结合EGFR、HER2及HER3的结合部分的组合的制作方法

结合egfr、her2及her3的结合部分的组合
1.本技术是申请号为202080014304.7的发明名称为“结合egfr、her2及her3的结合部分的组合”的中国专利申请的分案申请，原申请是2020年02月13日提交的pct国际申请pct/nl2020/050081于2021年08月13日进入中国国家阶段的申请。
技术领域
2.本发明涉及诸如抗体的结合部分(binding moieties)的领域，特别是涉及治疗性结合部分的领域。所述结合部分可以被用于人类的治疗。更具体地本发明涉及组合物，其包括两个或更多个多特异性结合部分，优选地为多特异性抗体。所述结合部分结合egfr、her2和her3。单一宿主细胞可以生成多个结合部分。


背景技术：

3.表皮生长因子(egf)受体(egfr)是含有细胞外蛋白质配体的表皮生长因子家族(egf-family)的成员的原型细胞表面受体(prototype cell-surface receptor)。该家族目前具有4个密切相关的受体酪氨酸激酶：egfr、her2(erbb-2/c-neu)、her3(erbb-3)和her4(erbb-4)。
4.egfr存在于细胞表面上并且通过它的特异性配体的结合而被活化，该特异性配体包括表皮生长因子与转形生长因子α(tgfα)。当通过它的生长因子配体的活化后，该受体经受从无活性的主要单体形式至有活性的同型二聚体的转变。除了在配体结合以后形成同型二聚体的外，egfr可与erbb受体家族的另一个成员(诸如her2)配对，以产生一个活化的异二聚体(activated hetero-dimer)。也存在证据暗示：二聚体在没有配体结合下形成以及由活化的egfrs所构成的簇团在配体结合后形成。
5.egfr的二聚体化刺激了它的内在细胞内蛋白质-酪氨酸激酶(ptk)活性。这个活性诱发数个信号传递级联反应(signal transduction cascades)造成细胞增殖与分化。egfr的激酶结构域可以交互磷酸化(cross-phosphorylate)它与复合的其他受体的酪氨酸残基，而且它本身可以那个方式被活化。
6.涉及egfr的突变与过度表现已经在几种类型的癌症中被鉴别出，而且它是扩展的抗癌疗法类型的标靶。这些包括用于肺癌的egfr标靶的小分子譬如吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)，以及用于结肠癌和头颈癌的抗体譬如西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)。
7.虽然采用egfr标靶的疗法存在一些成功，大多数与治疗抗性随着时间的发展有关联。egfr阳性肿瘤可以逃脱该标靶的疗法的方式之一是通过透过另一种受体二聚体的信号传递。举例来说，由于增高的her3表达或调节蛋白表达(heregulin expression)而为egfr/her3二聚体所致的增高的信号传递与例如肺癌和头颈癌中的egfr标靶的药物抗性有关联。除了治疗抗性的诱发的外，egfr-标靶抗体的某些副作用已被观察到。一个实例是与egfr抑制或抗-egfr生物治疗有关联的皮肤皮疹的发展。在极端的时，这样的皮疹可能导致治疗周期的降低和/或治疗的提前终止。
8.该egf受体家族的信号传递的各式各样的活化模式已被鉴别出。在这些当中包括了信号传递的配体依赖性(ligand dependent)和配体非依赖性(ligand independent)的活化。即令在没有her3配体存在的下，被过度表现的her2能够透过her2/her3异二聚体来产生致癌的信号传递(oncogenic signaling)(junttila，akita等人2009)。her2活性可以被her2特异性抗体所抑制。这样的her2特异性抗体举例来说可被使用于her2阳性(her2

