[0346]这些结果清楚地表明，切割idlv会增加基因组的定向整合。[0347]实施例8：[0348]为了证实idlvki的效率和精确性，发明人对从实施例7结束时获得的k562单细胞克隆中提取的基因组dna进行了pcr分析(图8a)。[0349]365个单细胞克隆是通过连续稀释gfp 细胞(facs分选)aavs1idlv细胞获得的，如图7所述处理。[0350]对pcr1产物进行sanger测序以确定是否存在任何错配。[0351]2周后，使用“magnapure96dnaandviralnasmallvolume”试剂盒(产品编号：06543588001-罗氏)提取基因组dna，并使用thermofisherscientificas的nanodrop8000分光光度计进行定量。[0352]使用kapa2gfastreadymix；kapabiosystem，通过图8a中所示的pcr有义整合和pcr反义整合进行靶向整合的筛选(sense引物：正向:5’cagctcaggttctgggagag3’(seqidno:81),反向:5’gcgaacggacgtgaagaatg3’(seqidno:82)；antisense引物:正向:5’gcgaacggacgtgaagaatg3’(seqidno:82),反向:5’cttgtaggcctgcatcatca3’(seqidno:83))。[0353]图8b汇总显示了用于靶向整合的克隆的分子分析的结果。[0354]这些结果清楚地表明，与没有同源序列的idlv相比，在idlv的grna切割位点旁边存在与基因组靶点同源的短序列，可以以预定的方向和无缝的方式介导idlv在基因组中的整合。[0355]接下来，发明人通过pcr分析研究了从实施例7结束时获得的k562单细胞克隆中提取的所述dna中的脱靶整合(图8c)。[0356]对从k562单细胞克隆中提取的基因组dna进行pcr分析以筛选一种主要的脱靶整合，是基于使用kapa2gfastreadymix；kapabiosystem使用pcr有义和pcr反义(sense引物:正向:5’ggtggaagggaacaggaagg3’(seqidno:84),反向:5’gcgaacggacgtgaagaatg3’(seqidno:82)andantisense引物:正向:5’gcgaacggacgtgaagaatg3’(seqidno:82),反向:5’gatgtgctgtcacctagggg3’(seqidno:85))。[0357]图8d中汇总了用于脱靶整合的克隆的分子分析的结果。[0358]这些结果以及图8b中的结果清楚地表明，在idlv的grna切割位点旁边存在基因组靶点同源的短序列，可以介导idlv在基因组中的整合(优选靶向vs脱靶位点)，其与没有同源序列的idlv相比高出1.5倍。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本发明涉及基因组工程和dna修复领域。2.特别地，本发明涉及能够在细胞基因组中进行精确且无毒的序列整合的idlv，其具有通过高效敲入(ki)实现的高效率。
背景技术：
：：3.对抗由功能缺失突变引起的有害细胞表型的主要治疗方法之一依赖于野生型基因拷贝的细胞内递送。对此，病毒介导的基因替代疗法作为一个快速发展的领域，已经提供了一些受限于对转基因拷贝数和表达水平的不完全控制的解决方案；此外，慢病毒和逆转录病毒载体的半随机整合可导致原癌基因的插入诱变和活化，而腺相关载体(aav)和腺病毒载体将dna作为附加体递送，其在循环细胞中被稀释。4.近年来，已经开发出一种使用具有位点特异性核酸酶的基因组dna切割来使转基因整合入选定基因座。一种途径涉及将转基因整合到其同源基因座中，例如将野生型转基因插入到内源基因座上以纠正突变基因。或者，可以将转基因插入专门选择的具有益特性(诸如永久、安全和非常高效的转基因表达)的非同源基因座。5.尽管令人感兴趣，但实现转基因的高效且无毒的递送以及高效的特异性位点整合仍然是待解决的复杂问题。6.使用工程化核酸酶的靶向基因组编辑正在革命性地改变基础生物医学研究，并为基因治疗带来巨大的潜力。但是，尽管进展迅速，但由于缺乏有效的工具，所追求的用于临床目的的靶向转基因整合(敲入，ki)的目标仍未实现。虽然已经成功描述了分裂和非分裂细胞中的ki，但是转基因递送的主要手段是质粒dna，其在原代细胞(尤其是造血干细胞，hsc)中是有毒的，因此不能靶向特定细胞，且对于体内递送也是不可行的。7.病毒载体dna递送代表质粒dna的目标替代物，特别是aav和整合缺陷型慢病毒载体(idlv)。慢病毒是 单链rna(～9.7kb)，并且一旦进入细胞核，就被逆转录以生成双链dna，其被半随机地整合到宿主细胞基因组中。idlv通过灭活整合酶蛋白而衍生自慢病毒，从而阻断它们整合到基因组中的能力。idlv基因组在缺失前以不同的分子形式持续存在于细胞核中。遗憾的是，idlv代表同源(hdr)和非同源末端连接(nhej)的低效dna底物。8.aav是单链dna病毒(～4.7kb)，并且一旦进入靶细胞的细胞核，就变成双链且成环形以作为附加体持续存在。aav是hdr介导的ki的良好底物；但是，hdr受其在大多数原代细胞中的低效率的限制，并且主要发生在细胞周期的s/g2期，使得其在非分裂细胞中是低效的。此外，对于hdr，需要用与基因组dna切割位点同源的基因组片段侧接转基因(每个～800bp)，这限制了可以通过aav递送的转基因的大小(约4.7kb的装载容量)，并且可以影响aav生产和转导(例如在二级结构的情况下)。因此，大约6％的所有人蛋白(其具有超过4kb的编码序列)与aav和表达元件(诸如启动子和聚腺苷酸化信号(polya信号))不适配，需要减小尺寸，通常限制了它们的转录强度和组织特异性(chamberlain,riyadandweber,hum.genether.methods.2016feb；27(1):1-12)。最近，不依赖同源性的ki策略被描述为在大脑和肌肉中体内进行aav的基于nhej的ki；但是，报道的效率非常低，在大多数情况下小于5％，并且整合的dna片段的大小非常小，小于700bp(suzukietal.,nature.2016dec1；540(7631):144-149)。9.对于hsc中的ki，已经采用含有同源臂的idlv和aav用于hdr介导的ki。对于idlv，仅报道了极低的离体效率和极低小鼠移植后的最小值(《1％kuoetal.cellrep.2018may29；23(9):2606-2616；～5％genoveseetal.nature.2014jun12；510(7504):235-240；almostundetectable,schirolietal.,scitranslmed.2017oct11；9(411)；《1％hoban,blood,2015,apr23；125(17):2597-604)。aav6更有希望，且最新报道显示其体外ki效率可达30-40％；但是，aav对干细胞也有毒性，因为它们诱导p53活化和细胞凋亡(hirsch,plosone,2011；6(11):e27520)。aav6转导显示一些细胞毒性(kuoetal.cellrep.2018may29；23(9):2606-2616)和减少经修饰的造血干细胞的移植(schirolietal.,cellstemcell,2019apr4；24(4):551-565)。此外，hdr介导的ki主要发生在祖细胞中，以真正的长期hsc为代价，其靶向少～5倍(gomez-ospinaetal.,humangenome-editedhematopoieticstemcellsphenotypicallycorrectmucopolysaccharidosistypei；bioarchive；doi:https://doi.org/10.1101/408757)。最后，如上所述，aav递送受到其包装限制的影响。10.因此，需要有一种在细胞中有效、位点特异性且无毒的转基因递送方法。确实需要新的工具以允许精确、高效且无毒地向细胞递送目标序列。特别地，所述方法和工具允许递送具有显著可变大小的目标序列，特别是允许递送具有至少1kb(千碱基)，特别是几kb大小的序列。11.本文所述的发明目的是满足上述需要。技术实现要素：12.首先，本发明涉及包含核酸的整合缺陷型慢病毒载体(idlv)，所述核酸在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含：13.a.至少一个核输出信号序列，特别是至少一个hiv-1rev应答元件(rre)，特别是一个rre，14.b.至少一个选自下组的目标核酸序列：polya信号；剪接信号序列；dna或rna结合位点；启动子；和编码治疗性蛋白或者是治疗性核糖核酸的转基因或其片段，15.c.至少一个核酸酶位点，特别是至少一个引导核酸靶向序列(grna-t)，16.d.任选地，至少一个同源臂序列，其包括与细胞基因组中的目标内源基因组位点的一部分同源的序列；和17.e.任选地，至少一个允许增强至少一个目标核酸序列的稳定表达的序列，特别是至少一个土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)序列。18.事实上，本发明人设法产生能够在细胞基因组中进行精确且无毒的序列整合的新型idlv，其通过有效的ki实现高效率，即使整合的序列具有相当长的长度(～9kb)。19.本发明特别涉及包含核酸的整合缺陷型慢病毒载体(idlv)，所述核酸在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含：20.a.至少一个核输出信号序列，特别是至少一个hiv-1rev应答元件(rre)，特别是一个rre，21.b.至少一个选自下组的目标核酸序列：polya信号；剪接信号序列；dna或rna结合位点；启动子；和编码治疗性蛋白或者是治疗性核糖核酸的转基因或其片段，22.c.至少一个核酸酶位点，特别是至少一个引导核酸靶向序列(grna-t)，23.d.至少一个同源臂序列，其包括与细胞基因组中的目标内源基因组位点的一部分同源的序列；和24.e.任选地，至少一个允许增强至少一个目标核酸序列的稳定表达的序列，特别是至少一个土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)序列。25.事实上，在具体实施方案中，根据本发明的idlv包含：26.d.至少一个同源臂序列，其包括与细胞基因组中的目标内源基因组位点的一部分同源的序列。27.根据具体实施方案，idlv是圆形或线性的，特别是圆形的。28.根据本发明的实施方案，idlv包含至少两个相同或不同的核酸酶位点，特别是至少两个相同或不同的grna-t序列，特别是两个相同或不同的grna-t序列。特别地，至少一个目标核酸序列包含在所述idlv的至少两个，特别是两个核酸酶位点之间。29.根据本发明的实施方案，本发明的idlv的至少一个核酸酶位点与包含在d点的细胞基因组中的目标内源基因组位点中的内源核酸酶位点相同或不同。30.在具体实施方案中，本发明的idlv的至少一个目标核酸序列是编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因或其片段。31.特别地，治疗性蛋白可以选自下组：细胞因子，特别是干扰素，更特别是干扰素-α、干扰素-β或干扰素-pi；激素；趋化因子；抗体(包括纳米抗体)；抗血管生成因子；用于替代治疗的酶，例如腺苷脱氨酶、α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-l-尿素酶和β-葡糖苷酶；白细胞介素；胰岛素；g-csf；gm-csf；hpg-csf；m-csf；凝血因子，诸如因子viii、因子ix、tpa、因子v、因子vii、因子x、因子xi、因子xii或因子xiii；跨膜蛋白，诸如神经生长因子受体(ngfr)；溶酶体酶，诸如α-半乳糖苷酶(gla)、α-l-艾杜糖苷酶(idua)、溶酶体酸性脂肪酶(lal)和半乳糖胺(n-乙酰)-6-硫酸酯酶(galns)；β样珠蛋白；白介素受体，诸如il-2受体、il-3受体、il-4受体、il-5受体、il-6受体、il-7受体、il-9受体、il-11受体、il-12受体、il-13受体、il-15受体、il-21受体、il-23受体和il-27受体；wiskott-aldrich综合症蛋白(wasp)；腺苷脱氨酶、三肽基肽酶1、α-l-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、n-磺基葡糖胺磺基水解酶、半乳糖胺-6-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶a、细胞色素b-245α链、细胞色素b-245β链、嗜中性粒细胞胞质因子1、嗜中性粒细胞胞质因子2和嗜中性粒细胞胞质因子4；可以被工程化为分泌的并最终被非修饰细胞摄取的任何蛋白质，及其组合。32.在本发明的实施方案中，所述idlv包含至少两个同源臂序列，特别是两个，每个都彼此不同，并且包括与细胞基因组中的目标内源基因组位点的至少两个，特别是两个不同部分同源的序列。33.在具体实施方案中，本发明的idlv不包含启动子。34.在本发明的实施方案中，细胞基因组中目标内源基因组位点包含在珠蛋白基因中，特别选自下组：ε珠蛋白基因、γg珠蛋白基因、γa珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、β珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、假δ珠蛋白基因、μ珠蛋白基因、假α1珠蛋白基因、α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因，特别是选自下组：γg珠蛋白基因、γa珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、β珠蛋白基因、α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因，更特别选自下组：α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因。35.在另一个实施方案中，本发明的idlv的序列a-c，以及d和e(如果存在)以下列顺序之一存在于idlv中，从5'到3'：[0036]-a，c，d，b；[0037]-a，c，d，b，e；[0038]-a，c，d，b，d，c；[0039]-a，c，d，b，d，c，e；[0040]-a，d，c，d，b；[0041]-a，d，c，d，b，e；[0042]-a，c，b，d，c，e；或[0043]-a，c，d，b，c，e。[0044]本发明的另一目的涉及包含至少一种本发明的idlv的分离细胞。[0045]特别地，所述细胞选自下组：造血干细胞；免疫系统细胞，特别是淋巴细胞；多能干细胞；胚胎干细胞；卫星细胞；神经干细胞；间充质干细胞；视网膜干细胞；和上皮干细胞，并且特别是造血干细胞。