脆弱拟杆菌与PD-1或PD-L1抗体联合用药治疗生殖泌尿系统癌症的应用的制作方法

脆弱拟杆菌与pd-1或pd-l1抗体联合用药治疗生殖泌尿系统癌症的应用
1.本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已于2015年4月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏。分类命名：脆弱拟杆菌zy-312(bacteroides fragilis zy-312)，保藏编号cgmcc no.10685。脆弱拟杆菌zy-312由本发明申请单位自行分离获得，并且已经在授权专利保护(专利号201510459408.x)，按照专利审查指南的规定，公众能够从商业渠道买到或已经授权，不用保藏，即不用提供保藏证明。
技术领域
2.本发明涉及一种脆弱拟杆菌的应用技术，特别是一种脆弱拟杆菌与pd-1抗体或pd-l1抗体共同用药在防治生殖泌尿系统癌症中的应用。


背景技术：

3.据2019年世界卫生组织(world health organi-zation，who)统计，癌症是目前112个国家人口的第一或第二大死因，以及23个国家人口的第三或第四大死因。癌症导致巨大的疾病负担。
4.女性生殖系统癌症包括乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌和子宫体癌。在女性中，妇科癌症(包括生殖器官和乳房)是发病率和死亡率最高的肿瘤，是全球第二大死因。乳腺癌通过手术治疗，能够取得较好疗效，但丧失乳房、失去女性特征常给患者带来沉重的心理压力，影响家庭生活。13％的宫颈癌患者就诊时已是晚期，而转移性宫颈癌的5年生存率仅有16.5％，中位生存时间8-13个月。由于转移性宫颈癌的异质性特点，目前仍没有标准的治疗方法。卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤。手术和化疗是卵巢癌的主要治疗方法；然而，患者经常在初始治疗后几年内因化疗耐药而复发。
5.泌尿及男性生殖系统癌症主要包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌和睾丸癌。根据最新的癌症统计数据，2020年，前列腺癌、膀胱癌和肾癌分别居全球癌症发病谱的第二、第六和第九。尽管一级预防、早期发现和治疗有所改进，但泌尿系统癌症的特点仍然是全球范围内的发病率和死亡率不断增加，且预后不佳。前列腺癌(pca)是全世界老年男性人口中的主要健康问题，并且是世界上与癌症相关的死亡的第五大常见原因。雄激素受体在pca的发展中起着至关重要的作用，雄激素剥夺疗法是新诊断的pca患者的一线治疗。然而，大多数患者会进展为去势抵抗性pca，通常与转移相关。男性膀胱癌(bca)的发病率是女性的三倍。针对膀胱肿瘤较常用的手术方法为经尿道膀胱肿瘤电切术,术后患者需常规应用化学药物灌注治疗。mvac(氨甲蝶呤、长春新碱、吡柔比星和顺铂)方案是目前膀胱癌化学药物治疗(以下简称化疗)的一线方案,但膀胱灌注化疗的疗效并不十分令人满意。虽然患者的病情在常规术后膀胱灌注化疗后可得到有效缓解甚至治愈,但复发率仍高达60％。复发性膀胱肿瘤的恶性程度会逐渐增加,最终发展为肌层浸润性膀胱肿瘤。肾细胞癌(rcc)的发病率在世界大部分地区稳步上升。全肾切除术或部分肾切除术是最佳的主要治疗方法。然而，rcc在切除后
20-40％的患者中复发，这与更差的肿瘤分期和分级相关。一些泌尿道恶性肿瘤与年龄有关，因此，由于全球人口老龄化，其发病率极有可能继续上升。
6.对于无手术根治机会的生殖、泌尿系统肿瘤患者，或保乳意愿强、身体状况许可的乳腺癌患者，目前多采取以全身药物治疗为主的综合治疗。全身药物治疗主要包括化疗药物、分子靶向药物及免疫治疗药物。
7.免疫治疗药物是目前最热门的肿瘤治疗手段。肿瘤免疫治疗主要包括免疫疫苗、免疫检查点抑制剂治疗、过继性免疫细胞治疗、细胞因子治疗等，其中免疫检查点抑制剂治疗以其显著的临床疗效而备受瞩目。
8.免疫检查点本是人体免疫系统中起保护作用的分子，起类似刹车的作用，防止t细胞过度激活导致的炎症损伤等。而肿瘤细胞利用人体免疫系统这一特性，通过过度表达免疫检查点分子，抑制人体免疫系统反应，逃脱人体免疫监视与杀伤，从而促进肿瘤细胞的生长。抑制免疫检查点分子及其配体的表达能够增强t细胞对肿瘤的杀伤效应，达到抗肿瘤的目的。已被公布的免疫检查点有ctla-4、pd-1/pd-l1、lag-3、tim-3、vista、a2ar等。
9.程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)在多种淋巴细胞上表达，尤其在肿瘤特异性t细胞上高表达。在肿瘤微环境中，它通过干扰保护性免疫应答而导致恶性肿瘤细胞的扩张。它具有两个配体，即程序性细胞死亡配体1和2(pd-l1、pd-l2)，其中，pd-l1被肿瘤细胞表达，以逃逸免疫系统对它进行的抗肿瘤反应。阻断pd-1和pd-l1间的作用可以在t细胞进入肿瘤微环境后保持t细胞的应答，保证t细胞的抗肿瘤作用。针对pd-1/pd-l1的抗体已有纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、jq1、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)和西米普利单抗(cemiplimab)。这些单抗被批准用于治疗乳腺癌、肺癌、大肠癌、癌症、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌和弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)。