)肿瘤的治疗中。采用这样的治疗的问题是：经常肿瘤逃脱该her2特异性治疗而且即令在该抑制抗体的存在的下仍继续生长。已被观察到的是：her2阳性肿瘤，诸如乳房、卵巢、子宫颈和胃肿瘤，可通过展现出向上调节的her3表达(ocana，vera-badillo等人2013)和/或her3配体表现(wilson，fridlyand等人2012)的肿瘤细胞的次族群的选择性过度生长而逃脱治疗。又，位于该her3受体中的活化突变已被鉴别出。
9.因此，尽管使用特异性地标靶egf受体家族成员的抗体治疗的有希望的结果，已被观察到的是：并非所有的肿瘤反应或充分地反应。本发明提供由标靶该egf受体家族的各式各样成员的结合部分所构成的组合以及用于生成它们的方法。本发明的组合显示出良好疗效。此类组合可以有成本效益的而且有效率的方式来被生成。


技术实现要素：

10.本发明提供一种包括两个或更多个结合部分的组合物，
11.其中各个结合部分包括结合至egfr的细胞外部分的可变结构域；以及
12.其中所述结合部分中的第一结合部分包括结合至her2的细胞外部分的可变结构域，并且所述结合部分中的第二结合部分包括结合至her3的细胞外部分的可变结构域。
13.优选地，该两个或更多个结合部分中的至少一个结合部分是抗体。在一个优选的实施方案中，该两个或更多个结合部分中的至少两个结合部分是抗体。此类抗体优选地为多特异性抗体，优选地是双特异性抗体。优选地此类抗体中的至少一个抗体以及更加优选地至少两者为igg抗体。在本发明的一优选的实施方案中，该组合物包括两个双特异性抗体。
14.如本文所描述的多特异性抗体优选地包括有重链带有ch3异二聚体化结构域。在一个实施方案中，该第一和/或该第二多特异性抗体的ch3异二聚体化结构域被工程化以促进该egfr可变结构域的重链与该her2和her3可变结构域的相应重链的异二聚体化。
15.本发明还提供如本文所描述的组合物用于癌症的治疗。在实施方案中，该癌症是一物理上皮癌。优选地，该组合物被使用于一表现egfr、her2和/或her3的癌症。该组合物优选地被使用于胰脏癌、大肠直肠癌、头颈癌、上皮性卵巢癌、上皮性输卵管癌、上皮性腹膜癌、膀胱癌或前列腺癌。在实施方案中，通过使用该组合物被治疗的癌症是晚期癌症(advanced cancer)。该组合物优选地被使用于转移癌(metastatic cancer)。该组合物优选地被使用于转移性胰脏癌、转移性大肠直肠癌、转移性头颈癌、转移性上皮性卵巢癌、转移性上皮性输卵管癌、转移性上皮性腹膜癌、转移性膀胱癌或转移性前列腺癌。在实施方案中，该组合物优选地被使用于为胃癌、肺癌、乳癌或食道癌的癌症。优选地，该组合物被使用于转移性胃癌、转移性肺癌、转移性乳癌或转移性食道癌。
16.本发明进一步提供一种含有两个或更多个结合部分的产物，所述结合部分各自包括结合至egfr的细胞外部分的可变结构域；其中所述结合部分中的第一结合部分包括结合
至her2的细胞外部分的可变结构域，并且所述结合部分中的第二结合部分包括结合至her3的细胞外部分的可变结构域，在治疗癌症上作为同时、分开或依序使用的组合制剂。
17.本发明进一步提供一种用于生成根据本发明的组合物的方法，该方法包括：
18.提供包括下列的细胞
19.–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同共同轻链形成结合至egfr的细胞外部分的可变结构域；
20.–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同该共同轻链形成结合至her2的细胞外部分的可变结构域；
21.–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同该共同轻链形成结合至her3的细胞外部分的可变结构域；以及
22.–
编码包括该共同轻链的多肽的核酸；
23.其中所述核酸中的两个或更多个核酸可以是或者不是物理连接的(physically linked)，并且其中该核酸中的每一个核酸还包括表达调控序列以允许所述被编码的重链和轻链在该细胞中的表达，并且其中该方法还包括培养该细胞以允许该重链和轻链的表达，以及任选地，收集该两个或更多个结合部分。
24.进一步被提供的是一种包括下列的細胞：