[0046]本发明的另一目的涉及包含至少一种本发明的idlv和/或至少一种本发明的分离细胞以及药学上可接受的介质的药物组合物。[0047]本发明的另一目的涉及本发明的idlv，本发明的分离细胞或本发明的药物组合物，其用于治疗：[0048]-选自下组的疾病：免疫性疾病、病毒性感染、肿瘤或血液病；和/或[0049]-在有需要的个体中因缺乏蛋白质或存在异常的非功能性蛋白质而引起的疾病。[0050]本发明的另一目的涉及用于产生car-t细胞的方法，其包括将至少一种本发明的idlv整合到淋巴细胞t细胞或造血干细胞中，[0051]所述idlv包含编码靶向癌细胞的嵌合抗原受体的转基因作为至少一个目标核酸序列。[0052]本发明的另一目的涉及用于产生表达抗体的b细胞的方法，其包括将至少一种本发明的idlv整合到淋巴细胞b细胞或造血干细胞中，[0053]所述idlv包含编码抗体的转基因作为至少一个目标核酸序列。附图说明[0054]图1a：根据本发明的idlv的示意图，其在长末端重复序列(ltr)序列之间从左到右包含rev应答元件(rre)、grna切割位点(grna-t)(grna)(核酸酶位点)、与将整合入idlv的细胞基因组中的目标内源基因组位点的一部分同源的35bp的微同源序列(mh5')(同源臂)、编码无启动子(δ)绿色荧光蛋白(gfp)的序列和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。该盒相对于ltr和rre病毒序列是有义方向。[0055]图1b：cas9切割后的细胞基因组中idlv整合的一种可能结果的示意图。内源性α-珠蛋白启动子(hs1-4)驱动gfp的表达，其被插入到α-珠蛋白启动子和α基因(hba)之间。[0056]图1c：表中显示了门控细胞的gfp 细胞的％和gfpmfi(中值荧光强度)值，其通过使用在点(a)中描述的idlv和不同的grna(hba15.1或hba16.1)将gfp整合到hba基因中之后，通过流式细胞仪分析k562-cas9细胞(稳定表达cas9的人白血病细胞系k562)中的gfp表达来测量。还测量了实施grna的两种方法的indel效率。显示了用“无grna”作为对照获得的结果。[0057]图2a：用于分析k562-cas9细胞克隆中的idlv基因组整合的pcr示意图。双箭头表示用于扩增的引物。[0058]图2b：所分析的163个克隆的dna和facs的分析汇总表。为了确定整合是否是无缝的，发明人对pcr2的每个pcr产物进行了sanger测序。[0059]图3：用图1a所示的本发明的idlv转导k562细胞，并且在表中所示的时间量(4小时、8小时、24小时、32小时或48小时)后，使用不同的grna(hba15.1或hba16.1)用rnp(预组装的cas9/grna复合物)转染该细胞。[0060]在idlv转导2周后，在idlv和rnp递送之间间隔4小时、8小时、24小时、32小时和48小时后进行gfp表达的流式细胞术分析。没有引入rnp的情况作为对照。[0061]表中显示了门控细胞的gfp 细胞的％和gfpmfi(中值荧光强度)值。还测量了实施hba15.1grna或hba16.1grna的两种方法的indel效率。还显示了对照组获得的结果。[0062]图4a：根据本发明的idlv的示意图，其在长末端重复序列(ltr)序列之间从左到右包含rev应答元件(rre)、grna切割位点(grna-t)(grna)(核酸酶位点)、与将整合入idlv的细胞基因组中的目标内源基因组位点的一部分同源的35bp的微同源序列(mh5')(同源臂)、编码无启动子(δ)密码子的优化因子viii(fviii)(cof8)序列和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。该盒相对于ltr和rre病毒序列是有义方向。[0063]图4b：用于分析k562-cas9细胞克隆中的idlv基因组整合的pcr示意图。双箭头表示用于扩增的引物。[0064]该图还显示了cas9切割后的k562-cas9细胞基因组中idlv整合的一种可能结果的示意图。内源性α-珠蛋白启动子(hs1-4)驱动gfp的表达，其被插入到α-珠蛋白启动子和α基因(hba)之间。[0065]图4c：所分析的27个克隆的dna和elisa分析的汇总表。为了确定整合是否是无缝的，发明人对来自pcr2的每个pcr产物进行了sanger测序。[0066]图4d：对于存在于具有fviii盒的靶向整合的批量和单个k562-cas9克隆的上清液中的fviii，进行双份elisa后获得的结果(测试1和2)。[0067]自上而下：克隆12、克隆24、克隆26、克隆27、ut(未处理细胞)、cellbulk(gp34bulk)、nnf(未转染细胞-gp34nnf)。[0068]图5a：根据本发明的idlv的示意图，其在长末端重复序列(ltr)序列之间，从左到右包含grna切割位点(grna-t)(grna)(核酸酶位点)、与将整合入idlv的细胞基因组中目标内源基因组位点的一部分同源的35bp的微同源序列(mh5')(同源臂)、编码无启动子(δ)绿色荧光蛋白(gfp)的序列、聚腺苷酸化信号a(polya信号或pa)、驱动嘌呤霉素抗性基因(puro)的组成型表达的人磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子和rev应答元件(rre)。该盒相对于ltr和rre病毒序列是反义方向。[0069]在该示意图的正下方是另一个与对照盒相对应的示意图。该盒与上文所述的盒不同之处在于其不包含所述切割位点(grna-t)(grna)(核酸酶位点)和所述35bp的mh5'同源臂序列。[0070]图5b：表中显示了门控细胞的gfp 细胞的％和gfpmfi(中值荧光强度)值，其通过使用在点(a)中描述的idlv和hba15.1grna将gfp整合到k562-cas9细胞的hba基因中之后，通过流式细胞仪分析k562-cas9细胞中的gfp表达来测量。还测量了indel的效率。还显示了用“无grna-t序列”作为对照获得的结果。[0071]图6a：表中显示了门控细胞的gfp 细胞的％和gfpmfi(中值荧光强度)值，其通过使用图1a中所述的idlv和不同的grna(hba15.1或hba16.1)将gfp整合到细胞的hba基因中之后，通过流式细胞仪分析红细胞分化初级hspc中的gfp表达测得来测量。还测量了indel的效率。[0072]图6b：经编辑细胞的菌落形成单位(cfu)测定。柱状图代表具有标准偏差的两个板的平均计数。[0073]纵坐标：计数[0074]横坐标：从左到右：来自图6a的含有hba15.1(gp33hba15)的细胞；来自图6a的不含任何grna(gp33)的细胞；来自图6a的含有hba16.1(gp33hba16)的细胞，未处理的细胞(ut)。[0075]在每列中，从底部到顶部：cfu-gemm(粒细胞/巨噬细胞形成单位；bfu-e(红细胞系爆裂形成单位)和cfu-gm(粒细胞/红细胞/单核细胞/巨核细胞形成单位)。[0076]图6c：13cfu的dna分析汇总表。为了确定整合是否是无缝的，发明人对来自pcr2的每个pcr产物进行sanger测序(如图2b所示)。[0077]图7a：[0078]第一行：根据本发明的idlv(gp57)的示意图，其在长末端重复序列(ltr)序列之间从左到右包含rev应答元件(rre)、grna切割位点(grna-t)(grna)(核酸酶位点＝seqidno.67＝gtcccctccaccccacagtg)、与将整合入idlv的细胞基因组中目标内源基因组位点的一部分同源的35bp的微同源序列(mh5')(同源臂)、人磷酸甘油酸激酶启动子(pgk)、绿色荧光蛋白(gfp)和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。该盒相对于ltr和rre病毒序列是有义方向。[0079]第二行：根据本发明的idlv(gp58)的示意图，其与第一行所示的idlv的区别仅在于其不包含35bp的mh5'同源臂序列。[0080]第三行：对照组idlv(ma277)的示意图，其与第一行所示的idlv的区别仅在于其不包含35bp的mh5'同源臂序列或grna切割位点。[0081]图7b：表中显示了门控细胞的gfp 细胞的％和gfpmfi(中值荧光强度)值，其通过使用在点(a)中描述的idlv构建体和使用aavs1grna的rnp，将gfp整合到aavs1基因座之后，通过流式细胞仪分析k562细胞中的gfp表达来测量。还测量了indel的效率和载体拷贝数(vcn)。还显示了用“无-grna-t序列”对照获得的结果。[0082]图8a：用于分析实施例7中实验后获得的k562细胞克隆中靶向idlv基因组整合的pcr示意图。双箭头表示用于扩增的引物。[0083]图8b：分析365个克隆的dna的分析汇总表。为了确定整合是否是无缝的，本发明人对来自图8a中所述的第一pcr的每个pcr产物进行了sanger测序。[0084]图8c：用于分析实施例7中实验后获得的k562细胞克隆中脱靶idlv基因组整合的pcr示意图。双箭头表示用于扩增的引物。[0085]图8d：365个克隆的一项主要脱靶dna分析的汇总表。具体实施方式[0086]如上所述，本发明人设法产生能够在细胞基因组中进行精确且无毒的序列整合的idlv，其具有通过高效ki实现的高效率。此外，本发明人证明该idlv甚至允许对具有相当长度的序列进行整合。[0087]在本发明的idlv靶向的细胞核中，慢病毒rna基因组被逆转录以生成dsdna。用核酸酶靶向该dsdna将产生更易于与其它dna末端相互作用的游离dna末端。因此，如果在相同的细胞中产生基因组dna切割，本发明人得以实现目标序列ki的增加。[0088]整合缺陷型慢病毒载体[0089]本发明涉及包含核酸的整合缺陷型慢病毒载体(idlv)，所述核酸在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含：[0090]a.至少一个核输出信号序列，特别是至少一个hiv-1rev应答元件(rre)，特别是一个rre，[0091]b.至少一个选自下组的目标核酸序列：polya信号；剪接信号序列；dna或rna结合位点；启动子；和编码治疗性蛋白或者是治疗性核糖核酸的转基因或其片段，[0092]c.至少一个核酸酶位点，特别是至少一个引导核酸靶向序列(grna-t)，和[0093]d.至少一个同源臂序列，其包括与细胞基因组中的目标内源基因组位点的一部分同源的序列。[0094]在本文中，ltr表示本领域技术人员公知的“长末端重复序列”。[0095]在本文中，涉及与另一序列位置相比的序列位置的术语“上游”和“下游”应以5'至3'方向考虑：当从5'读到3'时，上游序列位于另一序列“之前”(因此是下游序列)。[0096]所谓之前，在没有相反说明的情况下，指的是紧邻的之前或者是非紧邻的之前。[0097]除了侧翼有两个长末端重复(ltr)序列的其他辅助基因外，慢病毒还具有gag、pol和env基因。[0098]与其它慢病毒一样，idlv包含重组基因组，所述重组基因组在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含慢病毒衣壳蛋白psi序列、rna核输出信号序列、目标核酸序列(例如转基因)、剪接供体/受体位点和cppt序列(dulletal.(1998)j.vir.72:8463；sirvenetal.(2000)blood,(96)203))。例如，idlv构建体的设计已经描述于shawetal.biomedecines,2014,2,14-35中。[0099]idlv的产生与本领域公知的慢病毒载体相似。本领域技术人员可以参考本领域的一般知识，特别是由mertenetal.(2016)moleculartherapy(3)16017,sharonandkamen(2017)biotechnologyandbioengineering(115)25,mertenetal.(2011)hum.genether22(3)343,schweizerandmerten(2010)cur.genether.10(6)474,ansorgeetetal.(2010).biochem.eng.j.48(3):362所代表。idlv可以例如使用慢病毒载体产生，所述慢病毒载体在自身慢病毒整合酶基因本身或在病毒ltr的整合酶识别序列中包含一个或多个突变，如yanez-munozetal.(2006)natmed12(3):348-353；nightingaleetal.(2006)molther13(6):1121-1132,w02006/010834andwo2009/019612所述。优选地，所述idlv包含防止所述基因组整合到宿主细胞基因组中的突变整合酶。在具体实施方案中，idlv携带在酶的催化结构域中具有突变d64v的缺陷型整合酶。[0100]根据本发明的idlv可以是假型化的，即其包含来自不同于衍生自病毒(该病毒不同于从中衍生出idlv的病毒)的包膜糖蛋白、经修饰的包膜糖蛋白或嵌合的包膜糖蛋白。在具体实施方案中，idlv被vsv-g、galv-tr、rd114或合胞素糖蛋白假型化。[0101]序列a：核输出信号序列[0102]如上所述，本发明的idlv的具体特征在于其在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含至少一个核酸，所述至少一个核酸包含至少一个核输出信号序列。[0103]该至少一个核输出信号序列可以在本发明的idlv中仅存在一次。[0104]更特别地，该核输出信号序列可以在上述序列b到e的上游。[0105]因此，在具体实施方案中，本发明的idlv的具体特征在于其包含含有在上述序列b到e上游的一个核输出信号序列的核酸序列。[0106]根据本发明的核输出信号序列优选是hiv-1rev应答元件(rre)。[0107]rre序列(rev应答元件)是～350个核苷酸的rna序列，特别是已知在rev蛋白结合后允许病毒信使rna从细胞核输出至细胞质溶胶，因此是病毒复制所必需的。但是，也已经证明慢病毒载体中这种元件的存在是高效的载体功能的必要条件(例如，参见ansonandfuller；j.genemed.2003；5:829-838)。[0108]在本发明的具体实施方案中，本发明的idlv的特征在于其包含含有一个rre序列的核酸，所述rre序列位于上文提及的和下文描述的序列b到e的上游。[0109]序列b：目标核酸序列[0110]如上所述，特别地，本发明的idlv的特征在于其在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含至少一个核酸，所述至少一个核酸包含至少一个目标核酸序列。[0111]目标核酸选自下组：polya信号；剪接信号序列；dna或rna结合位点；启动子；和编码治疗性蛋白或者是治疗性核糖核酸的转基因或其片段。[0112]polya信号通常是aauaaa序列，其诱导rna在所述信号下游约10-30个核苷酸处的切割。