有机荧光小分子化合物、有机荧光纳米载体及其制备方法和应用

1.本发明专利涉及生物医药材料技术领域，尤其是指一种有机荧光小分子化合物、有机荧光纳米载体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.一般地，在体内的循环时间越长，纳米载体越有足够的时间向病灶部位累积，从而更好地发挥其诊断或治疗作用。然而，现有技术中，传统的纳米载体仍不足以满足对长循环性能的要求。近年来，纳米载体基于高曲率、尺寸小的特点，具有改善药物在体内的分布并且具有对肿瘤部位的高通透性和滞留效应(epr效应)作用，已经受到了广泛的关注。纳米载体一旦应用于体内，长循环特性成为其应用的重要因素。
3.目前临床广泛使用的化疗药物在体内分布较广，尤其在一些正常组织中也有分布，不仅降低了药物的生物利用率，还会对正常组织造成显著的毒副作用。另外，药物在血液中循环时间太短，难以到达病灶部位。因此，提高化疗药物对癌细胞的选择性，降低其在非靶向部位的分布，提高药物利用率是提高癌症治疗药物疗效的关键。例如，阿霉素作为蒽环类抗生素中的一员，具备较强的抗肿瘤活性。但因其组织分布较差，毒副作用较大，并且长期服用易导致多药耐药性等影响其药效的发挥，这些不良因素严重限制了其临床的应用。
4.综上所述，提供一种具有长循环特性、提高药物尤其是肿瘤药物利用率的药物载体显得很有必要。


技术实现要素：

5.聚合物胶束作为纳米载药系统中的一员，近年来备受关注，与其他的载体比较，它表现出明显的优势：(1)临界胶束浓度低，抗血液稀释性强；(2)粒径小，分布范围窄，可以利用erp效应(实体瘤的高通透性和滞留性效应)达到被动靶向；(3)具备特殊的核壳结构，亲水性外壳可避免res(网状内皮系统)的识别实现长循环，疏水性药物进入内核能够增加药物溶解度的同时降低毒副作用；(4)表面有修饰功能性配体，达到主动靶向作用。基于此，前药胶束的研究也层出不穷。
6.hla4p@dox由小分子近红外二区荧光团以及蒽醌类抗生素组成。并在体内持续实时跟踪药物传递和治疗的nir-ii成像，与游离dox相比，具有缓释率高、治疗效果好、心脏毒性小等特点。
7.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，由此，在本发明的第一方面，本发明提供一种有机荧光小分子化合物在制备药物载体中的应用，所述有机荧光小分子化合物结构式如式1所示：
[0008][0009]
其中，r1选自s和se的一种，r0、r2分别独自地选自o、s、se和n-r
11
中的一种，r
11
选自h、甲基和乙基中的一种；r3、r4、r5、r6分别独自地选自分别独自地选自和h中的一种，n取自0～18中的整数，m取自0～20中的整数；
[0010]
r7、r8、r9、r
10
分别独自地选自分别独自地选自分别独自地选自中的一种，n取自0～18中的整数，m取自0～20中的整数，x选自f、cl、br、i和n3中的一种。
[0011]
在本发明的一个或多个实施例中，所述有机荧光小分子化合物结构式如下所示：
[0012][0013]
在本发明的一个或多个实施例中，上述的一种有机荧光小分子化合物在制备药物载体中的应用，包括：在所述有机荧光小分子化合物的可调控位点修饰多肽、蛋白、聚乙二醇、核酸适配体或叶酸及其衍生物得到荧光团，将所述荧光团作为抗肿瘤药物载体。
[0014]
优选地，将所述荧光团作为蒽醌类抗生素抗肿瘤药物载体。
[0015]
进一步地，所述蒽醌类抗生素抗肿瘤药物包括阿霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星和米托蒽醌中的一种或几种。
[0016]
在本发明的第二方面，本发明提供一种抗肿瘤药物，包括在本发明第一方面所述
的有机荧光小分子化合物或在所述有机荧光小分子化合物的可调控位点修饰多肽、蛋白、聚乙二醇、核酸适配体或叶酸及其衍生物得到的荧光团。
[0017]
在本发明的一个或多个实施例中，所述抗肿瘤药物靶向肿瘤。
[0018]
在本发明的第三方面，本发明提供一种在本发明第二方面所述的抗肿瘤药物的制备方法，包括：
[0019]
步骤1)：去除抗肿瘤药物活性成分盐中的酸，得到游离药物，将在所述有机荧光小分子化合物的可调控位点修饰多肽、蛋白、聚乙二醇、核酸适配体或叶酸及其衍生物得到的荧光团和所述游离药物添加到dmso中，得到混合液；
[0020]
步骤2)：将去离子水或pbs添加到容器中，然后将步骤1)得到的混合液滴入容器底部，超声处理，得到混合物；
[0021]
步骤3)：将步骤2)得到的混合物透析，以去除未包载成功的游离药物。
[0022]
在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤1)中，混合液中，所述游离药物与所述荧光团的质量比为1：5；优选地，抗肿瘤药物活性成分选自柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星和米托蒽醌中的一种或多种。优选地，所述抗肿瘤药物活性成分盐为盐酸阿霉素。