25.–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同共同轻链形成结合至egfr的细胞外部分的可变结构域；
26.–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同该共同轻链形成结合至her2的细胞外部分的可变结构域；
27.–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同该共同轻链形成结合至her3的细胞外部分的可变结构域；以及
28.–
编码包括该共同轻链的多肽的核酸；
29.其中所述核酸中的两个或更多个核酸可以是或者不是物理连接的，并且其中该核酸中的每一个核酸还包括表达调控序列以允许所述被编码的重链和轻链在该细胞中的表达。
30.在一进一步的方面中，本发明提供一种包括核酸的容器，其包括：
31.–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同共同轻链形成结合至egfr的细胞外部分的可变结构域；
32.–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同共同轻链形成结合至her2的细胞外部分的可变结构域；
33.–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同共同轻链形成结合至her3的细胞外部分的可变结构域；以及
34.–
编码包括该共同轻链的多肽的核酸；
35.其中，任选地，所述核酸中的两个或更多个核酸可以是或者不是物理连接的，并且其中该核酸中的每一个核酸还包括表达调控序列以允许被编码的重链和轻链在细胞中的表达。
36.本发明进一步提供一种包括结合部分的组合物，该结合部分特异性地结合egfr的细胞外部分以及her2的细胞外部分。
37.本发明还提供包括结合部分的组合物，该结合部分特异性地结合合egfr的细胞外部分以及her3的细胞外部分。
38.该结合部分优选地为抗体，优选地是igg抗体，更加优选地是多特异性抗体。
附图说明
39.图1
40.实施方案的一示意图示，其中该组合物包括两个双特异性抗体共享一共同臂。该图描绘带有重链(1)以及轻链(4)的抗体。4个重链具有3个不相同的可变区(5、6以及7)。具有该共享的可变区(5)的重链具有一个异二聚体化结构域的一个部分(3)。带有可变区(6)以及(7)的所述重链具有该异二聚体化结构域的兼容的部分(2)。异二聚体化区(2)以及(3)的优选的配对可以引导双特异性抗体的形成。
41.图2
42.两种对于生长因子依赖型细胞株bxpc-3-luc2(perkin elmer 125058)以及n87细胞(nci-87细胞(crl-5822
tm
))的增殖的抑制效应。
43.两种对于bxpc-3-luc2(左侧图片))以及n87(右侧图片))细胞增殖的效用被测试。小组筛选的结果与一由两种单特异性抗体所构成的组合(egfr结合抗体西妥昔单抗以及her3单特异性抗体pg3178)或者与egfrxher3结合双特异性抗体pb4522来进行比较。所述细胞被生长在饱和量的hrg和egf的存在下。使用hrg和egf而未用抗体的相应的细胞的细胞生长的电平(有配体的基础值(basal w/ligand))此外未用hrg和egf且无抗体的基础电平(无配体(w/oligand))被表明。
44.单特异性抗体pg3178具有一个igg1恒定区以及两个带有图7或图8中的mf3178的重链可变区的可变结构域和图7中的序列11的共同轻链可变区。
45.双特异性抗体pb4522具有一个igg1恒定区以及两个可变结构域。该her3可变结构域具有图7或图8中的mf3178的重链可变区。该egfr可变结构域具有图7或图8中的mf4280的重链可变区。该两种抗体的轻链可变区是相同的并且具有图7中的序列11的共同轻链可变区的氨基酸序列。
46.图3