其后为多重单磷酸腺苷(amp)的序列，即仅具有腺嘌呤碱基的序列。其例如由50-300个单磷酸腺苷，特别是70-250个单磷酸腺苷构成。[0113]剪接信号序列可分为剪接位点本身序列和辅助信号，诸如外显子剪接增强子、内含子剪接增强子和外显子剪接沉默子。所有剪接位点符合共有序列，包括在内含子末端的几乎不变的二核苷酸：内含子的5'末端为gt、3'末端为ag，且通常在5'剪接位点具有序列mag|gtragt并且在3'剪接位点具有cag|g。[0114]dna或rna结合位点涉及例如转录激活物，转录阻遏物或表观遗传修饰物的结合位点以调节内源基因转录。rna结合位点可以例如用于结合蛋白的rna序列，以影响rna稳定性、rna定位、rna核输出/输入；microrna介导的转基因抑制或敲除的microrna结合位点。[0115]根据本发明的转基因编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸。[0116]在本发明的实施方案中，所述治疗性蛋白或治疗性核糖核酸可以是对其中存在idlv的细胞，特别是对其中编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的序列被整合到细胞基因组中目标内源基因组位点中的细胞提供治疗效果的任何蛋白质或核糖核酸。[0117]在本发明的另一实施方案中，所述治疗性蛋白可以是在其中存在idlv的细胞外，特别是在其中编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的序列被整合到细胞基因组中目标内源基因组位点中的细胞外提供治疗效果的任何蛋白质。所述治疗性蛋白确实可以由所述细胞分泌，或者可以部分(例如跨膜蛋白)或完全存在于所述细胞的表面上。[0118]特别地，治疗性蛋白选自下组：细胞因子，特别是干扰素，更特别是干扰素-α、干扰素-β或干扰素-pi；激素；趋化因子；抗体(包括纳米抗体)；抗血管生成因子；用于替代治疗的酶，例如腺苷脱氨酶、α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-l-尿素酶和β-葡糖苷酶；白细胞介素；胰岛素；g-csf；gm-csf；hpg-csf；m-csf；凝血因子，诸如因子viii、因子ix、tpa、因子v、因子vii、因子x、因子xi、因子xii或因子xiii；跨膜蛋白，诸如神经生长因子受体(ngfr)；溶酶体酶，诸如α-半乳糖苷酶(gla)、α-l-艾杜糖苷酶(idua)、溶酶体酸性脂肪酶(lal)和半乳糖胺(n-乙酰)-6-硫酸酯酶(galns)；β样珠蛋白；白介素受体，诸如il-2受体、il-3受体、il-4受体、il-5受体、il-6受体、il-7受体、il-9受体、il-11受体、il-12受体、il-13受体、il-15受体、il-21受体、il-23受体和il-27受体；wiskott-aldrich综合症蛋白(wasp)；腺苷脱氨酶、三肽基肽酶1、α-l-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、n-磺基葡糖胺磺基水解酶、半乳糖胺-6-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶a、细胞色素b-245α链、细胞色素b-245β链、嗜中性粒细胞胞质因子1、嗜中性粒细胞胞质因子2、嗜中性粒细胞胞质因子4；可以被工程化为分泌的并最终被非修饰细胞摄取的任何蛋白质，及其组合。[0119]本发明所述的转基因可以例如编码至少一种β样珠蛋白和/或至少一种β样珠蛋白核糖核酸，特别是编码至少一种功能性β样珠蛋白。根据本发明的β样珠蛋白基因是指选自下组的基因：ε珠蛋白(ε)、γg珠蛋白(gγ)、γa珠蛋白(aγ)、δ珠蛋白(δ)和β珠蛋白(β)基因。特别地，根据本发明的β样珠蛋白基因表示β珠蛋白基因。[0120]根据本发明的转基因可以编码一种以上的治疗性蛋白和/或治疗性核糖核酸。例如，根据本发明的转基因可以编码两种治疗性蛋白，特别是两种不同的治疗性蛋白。所述治疗性蛋白如上文所定义。在另一实施方案中，根据本发明的转基因可以编码两种治疗性核糖核酸，特别是两种不同的治疗性核糖核酸。所述治疗性核糖核酸如上文所述。在另一实施方案中，根据本发明的转基因可以编码一种治疗性蛋白和一种治疗性核糖核酸，所述治疗性蛋白和治疗性核糖核酸特别如上文所定义。[0121]本发明还涉及如上所述的转基因的片段。所述片段可以是目标治疗性蛋白的一部分，其具有与所述治疗性蛋白相同的性质，达到较高，相似或较低的强度/水平。[0122]在具体实施方案中，至少一个目标核酸序列是编码治疗性蛋白或治疗性核糖核酸的转基因或其片段。[0123]在具体实施方案中，根据本发明的idlv仅包含目标核酸序列。[0124]在另一实施方案中，根据本发明的idlv在目标核酸序列之前和/或之后紧邻包含至少一个本文所述的同源臂序列(序列d)。[0125]在本发明的具体实施方案中，根据本发明的idlv仅包含一个目标核酸序列和至少一个存在于所述目标核酸序列之前和/或之后紧邻的同源臂序列。[0126]在具体实施方案中，根据本发明的idlv包含两个同源臂序列，一个同源臂序列在至少一个、特别是一个目标核酸序列的上游，另一个同源臂序列在至少一个、特别是一个目标核酸序列的下游。[0127]在另一实施方案中，根据本发明的idlv包含两个同源臂序列，所述两个同源臂序列在至少一个、特别是一个目标核酸序列的上游。[0128]序列c：核酸酶位点[0129]如上所述，特别地，本发明的idlv的特征在于其在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含至少一个核酸酶位点。[0130]根据本发明的核酸酶位点是rna序列，一旦逆转录成双链dna，其将被核酸酶识别。因此，核酸酶将切割核酸的核苷酸之间的磷酸二酯键。取决于核酸酶，该作用将在单链或双链上进行，导致识别的dna序列中的单链或双链断裂。[0131]例如，所述核酸酶位点可以是一个含引导肽的核酸内切酶的识别位点，该核酸内切酶结合到选自转录激活物样效应物核酸酶(talen)或锌指核酸酶的选定靶位点。[0132]talen技术包含一个与特异性dna结合结构域融合的非特异性dna切割结构域(核酸酶)。特异性dna结合结构域由来源于转录激活物样效应物(tale)的高度保守的重复序列组成，所述转录激活物样效应物是由黄单胞菌细菌分泌以改变宿主植物细胞中基因转录的蛋白质。dna切割结构域或切割半结构域可以从foki等各种限制性核酸内切酶和/或归巢核酸内切酶(例如foki型iis限制性内切核酸酶)获得(参见wrightetal.(biochem.j.2014aug.15；462(1):15-24))。[0133]锌指核酸酶(zfn)技术包括使用由锌指dna结合结构域与dna切割结构域(核酸酶)融合产生的人工限制酶。锌指结构域特异性靶向目标dna序列，其允许相关的核酸酶靶向复杂基因组内的独特序列。[0134]锌指dna结合结构域包含双指(two-finger)模块链，每个识别dna的独特六聚体(6bp)序列。双指模块缝合在一起形成锌指蛋白。在talen技术中，dna切割结构域包含foki的核酸酶结构域(carrolld,genetics,2011aug；188(4):773-782；urnovf.d.natrevgenet.(9):636-46,(2010))。[0135]在另一个实施方案中，核酸酶位点可以是由缺乏靶标位点特异性的核酸内切酶(如rna引导的核酸内切酶)靶向的位点。该rna引导的内切核酸酶可以特别是成簇的规则间隔的短回文重复序列(crispr)相关蛋白(cas)，特别是crispr相关蛋白9(cas9)。[0136]在该实施方案中，核酸酶位点被一种或多种引导核酸，特别是引导rna(grna)识别。由引导核酸，特别是由引导rna识别的本发明所述的核酸酶位点也称为引导核酸靶向序列(grna-t)。该引导核酸特异性靶向并识别本发明所述的核酸酶位点。该引导核酸还与缺乏靶标位点特异性的核酸内切酶连接，所述核酸内切酶将切割如上所述的idlv的核酸酶位点。[0137]任何grna可用于靶向根据本发明的核酸酶位点，只要它特异性地靶向它。例如，可以使用根据本发明的grna，特别是靶向珠蛋白基因内的核酸酶位点的grna，更特别是靶向存在于选自下组的任何一种基因中的核酸酶位点的grna：ε珠蛋白基因、γg珠蛋白基因、γa珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、β珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、假δ珠蛋白基因、μ珠蛋白基因、假α1珠蛋白基因、α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因，特别是选自下组：γg珠蛋白基因、γa珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、β珠蛋白基因、α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因，更特别选自下组：α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因。[0138]上述grna可以例如选自下组：如hba-4、hba-10、hba-12、hba-14、hba19.1、hba15.1、hba16.1、hba17-g、hba20.1、hba5.1、grna2、grna3、grna11、hbaint172.1、hbaint173.2、hbaint173b.1、hbaint213.2、hbaint263.2、hbaint274.1、hbb37.1、hbb49.2、hbb53.1、hbb54.1、hbb77.1、hbbint136.2、hbbint136.2rev、hbbint147.1、hbbint148.1、hbbint2340.1、hbbint2797.1、hbbint220.1、hbbint239.2、hbbko和hbbaavs1，其靶向如下表1所示的序列。[0139][0140][0141]表1[0142]特别地，根据本发明的idlv在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含一个或两个核酸酶位点。[0143]当两个核酸酶位点存在于本发明的idlv的5'ltr序列和3'ltr序列之间时，它们可以是不同的或相同的。特别地，它们是不同的。[0144]在具体实施方案中，本发明的idlv包含至少两个相同或不同的核酸酶位点，特别是至少两个相同或不同的grna-t序列，特别是两个相同或不同的grna-t序列。[0145]根据该实施方案中，本发明的idlv的特征可以在于其包含至少一个目标核酸序列，其包含在所述idlv的至少两个，特别是两个核酸酶位点之间。[0146]在本发明的实施方案中，该至少一个核酸酶位点与d点的包含在细胞基因组中的目标内源基因组位点中的内源性核酸酶位点相同或不同。[0147]在具体实施方案中，在包含在本发明所述的idlv中的核酸的5'ltr序列和3'ltr序列之间：[0148]-当仅存在一个核酸酶位点时，其在至少一个目标核酸序列的上游；[0149]-当存在多于一个核酸酶位点时，特别是当存在两个核酸酶位点时，至少一个、特别是一个核酸酶位点在至少一个目标核酸序列的上游，并且至少一个、特别是一个核酸酶位点在至少一个目标核酸序列的下游。[0150]在具体实施方案中，在本发明的idlv中包含的核酸的5'ltr序列和3'ltr序列之间，当存在多于一个核酸酶位点时，特别是当存在两个核酸酶位点时，至少一个、特别是一个核酸酶位点在至少一个同源臂序列的上游，并且至少一个、特别是一个核酸酶位点在至少一个同源臂序列的下游。[0151]在具体实施方案中，本发明的idlv的特征在于，在5'ltr序列和3'ltr序列之间，至少一个核酸酶位点与至少一个同源臂序列直接相邻。[0152]“直接相邻”是指核酸酶位点直接位于根据本发明的核酸中同源臂序列的上游或下游。[0153]序列d：同源臂[0154]如上所述，本发明的idlv任选地包含核酸，该核酸在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含至少一个同源臂序列。在具体实施方案中，本发明的idlv包含核酸，该核酸在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含至少一个同源臂序列。[0155]该至少一个同源臂序列包括与细胞基因组中，特别是旨在将idlv整合入其中的细胞基因组中的目标内源基因组位点的一部分同源的序列。本发明的idlv中的同源臂将特别有利于将至少一个目标核酸序列定向敲入到目标内源基因组位点中。[0156]旨在将idlv整合到其中并因此其基因组包含目标内源基因组位点的这种细胞在本文中进一步描述并且也称为分离细胞。[0157]根据一个实施方案，所述细胞特别选自下组：造血干细胞；免疫系统细胞，特别是淋巴细胞；多能干细胞；胚胎干细胞；卫星细胞；神经干细胞；间充质干细胞；视网膜干细胞；和上皮干细胞，并且特别是造血干细胞。[0158]特别地，本发明的idlv在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含一个或两个同源臂序列。[0159]示例性的同源臂长度包括至少20、30、40、50、100、250、500、750、1000、2000、3000、4000或5000个核苷酸。在一些实施方案中，同源臂长度为50-100、100-250、250-500、500-750、750-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000或4000-5000个核苷酸。[0160]根据一个实施方案，同源臂序列为40个核苷酸。[0161]在具体实施方案中，本发明所述的idlv中同源臂序列的位置紧邻至少一个目标核酸序列的上游(即5')和/或紧邻其下游(即3')。[0162]因此，在本发明的实施方案中，当本发明的idlv在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含一个同源臂序列时，所述同源臂序列紧邻至少一个目标核酸序列，特别是一个目标核酸序列的上游(即5')和/或紧邻其下游(即3')。[0163]根据具体实施方案，idlv包含至少两个同源臂序列，特别是两个，每个都彼此不同，并且包括与细胞基因组中的目标内源基因组位点的至少两个，特别是两个不同部分同源的序列。[0164]当本发明的idlv在5'ltr序列和3'ltr序列之间包含两个同源臂序列时，至少一个所述同源臂序列紧邻至少一个目标核酸序列，特别是一个目标核酸序列的上游(即5')和/或紧邻其下游(即3')。[0165]根据本发明的目标内源基因组位点可以是基因的外显子、基因的内含子、启动子、基因的5'utr区、基因的3'utr区或基因间序列。[0166]特别地，它可以是安全港。