10.尽管pd-1/pd-l1抗体抗癌疗效显著(总体无进展生存率达到80％)，但临床研究显示，仅有20-45％患者对其有所响应。肠道微生物可通过其表面分子(如荚膜多糖、鞭毛和表面蛋白等)以及代谢物(如短链脂肪、吲哚和肌苷等)影响宿主的免疫系统甚至影响免疫检查点抑制剂的疗效。已有报道显示，在pd-1/pd-l1抗体的疗效中，双歧杆菌起到了促进作用。联用短双歧杆菌-长双歧杆菌-pd-1抗体可使得黑色素瘤生长几乎完全停止。此外，肠道中高含量的a.mucinophilia和f.prausnitzii与对pd-1治疗的良好反应相关。
11.脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)为革兰氏染色阴性、杆状、两端钝圆而浓染、有荚膜、无芽胞、无动力的专性厌氧细菌，分为产肠毒素型(etbf)和非产肠毒素型(ntbf)，是人及动物肠道正常菌群的一部分，主要存在于结肠中，呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘膜也可定植生长。研究发现非产肠毒型脆弱拟杆菌(ntbf)具有重要的益生作用。能够调控t细胞扩张和产生阻碍致病性th17细胞发育的细胞因子il-10，具有抗炎作用，被认为是具有潜力的新一代益生菌。已有多项研究表明ntbf能够分泌抑炎细胞因子il-10，促进th1/th2细胞的平衡，能够抵抗肠道炎症，对dss诱导的结肠炎具有治疗作用。
12.尽管肠道菌群与pd-1/pd-l1抗体间具有良好的相互作用，但还没有出现专为增强pd-1/pd-l1抗体疗效而开发的微生态制剂。因此，有必要探索脆弱拟杆菌与pd-1/pd-l1抗体共同用药从而抗生殖、泌尿系统肿瘤的应用。


技术实现要素：

13.为克服现有技术中所存在的上述缺陷，本发明的目的是提供一种脆弱拟杆菌与pd-1抗体和/或pd-l1抗体联合用药在防治生殖泌尿系统肿瘤中的应用。本发明通过大量实验证明，脆弱拟杆菌特别是保藏编号为cgmcc no.10685的脆弱拟杆菌zy-312能够通过调节免疫因子，改善免疫细胞状态，增强机体抗肿瘤免疫反应，有效防治生殖泌尿系统肿瘤。
14.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
15.第一方面，提供一种脆弱拟杆菌与免疫检查点抑制剂在制备预防和/或治疗生殖泌尿系统肿瘤的产品中的应用。
16.在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌是活菌、形态结构完整的灭活菌或形态结构不完整的灭活菌中的一种及以上。
17.在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌是脆弱拟杆菌活菌体，经过灭活、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的脆弱拟杆菌，脆弱拟杆菌裂解物，脆弱拟杆菌液体培养上清液中的一种或多种。
18.在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌为保藏编号为cgmcc no.10685的脆弱拟杆菌zy-312。
19.在其中一些实施例中，所述生殖泌尿系统肿瘤是指病发于泌尿系统和(或)生殖系统的肿瘤。其中包括女性胸部和生殖器官肿瘤、男性生殖器官肿瘤以及泌尿器官肿瘤。优选地，选自乳腺癌、宫颈癌、子宫体癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、睾丸癌中的一种或多种。
20.在其中一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂包括pd-1、pd-l1、pd-l2、ctla-4、lag-3、tim-3、vista、a2ar抗体中的至少一种；优选的，免疫检查点抑制剂为pd-1抗体和/或pd-l1抗体。
21.在其中一些实施例中，所述pd-1抗体包括纳武利尤单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、特瑞普利单抗(toripalimab)、信迪利单抗(cindilimab)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)及其他能够与pd-1结合，阻断pd-1/pd-l1信号通路，上调t细胞活化，激活内源性抗肿瘤免疫反应的物质。
22.在其中一些实施例中，所述pd-l1抗体包括阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)及其他能够与pd-l1结合，阻断pd-1/pd-l1信号通路，上调t细胞活化，激活内源性抗肿瘤免疫反应的物质。
23.根据本发明，所述产品为食品或药品。
24.在其中一些实施例中，所述食品包括奶粉、干酪、凝乳、酸奶酪、冰激凌或发酵谷类食品。所述食品还可以是动物食品，比如饲料等。
25.在其中一些实施例中，所述药品的剂型包括丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液或管饲制剂。所述药品包括人用药或动物用药。在其中一些实施例中，所述药品给药周期可为间歇给药、周期性给药、持续给药或长期给药。
26.在其中一些实施例中，脆弱拟杆菌与pd-1抗体和/或pd-l1抗体同时给药。
27.在其中一些实施例中，脆弱拟杆菌与pd-1抗体和/或pd-l1抗体分别给药。
28.在其中一些实施例中，脆弱拟杆菌采用口服或灌肠方式给药。
29.第二方面，提供一种用于防治生殖泌尿系统肿瘤的药物组合物，其中，所述药物组
合物同时包括脆弱拟杆菌及pd-1抗体和/或pd-l1抗体。