47.一个小组的的adcc活性。一个小组的的adcc活性使用n87以及一个cd16/nfat报道子分析(cd16/nfat reporter assay)来被测试。此类双特异性抗体具有一个igg1恒定区以及两个可变结构域。此类可变结构域的重链可变区的氨基酸序列被表明于图7或图8中。此类抗体中的轻链可变区是相同的并且具有图7中的序列11的共同轻链可变区的氨基酸序列。
48.图4
49.各种不同的的编号与特异性以及它们的adcc活性。
“‑”
表示无活性被观察到。
50.每一横列代表一包括有两种双特异性抗体的此类双特异性抗体的内码被表明于此类直行双特异性1(bispecific 1)和双特异性2(bispecific 2)中。
her2、her3和egfr结合结构域的重链可变区被表明于被标示为mf a、mf b和mf c的直行中。mf编号3178和2703组合以该共同轻链形成一个her3结合可变结构域。mf编号4280、3755、4003、4016组合以该共同轻链形成一个结合egfr的可变结构域，而mf编号1871、1847、1849和2032组合以该共同轻链形成一个结合her2的可变结构域。此类双特异性抗体具有一个igg1恒定区以及两个可变结构域。该等可变结构域的重链可变区的氨基酸序列被表明于图7或图8中。该等抗体中的轻链可变区是相同的并且具有图7中的序列11的共同轻链可变区的氨基酸序。
51.图5
52.的活体内试验。bxpc-3-luc2或n87细胞在第0天被注射至异种移植物模型的内。包括有双特异性抗体pb4516
×
pb6892(参见图4)的或对照组在第1、7、14、21和28天被注射。抗体在25mg/kg的剂量下被腹膜内注射。被描绘的是涉及(pb4516和pb6892)的结果。载体和西妥昔单抗充当对照组。
53.图6
54.包括有双特异性抗体pb4516和pb6892的在各种不同的pdx模型中的活体内试验。
55.pdx模型在第0天被注射，而使用抗体或对照组的治疗在第1、7、14、21和28天被完成。抗体在为25mg/kg的剂量下被腹膜内注射。
56.图7
57.通过mf号码被表明的各种不同的可变结构域的重链可变区的氨基酸序列，参见序列号码1-6，而cdrs和轻链可变区参见序列号码7-12。
58.图8
59.在本文被提到的各种不同的mfs的氨基酸序列。fr1-4意指架构区1-4。cdr1-3意指互补决定区1-3。tt是破伤风类毒素(tetanus toxoid)。
60.图9
61.a)her3晶体结构(pdb#4p59)，其显示位于灰色球体中的残基arg 426以及与arg 426距离在半径内的位于黑色球体中的残基；b)以灰色显示的残基arg 426以及与arg 426距离在半径内的以黑色显示的远距残基；c)呈浅灰色的位于区域arg 426中的残基以及呈深灰色的周围残基(全部被标记)。说明书附图与分析使用yasara(www.yasara.org)来被制作。
具体实施方式
62.如本文所使用的术语egfr意指在人类中由表皮生长因子受体基因(egfr)所编码的那个蛋白质。该蛋白质被知晓有许多的别名，的中包括：erb-b2受体酪氨酸激酶1；原致癌基因(proto-oncogene)c-erbb-1；erbb1；以及her1。涉及该人类egfr蛋白质以及编码它的基因的数据库登录编号是(genbank nm_005228.3)。该登录编号被给予主要是要提供进一步的方法来识别作为目标物的egfr蛋白质，被抗体结合的egfr蛋白质的实际序列可能有变化，例如，因为该编码基因内的突变(诸如发生在某些癌症中的那些)，诸如此类。除非另有
说明，当在本文提到egfr的时，所指的是人类egfr。由于介于人类和其他哺乳动物的egfr的直系同源物(orthologues)之间的序列与三级结构相似性，该egfr可变结构域可能也结合这样的直系同源物，但未必如此。结合egfr的该可变结构域可结合egfr以及它的各式各样的变异体，诸如被表现在某些egfr阳性肿瘤上的那些。
63.本发明的一抗体或结合部分的结合egfr的可变结构域优选地结合egfr的结构域i或结构域iii。该egfr蛋白质的结构除了别的文献以外已被描述于ferguson(2008：annu rev biophys.2008；37:353