[0167]安全港是宿主基因组中的染色体位置，其中本发明的至少一个目标核酸序列可以以可预测的方式整合和发挥功能，而不干扰内源基因活性或促进癌症(sadelainetal.,natrevcancer.2011dec1；12(1):51-8)。安全港，也称为基因组安全港(gsh)，是细胞基因组的基因内或基因外区域，其能够适应新整合的dna的可预测表达而对宿主细胞或生物体没有不利影响。有用的安全港必须允许足够的转基因表达，以产生所需水平的本发明的至少一个目标核酸序列。[0168]作为可以在人细胞中用作安全港的人基因组的特定基因内位点，可以提及例如腺相关病毒位点1(aavs1)(染色体19位置19q13.42)、趋化因子(cc基序)受体5(ccr5)基因位点(染色体3位置3q21.31)和小鼠rosa26基因位点的人直向同源基因(染色体3位置3q25.3)。[0169]在具体实施方案中，细胞基因组中目标内源基因组位点包含在珠蛋白基因中，特别是选自下组：ε珠蛋白基因、γg珠蛋白基因、γa珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、β珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、假δ珠蛋白基因、μ珠蛋白基因、假α1珠蛋白基因、α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因，特别是选自下组：γg珠蛋白基因、γa珠蛋白基因、δ珠蛋白基因、β珠蛋白基因、α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因，更特别选自下组：α1珠蛋白基因和α2珠蛋白基因。[0170]在具体实施方案中，根据本发明的目标内源基因组位点在旨在被本发明的至少一个目标核酸序列完全或部分替代的基因中。实际上，根据本发明的转基因可以整合到其同源基因座中，例如将野生型转基因插入到内源基因座中以纠正突变基因。[0171]在另一实施方案中，根据本发明的内源目的基因组位点是t细胞中的t细胞受体编码基因。根据该实施方案，根据本发明的目标内源基因组位点可特别编码嵌合抗原受体(car，也称为嵌合免疫受体，人工t细胞受体或嵌合t细胞受体)，其能够靶向靶标，同时当与所述靶标(抗原)结合时能够激活t细胞免疫功能。相应获得的car-t细胞(嵌合抗原受体t细胞)是本领域众所周知的，用于治疗许多疾病，特别是用于治疗癌症(rajeetal.n.engl.j.med.380；18；1726-1737)。[0172]在另一实施方案中，根据本发明的内源目的基因组位点是b细胞中的免疫球蛋白编码基因。根据该实施方案，根据本发明的目标内源基因组位点可特别编码治疗性蛋白，更特别是免疫球蛋白或其片段(vossetal.elife2019；8:e42995andt-ccheong；natcommun.2016mar9；7:10934)。[0173]在另一实施方案中，根据本发明的目标内源基因组位点是造血干细胞(hsc)中的t细胞受体编码基因或免疫球蛋白编码基因。[0174]序列e：增强目标核酸序列(序列b)稳定表达的序列[0175]如上所述，本发明的idlv在5'ltr序列和3'ltr序列之间可包含至少一个允许增强至少一个目标核酸序列的稳定表达的序列。[0176]特别地，该允许增强至少一个目标核酸序列的稳定表达的至少一种序列是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)序列。[0177]土拨鼠肝炎病毒(whp)转录后调控元件(wpre)是597个核苷酸或更少的序列(schambachetal.,genether.2006apr；13(7):641-5)，其转录时产生增强表达的三级结构。该序列在分子生物学领域常用于增强由病毒载体递送的基因的表达。wpre是具有γ、α和β组分的三部分调节元件。α组分长80bp，可单独使用，但优选与γ和β组分组合使用。[0178]在具体实施方案中，本发明的idlv仅包含一种允许增强至少一个目标核酸序列的稳定表达的序列。[0179]在具体实施方案中，本发明的idlv仅包含一个土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)序列。[0180]在本发明的具体实施方案中，本发明的idlv的特征在于，在5'ltr序列和3'ltr序列之间，该允许增强至少一个目标核酸序列的稳定表达的至少一个序列在上述序列a-d的下游。[0181]在本发明的具体实施方案中，本发明的idlv的特别在于，在5'ltr序列和3'ltr序列之间，至少一个、特别是一个wpre序列在上述序列a-d的下游。[0182]在具体实施方案中，如上定义的序列a-c，以及d和e(如果存在)以下列顺序之一存在于idlv中，从5'至3'：[0183]-a，c，d，b；[0184]-a，c，d，b，e；[0185]-a，c，d，b，d，c；[0186]-a，c，d，b，d，c，e；[0187]-a，d，c，d，b；[0188]-a，d，c，d，b，e；[0189]-a，c，b，d，c，e；或[0190]-a，c，d，b，c，e。[0191]根据具体实施方案，根据本发明的idlv是圆形或线性的，特别是圆形的。更特别地，根据具体实施方案，根据本发明的idlv的胞内形式是圆形或线性的，特别是圆形的。[0192]根据另一个实施方案，本发明的idlv是线性的。特别地，根据另一个实施方案，本发明的idlv的胞内形式是线性的。[0193]根据具体实施方案，idlv不包含启动子。[0194]分离细胞[0195]如上所述，本发明还涉及包含至少一种根据本发明所定义的idlv的分离细胞。[0196]根据具体实施方案，分离细胞选自下组：造血干细胞(hsc)；免疫系统细胞，特别是淋巴细胞；诱导的多能干细胞；胚胎干细胞；卫星细胞；神经干细胞；间充质干细胞；视网膜干细胞；和上皮干细胞，并且特别是造血干细胞。[0197]在本发明的具体实施方案中，分离细胞不同于胚胎干细胞。[0198]hsc是能够自我更新的多能干细胞，其特征在于它们具有在适合条件下产生造血系统的所有细胞类型的能力。hsc不是全能细胞，即它们不能发育成完整的生物体。[0199]在具体实施方案中，根据本发明的hsc来源于胚胎干细胞，特别是来源于人胚胎干细胞，并且因此是胚胎造血干细胞。[0200]胚胎干细胞(esc)是衍生自胚胎的未分化内团细胞并能够自我更新的干细胞。在合适条件下，这些多能干细胞能够在成体(adultbody)中的超过220种细胞类型中的任一种中分化。esc不是全能细胞，即它们不能发育成完整的生物体。esc可以根据youngchung等人所述方法获得(youngchungetal.cellstemcell2,2008february7；2(2):113-7)。[0201]在另一具体实施方案中，根据本发明的hsc是诱导性多能干细胞，更特别是人诱导性多能干细胞(hipscs)。因此，根据具体实施方案，本文所述的hsc是造血诱导性多能干细胞。[0202]hipsc是表现出类似于esc的多能干细胞样状态的遗传重编程成体细胞。它们是人工培育的干细胞，已知它们不存在于人体中，但表现出与esc相似的性质。如yingwang等人(https://doi.org/10.1101/050021)和lapillonneh等人(haematologica.2010；95(10))和j.dias等人(stemcellsdev.2011；20(9):1639-1647)所述，产生所述细胞的方法是本领域的公知常识。[0203]“自我更新”是指细胞分裂并产生至少一个具有与亲代细胞相同(例如，自我更新)特征的子代细胞的能力。第二子代细胞可以定向于特定的分化途径。例如，自我更新hsc可以分裂并形成一个子干细胞和另一个在骨髓或淋巴途径中起分化作用的子细胞。自我更新提供了用于补充造血系统的未分化干细胞的连续来源。[0204]用于鉴定hsc的标记表型是本领域公知的。对于人hsc，细胞标记表型优选包括cd34 cd38low/-cd49f cd59 cd90 cd45ra-thy1 c-kit lin-的任意组合(nottaf,science.333(6039):218-21(2011))。对于小鼠hsc，细胞标记物表型可以示例性地为cd34low/-sca-1 c-kit 和lin-cd150 cd48-cd90.1.thy1 /lowflk2/flt3-和cd117 的任意组合(参见例如frascolietal.(j.vis.exp.2012jul8；(65).pii:3736)。[0205]免疫系统的细胞是宿主防御系统的一部分，其包括生物体内的许多防止疾病的生物结构和过程。根据本发明，免疫系统的细胞包括先天免疫系统的细胞和适应性免疫系统的细胞。[0206]先天免疫系统的细胞的实例包括白细胞，诸如吞噬细胞(巨噬细胞，嗜中性粒细胞和树突细胞)、先天淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和天然杀伤细胞。[0207]适应性免疫系统的细胞的实例包括淋巴细胞，特别是b细胞和t细胞，诸如杀伤性t细胞、辅助性t细胞。[0208]根据具体实施方案中，根据本发明的分离细胞是淋巴细胞。[0209]卫星细胞，也称为肌卫星细胞或肌肉干细胞，是在成熟肌肉中发现的具有极少细胞质的小多能细胞。卫星细胞是骨骼肌细胞的前体，能够产生卫星细胞或分化的骨骼肌细胞。它们具有向其母体肌纤维提供额外肌核或返回静止状态的潜力。更具体地，通过活化，卫星细胞可重新进入细胞周期以增殖和分化为成肌细胞。[0210]神经干细胞(nsc)是自我更新的多能细胞，其首先产生放射状神经胶质祖细胞，其在胚胎发育期间产生所有动物的神经系统的神经元和神经胶质。一些神经祖干细胞持续存在于成年脊椎动物脑中高度受限的区域，并在整个生命中持续产生神经元。[0211]间充质干细胞是能分化为多种细胞类型的多能基质细胞，包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。由于这些细胞是传统上在骨髓中发现的成体干细胞，它们也称为骨髓基质细胞。但是，它们也可以分离自其它组织，包括脐带血、外周血、输卵管、胎儿肝和肺。[0212]视网膜干细胞，也称为视网膜祖细胞，是能够分化成视网膜中存在的不同细胞类型的多能细胞。[0213]诱导多能干细胞(ipsc)是一类多能干细胞，其可以直接从如上所述的成体细胞产生。因为它们可以无限繁殖，以及在体内产生所有其他细胞类型(诸如神经元、心脏、胰腺和肝细胞)，所以它们代表可用于替代那些因损伤或疾病而损失的细胞的单一来源。获得诱导多能干细胞的方法属于本领域技术人员的常识。[0214]上皮干细胞在组织稳态、伤口修复和癌发生中起重要作用。已经证实角膜上皮干细胞存在于角膜缘上皮中，而结膜的穹窿区似乎是结膜上皮干细胞的主要部点。角膜和结膜上皮以及毛囊和滤泡间表皮的干细胞共有重要特征：它们能够自我更新；它们相对静止(慢循环)；能够诱导它们增殖；并且它们是多能性的。显然，在角膜和毛囊角质细胞之间存在一定程度的柔性。[0215]优选纯化本文所述的分离细胞。[0216]如本文所用，“纯化的细胞”是指所述细胞占纯化样品中细胞的至少50％；更优选地，纯化样品中细胞的至少51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。[0217]细胞的选择和/或纯化可包括阳性和阴性选择方法，以获得基本上纯的细胞群。[0218]在一个方面，荧光激活细胞分选(facs)作为一种流式细胞术技术，可用于分选和分析不同的细胞群。具有特定细胞标记的细胞被抗体标记，或典型地是与细胞标记结合的抗体混合物。针对不同标记物的每种抗体与可检测分子，特别是荧光染料缀合，所述荧光染料可与偶联于其它抗体的其它荧光染料区分。使染色的细胞流通过激发荧光染料的光源，并且来自细胞的发射光谱检测特定标记抗体的存在。通过同时检测不同的荧光染料，显示不同组细胞标记的细胞被鉴定并与群体中的其它细胞分离。其它facs参数，包括但不限于如侧向散射(ssc)、前向散射(fsc)和活性染料染色(例如，用碘化丙啶)可以基于大小和生存力选择细胞。[0219]在另一个方面，免疫磁性标记可用于分选不同的细胞群。该方法基于通过抗体或凝集素将小的可磁化颗粒附着到细胞上。当将混合的细胞群置于磁场中时，附着有磁珠的细胞将被磁体吸引从而与未标记的细胞分离。[0220]根据具体实施方案中，根据本发明进行遗传修饰的hsc呈现β-血红蛋白病表型，即与健康的相应细胞相比呈现β样珠蛋白的表达减少。特别地，根据本发明进行遗传修饰的hsc细胞呈现β-地中海贫血或镰状细胞病表型。[0221]在具体实施方案中，本文所述的分离细胞，特别是hsc是哺乳动物细胞，特别是人细胞。[0222]在具体实施方案中，分离细胞的初始群体可以是自体的。[0223]“自体的”是指衍生自或来源于同一患者或个体。“自体移植”是指受试者自身细胞或器官的采集和再输注或移植。单独或补充使用自体细胞可以消除或减少将细胞回输宿主的许多副作用，特别是移植物抗宿主反应。[0224]在这种情况下，从所述个体收集分离细胞，根据本文所述的方法进行离体或体外遗传修饰，并施用于同一个体。[0225]在另一实施方案中，分离细胞的初始群体可以衍生自同种异体供体或来自多个同种异体供体。供体可以彼此相关或不相关，并且在移植情况下，与受体(或个体)相关或不相关。[0226]因此，如本文所述的待修饰的分离细胞对于需要治疗的个体可以是外源性的。[0227]本文所述的分离细胞可重悬于药学上可接受的载体中并直接使用，或可通过本领域技术人员可选的各种细胞纯化技术进行处理，诸如facs分选、磁性亲和分离和免疫亲和柱。[0228]药物组合物[0229]本发明还涉及药物组合物，其包含至少一种如本文所述的idlv和/或至少一种如本文所述的分离细胞，以及药学上可接受的介质。[0230]如本文所述的药学上可接受的介质特别适合施用于哺乳动物个体。[0231]“药学上可接受的介质”包括本领域普通技术人员在配制药物组合物时已知的任何标准的药学上可接受的介质，例如盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、乙醇水溶液或葡萄糖溶液、甘露醇、葡聚糖、丙二醇、油类(例如植物油、动物油、合成油等)、微晶纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸钙、明胶或聚山梨醇酯80等。[0232]如本文所述的药物组合物通常还包含一种或多种缓冲剂(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)；碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)；甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基苯甲醚等)；抑菌剂；螯合剂，诸如edta或谷胱甘肽；使制剂与受体血液等渗、低渗或弱高渗的溶质；悬浮剂；增稠剂和/或防腐剂。[0233]当然，载体的类型典型地会根据施用方式而有所不同。