[0023]
在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤2)中，所述混合液滴入容器的滴入速度为每分钟60～110滴；使用超声清洗机进行超声处理，超声功率控制为230～250w，工作频率控制为40khz，超声时间控制为5～20秒。
[0024]
在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤3)中，所述透析使用的透析袋的截留分子量为10kda，以去离子水为外液，透析时间控制为24～60小时，期间更换外液大于6次。
[0025]
在本发明的第四方面，本发明提供一种有机荧光纳米载体，其特征在于，所述有机荧光纳米载体包括本发明第一方面所述的有机荧光小分子化合物或在所述有机荧光小分子化合物的可调控位点修饰多肽、蛋白、聚乙二醇、核酸适配体或叶酸及其衍生物得到的荧光团。
[0026]
本发明的有益效果在于：
[0027]
1、本发明提供一种有机荧光小分子化合物在制备药物载体中的应用，所述有机荧光小分子化合物在其可调控位点修饰多肽、蛋白、聚乙二醇、核酸适配体或叶酸及其衍生物得到荧光团，所述荧光团可作为抗肿瘤药物载体；
[0028]
2、本发明提供一种抗肿瘤药物，与游离抗肿瘤药物相比，具有肿瘤靶向，缓释率高、治疗效果好、心脏毒性小等特点；
[0029]
3、本发明提供上述抗肿瘤药物的制备方法，其合成路线简单，反应效率高，收率高，具有较高的工业应用前景；
[0030]
4、本发明提供一种药物载体，抗肿瘤药物在所述药物载体的包载下具有肿瘤靶向，缓释率高、治疗效果好、心脏毒性小等特点。
附图说明
[0031]
图1为hla4的核磁氢谱图；
[0032]
图2为hla4的核磁碳谱图；
[0033]
图3为hla4的吸收和发射光谱图；
[0034]
图4为化合物hla4转变为可用于生物成像探针hla4p的制备过程；
[0035]
图5为化合物hla4p核磁氢谱表征；
[0036]
图6为化合物hla4连接聚乙二醇后可以自组装形成纳米粒子的透射电镜图；
[0037]
图7为实施例2所制备的hla4p@dox自组装示意图；
[0038]
图8为实施例3共聚焦显微镜的细胞摄取成像；
[0039]
图9为实施例2所制备的hla4p@dox的tem与dls图；
[0040]
图10为实施例5中尾静脉注射后dox和hla4p@dox不同时间节点的生物分布图；
[0041]
图11为实施例5中尾静脉注射dox后不同时间节点的不同器官的生物分布图；
[0042]
图12为实施例5中尾静脉注射hla4p@dox后不同时间节点的不同器官的生物分布图；
[0043]
图13为实施例6为给予各种治疗下小鼠的肿瘤大小图；
[0044]
图14为实施例7中给予各种治疗下小鼠的近红外二区成像图；
[0045]
图15为实施例8中给予各种治疗下小鼠的不同器官的h&e染色图。
具体实施方式
[0046]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，使用的方法如无特别说明，均为本领域公知的常规方法，使用的耗材和试剂如无特别说明，均为市场购得。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
[0047]
实施例1
[0048]
有机荧光小分子化合物结构式如式1所示：
[0049][0050]
其中，y、z分别独自地选自o、s、se和n-r9中的一种，r9选自h、甲基和乙基中的一种；r1、r2、r3、r4分别独自地选自分别独自地选自和h中的一种，n取自0～18中的整数，m取自0～20中的整数；
[0051]
r5、r6、r7、r8分别独自地选自
[0052]
中的一种，n取自0～18中的整数，m取自0～20中的整数，x选自f、cl、br、i和n3中的一种。
[0053]
上述有机荧光小分子化合物(式1所示化合物)的制备路线如下所示：
[0054][0055]
以下实验组1以化合物hla4为示例说明有机荧光小分子化合物(式1所示化合物)的制备。
[0056]
实验组1：化合物hla4的制备
[0057]
步骤1)：化合物3a的制备：
[0058]
取化合物2a(2g，5.9mmol)、锌粉(13.8g，212.4mmol)和氯化铵(18.8g，354mmol)加入500ml圆底烧瓶中，在氩气保护下加入甲醇-水(v/v，9:1)100ml和二氯甲烷100ml，向反应液中通入氩气鼓泡5min排除体系内氧气，氩气保护下在室温下反应2小时。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去甲醇，残渣复溶在150ml二氯甲烷中，水(30ml
