一种抗人CD34抗体、抗人CD34嵌合抗体及应用的制作方法

一种抗人cd34抗体、抗人cd34嵌合抗体及应用
技术领域
1.本发明属于体外诊断领域，尤其是涉及一种抗人cd34抗体、抗人cd34嵌合抗体及应用。


背景技术：

2.白血病是威胁人类生命健康的主要几种疾病之一，在我国发病率大约为2.76/100000人。其中急性淋巴细胞白血病多见于儿童，急性髓系白血病多见于成年人，而慢性白血病多发于40岁以上人群。它是一类起源于造血 (或淋巴) 干细胞的恶性疾病。由于干细胞受损，白血病细胞失去进一步分化成熟的能力，或者增殖与分化能力不平衡，而停滞在细胞发育的不同阶段，具体表现为细胞在体内无限增殖，而其分化成熟和凋亡受阻。白血病与其它癌症一样，一直因为没有特应性的标志导致无法用常规药物准确杀伤白血病细胞。白血病细胞与正常细胞的区别目前认为主要在于某些生物分子的表达量不同，利用这些特征，特别是与造血干/祖细胞的区别可以在一定程度上杀伤白血病细胞而不影响造血的重建。特异性识别某种细胞膜表面分子的抗体正是实现这一目的的最好工具，目前利用抗体治疗白血病主要是通过以下三种途径：抗体结合白血病细胞后通过补体依赖的细胞毒和抗体依赖细胞介导的细胞毒直接杀伤白血病细胞；抗体结合白血病细胞表面分子，通过所引发的下游信号诱导白血病细胞分化或凋亡；通过抗体的靶向作用将杀伤性药物或效应物带入白血病细胞内达到局部杀伤的目的等。
3.cd34分子于1984年被美国科学家civin发现，属于钙黏蛋白家族，其结构包括胞外区、跨膜区、胞浆区3部分。作为一种黏附分子，cd34分子选择性地表达于人类及其他哺乳动物造血干/祖细胞（hematopieticstem/ progenitor cell，hsc/hpc）表面，并随细胞的成熟逐渐减弱至消失。细胞间的黏附是由多种机制和因素参与的复杂过程，在多细胞生物个体的演化过程、细胞调节、组织生理学以及疾病发生中都有着至关重要的作用。黏附分子以受体－配体结合的形式发挥作用，参与细胞的识别、活化和信号转导、细胞的增殖与分化、伸展与移动，是免疫应答、炎症发生、凝血、肿瘤转移以及创伤愈合等一系列重要生理病理过程的分子基础。在造血干细胞移植过程中，cd34分子起到运输造血干细胞(hematopietic,hsc)的作用，在动员剂的作用下，促使hsc迁离骨髓进入外周血完成动员过程，并介导其与骨髓微环境的结合增强hsc定植。
4.随着对cd34分子介导细胞间黏附作用机制探讨的广泛深入，已有愈来愈多的研究结果表明除造血干/祖细胞外，还有许多其他类型的细胞也表达cd34分子，如某些类型的白血病细胞、实体瘤细胞、血管内皮细胞及纤维母细胞等。迄今为止，cd34分子介导黏附作用的机制尚未完全阐明，对cd34分子特异配体/受体的鉴定和细胞内蛋白分子的相互作用激活黏附分子（尤其是选择素家族）的作用机制亦尚待进一步明确。由于细胞间黏附作用密切参与体内免疫应答、炎症发生、凝血、肿瘤转移以及创伤愈合等一系列重要生理病理过程，对cd34分子作用机制的明确以及进一步加以应用，在临床上对于血液病的诊断治疗、实体瘤的治疗、鉴别肿瘤良恶性及起源有着重要意义，在器官移植、造血干细胞移植等领域具有
广阔的应用前景。
5.以上这些事实均表明 cd34 分子可应用于白血病诊断治疗、器官移植、造血干细胞移植领域，cd34分子的抗体具有巨大的潜在药用价值。
6.目前白血病治疗主要采用控制增殖、诱导凋亡的化疗药物，包括烷化剂、抗代谢药物等。这些药物在杀死白血病细胞的同时，对正常造血细胞也有严重损伤，故对机体存在严重的毒副作用。此外，白血病细胞常会对化疗药物产生耐药，同时化疗后复发率较高，严重影响临床化疗药物治疗的有效性。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种抗人cd34抗体、抗人cd34嵌合抗体及应用。
8.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种小鼠抗人cd34抗体，该小鼠抗人cd34抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述的小鼠抗人cd34抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示。
9.进一步，所述的重链可变区的互补决定区包括cdr1、cdr2与cdr3；所述的重链可变区的cdr1的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述的重链可变区的cdr2的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述的重链可变区的cdr3的氨基酸序列如seq id no.5所示；所述的重链可变区的骨架区包括fr1、fr2、fr3和fr4；所述的重链可变区的fr1的氨基酸序列如seq id no.6所示；所述的重链可变区的fr2的氨基酸序列如seq id no.7所示；所述的重链可变区的fr3的氨基酸序列如seq id no.8所示；所述的重链可变区的fr4的氨基酸序列如seq id no.9所示。