[0234]在一个实施方案中，本文所述的idlv和/或分离细胞可以与治疗化合物组合用于组合物中，其有效地治疗：[0235]-选自下组的疾病：免疫疾病、病毒感染、肿瘤和血液疾病；和/或[0236]-因缺乏蛋白质或在有需要的个体中存在异常的非功能性蛋白质而引起的疾病。[0237]在一个实施方案中，本文所述的idlv和/或分离细胞可以与不同于本发明的idlv和/或不包含根据本发明的idlv的分离细胞组合用于本文所述的组合物中。[0238]在一个实施方案中，本文所述的idlv和/或分离细胞可以与增强所施用的idlv和/或细胞的治疗效果的其他试剂和化合物组合用于本发明的组合物中。[0239]用作药物的idlv和分离细胞[0240]本发明的另一个目的是上文定义的idlv或分离细胞或药物组合物，其用作药物。[0241]如本文所述的idlv、分离细胞和药物组合物通过任何合适的途径(诸如静脉内、心内、鞘内、肌内、关节内或骨髓内)注射并且以足以提供治疗益处的量施用至受试者。[0242]实现治疗效果所需的idlv或分离细胞的量将根据用于具体目的的常规程序凭经aspergillosis)；斑秃——不是一种罕见的疾病(alopeciaareata–notararedisease)；全秃(alopeciatotalis)；普秃(alopeciauniversalis)；淀粉样变性aa(amyloidosisaa)；家族性内脏淀粉样变性病(amyloidosisfamilialvisceral)；共济失调毛细血管扩张症(ataxiatelangiectasia)；自身免疫性淋巴增生综合征(autoimmunelymphoproliferativesyndrome)；ctla4单倍体不足引起的自身免疫性淋巴组织增生综合征(autoimmunelymphoproliferativesyndromeduetoctla4haploinsuffiency)；自身免疫性多腺综合征1型(autoimmunepolyglandularsyndrometype1)；常染色体显性高ige综合征(autosomaldominanthyperigesyndrome)；常染色体隐性早发性炎症性肠病(autosomalrecessiveearly-onsetinflammatoryboweldisease)；常染色体隐性遗传高ige综合征(autosomalrecessivehyperigesyndrome)；裸淋巴细胞综合征2(barelymphocytesyndrome2)；巴特综合征(barthsyndrome)；布劳综合征(blausyndrome)；布鲁姆综合征(bloomsyndrome)；闭塞性细支气管炎(bronchiolitisobliterans)；c1q缺乏症(c1qdeficiency)；念珠菌病家族性慢性皮肤粘膜，常染色体隐性遗传(candidiasisfamilialchronicmucocutaneous,autosomalrecessive)；软骨毛发发育不全(cartilage-hairhypoplasia)；charge综合征(chargesyndrome)；chediak-higashi综合征(chediak-higashisyndrome)；家族性巨颌症(cherubism)；伴有脂肪营养不良和体温升高的慢性非典型中性粒细胞性皮肤病(chronicatypicalneutrophilicdermatosiswithlipodystrophyandelevatedtemperature)；慢性移植物抗宿主病(chronicgraftversushostdisease)；慢性肉芽肿病(chronicgranulomatousdisease)；科恩综合征(cohensyndrome)；联合免疫缺陷伴皮肤肉芽肿(combinedimmunodeficiencywithskingranulomas)；普通变异免疫缺陷(commonvariableimmunodeficiency)；补体成分2缺乏(complementcomponent2deficiency)；补体成分8缺乏1型(complementcomponent8deficiencytype1)；补体成分8缺乏2型(complementcomponent8deficiencytype2)；先天性肺泡蛋白沉积症(congenitalpulmonaryalveolarproteinosis)；冷球蛋白血症(cryoglobulinemia)；皮肤肥大细胞瘤(cutaneousmastocytoma)；周期性中性粒细胞减少症(cyclicneutropenia)；白细胞介素-1受体拮抗剂缺乏症(deficiencyofinterleukin-1receptorantagonist)；树突状细胞、单核细胞、b淋巴细胞和自然杀伤淋巴细胞缺乏症(dendriticcell,monocyte,blymphocyte,andnaturalkillerlymphocytedeficiency)；先天性角化不良(dyskeratosiscongenita)；先天性角化不良常染色体显性遗传(dyskeratosiscongenitaautosomaldominant)；先天性角化不良常染色体隐性遗传(dyskeratosiscongenitaautosomalrecessive)；x连锁的先天性角化不良(dyskeratosiscongenitax-linked)；疣状表皮发育不良(epidermodysplasiaverruciformis)；家族性淀粉样变性，finnish型(familialamyloidosis,finnishtype)；家族性感冒自身炎症综合征(familialcoldautoinflammatorysyndrome)；家族性地中海热(familialmediterraneanfever)；家族性混合冷球蛋白血症(familialmixedcryoglobulinemia)；常见的慢性皮肤黏膜念珠菌病(familiarchronicmucocutaneouscandidiasis)；费尔蒂综合征(felty’ssyndrome)；1b型糖原贮积病(glycogenstoragediseasetype1b)；griscelli综合征2型(griscellisyndrometype2)；桥本脑病(hashimotoencephalopathy)；桥本氏综合症(hashimoto’ssyndrome)；噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(hemophagocyticlymphohistiocytosis)；亨内卡姆综合征(hennekamsyndrome)；伴有免疫缺陷的肝静脉闭塞性疾病(hepaticvenoocclusivediseasewithimmunodeficiency)；遗传性叶酸吸收不良(hereditaryfolatemalabsorption)；hermanskypudlak综合征2(hermanskypudlaksyndrome2)；单纯疱疹脑炎(herpessimplexencephalitis)；hoyeraalhreidarsson综合征(hoyeraalhreidarssonsyndrome)；高ige综合征(hyperigesyndrome)；高igd综合征(hyper-igdsyndrome)；icf综合征(icfsyndrome)；特发性急性嗜酸性粒细胞肺炎(idiopathicacuteeosinophilicpneumonia)；特发性cd4阳性t淋巴细胞减少症(idiopathiccd4positivet-lymphocytopenia)；il12rb1缺乏(il12rb1deficiency)；胸腺缺失导致的免疫缺陷(immunedefectduetoabsenceofthymus)；钙进入缺陷导致t细胞失活的免疫功能障碍1(immunedysfunctionwitht-cellinactivationduetocalciumentrydefect1)；钙进入缺陷导致t细胞失活的免疫功能障碍2(immunedysfunctionwitht-cellinactivationduetocalciumentrydefect2)；高igm1型免疫缺陷(immunodeficiencywithhyperigmtype1)；高igm2型免疫缺陷(immunodeficiencywithhyperigmtype2)；高igm3型免疫缺陷(immunodeficiencywithhyperigmtype3)；高igm4型免疫缺陷(immunodeficiencywithhyperigmtype4)；高igm5型免疫缺陷(immunodeficiencywithhyperigmtype5)；胸腺瘤免疫缺陷(immunodeficiencywiththymoma)；无汗性外胚层发育不良伴免疫缺陷(immunodeficiencywithoutanhidroticectodermaldysplasia)；免疫失调、多内分泌病和x连锁肠病(immunodysregulation,polyendocrinopathyandenteropathyx-linked)；免疫球蛋白a缺乏症2(immunoglobulinadeficiency2)；肠闭锁多发(intestinalatresiamultiple)；irak-4缺乏症(irak-4deficiency)；孤立生长激素缺乏症3型(isolatedgrowthhormonedeficiencytype3)；川崎病(kawasakidisease)；大颗粒淋巴细胞白血病(largegranularlymphocyteleukemia)；白细胞粘附缺陷1型(leukocyteadhesiondeficiencytype1)；lrba缺乏症(lrbadeficiency)；狼疮(lupus)；淋巴细胞性垂体炎(lymphocytichypophysitis)；马吉德综合征(majeedsyndrome)；melkersson-rosenthal综合征(melkersson-rosenthalsyndrome)；mhc1类缺乏症(mhcclass1deficiency)；muckle-wells综合征(muckle-wellssyndrome)；多灶性纤维硬化(multifocalfibrosclerosis)；多发性硬化症(multiplesclerosis)；myd88缺乏症(myd88deficiency)；新生儿多系统炎症性疾病(neonatalonsetmultisysteminflammatorydisease)；新生儿系统性红斑狼疮(neonatalsystemiclupuserythematosus)；内瑟顿综合征(nethertonsyndrome)；中性粒细胞特异性颗粒缺乏症(neutrophil-specificgranuledeficiency)；nijmegen断裂综合征(nijmegenbreakagesyndrome)；联合免疫缺陷病(omennsyndrome)；骨硬化症常染色体隐性遗传7(osteopetrosisautosomalrecessive7)；复发性风湿病(palindromicrheumatism)；papillonlefevre综合征(papillonlefevresyndrome)；部分雄激素不敏感综合征(partialandrogeninsensitivitysyndrome)；帕斯利病(paslidisease)；皮尔逊综合征(pearsonsyndrome)；小儿多发性硬化症(pediatricmultiplesclerosis)；周期性发热、口疮性口炎、咽炎和腺炎(periodicfever,aphthousstomatitis,pharyngitisandadenitis)；pgm3-cdg；中性粒细胞减少症(poikilodermawithneutropenia)；妊娠瘙痒性荨麻疹丘疹斑块(pruriticurticarialpapulesplaquesofpregnancy)；嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症(purinenucleosidephosphorylasedeficiency)；化脓性关节炎、坏疽性脓皮病和痤疮(pyogenicarthritis,pyodermagangrenosumandacne)；复发性多软骨炎(relapsingpolychondritis)；网状发育不全(reticulardysgenesis)；结节病(sarcoidosis)；saybarbermillersyndrome；schimke免疫骨发育不良(schimkeimmunoosseousdysplasia)；施尼茨勒综合征(schnitzlersyndrome)；选择性iga缺乏症(selectiveigadeficiency)；选择性igm缺乏症(selectiveigmdeficiency)；严重的联合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficiency)；由于完全rag1/2缺乏导致的严重联合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficiencyduetocompleterag1/2deficiency)；对电离辐射敏感的严重联合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficiencywithsensitivitytoionizingradiation)；严重联合免疫缺陷，非典型(severecombinedimmunodeficiency,atypical)；重度先天性中性粒细胞减少症常染色体隐性遗传3(severecongenitalneutropeniaautosomalrecessive3)；严重的先天性中性粒细胞减少症x连锁(severecongenitalneutropeniax-linked)；伴有严重联合免疫缺陷的短肢骨骼发育不良(short-limbskeletaldysplasiawithseverecombinedimmunodeficiency)；shwachman-diamond综合征(shwachman-diamondsyndrome)；singleton-merten综合征(singleton-mertensyndrome)；slc35c1-cdg(cdg-iic)；特异性抗体缺乏症(singleton-mertensyndrome)；脊椎软骨发育不良(spondyloenchondrodysplasia)；stevens-johnson综合征/中毒性表皮坏死松解症(stevens-johnsonsyndrome/toxicepidermalnecrolysis)；t细胞免疫缺陷、先天性脱发和指甲营养不良(t-cellimmunodeficiency,congenitalalopeciaandnaildystrophy)；tarp综合征(tarpsyndrome)；trichohepatoenteric综合征(trichohepatoentericsyndrome)；肿瘤坏死因子受体相关周期性综合征(tumornecrosisfactorreceptor-associatedperiodicsyndrome)；双胞胎输血综合征(twintotwintransfusionsyndrome)；维西综合征(vicisyndrome)；whim综合征(whimsyndrome)；wiskottaldrich综合征(wiskottaldrichsyndrome)；伍兹布莱克诺伯里综合征(woodsblacknorburysyndrome)；x连锁无丙种球蛋白血症(x-linkedagammaglobulinemia)；x连锁免疫缺陷与镁缺陷、爱泼斯坦-巴尔病毒感染和瘤形成(x-linkedimmunodeficiencywithmagnesiumdefect,epstein-barrvirusinfectionandneoplasia)；x连锁淋巴增生综合征(x-linkedlymphoproliferativesyndrome)；x连锁淋巴增生综合征1(x-linkedlymphoproliferativesyndrome1)；x连锁淋巴增生综合征2(x-linkedlymphoproliferativesyndrome2)；x连锁严重联合免疫缺陷和zap-70缺乏症(x-linkedseverecombinedimmunodeficiencyandzap-70deficiency)。