×
3)洗三次，饱和食盐水(30ml
×
3)洗三次。有机相用无水硫酸镁干燥3小时，过滤，滤液旋干得中间体。取上述中间体、n-亚磺酰苯胺(2.47g，17.8mmol)和三甲基氯硅烷(2.57g，23.7mmol)加入50ml圆底烧瓶中，在氩气保护下加入20ml吡啶，向反应液中通入氩气鼓泡5min排除体系内氧气，氩气保护下在室温下反应2小时。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去吡啶，残渣复溶在150ml二氯甲烷中，水(30ml
×
3)洗三次，饱和食盐水(30ml
×
3)洗三次。有机相用无水硫酸镁干燥3小时，过滤，滤液旋干得1.62g化合物3a,收率：90％。
[0059]
化合物3a结构测定数据如下：
[0060]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.43(s,1h),6.93(s,1h),2.65(t,j＝7.7hz,2h),1.93
–
1.62(m,2h),1.46
–
1.14(m,19h),0.90(t,j＝6.8hz,3h).
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ156.18,144.66,134.65,125.64,120.24,112.46,31.94,30.49,30.43,29.69,29.62,29.48,29.38,29.35,22.71,14.14.
[0061]
步骤2)：化合物4a的制备：
[0062]
取上述蓝色化合物3a(840mg,1.31mmol)、n-溴代琥珀酰亚胺(nbs)(780mg，3.93mmol)加入50ml圆底烧瓶中，在氩气保护下加入20ml吡啶，向反应液中通入氩气鼓泡
5min排除体系内氧气，氩气保护下在室温下反应2小时。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去吡啶，残渣复溶在150ml二氯甲烷中，水(30ml
×
3)洗三次，饱和食盐水(30ml
×
3)洗三次。有机相用无水硫酸镁干燥3小时，过滤，滤液旋干得953mg化合物3a。收率：91％。
[0063]
化合物4a结构测定数据如下：
[0064]
hrms(esi)calcd for:c
52h41
n6o8s
4
([m h] ):800.8769,found:800.8743.
[0065]
步骤3)：化合物6a的制备:
[0066]
取化合物4a(720mg，0.904mmol)、百分之十五质量分数的碳酸氢钠、化合物5a(1.23g，2.26mmol)和四三苯基膦钯(10mg，0.008mmol)加入50ml圆底烧瓶中，在氩气保护下加入20ml四氢呋喃，向反应液中通入氩气鼓泡5min排除体系内氧气，氩气保护下在室温下反应2小时。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氢呋喃，残渣复溶在150ml二氯甲烷中，水(30ml
×
3)洗三次，饱和食盐水(30ml
×
3)洗三次。有机相用无水硫酸镁干燥3小时，过滤，滤液旋干得1.03g 6a,收率：80％。
[0067]
化合物6a结构测定数据如下:1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.47(s,2h),7.36(d,j＝8.5hz,4h),7.33
–
7.28(m,5h),7.16(d,j＝9.7hz,8h),7.08(dd,j＝15.1,7.9hz,10h),4.22(dd,j＝10.8,6.1hz,4h),2.96(t,j＝7.8hz,4h),2.71(dd,j＝16.0,8.0hz,4h),2.65(t,j＝7.8hz,4h),1.71(dt,j＝15.1,7.6hz,4h),1.38
–
1.22(m,36h),1.06
–
0.98(m,4h),0.90(t,j＝6.7hz,6h),0.08(s,18h).
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ173.11,147.49,145.59,135.77,129.63,129.33,129.27,125.07,124.61,123.14,122.64,62.70,36.11,31.94,30.96,30.42,29.72,29.70,29.67,29.64,29.60,29.50,29.38,28.99,22.71,17.35,14.15,-1.44.
[0068]
maldi-tof-ms calcd for:c
74h80
n6o4s4([m h] ):1474.51,found:1474.9806.