–
373.doi：10.1146/annurev.biophys.37.032807.125829)的中。人类egfr的结构域被描述于上面所提及的ferguson参考数据的图1中。本文所公开的发明的实施方案的结合egfr的可变结构域优选地结合egfr的结构域iii。该抗体优选地抑制bxpc-3细胞(atcc crl-1687)或bxpc-3-luc2细胞(perkin elmer 125058)的egf诱发的增殖。
64.如本文所使用的术语her2意指在人类中由erbb-2基因所编码的那个蛋白质。有关该基因或蛋白质的替代名称包括：cd340；erbb-2；her-2/neu；mln 19；neu；ngl；tkr1。该erbb-2基因经常被称为her2(源自于人类表皮生长因子受体2)。当在本文提到her2的时，所指的是人类her2。包括结合her2的可变结构域的抗体结合人类her2。由于介于人类和其他哺乳动物的her2的直系同源物之间的序列与三级结构相似性，该her2可变结构域可能也结合这样的直系同源物，但未必如此。涉及该人类her2蛋白质以及编码它的基因的数据库登录编号是(np_001005862.1，np_004439.2，nc_000017.10，nt_010783.15)。此类登录编号被给予主要是要提供进一步的方法来识别作为目标物的her2，被该抗体结合的her2蛋白质的实际序列可能有变化，例如，因为该编码基因内的突变(诸如发生在某些癌症中的那些)，诸如此类。该her2可变结构域可结合her2以及它的各式各样的变异体，诸如被表现在某些her2阳性肿瘤细胞上的那些。
65.该her2蛋白质含有数个结构域(参阅供参考landgraf，r breast cancer res.2007；9(1)：202-的图1)。所述细胞外结构域被称为结构域i-iv。本文所公开的发明的实施方案的结合her2的可变结构域优选地结合her2结构域i或结构域iv，优选地结构域iv。
66.如本文所使用的术语her3意指在人类中由erbb3基因所编码的那个蛋白质。有关该基因或蛋白质的替代名称为：lccs2；mda-bf-1；c-erbb-3；c-erbb3；erbb3-s；p180-erbb3；p45-serbb3；以及p85-serbb3。当在本文提到her3的时，所指的是人类her3。包括结合her3的可变结构域的抗体结合人类her3。由于介于人类和其他哺乳动物的her3的直系同源物之间的序列与三级结构相似性，该her3可变结构域可能也结合这样的直系同源物，但未必如此。涉及该人类her3蛋白质以及编码它的基因的数据库登录编号是(np_001005915.1，np_001973.2，nc_000012.11，nt_029419.12)。此类登录编号被给予主要是要提供进一步的方法来识别作为目标物的her3，被一抗体结合的her3蛋白质的实际序列可能有变化，例如，因为该编码基因内的突变(诸如发生在某些癌症中的那些)，诸如此类。该her3可变结构域可结合her3以及它的各式各样的变异体，诸如被表现在某些her2阳性肿瘤细胞上的那些。
67.her3的结构除了别的文献以外已被描述于cho等人(2002；science 297，1330-1333：doi：10.1126/science.1074611)的中。该人类蛋白质具有4个细胞外结构域。本文所公开的发明的实施方案的结合her3的可变结构域优选地结合her3的结构域iii。在一个优