[0258]如上所述的血液病可以例如选自下组：5q-综合征(5q-syndrome)；aagenaes综合征(aagenaessyndrome)；腹主动脉瘤(abdominalaorticaneurysm)；无β脂蛋白血症(abetalipoproteinemia)；缺过氧化氢酶血(acatalasemia)；铜蓝蛋白血症(aceruloplasminemia)；获得性粒细胞缺乏症(acquiredagranulocytosis)；获得性血友病(acquiredhemophilia)；获得性血友病a(acquiredhemophiliaa)；获得纯红细胞再生thrombocytopenia)；先天性白蛋白血症(congenitalanalbuminemia)；先天性红细胞生成异常性贫血1型(congenitaldyserythropoieticanemiatype1)；先天性红细胞生成异常性贫血2型(congenitaldyserythropoieticanemiatype2)；先天性红细胞生成异常性贫血3型(congenitaldyserythropoieticanemiatype3)；先天性红细胞生成性卟啉病(congenitalerythropoieticporphyria)；先天性肌无力综合征伴发作性呼吸暂停(congenitalmyasthenicsyndromewithepisodicapnea)；先天性肺淋巴管扩张症(congenitalpulmonarylymphangiectasia)；先天性血栓性血小板减少性紫癜(congenitalthromboticthrombocytopenicpurpura)；皮肤肥大细胞瘤(cutaneousmastocytoma)；皮肤松弛，常染色体隐性遗传1型(cutislaxa,autosomalrecessivetype1)；cutismarmoratatelangiectaticacongenita；周期性中性粒细胞减少症(cyclicneutropenia)；周期性血小板减少症(cyclicthrombocytopenia)；主动脉囊性内侧坏死(cysticmedialnecrosisofaorta)；dahlbergborer新人综合征(dahlbergborernewcomersyndrome)；耳聋-淋巴水肿-白血病综合征(deafness-lymphedema-leukemiasyndrome)；脱水遗传性口细胞增多症(dehydratedhereditarystomatocytosis)；脱水遗传性口细胞增多症假性高钾血症和围产期水肿(dehydratedhereditarystomatocytosispseudohyperkalemiaandperinataledema)；diamond-blackfan贫血症(diamond-blackfananemia)；diamond-blackfan贫血2(diamond-blackfananemia2)；diamond-blackfan贫血3(diamond-blackfananemia3)；异常纤维蛋白原血症(dysfibrinogenemia)；先天性角化不良(dyskeratosiscongenita)；先天性角化不良常染色体显性遗传(dyskeratosiscongenitaautosomaldominant)；先天性角化不良常染色体隐性遗传(dyskeratosiscongenitaautosomalrecessive)；x连锁的先天性角化不良(dyskeratosiscongenitax-linked)；ehlers-danlos综合征，纤维连接异常型(ehlers-danlossyndrome,dysfibronectinemictype)；嗜酸性肉芽肿伴多血管炎(eosinophilicgranulomatosiswithpolyangiitis)；持久隆起性红斑(erythemaelevatumdiutinum)；原发性血小板增多症(essentialthrombocythemia)；埃文斯综合征(evanssyndrome)；结外鼻nk/t细胞淋巴瘤(extranodalnasalnk/tcelllymphoma)；法布里病(fabrydisease)；因子v缺乏症(factorvdeficiency)；因子v莱顿易栓症(factorvleidenthrombophilia)；因子vii缺乏症(factorviideficiency)；因子x缺乏症(factorxdeficiency)；因子xi缺乏症(factorxideficiency)；因子xii缺乏症(factorxiideficiency)；因子xiii缺乏症(factorxiiideficiency)；tsh受体突变引起的家族性甲状腺功能亢进症(familialhyperthyroidismduetomutationsintshreceptor)；家族性lcat缺乏症(familiallcatdeficiency)；伴有髓系恶性肿瘤的家族性血小板疾病(familialplateletdisorderwithassociatedmyeloidmalignancy)；家族性胸主动脉瘤和夹层(familialthoracicaorticaneurysmanddissection)；范可尼贫血(fanconianemia)；胎儿和新生儿同种免疫性血小板减少症(fetalandneonatalalloimmunethrombocytopenia)；纤维肌肉发育不良(fibromusculardysplasia)；滤泡性淋巴瘤(follicularlymphoma)；真正的弥漫性静脉扩张症(genuinediffusephlebectasia)；巨细胞动脉炎(giantcellarteritis)；巨血小板综合征(giantplateletsyndrome)；格兰兹曼血小板无力症(glanzmannthrombasthenia)；糖皮质激素可治疗的醛固酮增多症(glucocorticoid-remediablealdosteronism)；谷氨酸甲亚氨基转移酶缺乏症(glutamateformiminotransferasedeficiency)；糖原贮积病12型(glycogenstoragediseasetype12)；糖原贮积病7型(glycogenstoragediseasetype7)；糖蛋白vi缺乏症(glycoproteinvideficiency)；goodpasture综合征(goodpasturesyndrome)；戈勒姆病(gorham’sdisease)；韦格纳肉芽肿(granulomatosiswithpolyangiitis)；肉芽肿性皮肤松弛病(granulomatousslackskindisease)；灰色血小板综合征(grayplateletsyndrome)；毛细胞白血病(hairycellleukemia)；桥本-普利兹克综合征(hashimoto-pritzkersyndrome)；亨氏体贫血(heinzbodyanemias)；血管瘤血小板减少综合征(hemangiomathrombocytopeniasyndrome)；血色病-非罕见病(hemochromatosis-notararedisease)；2型血色素沉着症(hemochromatosistype2)；3型血色素沉着症(hemochromatosistype3)；4型血色素沉着症(hemochromatosistype4)；血红蛋白c病(hemoglobincdisease)；血红蛋白e病(hemoglobinedisease)；血红蛋白sc病(hemoglobinscdisease)；血红蛋白se病(hemoglobinsedisease)；溶血性贫血致死性先天性非球形红细胞性生殖器和其他异常(hemolyticanemialethalcongenitalnonspherocyticwithgenitalandotherabnormalities)；溶血性尿毒症综合征(hemolyticuremicsyndrome)；血友病a(hemophiliaa)；血友病b(hemophiliab)；失血性休克和脑病综合征(hemorrhagicshockandencephalopathysyndrome)；亨内卡姆综合征(hennekamsyndrome)；过敏性紫癜(henoch-schonleinpurpura)；肝素诱导的血小板减少症(heparin-inducedthrombocytopenia)；遗传性抗凝血酶缺乏症(hereditaryantithrombindeficiency)；遗传性椭圆形红细胞增多症(hereditaryelliptocytosis)；遗传性叶酸吸收不良(hereditaryfolatemalabsorption)；遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditaryhemorrhagictelangiectasia)；遗传性出血性毛细血管扩张症2型(hereditaryhemorrhagictelangiectasiatype2)；遗传性出血性毛细血管扩张症3型(hereditaryhemorrhagictelangiectasiatype3)；遗传性出血性毛细血管扩张症4型(hereditaryhemorrhagictelangiectasiatype4)；遗传性淋巴水肿ii型(hereditarylymphedematypeii)；遗传性高铁血红蛋白血症(hereditarymethemoglobinemia)；遗传性副神经节瘤-嗜铬细胞瘤(hereditaryparaganglioma-pheochromocytoma)；遗传性球形红细胞增多症(hereditaryspherocytosis)；hermanskypudlak综合征2(hermanskypudlaksyndrome2)；高分子量激肽原缺乏症(highmolecularweightkininogendeficiency)；组织细胞增多症-淋巴结病加综合征(histiocytosis-lymphadenopathyplussyndrome)；hoyeraalhreidarsson综合征(hoyeraalhreidarssonsyndrome)；糖基磷脂酰肌醇缺乏引起的高凝综合征(hypercoagulabilitysyndromeduetoglycosylphosphatidylinositoldeficiency)；嗜酸性粒细胞增多综合征(hypereosinophilicsyndrome)；过敏性血管炎(hypersensitivityvasculitis)；低补体性荨麻疹性血管炎(hypocomplementemicurticarialvasculitis)；低纤维蛋白原血症，家族性(hypofibrinogenemia,familial)；少毛症-淋巴水肿-毛细血管扩张综合征(hypotrichosis-lymphedema-telangiectasiasyndrome)；特发性中性粒细胞减少症(idiopathicneutropenia)；特发性血小板减少性紫癜(idiopathicthrombocytopenicpurpura)；imerslund-grasbeck综合征(imerslund-grasbecksyndrome)；包涵体肌病2(inclusionbodymyopathy2)；遗传性骨髓衰竭综合征(inheritedbonemarrowfailuresyndromes)；颈内动脉发育不全(internalcarotidagenesis)；内在因素缺乏症(intrinsicfactordeficiency)；铁难治性缺铁性贫血(iron-refractoryirondeficiencyanemia)；雅各布森综合征(jacobsensyndrome)；幼年型粒单核细胞白血病(juvenilemyelomonocyticleukemia)；少年颞动脉炎(juveniletemporalarteritis)；神崎病(kanzakidisease)；卡波西肉瘤(kaposisarcoma)；卡波西样血管内皮瘤(kaposiformhemangioendothelioma)；卡波西样淋巴管瘤病(kaposiformlymphangiomatosis)；川崎病(kawasakidisease)；klippel-trenaunay综合征(klippel-trenaunaysyndrome)；朗格汉斯细胞肉瘤(langerhanscellsarcoma)；大颗粒淋巴细胞白血病(largegranularlymphocyteleukemia)；leschnyhan综合征(leschnyhansyndrome)；利德尔综合征(liddlesyndrome)；水肿(lipedema)；无脑畸形2(lissencephaly2)；loeys-dietz综合征(loeys-dietzsyndrome)；loeys-dietz综合征1型(loeys-dietzsyndrometype1)；loeys-dietz综合征2型(loeys-dietzsyndrometype2)；loeys-dietz综合征3型(loeys-dietzsyndrometype3)；loeys-dietz综合征4型(loeys-dietzsyndrometype4)；淋巴水肿和脑动静