[0069]
步骤4)：化合物hla4的制备:
[0070]
取化合物6a(100mg，0.068mmol)、三氟乙酸(5ml)加入50ml圆底烧瓶中，在氩气保护下加入20ml二氯甲烷，向反应液中通入氩气鼓泡5min排除体系内氧气，氩气保护下在室温下反应2小时。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去二氯甲烷，干得85mg hla4。收率：98％。
[0071]
化合物hla4结构测定数据如下：
[0072]
maldi-tof-ms calcd for:c
74h80
n6o4s4([m h] ):1272.57.,found:1272.4865.
[0073]
实施例1实验组1制备得到的化合物hla4核磁氢谱表征图谱如图1所示；实施例1实验组1制备得到的化合物hla4核磁碳谱表征如图2所示；实施例1实验组1制备得到的化合物hla4的吸收和发射光谱图如图3所示。
[0074]
以下实验组2为以上述实验组1制备得到的化合物hla4制备可用于生物成像探针hla4p。
[0075]
实验组2：荧光团hla4p的制备
[0076]
取化合物hla4(123mg，0.226mmol)、mpeg2000nh2(1.23g,0.565mmol)、100μl dipea、n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(0.7611mg，0.030mmol)和hatu(11.410mg，0.030mmol)加入50ml圆底烧瓶中，在氩气保护下加入20ml n,n二甲酰胺，向反应液中通入氩气鼓泡5min排除体系内氧气，氩气保护下在室温下反应2小时。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去n,n二甲酰胺，得1.1g hla4p。收率：90％。
[0077]
化合物hla4p结构测定数据核磁氢谱表征如图5所示。
[0078]
图6为化合物hla4连接聚乙二醇后可以自组装形成纳米粒子的透射电镜图。
[0079]
实施例2
[0080]
荧光团包载抗肿瘤药物(hla4p@dox)的制备
[0081]
首先，去除dox.hcl(盐酸多柔比星)中的盐酸。将实施例1制备得到的荧光团hla4p5mg和疏水性游离药物dox(多柔比星)1mg添加到dmso溶液中，得到混合液。将去离子水或pbs添加到圆底烧瓶中，然后将hla4p和dox的混合液缓慢滴入底部。所述混合液滴入容器的滴入速度为每分钟60～110滴，添加后，超声处理10s。超声功率控制为240w，工作频率控制为40khz。得到混合物，将混合物透析以去除游离dox约48小时，所述透析使用的透析袋的截留分子量为10kda，以去离子水为外液，透析时间控制为48小时，期间更换外液大于6次，即得到所述hla4p@dox。
[0082]
图6为实施例2制备hla4p@dox自组装过程示意图。以抗癌药物盐酸阿霉素(dox)为模型药物，探讨hla4p的载药量和控释能力。hla4p@dox是通过典型的纳米封装方法制备的。通过tem和dls对hla4p@dox进行了表征，其平均尺寸分别为150nm和180nm，略高于单个hla4p的自组装尺寸。根据dox的uv-vis吸光度测定hla4p@dox的包封率为65％，图9为实施例2所制备的hla4p@dox的tem与dls图。
[0083]
实施例3
[0084]
共焦激光扫描
[0085]
ct-26细胞在培养瓶中培养。24小时后，在共聚焦小皿中加入1ml培养基，再加入hla4p@dox。4小时后，取出小盘中的培养基并添加1ml pbs。将4％多聚甲醛溶液(1ml)添加到每个小盘中，并保持15分钟以进行细胞固定。15min后，取出多聚甲醛固定液，加入pbs缓冲液3次，加入200μl dapi染色液。在与dapi染色液孵育10分钟后，也移除染色液并用pbs缓冲液洗涤3次。在共聚焦显微镜leica-lcs-sp8-sted下观察细胞。利用共聚焦显微镜对ct-26细胞在8小时内使用游离dox(cdox＝60μm)和hla4p@dox(cdox＝60μm)进行细胞摄取成像。图8为实施例3共聚焦显微镜的细胞摄取成像。结果显示，当ct26细胞与游离dox培养6h时，药物摄取效率为约50％。相比之下，与hla4p@dox孵育6h后，药物摄取量增加到约80％，说明hla4p@dox促进了dox的细胞内化和积累。共聚焦激光扫描显微镜进一步证明ct-26细胞对hla4p@dox的吸收增强。hla4p@dox的红色荧光比游离dox强得多，表明ct-26细胞对其有更高的吸收。