30.在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌是活菌、形态结构完整的灭活菌或形态结构不完整的灭活菌中的一种及以上。
31.在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌是脆弱拟杆菌活菌体，经过灭活、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的脆弱拟杆菌，脆弱拟杆菌裂解物，脆弱拟杆菌液体培养上清液中的一种或多种。
32.在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌为保藏编号为cgmcc no.10685的脆弱拟杆菌zy-312。
33.在其中一些实施例中，所述生殖泌尿系统肿瘤包括女性胸部和生殖器官肿瘤、男性生殖器官肿瘤以及泌尿器官肿瘤。优选地，选自乳腺癌、宫颈癌、子宫体癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、睾丸癌中的一种或多种。
34.在其中一些实施例中，所述pd-1抗体包括纳武利尤单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、特瑞普利单抗(toripalimab)、信迪利单抗(cindilimab)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)及其他能够与pd-1结合，阻断pd-1/pd-l1信号通路，上调t细胞活化，激活内源性抗肿瘤免疫反应的物质。
35.在其中一些实施例中，所述pd-l1抗体包括阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)及其他能够与pd-l1结合，阻断pd-1/pd-l1信号通路，上调t细胞活化，激活内源性抗肿瘤免疫反应的物质。
36.根据本发明，所述组合物为药物。
37.在其中一些实施例中，所述药物的剂型包括丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液或管饲制剂。所述药品包括人用药或动物用药。
38.在其中一些实施例中，脆弱拟杆菌与pd-1抗体和/或pd-l1抗体同时给药。
39.在其中一些实施例中，脆弱拟杆菌与pd-1抗体和/或pd-l1抗体分别给药。
40.在其中一些实施例中，所述药物采用口服或灌肠方式给药。
41.在其中一些实施例中，所述药物给药周期可为间歇给药、周期性给药、持续给药或长期给药。
42.本发明的有益效果：
43.本发明通过大量实验证明，脆弱拟杆菌特别是保藏编号为cgmcc no.10685的脆弱拟杆菌zy-312与pd-1抗体和/或pd-l1抗体联合应用，在体内可通过调节免疫因子，改善免疫细胞状态，增强机体抗肿瘤免疫反应，有效防治生殖、泌尿系统肿瘤。
44.本发明采用的脆弱拟杆菌zy-312不含bft基因，是非产毒菌株，急性毒性证实，该菌株对正常小鼠和裸鼠均无致病性(wang y，deng h，li z，tan y，han y，wang x，du z，liu y，yang r，bai y，bi y，zhi f.safety evaluation of a novel strain of bacteroides fragilis.front microbiol.2017mar 17；8:435.)。根据专利zl201510459408.x和科技文献xu w，su p，zheng l，fan h，wang y，liu y，lin y，zhi f.in vivo imaging of a novel strain of bacteroides fragilis via metabolic labeling.front microbiol.2018oct 1；9:2298.的报道，该菌株对胃酸、胆盐有着较好的耐性，能够保证其在胃中的存活和有效定植。
附图说明
45.图1为实施例1中脆弱拟杆菌的菌落形态图；
46.图2为实施例1种脆弱拟杆菌革兰氏镜检图。
具体实施方式
47.下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
48.除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，所有细胞购自atcc；所有细胞培养材料购自gibco；所有实验动物购自浙江维通利华实验动物技术有限公司；或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
49.除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
50.实施例1脆弱拟杆菌活菌液、灭活菌液的制备
51.将脆弱拟杆菌zy-312菌种划线接种于血平皿，厌氧培养48h。观察菌落形态特征、染色特性、大小、球杆状和分布情况等。
52.菌落特征：脆弱拟杆菌zy-312在血平皿上37℃培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1mm-3mm之间，参见图1。
53.显微镜下形态：脆弱拟杆菌zy-312进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，呈现典型的杆状，两端钝圆而浓染，菌体中间不着色部分形如空泡，参见图2。
54.选取单个菌落接种于植物源蛋白胨液体培养基中进行发酵培养8小时(温度为37℃)，得脆弱拟杆菌zy-312活菌菌液。
55.常规热灭活所得脆弱拟杆菌zy-312活菌液，得脆弱拟杆菌灭活菌液。
56.实施例2脆弱拟杆菌联合pd-1抗体治疗小鼠4t1乳腺癌移植瘤
57.试验设计：选用balb/c雌性小鼠70只，按体重区间随机分为7组，即空白组、模型组、zy-312(10