选的实施方案中，一可变结构域对于一her3阳性细胞的亲和力(kd)低于或等于2.0nm，更加优选地是低于或等于1.5nm，更加优选地是低于或等于1.39nm，更加优选地是低于或等于0.99nm。在一个优选的实施方案中，一根据本发明的抗体优选地包括可变结构域结合her3的结构域iii的至少一个选自于包括有天然的her3蛋白质中的r426以及坐落与r426距离内的氨基酸残基所构成的群组中的氨基酸。在一个优选的实施方案中，可变结构域对于位于sk-br-3细胞上的her3的亲和力(kd)低于或等于2.0nm，更加优选地是低于或等于1.5nm，更加优选地是低于或等于1.39nm，更加优选地是低于或等于0.99nm。在一个实施方案中，该亲和力(kd)落在1.39-0.59nm的范围的内。在一个优选的实施方案中，可变结构域对于位于bt-474细胞上的her3的亲和力(kd)低于或等于2.0nm，更加优选地是低于或等于1.5nm，更加优选地是低于或等于1.0nm更加优选地是低于或等于0.5nm，更加优选地是低于或等于0.31nm，更加优选地是低于或等于0.23nm。在一个实施方案中，该亲和力(kd)落在0.31-0.15nm的范围的内。上面所提及的亲和力优选地是当使用稳定状态细胞亲和力测量术(steady state cell affinity measurements)来被测量的，其中细胞在4℃下使用放射性标记的抗体(radioactively labeled antibody)来被培育，在这之后细胞结合的放射性(cell-bound radioactivity)被测量。
68.结合her3的结构域iii的至少一个氨基酸的可变结构域优选地结合选自于包括有天然的her3蛋白质中的r426以及坐落在与r426距离内的氨基酸残基所构成的群组中的氨基酸。优选地，坐落在该天然的her3蛋白质的中而与r426距离内的该氨基酸残基选自于由下列所构成的群组：l423、y424、n425、g427、g452、r453、y455、e480、r481、l482、d483以及k485(参见举例来说图9以及表1)。氨基酸残基编号为蛋白质数据库(protein data bank，pdb)id#4p59所具有者。结合her3的结构域iii的这个区域的抗体展现出特别良好的结合特征而且它们能够抵消位于her3阳性细胞上的her3的一活性。带有her3结合特征的可变结构域被描述于wo 2015/130172中，该专利案在此被并入本案以作为参考。在一个优选的实施方案中，根据本发明的双特异性抗体被提供，其中该抗体包括可变结构域至少结合her3的结构域iii的r426。优选地，该抗体包括可变结构域至少结合her3的结构域iii的r426。
69.在某些实施方案中，组合物包括两个或更多个抗体，其中该等抗体的每一者包括结合至egfr的细胞外部分的可变结构域；并且其中该等抗体的一第一者包括结合至her2的细胞外部分的可变结构域以及该等抗体的一第二者包括结合至her3的细胞外部分的可变结构域。在一个优选的实施方案中，该第一和第二抗体的结合至egfr的细胞外部分的可变结构域具有基本上相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，该第一和第二抗体包括可变结构域结合egfr的结构域i，以及该第一抗体包括可变结构域结合her2的结构域i，而该第二抗体包括可变结构域结合her3的结构域iii。在另一个实施方案中，该第一和第二抗体包括可变结构域结合egfr的结构域i，以及该第一抗体包括可变结构域结合her2的结构域iv，而该第二抗体包括可变结构域结合her3的结构域iii。在一进一步的实施方案中，该第一和第二抗体包括可变结构域结合egfr的结构域iii，以及该第一抗体包括可变结构域结合her2的结构域i，而该第二抗体包括可变结构域结合her3的结构域iii。在一进一步的实施方案中，该第一和第二抗体包括可变结构域结合egfr的结构域iii，以及该第一抗体包括可变结
构域结合her2的结构域iv，而该第二抗体包括可变结构域结合er3的结构域iii。