10.进一步，所述的轻链可变区的互补决定区包括cdr1、cdr2与cdr3；所述的轻链可变区的cdr1的氨基酸序列如seq id no.10所示；所述的轻链可变区的cdr2的氨基酸序列如seq id no.11所示；所述的轻链可变区的cdr3的氨基酸序列如seq id no.12所示；所述的轻链可变区的骨架区包括fr1、fr2、fr3和fr4；所述的轻链可变区的fr1的氨基酸序列如seq id no.13所示；所述的轻链可变区的fr2的氨基酸序列如seq id no.14所示；所述的轻链可变区的fr3的氨基酸序列如seq id no.15所示；所述的轻链可变区的fr4的氨基酸序列如seq id no.16所示。
11.一种抗人cd34嵌合抗体，该抗人cd34嵌合抗体的重链可变区的氨基酸序列包含所述的小鼠抗人cd34抗体的重链可变区的氨基酸序列，该抗人cd34嵌合抗体的轻链可变区的氨基酸序列包含所述的小鼠抗人cd34抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
12.一种核苷酸分子，该核苷酸分子编码所述的抗人cd34嵌合抗体。
13.进一步，所述的核苷酸分子编码所述的抗人cd34嵌合抗体的重链可变区的核苷酸序列如seq id no:17所示，编码所述的抗人cd34嵌合抗体的轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:18所示。
14.一种表达载体，该表达载体包含所述的核苷酸分子。
15.所述的小鼠抗人cd34抗体的应用，所述的小鼠抗人cd34抗体在制备用于诊断血液病的试剂中的应用或在制备用于治疗血液病、实体瘤的药物中的应用或在制备免疫抑制类药物中的应用或在鉴别肿瘤的方法中的应用。
16.所述的小鼠抗人cd34抗体的应用，所述的小鼠抗人cd34抗体在器官移植领域或造血干细胞移植领域中的应用。
17.所述的表达载体的应用，所述的表达载体在制备用于诊断血液病的试剂中的应用或在制备用于治疗血液病、实体瘤的药物中的应用或在制备免疫抑制类药物中的应用或在鉴别肿瘤的方法中的应用。
18.所述的表达载体的应用，所述的表达载体在器官移植领域或造血干细胞移植领域中的应用。
19.所述的抗人cd34嵌合抗体的应用，所述的抗人cd34嵌合抗体在制备用于诊断血液病的试剂中的应用或在制备用于治疗血液病、实体瘤的药物中的应用或在制备免疫抑制类药物中的应用或在鉴别肿瘤的方法中的应用；所述的抗人cd34嵌合抗体在器官移植领域或造血干细胞移植领域中的应用。
20.相对于现有技术，本发明具有以下优势：本发明所述的抗人cd34嵌合抗体对于血液病的诊断治疗、实体瘤的治疗、鉴别肿瘤良恶性及起源有着重要意义，在器官移植、造血干细胞移植等领域具有广阔的应用前景；小鼠抗人cd34抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因及人抗体轻链恒定区基因和重链恒定区基因重组后表达产生的抗cd34嵌合抗体，能够特异性结合人cd34分子并能够降低鼠源性抗人cd34抗体的背景及免疫源性。流式中需要根据使用的抗体的亚型来选择不同种类的同型对照，将鼠源性单克隆抗体改为本发明所述的嵌合抗体后，恒定区为人igg1，只要使用人igg1的同型对照即可，大大减少实验的复杂性。
附图说明
21.图1为本发明实施例3所述的抗人cd34嵌合抗体纯化图：其中泳道m为maker，泳道1为抗人cd34嵌合抗体非还原电泳，泳道2为抗人cd34嵌合抗体还原电泳；图2为本发明实施例5中细胞系检测的鼠源cd34-pe的阴性对照流式细胞散点图；图3为本发明实施例5中细胞系检测的鼠源cd34-pe的阴性对照流式细胞直方图；图4为本发明实施例5中细胞系检测的鼠源cd34-pe的流式细胞散点图；图5为本发明实施例5中细胞系检测的鼠源cd34-pe的流式细胞直方图；图6为本发明实施例5中细胞系检测的抗人cd34-pe嵌合抗体的阴性对照流式细胞散点图；图7为本发明实施例5中细胞系检测的抗人cd34-pe嵌合抗体的阴性对照流式细胞直方图；图8为本发明实施例5中细胞系检测的抗人cd34-pe嵌合抗体的流式细胞散点图；图9为本发明实施例5中细胞系检测的抗人cd34-pe嵌合抗体的流式细胞直方图。
具体实施方式
22.除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