10
cfu/只)、pd-1抗体(pd-1ab)组(商品编号be0146，购自bioxcell，下同200μg/只)、zy-312活菌联用pd-1抗体组、zy-312灭活菌组(10
10
cell/只)、zy-312灭活菌联用pd-1抗体组，每组10只。除空白组外，其余各组动物于第四对乳腺脂肪垫下接种1
×
106个4t1细胞，肿瘤体积达到100-150mm3时(d0)开始分组给药：从d0开始，空白组、模型组动物每日口服300μl生理盐水，每周两次腹腔注射200μl pbs；各给药组同频次给予对应药物，其中脆弱拟杆菌菌液给药体积为300μl，pd-1抗体给药体积为200μl。每天观察动物的健康状况及死亡情况，每两天测量一次肿瘤体积。给药后第14天(d14)，所有小鼠安乐死，采集小鼠血清、肿瘤、脾脏、粪便、右侧颈部淋巴以及右侧腋窝淋巴。所有肿瘤称重和拍照。肿瘤分为三份，一份冻存用于细胞因子检测，一份于福尔马林中固定，一份送于体外用于流式分析。
58.检测项目与方法：
59.肿瘤体积与肿瘤生长抑制率：每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：v＝0.5a
×
b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
60.化合物的抑瘤疗效用tgi(％)或相对肿瘤增殖率t/c(％)评价。tgi(％)，反映肿瘤生长抑制率。tgi(％)的计算：tgi(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积－同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]
×
100。
[0061]
相对肿瘤增殖率t/c(％)：计算公式如下：t/c％＝t
rtv
/c
rtv
×
100(t
rtv
：治疗组rtv；c
rtv
：同型对照组rtv)。根据肿瘤测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，rtv)，计算公式为rtv＝vt/v0，其中v0是分组给药时(即d0)测量所得平均肿瘤体积，vt为某一次测量时的平均肿瘤体积，t
rtv
与c
rtv
取同一天数据。
[0062]
脾脏内t细胞亚群：流式细胞术分析肿瘤内cd4

t细胞和cd8

t细胞的比例。
[0063]
细胞因子检测：elisa检测小鼠血清中il-2和ifn-γ的含量。
[0064]
数据统计与分析：使用spss统计软件25.0进行统计学分析。
[0065]
1.试验结果
[0066]
(1)肿瘤体积、肿瘤重量与肿瘤生长抑制率
[0067]
表1基于分组给药后第14天肿瘤体积计算得出的抑瘤药效
[0068][0069]
注：
[0070]
a.平均值
±
sem。
[0071]
b.肿瘤生长抑制评价指标根据公式t/c％＝t
rtv
/c
rtv
×
100％和tgi(％)＝[1-(ti-t0)/(vi-v0)]
×
100计算。
[0072]
c.根据肿瘤体积计算，两组间p值按照unpaired t-test(one-tailed)方法计算。
[0073]
表2基于分组给药后第14天肿瘤重量计算得出的抑瘤药效
[0074][0075]
注：
[0076]
a.平均值
±
sem。
[0077]
b.肿瘤生长抑制评价指标根据公式t/c
weight
＝tw
treatment
/tw
同型对照
计算。
[0078]
c.根据肿瘤重量计算，两组间p值按照unpaired t-test(one-tailed)方法计算。
[0079]
根据上表可知，与空白组相比，移植瘤小鼠产生明显肿瘤瘤块，造模成功。与模型组相比，pd-1抗体、脆弱拟杆菌zy-312单独用药时，肿瘤生长速度有一定程度的减缓；但在zy-312与pd-1抗体联合用药时，肿瘤生长明显减缓。可见，脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体能够有效抑制肿瘤生长。
[0080]
(2)t细胞亚群
[0081]
表3各组小鼠脾脏t细胞亚群比例(mean
±
sd)
[0082][0083]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0084]
如上表，与模型组相比，各给药组均不同程度地上调了脾脏内cd4 t细胞占总细胞的比例。脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体组的上调幅度与模型组具有显著性差异，大于单独给药组。
[0085]
与模型组相比，各给药组均不同程度地上调了脾脏内cd8 t细胞占总细胞的比例。脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体组的上调幅度与模型组具有显著性差异，大于单独给药组。
[0086]
可见，脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体能够上调脾脏内cd4 和cd8 t细胞的比例。
[0087]
(3)细胞因子检测
[0088]
表4各组小鼠血清细胞因子水平(mean
±
sd)
[0089][0090][0091]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0092]
如上表，与模型组相比，各给药组均不同程度地上调了血清il-2的水平。脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体组的上调幅度与模型组具有显著性差异，大于单独给药组。
[0093]