70.在某些实施方案中，一结合部分是一蛋白质或一适配体(aptamer)。如本文所描述的结合部分通常具有两个或更多个结合特异性。该结合部分优选地包括两个或更多个抗体的可变结构域。可变结构域可以各种不同的方式来被提供。许多含有抗体可变结构域的片段被描述于“nelson 2010：mabs.2010 jan-feb；2(1)：77-83”的中，并且包括各种不同的fab片段、scfv片段以及诸如vhh片段的所谓的单结构域抗体。各种不同的fab片段或单链fv片段在现今是众所周知的。单结构域抗体是由单一单体可变抗体结构域所构成的一抗体片段。就像一完整的抗体，它能够任选地结合至特定的抗原。具有一仅为12-15kda的分子量，单结构域抗体要比由两个蛋白质重链和两个轻链所构成的普通抗体(150-160kda)小很多，而且甚至小于fab片段(～50kda，一个轻链和半个重链)以及单链可变片段(～25kda，两个可变结构域，一个来自轻链而一个来自重链)。单结构域片段首先从骆驼科动物重链抗体被制造出。类似的单结构域片段现在可以被人工地制造出而且可以衍生自其他的生物体。一可变结构域优选地包括重链可变区以及轻链可变区。可变结构域有时候被称为vh/v
l
组合，其中vh代表重链的可变区，而v
l
代表轻链的可变区。
71.该两个或更多个片段可以被连接以产生具有许多结合特异性的结合部分。连接通常使用一包括有2个或更多个氨基酸残基的连接胜肽而被完成。连接部分也可以是一蛋白质的部分或全部。举例来说，人类血清白蛋白有时候被使用。如本文所描述的结合部分优选地包括有至少一个可变结构域带有一个mf的重链可变区(例如，如图7或图8中所描述的)被配对以一个轻链可变区(例如轻链可变区)。在一个优选的实施方案中，该结合部分包括两个或更多个这样的可变结构域。
72.结合egfr和her2的结合部分是与结合egfr和her3的结合部分不相同的结合部分。如果所述结合部分的至少一者是多特异性抗体，至少一个多特异性抗体可结合至少egf和her2或者结合至少egfr和her3。在一个优选的实施方案中，所述结合部分包括有双特异性抗体，其中双特异性抗体结合egfr和her2，而另一个双特异性抗体结合egfr和her3。
73.如本文所使用的术语“抗体”是指属于蛋白质的免疫球蛋白类别的蛋白质性分子，其含有结合一位于抗原上的表位的一个或更多个结构域，其中此类结构域衍生自一个抗体的可变区或者共享该抗体的可变区的序列同源性。抗体通常由基本结构单元所构成
–
各个具有两个重链以及两个轻链。供治疗用途的抗体优选地为尽可能地接近要被治疗的个体的天然抗体(例如供人类个体的人类抗体)。一根据本发明的抗体不受限于用于生成它的任何特定型式或方法。
74.由于一抗体通常识别抗原的一表位，而这样的一个表位可能也存在于其他的化合物中，“特异性地识别”抗原(例如，egfr、her2或her3)的根据本发明的抗体可能也识别其他的化合物，如果此类其他的化合物含有同一种的表位。因此，术语“特异性地识别”或“特异性地结合”或者具有相同内涵(connotation)的术语，就抗原与抗体相互作用而言，不排除此类抗体对含有相同的或同一种的表位的其他的化合物的结合。
[0075]“双特异性抗体”是如本文所描述的抗体，其中该抗体的一个可变结构域结合至第一抗原，而该抗体的二可变结构域结合至第二抗原，其中该第一和第二抗原不是相同的。术语“双特异性抗体”还涵盖抗体，其中链可变区/轻链可变区(vh/v
l
)组合结合位于抗原上的第一表位，以及第二vh/v
l
组合结合第二表位。该第二表位可以是位于相同抗原上的不相同
的表位。该术语还包括抗体，其中vh能够特异性地识别第一抗原，而在一免疫球蛋白可变区中被配对以该vh的v
l
能够特异性地识别第二抗原。所形成的vh/v
l
配对将会结合抗原1或者抗原2。这种所谓的“二合一抗体(two-in-one antibodies)”，被描述于例如wo 2008/027236、wo 2010/108127以及schaefer等人(cancer cell 20，472-486，october 2011)的中。根据本发明的双特异性抗体不受限于用于生成它的任何特定型式或方法。
[0076]