脉异常(lymphedemaandcerebralarteriovenousanomaly)；淋巴水肿-分离综合征(lymphedema-distichiasissyndrome)；淋巴瘤样丘疹病(lymphomatoidpapulosis)；马富奇综合征(maffuccisyndrome)；马吉德综合征(majeedsyndrome)；套细胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma)；麦克劳德神经棘红细胞增多症综合征(mcleodneuroacanthocytosissyndrome)；巨脑-毛细血管畸形综合征(megalencephaly-capillarymalformationsyndrome)；二氢叶酸还原酶缺乏引起的巨幼细胞性贫血(megaloblasticanemiaduetodihydrofolatereductasedeficiency)；高铁血红蛋白血症，β-珠蛋白型(methemoglobinemia,beta-globintype)；甲钴胺缺乏cblg型(methylcobalamindeficiencycblgtype)；甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症cblx型(methylmalonicacidemiaandhomocysteinemiatypecblx)；甲基丙二酸血症伴同型胱氨酸尿症cblc型(methylmalonicacidemiawithhomocystinuriatypecblc)；甲基丙二酸血症伴高胱氨酸尿症cbld型(methylmalonicacidemiawithhomocystinuriatypecbld)；甲基丙二酸血症伴高胱氨酸尿症cblf型(methylmalonicacidemiawithhomocystinuriatypecblf)；甲基丙二酸血症伴高胱氨酸尿症cblj型(methylmalonicacidemiawithhomocystinuriatypecblj)；微囊性淋巴管畸形(microcysticlymphaticmalformation)；显微镜下多血管炎(microscopicpolyangiitis)；米罗伊病(milroydisease)；mpi-cdg(cdg-ib)；multicentriccastleman病(multicentriccastlemandisease)；多灶性淋巴管内皮瘤病伴血小板减少症(multifocallymphangioendotheliomatosiswiththrombocytopenia)；多发性骨髓瘤(multiplemyeloma)；多系统平滑肌功能障碍综合征(multisystemicsmoothmuscledysfunctionsyndrome)；骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndromes)；骨髓纤维化(myelofibrosis)；骨髓肉瘤(myeloidsarcoma)；myh9相关的血小板减少症(myh9relatedthrombocytopenia)；新生儿血色素沉着症(neonatalhemochromatosis)；中性粒细胞减少症慢性家族性(neutropeniachronicfamilial)；先天性嗜中性粒细胞减少症致死性嗜酸性粒细胞增多症(neutropenialethalcongenitalwitheosinophilia)；先天性不消退型血管瘤(non-involutingcongenitalhemangioma)；由于己糖激酶缺乏导致的非球形红细胞性溶血性贫血(nonspherocytichemolyticanemiaduetohexokinasedeficiency)；努南综合征(noonansyndrome)；努南综合征1(noonansyndrome1)；努南综合征2(noonansyndrome2)；努南综合征3(noonansyndrome3)；努南综合征4(noonansyndrome4)；努南综合征5(noonansyndrome5)；努南综合征6(noonansyndrome6)；乳清酸尿症1型(oroticaciduriatype1)；巴黎-特鲁索血小板减少症(paris-trousseauthrombocytopenia)；帕克斯韦伯综合征(parkeswebersyndrome)；阵发性冷血红蛋白尿(paroxysmalcoldhemoglobinuria)；阵发性夜间血红蛋白尿(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria)；皮尔逊综合征(pearsonsyndrome)；peho综合征(pehosyndrome)；phace综合征(phacesyndrome)；嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)；磷酸甘油酸激酶缺乏症(phosphoglyceratekinasedeficiency)；浆母细胞淋巴瘤(plasmablasticlymphoma)；纤溶酶原激活物抑制剂1型缺乏症(plasminogenactivatorinhibitortype1deficiency)；血小板储存池不足(plateletstoragepooldeficiency)；普卢默文森综合征(plummervinsonsyndrome)；poems综合征(poemssyndrome)；中性粒细胞减少症(poikilodermawithneutropenia)；真性红细胞增多症(polycythemiavera)；先天性前激肽释放酶缺乏症(prekallikreindeficiency,congenital)；中枢神经系统原发性血管炎(primaryangiitisofthecentralnervoussystem)；原发性中枢神经系统淋巴瘤(primarycentralnervoussystemlymphoma)；原发性家族性和先天性红细胞增多症(primaryfamilialandcongenitalpolycythemia)；原发性肠淋巴管扩张症(primaryintestinallymphangiectasia)；血小板原发性释放障碍(primaryreleasedisorderofplatelets)；脯氨酸酶缺乏症(prolidasedeficiency)；蛋白质c缺乏症(proteincdeficiency)；蛋白质s缺乏症(proteinsdeficiency)；变形杆菌综合征(proteussyndrome)；凝血酶原缺乏症(prothrombindeficiency)；假性冯维勒布兰德病(pseudo-vonwillebranddisease)；假性高钾血症卡迪夫(pseudohyperkalemiacardiff)；弹力纤维性假黄瘤(pseudoxanthomaelasticum)；肺动静脉瘘(pulmonaryarterio-veinousfistula)；肺动脉闭锁伴完整的室间隔(pulmonaryatresiawithintactventricularseptum)；肺静脉狭窄(pulmonaryveinstenosis)；单纯性紫癜(purpurasimplex)；pyropoikilocytosishereditary；丙酮酸激酶缺乏症(pyruvatekinasedeficiency)；魁北克血小板疾病(quebecplateletdisorder)；红细胞磷脂缺陷伴溶血(redcellphospholipiddefectwithhemolysis)；难治性血细胞减少症伴单系发育不良(refractorycytopeniawithunilineagedysplasia)；revesz综合征(reveszsyndrome)；雷诺氏综合症(reynoldssyndrome)；rh缺乏综合征(rhdeficiencysyndrome)；罗赛-多夫曼病(rosai-dorfmandisease)；rotor综合征(rotorsyndrome)；斯科特综合征(scottsyndrome)；重度先天性中性粒细胞减少症常染色体显性遗传(severecongenitalneutropeniaautosomaldominant)；重度先天性中性粒细胞减少症常染色体隐性遗传3(severecongenitalneutropeniaautosomalrecessive3)；塞萨里综合征(sezarysyndrome)；shwachman-diamond综合征(shwachman-diamondsyndrome)；镰状β地中海贫血(sicklebetathalassemia)；镰状细胞-血红蛋白d病(sicklecell-hemoglobinddisease)；镰刀型细胞贫血症(sicklecellanemia)；铁粒幼细胞性贫血(sideroblasticanemia)；铁粒幼细胞性贫血和线粒体肌病(sideroblasticanemiaandmitochondrialmyopathy)；铁粒幼细胞性贫血吡哆醇难治性常染色体隐性遗传(sideroblasticanemiapyridoxine-refractoryautosomalrecessive)；铁粒幼细胞性贫血吡哆醇反应性常染色体隐性遗传(sideroblasticanemiapyridoxine-responsiveautosomalrecessive)；慢通道先天性肌无力综合征(slow-channelcongenitalmyasthenicsyndrome)；斯奈登综合征(sneddonsyndrome)；口细胞增多症i(stomatocytosisi)；口细胞增多症ii(stomatocytosisii)；sturge-weber综合征(sturge-webersyndrome)；脐上腹中缝和面部海绵状血管瘤(supraumbilicalmidabdominalrapheandfacialcavernoushemangiomas)；瓣上主动脉瓣狭窄(supravalvularaorticstenosis)；苏萨克综合征(susacsyndrome)；swyer综合征(swyersyndrome)；系统性肥大细胞增多症(systemicmastocytosis)；富含t细胞/组织细胞的大b细胞淋巴瘤(t-cell/histiocyterichlargebcelllymphoma)；高安动脉炎(takayasuarteritis)；tar综合征(tarsyndrome)；地中海贫血(thalassemia)；硫胺素反应性巨幼细胞性贫血综合征(thiamineresponsivemegaloblasticanemiasyndrome)；胸喉骨盆发育不良(thoracolaryngopelvicdysplasia)；血小板病无脾缩小(thrombocytopathyaspleniamiosis)；血小板减少症2(thrombocytopenia2)；伴有血清iga升高和肾脏疾病的血小板减少症(thrombocytopeniawithelevatedserumigaandrenaldisease)；血栓调节蛋白异常，家族性(thrombomodulinanomalies,familial)；获得性血栓性血小板减少性紫癜(thromboticthrombocytopenicpurpura,acquired)；儿童短暂性红细胞减少症(transienterythroblastopeniaofchildhood)；一过性骨髓增生综合征(transientmyeloproliferativesyndrome)；磷酸丙糖异构酶缺乏症(triosephosphateisomerasedeficiency)；结节性硬化症(tuberoussclerosis)；簇状血管瘤(tuftedangioma)；双胞胎输血综合征(twintotwintransfusionsyndrome)；1型纤溶酶原缺乏症(type1plasminogendeficiency)；unicentriccastleman病(unicentriccastlemandisease)；血管ehlers-danlos综合征(vascularehlers-danlossyndrome)；盖伦动脉瘤静脉(veinofgalenaneurysm)；vonhippel-lindau病(vonhippel-lindaudisease)；冯维勒布兰德病(vonwillebranddisease)；温抗体溶血性贫血(warmantibodyhemolyticanemia)；白血小板综合征(whiteplateletsyndrome)；威廉姆斯综合征(williamssyndrome)；wiskottaldrich综合征(wiskottaldrichsyndrome)；wt肢体血液综合征(wtlimbbloodsyndrome)；wyburn-mason综合征(wyburn-masonsyndrome)；x连锁铁粒幼细胞性贫血(x-linkedsideroblasticanemia)；x连锁血小板减少症和黄指甲综合征(x-linkedthrombocytopeniaandyellownailsyndrome)。[0259]溶酶体贮积症可以例如选自戈谢病(gaucher’sdisease)(葡萄糖脑苷脂酶缺乏-基因名称：gba)、法布里病(fabry’sdisease)(α-半乳糖苷酶缺乏-gla)、亨特病(hunter'sdisease)(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶缺乏-ids)、hurler病(hurler'sdisease)(α-l艾杜糖醛酸酶缺乏症-idua)和尼曼-皮克病(niemann-pick'sdisease)(鞘磷脂磷酸二酯酶1缺乏症-smpd1)。[0260]在具体实施方案中，由个体中缺乏蛋白质或存在异常的非功能性蛋白质引起的疾病可以选自下组：血友病b(hemophiliab)、血友病a(hemophiliaa)、腺苷脱氨酶缺乏症(adenosinedeaminasedeficiency)、β-地中海贫血(beta-thalassemia)、镰刀形红细胞贫血症(sicklecellanemia)、wiskottaldrich综合征(wiskottaldrichsyndrome)、x连锁无丙种球蛋白血症(x-linkedagammaglobulinemia)、慢性肉芽肿病(cgd)(chronicgranulomatousdisease)、普通变异免疫缺陷(commonvariableimmunodeficiency)、x连锁scid(x-linkedscid)、ada缺陷型scid(ada-deficientscid)、共济失调毛细血管扩张症(ataxiatelangiectasia)、omenn综合征(omennsyndrome)、范可尼贫血(fanconianemia)、whim综合征(whimsyndrome)、法布里病(fabrydisease)、沃尔曼病(wolmandisease)、因子v缺乏症(factorvdeficiency)、因子v莱顿易栓症(factorvleidenthrombophilia)、因子vii缺乏症(factorviideficiency)、因子x缺乏症(factorxdeficiency)、因子xi缺乏症(factorxideficiency)、因子xii缺乏症(factorxiideficiency)、因子xiii缺乏症(factorxiiideficiency)。