与模型组相比，各给药组均不同程度地上调了血清ifn-γ的水平。脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体组的上调幅度与模型组具有显著性差异，大于单独给药组。
[0094]
可见，脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体能够上调细胞因子il-2和ifn-γ的水平。
[0095]
综上所述，脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体能够通过增强小鼠抗肿瘤免疫功能，有效防治乳腺癌。
[0096]
实施例3脆弱拟杆菌联合pd-1抗体治疗小鼠id8卵巢癌腹水瘤
[0097]
1.试验设计及流程
[0098]
4-6周龄c57bl/6雌性小鼠70只，按体重区间随机分为7组，即空白组、模型组、zy-312(10
10
cfu/只)、pd-1抗体(pd-1ab)组(be0273，bioxcell 200μg/只)、zy-312活菌联用pd-1抗体组、zy-312灭活菌组(10
10
cfu/只)、zy-312灭活菌联用pd-1抗体组(10
10
cfu/只)，每组10只。
[0099]
采用含10％小牛血清、青霉素(100u/ml)及链霉素(100u/ml)的dmem培养液在常规条件(37℃、饱和湿度、5％co2)下培养id8卵巢癌细胞至对数生长期，调整细胞浓度为2
×
107个/ml，除空白组外，每组各小鼠腹腔注射0.2ml细胞悬液，空白组腹腔注射0.2ml生理盐水。
[0100]
接种3周后(d0)开始分组给药：从d0开始，空白组、模型组动物每日口服300μl生理盐水，每两天一次腹腔注射100μl pbs；各给药组同频次给予对应药物，其中脆弱拟杆菌菌液给药体积为300μl，pd-1抗体给药体积为100μl，抗体共给药9次。每天观察动物的健康状况及死亡情况，每两天测量一次肿瘤体积。末次给药两周后，所有小鼠安乐死，采集小鼠血清、腹水、肿瘤、脾脏、粪便、右侧颈部淋巴以及右侧腋窝淋巴。肿瘤分为两份，一份于福尔马林中固定，一份送于体外用于流式分析。
[0101]
检测项目与方法：
[0102]
腹水体积：5ml注射器，18号针头抽取腹水。
[0103]
肿瘤内t细胞亚群：流式细胞术分析肿瘤内cd3 cd4

t细胞和cd3 cd8

t细胞的比例。
[0104]
细胞因子检测：elisa检测小鼠腹水中il-2的含量。
[0105]
数据统计与分析：使用spss统计软件25.0进行统计学分析。
[0106]
2.试验结果
[0107]
(1)腹水体积
[0108]
表5各组小鼠腹水体积(mean
±
sd)
[0109][0110]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0111]
小鼠腹腔注射id8卵巢癌细胞造模为腹水瘤。与空白组相比，模型组出现显著腹水表现，造模成功。与模型组相比，各给药组均减小了腹水体积，脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体组腹水体积显著小于模型组。
[0112]
(2)t细胞亚群
[0113]
表6各组小鼠肿瘤内t细胞亚群(mean
±
sd)
[0114][0115]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0116]
腹腔内肿瘤分散为小而易碎的腹膜内微结节，附着在直径2-7cm的肠系膜上。从肠系膜轻轻分离并收集每只小鼠中存在的肿瘤微结节，制为细胞悬液进行流式细胞数检测。
[0117]
与模型组相比，各给药组均提高了cd3 cd8 t细胞在活细胞中的比例，除zy-312组外，其余组与模型组均具有显著性差异；脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体组上调幅度更高。
[0118]
与模型组相比，各给药组均显著提高了cd3 cd4 t细胞在活细胞中的比例，脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体组上调幅度更高。这说明pd-1抗体和脆弱拟杆菌zy-312均能够提高肿瘤内浸润t细胞的比例。
[0119]
(3)细胞因子
[0120]
表7各组小鼠腹水中il-2含量(mean
±
sd)
[0121][0122]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0123]
il-2是免疫激活因子，其水平反应效应t细胞功能。与模型组相比，各给药组均显著提高了腹水中il-2的水平，脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体组上调幅度更高。这说明pd-1抗体和脆弱拟杆菌zy-312均能够增强效应t细胞功能。
[0124]
综上，脆弱拟杆菌能够提高肿瘤内浸润t细胞比例、增强效应t细胞功能，有效防治卵巢癌。
[0125]
实施例4脆弱拟杆菌联合pd-1抗体治疗小鼠宫颈癌移植瘤
[0126]
1.试验设计及流程
[0127]
6-8周龄c57bl/6雌性小鼠70只，按体重区间随机分为7组，即空白组、模型组、zy-312(10
10
cfu/只)、pd-1抗体(pd-1ab)组(be0273，bioxcell 200μg/只)、zy-312活菌联用pd-1抗体组、zy-312灭活菌组(10
10
cfu/只)、zy-312灭活菌联用pd-1抗体组(10
10
cfu/只)，每组10只。
[0128]
采用含10％小牛血清、青霉素(100u/ml)及链霉素(100u/ml)的dmem培养液在常规条件(37℃、饱和湿度、5％co2)下培养tc-1细胞至对数生长期，调整细胞浓度为6