23.下面结合实施例来详细说明本发明。
24.实施例1小鼠抗人cd34抗体的轻重链可变区基因克隆(1)rna提取：采用trizol一步法，1)取杂交瘤细胞约1
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106个，加入1mltrizol，吹打混匀，室温静置10分钟；2)加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置2-3分钟；3)12000rpm，4℃，离心15分钟；4)取上清，加入0.5ml异丙醇室温静置15分钟；5)12000rpm，4℃，离心15分钟；6)弃上清，加入1ml75％的乙醇洗，7500rpm，4℃，离心5分钟；7)弃上清，沉淀晾干，加入30μldepc水溶解；(2)逆转录为cdna(40μl)：使用transscriptall-in-onefirst-strandcdnasynthesissupermixforqpcr试剂盒进行ni转录反应，取总rna1.0μg，transscriptall-in-onesupermixforqpcr4μl，gdnaremover4μl，depc水补充至20μl，反应42℃，15min后，85℃孵育5min，于20℃保存；(3)pcr扩增cd34抗体的轻重链可变区基因轻链可变区基因pcr扩增反应体系(50μl)：设计通用简并引物：上游引物5
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gacattgtgctcacccagwctsmh-3’，下游引物5
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ccgttagatctccarbttkgtscs-3’；以cdna为模板，高保真pfudna聚合酶扩增；pcr循环程序为94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；重链可变区基因pcr扩增反应体系(50μl)：上游引物5
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caggtsmarctgcagsagtcwgg-3’；下游引物5
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tgaggagackgtgachgtggtscc-3’；以cdna为模板，高保真pfudna聚合酶扩增；pcr循环程序为94℃5分钟；94℃，30秒，55℃，30秒，72℃，30秒，共35个循环；最后72℃延伸10分钟；(4)测序载体的构建：pclone007bluntsimplevectorkit购白擎科生物；将轻重链可变区基因pcr产物回收，与pclone007bluntsimplevector载体连接后，按常规方法氯化钙转化，以100μg/ml氨苄浓度筛选阳性克隆，送测序，该基因完全符合蛋白数据库中抗体所具有的若干保守的框架氨基酸的特点，该序列为抗体基因序列。分别命名为pclone007-vh及pclone007-vl。
25.实施例2嵌合抗体表达载体pcdna3.4-h和pcdna3.4-l的构建根据轻、重链可变区序列及构建载体pcdna3.4的序列，设计并合成了用于扩增重链可变区的引物（pdh-f和pdh-r）、用于扩增轻链可变区的引物（pdl-f和pdl-r）和用于扩增载体的引物（zt-f和zt-r）。
26.pdh-f：5
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ttccaggttccactggtgacgagatccagctgcagcagtctg-3’（核苷酸序列如seqidno:19所示）pdh-r：5
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gatgggcccttggtgctagctgaggagacggtgactgaggtt-3’（核苷酸序列如seqidno:20所示）pdl-f：5
’‑
ttccaggttccactggtgacgatgttgtgatgacccaaactcc-3’（核苷酸序列如seqidno:21所示）pdl-r：5’‑
acagatggtgcagccaccgtccgttttatttccagcttggtc-3’（核苷酸序列如seqidno:22所示）zth-f：5
’‑
gctagcaccaagggccca-3’（核苷酸序列如seqidno:23所示）zth-r：5
’‑
gtcaccagtggaacctggaacc-3’（核苷酸序列如seqidno:24所示）ztl-f：5