[0261]在另一实施方案中，本文所述的idlv、分离细胞或药物组合物可用于治疗选自下组的疾病：免疫疾病、病毒感染、肿瘤和血液疾病。[0262]实际上，根据本发明的实施方案，本发明的治疗性蛋白质可以是可用于中和靶蛋白(如细菌毒素)或直接引起疾病的蛋白质(例如黄斑变性中的vegf)以及高度选择性地杀死其持久性和复制危及宿主的细胞(例如癌细胞，以及自身免疫性疾病中的某些免疫细胞)的蛋白质的治疗性抗体。[0263]本发明还涉及用于预防和/或治疗以下的方法：[0264]-选自下组的疾病：免疫疾病、病毒感染、肿瘤和血液疾病；和/或[0265]-因缺乏蛋白质或在有需要的个体中存在异常的非功能性蛋白质而引起的疾病；[0266]包括向有需要的个体施用至少根据本发明的idlv。[0267]本发明还涉及用于预防和/或治疗以下的方法：[0268]-选自下组的疾病：免疫疾病、病毒感染、肿瘤和血液疾病；和/或[0269]-因缺乏蛋白质或在有需要的个体中存在异常的非功能性蛋白质而引起的疾病；[0270]包括向有需要的个体施用至少根据本发明的分离细胞。[0271]本发明还涉及用于预防和/或治疗以下的方法：[0272]-选自下组的疾病：免疫疾病、病毒感染、肿瘤和血液疾病；和/或[0273]-因缺乏蛋白质或在有需要的个体中存在异常的非功能性蛋白质而引起的疾病；[0274]包括向有需要的个体施用至少根据本发明的药物组合物。[0275]本发明进一步涉及本发明的idlv、本发明的分离细胞或本发明的药物组合物在制备用于预防和/或治疗以下的药物中的用途：[0276]-选自下组的疾病：免疫疾病、病毒感染、肿瘤和血液疾病；和/或[0277]-因缺乏蛋白质或在有需要的个体中存在异常的非功能性蛋白质而引起的疾病。[0278]根据本发明产生car-t细胞的方法[0279]根据本发明还提供用于产生car-t细胞的方法。[0280]本发明实际上还涉及用于产生car-t细胞的方法，该方法包括将至少一种如上定义的idlv整合到淋巴细胞t细胞中，[0281]所述idlv包含编码靶向癌细胞的嵌合抗原受体的转基因作为至少一个目标核酸序列。idno：76))进行了定性pcr(pcr2)(kapa2gfastreadymix；kapabiosystem)，产生了823bp的扩增产物。[0309]对pcr2产物进行sanger测序并与基因组序列比较以评估是否存在任何错配。[0310]84％整合供体dna表达了gfp(62个克隆中的52个)，其中85％是作为切割idlv插入的(52个克隆中的44个)。由于存在mh序列，100％的切割idlv以无缝方式整合，与野生型基因组序列相比没有核苷酸变化。图2b是克隆的分子分析的汇总表。[0311]实施例3：idlv转导和核酸酶切割之间的最佳时机[0312]随后，发明人进行了另外的实验以寻找idlv转导和核酸酶切割之间的最佳时机，使得idlvki的效率达到最高。[0313]为此，发明人用gp33idlv转导野生型k562(如实施例1)，并在不同时间点用体外预组装的cas9/grna复合物(rnp)转染细胞。在每个指定的时间点，用18μlsfcellline4d-nucleofector试剂盒使用nucleofectoramaxa4d(lonza)和2.75μl所述hba15.1或hba16.1rnp对2×105个转导的细胞进行洗涤和核转染。cas9与grna(hba15.1或hba16.1)的组装通过混合30μm经细菌纯化的cas9蛋白和45μm的synthego的合成grna引导物(比例分别为1:1.5)使用适当体积的缓冲液10x在室温下混合10分钟来进行。[0314]2周后，发明人通过facs评估了gfp表达，并观察到idlv和rnp递送之间延迟24-32小时可以保证最佳的gfp表达，其中切割后的idlv比未切割的idlv性能提高约10倍(图3)。ki的更高效率可以用rnp技术更高的切割性能来解释；事实上，rnp结果的indel频率远高于使用grna质粒获得的效率(图1)。[0315]实施例4：经idlv转导的bddfviii敲入[0316]由于目前hsc基因组编辑技术的问题之一是可以整合的dna的大小，本发明人决定通过在idlv中插入大的治疗相关转基因来挑战他们的方法。因此，它们将gfp(大约700ntd)与bddfviii编码序列交换：cof8(～4400ntd；参考)(图4a)。[0317]如实施例1，发明人用idlvfviii转导k562-cas9，然后用编码靶向idlv和基因组dna的grna的质粒(hba15.1)转染它们。为了测定idlvki的效率和精确度，他们对从k562-cas9单细胞克隆中提取的基因组dna进行pcr分析(图4b)。[0318]对于pcr1，使用kapa2gfastreadymix(kapabiosystem)对是否存在整合的cofviii盒进行pcr筛选(正向：gagctgtcctgggactacat(seqidno：77)，反向：gtgatcaccacggtgtcgta(seqidno：78)，扩增子230bp)。[0319]为了证实合适的5'基因组dna-idlv连接，发明人使用基因组特异性引物(tatcgccagagggaaaggga(seqidno：79)和cofviii7r(gggttttcttgtacaccacgc(seqidno：80)引物、845bp的扩增子进行定性pcr(pcr2)(kapa2gfastreadymix；kapabiosystem)。[0320]82％的整合供体dna作为切割idlv插入(11个克隆中的9个)。由于存在mh序列，100％的切割idlv以无缝方式整合，与野生型基因组序列相比没有核苷酸变化。图4c是克隆的分子分析的汇总表。[0321]两周后，发明人通过elisa分析大量群体和细胞上清液中的5个克隆的fviii表达(asserachromviii：ag(stago)elisa试剂盒)。由于idlvfviii无启动子，仅在以下情况下获得表达：i)将idlv以正确的方向和作用方式整合在预期的基因座处；ii)k562细胞能够产生和分泌功能完全的fviii。fviii产量表示为24h中通过2×106个细胞产生的fviii量(图4d)。[0322]总之，该数据表明根据本发明的idlv可以有效地递送fviii并在内源启动子的控制下整合它。产生的fviii被细胞有效地分泌，并保持其酶活性。[0323]实施例5：经idlv转导的gfp敲入(idlvgp35)[0324]本发明人进一步设计了在不同位置具有grna-t的idlv(gp35)以允许其设计的更多灵活性。为此，它们插入表达盒，所述表达盒按从5'到3'的顺序含有：i)grna-t；ii)无启动子的gfp；iii)pgk驱动的嘌呤霉素转基因。该盒以相对于载体ltr的反义方向插入。作为对照，发明人设计了缺失grna-t序列以及gfp上游的mh5'序列的类似idlv(图5a)。[0325]用这些idlv转导k562-cas9细胞，24h后，用hba15.1grna编码质粒转染。[0326]gfp表达分析再次显示，与对照idlv相比，grna-t的存在使idlvki增加了几乎8倍(图5b)。[0327]indel的％与已经被cas9切割的基因组等位基因的百分比相关。[0328]实施例6：[0329]最后，本发明人证实根据本发明的方法也可用于修饰临床相关细胞，如cd34 人hspc。[0330]发明人培养hsc48小时，用gfpidlv(gp33)转导它们，24小时后用rnp(hba15.1)转染它们。[0331]作为对照，本发明人使用仅切割基因组dna而不切割idlv的hba16.1。然后，细胞向红细胞系分化以诱导α-珠蛋白表达。[0332]为此，将动员的外周血hspc(所有细胞)解冻并在预刺激培养基中培养48h(stemspan，干细胞技术；rhscf300ng/ml，flt3-l300ng/ml，rhtpo100ng/ml和il-320ng/ml，cellgenix)。在预刺激培养基中存在硫酸鱼精蛋白(4μg/ml)的情况下，在涂有逆转录酶的板(5μg/孔)上用idlvgp33转导hspc。[0333]转导后24小时，洗涤细胞并用rnp电穿孔(cas9:grnahba15.1；如实施例3)。使用p3原代细胞4d-nucleofector试剂盒(lonza)，用rnp复合物对每种条件的2×105个细胞进行核转染。[0334]将hspc在红细胞分化培养基中培养14天(stemspan，干细胞技术；rhscf20ng/ml，epo1u/ml，il35ng/ml，地塞米松2μm和β雌二醇1μm)。通过流式细胞术在分化过程中监测gfp表达。[0335]尽管两种grna的切割效率相似(indel效率)，但facs分析表明，靶向idlv的核酸酶产生的gfp阳性细胞比标准idlv多10倍(图6a)。[0336]发明人将hspc铺板在甲基纤维素中以获得单细胞集落并在体外监测hspc多能性。在核转染后，将每种条件的103个细胞与3ml甲基纤维素培养基(h3434，干细胞技术)混合用于菌落形成单位(cfc)测定。[0337]14天后，计数菌落并根据其外观评分。将菌落记为粒细胞/红细胞/单核细胞/巨核细胞形成单位(cfu-gemm)、粒细胞/巨噬细胞形成单位(cfu-gm)或红细胞爆裂形成单位(bfu-e)。[0338]重要的是，与未处理的对照相比，ki方法对祖细胞没有毒性或没有任何谱系偏移(图6b)。[0339]在倒置荧光显微镜下挑选单个gfp阳性克隆。在标准条件下用蛋白酶k(thermofisherscientific)裂解后提取dna。如实施例2所述对基因组dna进行分子分析。[0340]本发明人观察到gfp在红细胞(bfu；99个中的13个)中的表达，但在粒细胞/巨噬细胞菌落中没有，这再次表明gfp表达是由红细胞特异性的α-珠蛋白启动子驱动的。为了进一步确认idlvki的精确性，他们对从gfp 单个菌落中提取的基因组dna进行了pcr分析，以确认靶向(on-target)供体dna的整合。[0341]100％插入的idlv被切割，并且由于mh序列的存在，90％被切割的idlv以无缝方式整合，与野生型基因组序列相比没有核苷酸变化(图6c)。[0342]实施例7：[0343]发明人根据本发明产生了编码hpgk、gfp的idlv(称为gp57)，并在hpgk的5'处插入grna靶向序列(grna-t)以切割idvl，以及与目标基因组位点同源的～40bp的短同源序列(微同源，mh)。类似地，他们产生了另外两个idlv(根据本发明的gp58和ma277对照)，它们分别缺乏mh或mh和grna-t(图7a)。[0344]为此，发明人用每个指定的idlv转导野生型k562细胞(如实施例1)并且，24小时后，用18μlsfcellline4d-nucleofector试剂盒使用nucleofectoramaxa4d(lonza)和2.75μl所述hba15.1rnp对2×105个转导的细胞进行转染。cas9与grna(hba15.1)的组装是通过将30μm的细菌纯化的2-nlscas9蛋白和45μm的synthego的合成grna引导物(比例分别为1:1.5)使用适当体积的缓冲液10x在室温下混合10分钟。[0345]2周后，发明人通过facs评估gfp的表达，并且观察到切割idlvdna后，阳性细胞的比例增加了约4倍，表明与对照idlv相比，对于根据本发明的两种idlv构建体(有和没有同源臂序列)，基因组dna中的gfpki更有效率。vcn(载体拷贝数)与gfp 细胞的％相关。indel的％与被cas9切割的基因组等位基因的百分比相关。(图7b)。[0346]这些结果清楚地表明，切割idlv会增加基因组的定向整合。[0347]实施例8：[0348]为了证实idlvki的效率和精确性，发明人对从实施例7结束时获得的k562单细胞克隆中提取的基因组dna进行了pcr分析(图8a)。[0349]365个单细胞克隆是通过连续稀释gfp 细胞(facs分选)aavs1idlv细胞获得的，如图7所述处理。[0350]对pcr1产物进行sanger测序以确定是否存在任何错配。[0351]2周后，使用“magnapure96dnaandviralnasmallvolume”试剂盒(产品编号：06543588001-罗氏)提取基因组dna，并使用thermofisherscientificas的nanodrop8000分光光度计进行定量。[0352]使用kapa2gfastreadymix；kapabiosystem，通过图8a中所示的pcr有义整合和pcr反义整合进行靶向整合的筛选(sense引物：正向:5’cagctcaggttctgggagag3’(seqidno:81),反向:5’gcgaacggacgtgaagaatg3’(seqidno:82)；antisense引物:正向:5’gcgaacggacgtgaagaatg3’(seqidno:82),反向:5’cttgtaggcctgcatcatca3’(seqidno:83))。[0353]图8b汇总显示了用于靶向整合的克隆的分子分析的结果。[0354]这些结果清楚地表明，与没有同源序列的idlv相比，在idlv的grna切割位点旁边存在与基因组靶点同源的短序列，可以以预定的方向和无缝的方式介导idlv在基因组中的整合。[0355]接下来，发明人通过pcr分析研究了从实施例7结束时获得的k562单细胞克隆中提取的所述dna中的脱靶整合(图8c)。[0356]对从k562单细胞克隆中提取的基因组dna进行pcr分析以筛选一种主要的脱靶整合，是基于使用kapa2gfastreadymix；kapabiosystem使用pcr有义和pcr反义(sense引物:正向:5’ggtggaagggaacaggaagg3’(seqidno:84),反向:5’gcgaacggacgtgaagaatg3’(seqidno:82)andantisense引物:正向:5’gcgaacggacgtgaagaatg3’(seqidno:82),反向:5’gatgtgctgtcacctagggg3’(seqidno:85))。[0357]图8d中汇总了用于脱靶整合的克隆的分子分析的结果。[0358]这些结果以及图8b中的结果清楚地表明，在idlv的grna切割位点旁边存在基因组靶点同源的短序列，可以介导idlv在基因组中的整合(优选靶向vs脱靶位点)，其与没有同源序列的idlv相比高出1.5倍。当前第1页12当前第1页12
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