×
106个/
ml，除空白组外，每组各小鼠右侧腋下皮下注射0.1ml细胞悬液，空白组右侧腋下皮下注射0.1ml生理盐水。
[0129]
接种7日后(d0)开始分组给药：从d0开始，空白组、模型组动物每日口服300μl生理盐水，每七天一次腹腔注射100μl pbs；各给药组同频次给予对应药物，其中脆弱拟杆菌菌液给药体积为300μl，pd-1抗体给药体积为100μl，抗体共给药3次。每天观察动物的健康状况及死亡情况，每两天测量一次肿瘤体积。末次给药一周后，所有小鼠安乐死，采集小鼠血清、肿瘤、脾脏、粪便、右侧颈部淋巴以及右侧腋窝淋巴。
[0130]
检测项目与方法：
[0131]
肿瘤重量与肿瘤生长抑制率：抑瘤率＝100％(模型组肿瘤平均重量-给药组肿瘤平均重量)/模型组肿瘤平均重量。
[0132]
细胞毒性(cytotoxicity assay)：使用非放射性细胞毒性法测量脾细胞的细胞毒性。
[0133]
细胞因子检测：elisa检测小鼠肿瘤中血管内皮生长因子(vegf)和il-10的表达以及脾淋巴细胞培养物上清液中的ifn-γ和il-4的水平。
[0134]
数据统计与分析：使用spss统计软件25.0进行统计学分析。
[0135]
2.试验结果
[0136]
(1)肿瘤重量与肿瘤生长抑制率
[0137]
表8各组小鼠肿瘤重量与抑瘤率(mean
±
sd)
[0138][0139]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0140]
与空白组相比，模型组明显成瘤，造模成功。
[0141]
与模型组相比，各给药组肿瘤重量下降，脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体组具有显著性差异。这说明脆弱拟杆菌能够有效抑制宫颈癌生长，脆弱拟杆菌zy-312与pd-1抗体联用效果更佳。
[0142]
(2)细胞毒性(cytotoxicity assay)
[0143]
表9各组小鼠脾脏细胞细胞毒性(mean
±
sd)
[0144]
[0145]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0146]
细胞毒性反映免疫细胞对靶细胞的杀伤能力。与模型组相比，各给药组均上调了脾细胞对肿瘤细胞的细胞毒性，脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体组具有显著性差异。
[0147]
(3)细胞因子
[0148]
表10各组小鼠细胞因子(mean
±
sd)
[0149][0150]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0151]
cd4 t细胞是效应t细胞的重要成分，根据所产生的细胞因子和效应细胞的生物功能特征，将其分为th1、th2、treg和th17。th1主要分泌ifn-γ和il-2，促进细胞免疫，而th2主要分泌il-4、il-5、il-10和il-13，促进体液免疫。肿瘤细胞能够诱导th1/th2的极化平衡向th2漂移，进而上调免疫抑制细胞调控t细胞的水平。vegf是肿瘤血管生成的关键机制，也是多种恶性肿瘤抗血管生成治疗的主要靶标。
[0152]
在肿瘤微环境中，与模型组相比，各给药组均不同幅度下调了vegf和il-10的水平，联用组具有显著性。
[0153]
在脾脏中，与模型组相比，各给药组均不同幅度下调了il-4/ifn-γ的比值，联用组具有显著性。这说明脆弱拟杆菌联用pd-1抗体能够调节th1/th2的平衡，抑制th2极化。
[0154]
上述结果表明，脆弱拟杆菌联用pd-1抗体能够抑制肿瘤血管生成，促进抗肿瘤免疫反应。
[0155]
综上，脆弱拟杆菌能够增强ctls功能，促进抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤血管生成，有效防治宫颈癌。
[0156]
实施例5脆弱拟杆菌联合pd-1抗体治疗小鼠tramp-c1前列腺癌移植瘤
[0157]
1.试验设计及流程
[0158]
前列腺移植瘤模型制备
[0159]
(1)采用含10％小牛血清、1％青霉素与链霉素混合液的1640培养液在常规条件下(37℃、饱和湿度、5％co2)下培养tramp-c1前列腺癌细胞至对数生长期，调整细胞浓度为1
×
108个/ml。c57bl/6雄性小鼠，无菌条件下左侧腹股沟皮下注射0.1ml细胞悬液，待肿瘤长至直径2-3cm时处死荷瘤小鼠，作为移植用瘤源。
[0160]
(2)c57bl/6雄性小鼠70只，按体重区间随机分为7组，即空白组、模型组、zy-312(10
10
cfu/只)、pd-1抗体(pd-1ab)组(be0273，bioxcell 200μg/只)、zy-312活菌联用pd-1抗体组、zy-312灭活菌组(10
10
cfu/只)、zy-312灭活菌联用pd-1抗体组(10
10
cfu/只)，每组10只。将瘤源分割成直径0.4cm的小块，除空白组外，植入各小鼠左侧腹股沟皮下。一周后小鼠成瘤。空白组行相同手术，但不植入瘤块。
[0161]
成瘤后(d0)开始分组给药：从d0开始，空白组、模型组动物每日口服300μl生理盐
水，每周一次腹腔注射100μl pbs；各给药组同频次给予对应药物，其中脆弱拟杆菌菌液给药体积为300μl，pd-1抗体给药体积为100μl，抗体共给药7次。每天观察动物的健康状况及死亡情况，每两天测量一次肿瘤体积。末次给药两周后，所有小鼠安乐死，采集小鼠血清、肿瘤、脾脏、粪便、右侧颈部淋巴以及右侧腋窝淋巴。脾脏、肿瘤分为两份，一份于福尔马林中固定，一份送于体外用于流式分析。
[0162]
检测项目与方法：
[0163]
肿瘤重量与肿瘤生长抑制率：抑瘤率＝100％(模型组肿瘤平均重量-给药组肿瘤平均重量)/模型组肿瘤平均重量。