’‑
acggtggctgcaccatctg-3’（核苷酸序列如seqidno:25所示）ztl-r：5
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gtcaccagtggaacctggaacc-3’（核苷酸序列如seqidno:26所示）轻链可变区基因pcr扩增反应体系(50μl)：上游引物pdl-f；下游引物pdl-r；以pclone007-vl为模板，高保真pfudna聚合酶扩增；pcr循环程序为94℃5分钟；94℃30秒，58℃60秒，72℃30秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。
27.重链可变区基因pcr扩增反应体系(50μl)：上游引物pdh-f；下游引物pdh-r；以pclone007-vh为模板，高保真pfudna聚合酶扩增；pcr循环程序为94℃5分钟；94℃30秒，58℃60秒，72℃30秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。
28.线性化载体的扩增：上游引物zt-f；下游引物zt-r；以pcdna-cd52-h(合成序列，含人igg1恒定区核苷酸序列)为模板，高保真pfudna聚合酶扩增；pcr循环程序为94℃5分钟；94℃30秒，58℃60秒，72℃4min，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；将pcr产物分别回收，将回收轻链可变区pcr产物和重链可变区pcr产物分别与回收线性化载体产物使用重组酶进行重组，重组后转化dh5α克隆菌株，并挑取单菌落扩大培养，送样测序，测序正确的克隆用于转染cho细胞。
29.实施例3抗人cd34嵌合抗体的表达、纯化(1)嵌合抗体cd34抗体的表达：将准备好的cho细胞从培养箱中取出，准备两支15ml无菌离心管，在其中一支中加入5mlspm培养基和100μg无菌质粒dna(含轻链表达载体和重链表达载体)，轻轻吹打混匀；取另一支离心管，加入5mlspm和320μl转染试剂，轻轻吹打混匀；将含有转染试剂的离心管中所有液体转移至含质粒的离心管中，轻轻吹打混匀；室温下静置5分钟制备出质粒-载体复合物；从恒温摇床中取出细胞，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，放回co2恒温摇床中震荡培养；第1天和第5天补加辅料，第12天收获细胞上清；(2)抗人cd34嵌合抗体的纯化：将上步收集的细胞上清先使用g25将培养上清置换为pbs，再是使用proteina亲和柱进行纯化，pbs平衡柱子后，上样，使用ph3.0的甘氨酸进行洗脱，洗脱纯抗使用g25柱置换溶液，将溶液置换为pbs，取样进行电泳测试，结果如图1所示，然后分装后于-20℃冻存；(3)westernblot鉴定：主要参考分子克隆方法进行western印迹，结果证明条
带为抗体；实施例4抗人cd34嵌合抗体的pe标记将抗人cd34嵌合抗体使用还原剂进行还原，将其与经过活化的pe混合均匀，25℃搅拌，反应1小时；再使用s200increase纯化柱纯化，得到pe标记cd34嵌合抗体。
30.实施例5抗人cd34嵌合抗体的活性测定(1)细胞系检测：取cd34表达阳性细胞kg1a细胞系，制成1
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106细胞悬液；分别加入不同量的嵌合抗体cd34-pe和鼠源cd34-pe，室温避光孵育30分钟；加入2ml冷pbs缓冲液，重悬，1000转/分钟离心5分钟，弃上清；加入250μlpbs缓冲液，流式细胞仪检测；如图2-9所示，结果显示嵌合抗体cd34-pe与鼠源cd34-pe的反应性一致。
31.(2)竞争性免疫荧光抑制试验：细胞系检测：取cd34表达阳性细胞kg1a细胞系，制成1
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106细胞悬液；加入不同量的抗人cd34嵌合抗体，室温避光孵育1小时；再加入0.5μgpe标记的鼠源cd34-pe（来源于小鼠腹水纯抗），室温避光孵育20分钟；加入2ml冷pbs缓冲液，重悬，1000转/分钟离心5分钟，弃上清；加入250μlpbs缓冲液，流式细胞仪检测；经抗人cd34嵌合抗体竞争后，鼠源cd34-pe与kg1a细胞系结合的阳性率基本降低为0，与外周血白细胞反应时荧光强度明显下降，证明抗人cd34嵌合抗体可竞争性抑制鼠源cd34-pe与kg1a细胞系的结合。
32.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。