[0086]
实施例4
[0087]
包封率和载药量的计算
[0088]
对溶解在dmso中的不同浓度的dox进行校准曲线。透析后，将dox从血液中分离出来hla4p@dox溶解于二甲基亚砜中测定吸光度，其中吸收波长为480nm。通过以下计算公式分析载药效率(dle)和载药含量(dlc)：
[0089][0090][0091]
hla4p能有效包封抗肿瘤药物阿霉素(dox，包封率约65％)，并实现dox的缓释。
[0092]
实施例5
[0093]
hla4p@dox的生物分布
[0094]
icr小鼠随机分为不同的组。hla4p@dox将游离dox溶液静脉注射到icr小鼠体内。从不同时间点采集血样，然后在13000rpm下离心全血样本15分钟以收集血浆。我们将ct-26荷瘤balb/c小鼠随机分为不同组。hla4p@dox将游离dox溶液静脉注射到ct-26小鼠模型中。在注射后不同时间点处死小鼠，然后获取心脏、脾脏、肝脏、肺、肾和肿瘤并称重。将这些血浆和组织悬浮在含有0.3n hcl的70％乙醇溶液中，然后将混合物充分匀浆。进一步离心步骤后，在480nm波长下测量上清液中dox的吸光度。根据标准曲线，测定小鼠血液和各种组织中的dox含量。图10为实施例5中尾静脉注射后dox和hla4p@dox不同时间节点的生物分布图；图11为实施例5中尾静脉注射dox后不同时间节点的不同器官的生物分布图；图12为实施例5中尾静脉注射hla4p@dox后不同时间节点的不同器官的生物分布图。由图4、5、6结果可以得知，即使72h hla4p@dox仍然具有一定的浓度且高于游离的dox，侧面也反应出hla4p@dox具有优良的长循环治疗的潜力。
[0095]
实施例6
[0096]
hla4p@dox活体上的抗肿瘤作用
[0097]
将携带ct-26的小鼠(19-25g)随机分为4组(n＝5)，当ct-26小鼠的肿瘤体积以约70mm3的平均大小增长时，进行治疗(该时间点记录为“第1天”)。ct-26荷瘤小鼠组静脉注射1次。将游离dox(6mg/kg)、hla4p、pbs和hla4p@dox(6mg/kg)分别静脉注射到小鼠体内。用电子游标卡尺测量肿瘤体积。ct-26肿瘤体积的分析公式为：v＝e2×
e/2，其中e和e分别为ct-26肿瘤的最长和最短直径。图13为给予各种治疗(pbs、dox(6mg/kg)、hla4p和hla4p@dox(6mg/kg))下小鼠的肿瘤大小图。每两天称重一次ct-26小鼠，然后一直检测小鼠的存活率。
[0098]
每2天测量一次肿瘤大小和体重。pbs和hla4p治疗后ct-26肿瘤生长速度非常快，治疗14天后两组对照组的肿瘤体积分别增加了13倍和12倍。然而，使用游离dox治疗的ct-26肿瘤在注射后的最初6天内生长速度减慢。游离dox治疗组的平均肿瘤体积在治疗14天后增加了6倍。
[0099]
实施例7
[0100]
hla4p@dox追踪治疗的成像
[0101]
将实施例6不同治疗组的小鼠进行近红外二区荧光成像，图14为不同治疗组(dox(6mg/kg)和hla4p@dox(6mg/kg))小鼠的近红外二区成像图。
[0102]
结果显示，hla4p@dox不仅具有明亮的nir-ii发光(～1055nm)，肿瘤滞留持续14天，而且在体外和体内均比游离dox治疗效果更好，副作用更少。hla4p@dox可以被808nm激光激发，显示出实时跟踪的能力，并在体内长时间连续nir-ii成像。具有一定的追踪治疗效果。
[0103]
整个治疗过程通过nir-ii荧光成像进行精确监测。在高t/tn(》23)的肿瘤部位获得了显著的nir-ii信号，荧光信号可以持续14天，表明hla4p@dox具有优越的肿瘤靶向能力和超长的肿瘤滞留。
[0104]
实施例8
[0105]
组织学分析
[0106]
肿瘤或主要器官取自实施例6不同治疗组小鼠(游离dox(6mg/kg)、hla4p、pbs和
hla4p@dox(6mg/kg))，并用edta/福尔马林溶液固定。包埋后，用h&e染色法对各种组织样品进行染色。图15为不同治疗组(pbs、dox(6mg/kg)和hla4p@dox(6mg/kg))小鼠的不同器官的h&e染色图。
[0107]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。