[0164]
t细胞亚群：流式细胞术分析脾脏、肿瘤内cd3 cd8 t细胞的比例。
[0165]
细胞因子检测：elisa检测小鼠血清中il-2、ifn-γ、tnf-α的含量。
[0166]
数据统计与分析：使用spss统计软件25.0进行统计学分析。
[0167]
2.试验结果
[0168]
(1)肿瘤重量与肿瘤生长抑制率
[0169]
表11各组小鼠肿瘤重量与肿瘤生长抑制率(mean
±
sd)
[0170][0171]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0172]
与空白组相比，模型组显著成瘤，造模成功。
[0173]
与模型组相比，各给药组肿瘤重量均下降，联用组肿瘤重量显著下降。说明脆弱拟杆菌zy-312能够抑制前列腺肿瘤生长，zy-312联用pd-1抗体抑瘤效果更佳。
[0174]
(2)t细胞亚群
[0175]
表12各组小鼠脾脏、肿瘤内t细胞亚群(mean
±
sd)
[0176][0177]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0178]
与模型组相比，各给药组均上调脾脏cd8 t细胞在cd3 t细胞中的比例，脆弱拟杆
菌zy-312联用pd-1抗体组具有显著性。
[0179]
与模型组相比，各给药组均上调肿瘤内浸润cd8 t细胞在cd3 t细胞中的比例，脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体组具有显著性。上述结果说明脆弱拟杆菌能够增加脾脏和肿瘤内浸润效应t细胞比例，脆弱拟杆菌zy-312与pd-1抗体联用效果更佳。
[0180]
(3)细胞因子
[0181]
表13各组小鼠血清细胞因子(mean
±
sd)
[0182][0183]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0184]
il-2、ifn-γ和tnf-α均是免疫激活因子。与模型组相比，各给药组均上调血清细胞因子水平，脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体组具有显著性。这说明脆弱拟杆菌能够上调免疫激活因子水平，脆弱拟杆菌zy-312与pd-1抗体联用效果更佳。
[0185]
综上，脆弱拟杆菌联用pd-1抗体可增加效应t细胞数量，上调免疫激活因子水平，增强机体抗肿瘤免疫反应，有效防治前列腺癌。
[0186]
实施例6脆弱拟杆菌联合pd-1抗体治疗小鼠mb49膀胱癌移植瘤
[0187]
1.试验设计及流程
[0188]
6-8周龄c57bl/6小鼠70只，雌雄各半，按体重区间随机分为7组，即空白组、模型组、zy-312(10
10
cfu/只)、pd-1抗体(pd-1ab)组(be0273，bioxcell 100μg/只)、zy-312活菌联用pd-1抗体组、zy-312灭活菌组(10
10
cfu/只)、zy-312灭活菌联用pd-1抗体组(10
10
cfu/只)，每组10只。
[0189]
采用含10％小牛血清、青霉素(100u/ml)及链霉素(100u/ml)的1640培养液在常规条件(37℃、饱和湿度、5％co2)下培养mb49膀胱癌细胞至对数生长期，调整细胞浓度为1
×
106个/ml，除空白组外，每组各小鼠后腿背部皮下注射0.1ml细胞悬液，空白组后腿背部皮下注射0.1ml生理盐水。
[0190]
接种当天(d0)开始分组给药：从d0开始，空白组、模型组动物每日口服300μl生理盐水，每四天一次腹腔注射100μl pbs；各给药组同频次给予对应药物，其中脆弱拟杆菌菌液给药体积为300μl，pd-1抗体给药体积为100μl，抗体共给药4次。每天观察动物的健康状况及死亡情况，每两天测量一次肿瘤体积。末次给药一周后，所有小鼠安乐死，采集小鼠血液、肿瘤、脾脏、粪便、右侧颈部淋巴以及右侧腋窝淋巴。肿瘤分为两份，一份于福尔马林中固定，一份送于体外用于流式分析。
[0191]
检测项目与方法：
[0192]
肿瘤重量与肿瘤生长抑制率：抑瘤率＝100％(模型组肿瘤平均重量-给药组肿瘤平均重量)/模型组肿瘤平均重量。
[0193]
t细胞亚群：流式细胞术分析外周血内cd4 、cd8 t细胞的比例。
[0194]
细胞因子检测：elisa检测小鼠血清中il-10、il-12、ifn-γ的含量。
[0195]
数据统计与分析：使用spss统计软件25.0进行统计学分析。
[0196]
2.试验结果
[0197]
(1)肿瘤重量与肿瘤生长抑制率
[0198]
表14各组小鼠肿瘤重量与肿瘤生长抑制率(mean
±
sd)
[0199][0200][0201]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0202]
与空白组相比，模型组明显成瘤，造模成功。
[0203]
与模型组相比，各给药组肿瘤重量均下降，联用组肿瘤重量显著下降。说明脆弱拟杆菌zy-312能够抑制膀胱肿瘤生长，zy-312联用pd-1抗体抑瘤效果更佳。
[0204]
(2)t细胞亚群
[0205]
表15各组小鼠外周血t细胞亚群(mean
±
sd)
[0206][0207]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0208]
与模型组相比，各给药组外周血cd4 、cd8 t细胞比例上升，脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体组具有显著性。说明脆弱拟杆菌能够上调外周血效应t细胞比例，脆弱拟杆菌zy-312与pd-1抗体联用效果更佳。
[0209]
(3)细胞因子
[0210]
表16各组小鼠血清细胞因子
[0211]
[0212]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0213]
与空白组相比，模型组各细胞因子均上升，显示出机体针对肿瘤的免疫反应。
[0214]
il-10是免疫抑制因子，与模型组相比，pd-1抗体组il-10水平上升；zy-312和联用组下调了il-10的水平。联用组下调幅度更大。
[0215]
il-12、ifn-γ均是免疫激活因子，与模型组相比，各给药组均上调了il-12的水平。联用组具有显著性。
[0216]
与模型组相比，各给药组均显著上调了ifn-γ的水平，联用组上调幅度更大。
[0217]
上述结果说明脆弱拟杆菌能够下调免疫抑制因子水平，上调免疫激活因子水平，脆弱拟杆菌zy-312与pd-1抗体联用效果更佳。
[0218]
综上，脆弱拟杆菌联用pd-1抗体可增加效应t细胞数量，下调免疫抑制因子水平，上调免疫激活因子水平，增强机体抗肿瘤免疫，有效防治膀胱癌。
[0219]
实施例7脆弱拟杆菌联合pd-1抗体治疗小鼠renca肾细胞癌移植瘤
[0220]
1.试验设计及流程
[0221]
6-8周龄balb/c雄性小鼠70只，按体重区间随机分为7组，即空白组、模型组、zy-312(10
10
cfu/只)、pd-1抗体(pd-1ab)组(be0146，bioxcell 200μg/只)、zy-312活菌联用pd-1抗体组、zy-312灭活菌组(10
10
cfu/只)、zy-312灭活菌联用pd-1抗体组(10
10
cfu/只)，每组10只。
[0222]
采用含10％小牛血清、青霉素(100u/ml)及链霉素(100u/ml)的1640培养液在常规条件(37℃、饱和湿度、5％co2)下培养renca肾癌细胞至对数生长期，调整细胞浓度为2
×
107个/ml，除空白组外，每组各小鼠左侧胁腹部皮下注射50μl细胞悬液，空白组左侧胁腹部皮下注射50μl生理盐水。
[0223]
肿瘤体积达到500mm3(d0)开始分组给药：从d0开始，空白组、模型组动物每日口服300μl生理盐水，每三天一次腹腔注射100μl pbs；各给药组同频次给予对应药物，其中脆弱拟杆菌菌液给药体积为300μl，pd-1抗体给药体积为100μl，抗体共给药3次。每天观察动物的健康状况及死亡情况，每两天测量一次肿瘤体积。d24，所有小鼠安乐死，采集小鼠血液、肿瘤、脾脏、粪便、右侧颈部淋巴以及右侧腋窝淋巴。肿瘤分为两份，一份于福尔马林中固定，一份送于体外用于流式分析。
[0224]
检测项目与方法：
[0225]
肿瘤重量与肿瘤生长抑制率：抑瘤率＝100％(模型组肿瘤平均重量-给药组肿瘤平均重量)/模型组肿瘤平均重量。
[0226]
t细胞亚群：流式细胞术分析肿瘤引流淋巴结内cd80 、cd86 t细胞的比例。
[0227]
细胞因子检测：elisa检测小鼠血清中il-2、ifn-γ、il-4、il-10的含量。
[0228]
数据统计与分析：使用spss统计软件25.0进行统计学分析。
[0229]
2.试验结果
[0230]
(1)肿瘤重量与肿瘤生长抑制率
[0231]
表17各组小鼠肿瘤重量与肿瘤生长抑制率(mean
±
sd)
[0232][0233]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0234]
与空白组相比，模型组显著成瘤，造模成功。
[0235]
与模型组相比，各给药组均使肿瘤重量下降，脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体组具有显著性差异。说明脆弱拟杆菌能够抑制肾癌生长，脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体效果更佳。
[0236]
(2)t细胞亚群
[0237]
表18各组小鼠肿瘤引流淋巴结t细胞亚群(mean
±
sem)
[0238][0239]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0240]
树突状细胞表达pd-l1配体，该配体可使树突状细胞处于非成熟状态，促使肿瘤细胞发生免疫逃逸。系统应用pd-1抗体理论上可促使树突状细胞成熟，增强机体抗肿瘤免疫反应。与模型组相比，各给药组均提高了肿瘤引流淋巴结内成熟树突状细胞的比例，pd-1抗体和脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体组具有显著性差异。说明脆弱拟杆菌能够促进树突状细胞成熟，增强机体抗肿瘤免疫反应，脆弱拟杆菌zy-312与pd-1抗体联用时效果更佳。
[0241]
(3)细胞因子
[0242]
表19各组小鼠血清细胞因子(mean
±
sd)
[0243][0244]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0245]
il-2、ifn-γ是th1型细胞因子，il-4、il-10是th2型细胞因子。与模型组相比，各给药组虽然对th2型细胞因子的影响不大，但上调了th1型细胞因子，脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体组上调幅度大于两药单用组。这说明脆弱拟杆菌能够调节th1/th2平衡，增强机
体th1型免疫反应，进而增强抗肿瘤免疫反应，脆弱拟杆菌zy-312与pd-1抗体联用时效果更佳。
[0246]
综上，脆弱拟杆菌zy-312联用pd-1抗体可促进树突状细胞成熟，增强机体th1型免疫反应，有效防治肾癌。
[0247]
本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。