双特异性抗体为多特异性抗体的一示范例。三-或更多特异性抗体可以通过将结合部分(诸如scfv片段)加设至所述重链中的一者或多者而被制造出。还有可能的是将一个或更多个可变结构域加设至正常的或双特异性抗体的可变区。一种生成共同轻链以及两个不相同的重链(各自与该共同轻链形成一有功能的可变结构域)的细胞生成，除了别的以外，一种带有两个不相同的重链与轻链组合的双特异性抗体。同样地，一种生成共同轻链以及三个或更多个不相同的重链的细胞可以形成数种双特异性抗体，它们一起能够标靶三种或更多种抗原。现今有可能来建立抗体的标准型式(即一个恒定部分以及两个可变结构域)以及加设进一步的结合结构域。照此情形，具有被附接至抗体的恒定部分或可变结构域中的一者或多者的一个或更多个带有附加的结合特异性的单链fv的多特异性抗体可以被制造出。还有可能来生成带有两个或更多个可变区的重链。附加的重链区有利地可与不相同的或共同轻链可变区来相联。涉及这样的抗体的一描述，参见us 62/650467，该专利案在此被并入本案以作为参考。
[0077]
当在本文提及核酸或氨基酸序列时，“百分比(％)相同性”被定义为：在排比序列用于最佳比较目的之后，一候选序列中的残基与一选定序列中的残基为相同的百分比。比较核酸序列的百分比序列相同性使用vector nti program advance 10.5.2软件的alignx应用程序使用默认值来被测定，此类默认值使用一种改良的clustalw算法(thompson，j.d.，higgins，d.g.，and gibson t.j.(1994)nuc.acid res.22：4673-4680)、swgapdnarnt得分矩阵(swgapdnarnt score matrix)、一为15的空位开放罚分(gap opening penalty)以及一为6.66的空位延伸罚分(gap extension penalty)。氨基酸序列使用vector nti program advance 11.5.2软件的alignx应用程序使用默认值来被排比，此类默认值使用一种改良的clustalw算法(thompson，j.d.，higgins，d.g.，and gibson t.j.，1994)、blosum62mt2得分矩阵(blosum62mt2 score matrix)、一为10的空位开放罚分以及一为0.1的空位延伸罚分。
[0078]
如本文所使用的术语“共同轻链”意指诸如那些可以在一个多特异性抗体中被使用的轻链。在双特异性抗体中，该两个轻链可以是一个共同轻链(或其v
l
部分)。该两个轻链(或其v
l
部分)可以是相同的或者具有某些氨基酸序列差异而全长的抗体的结合特异性未被影响。术语“共同轻链”、“共同v
l”、“单一轻链”、“单一v
l”，有或无术语“重排的”的加入，在本文被互换地使用。“共同”意指具有相同序列的轻链而且也意指氨基酸序列不是相同的功能等效物。此类轻链的许多变异体存在，其中不影响有功能的结合区的形成的突变(删除、取代、插入和/或加入)是存在的。本发明的轻链也可以是一个如本文所指明的轻链，具有从0至10个(优选地从0至5个)氨基酸插入、删除、取代、加入或者这些的一组合。举例来说，制备或发现非为相同的但仍为功能上等效的轻链落在如本文所使用的共同轻链的定义的范围的内，例如，通过引入以及测试守恒的氨基酸变化、位于当被配对以该重链的时不会或仅部分地有助于结合特异性的区域内的氨基酸的变化，诸如此类。在某些实施方案中，带有3
个或更多个可变结构域的多特异性抗体具有可变结构域带有不相同的重链以及相同的轻链或者轻链带有某些氨基酸差异而全长的多特异性抗体的结合特异性未被影响。这样一种轻链有利地也是如本文所描述的共同轻链。在一个优选的实施方案中，一个多特异性抗体的全部的可变结构域包括一个共同轻链。供使用于本发明的多价抗体中的一个共同轻链(可变区)可以是一个λ轻链，而这因此在本发明的处境中也被提供，但是一个κ轻链被偏好。本发明的共同轻链可以包括一个κ轻链或一个λ轻链的一恒定区。它优选地是一个κ轻链的一恒定区，优选地其中该共同轻链是一个生殖系轻链，优选地是一个包括有igvk1-39基因节段的重排的生殖系人类κ轻链，例如重排的生殖系人类κ轻链igvk1-39*01/igjk1*01。共同轻链氨基酸序列的示范例被表明于图7序列10、11或12中。
[0079]
根据本发明的术语“全长的igg”或“全长的抗体”被定义为包括一个基本上完整的igg，但是它不必然地具有一个完整的igg的所有功能。为了避免疑问，一个全长的igg含有两个重链和两个轻链。各个链含有恒定区(c)和可变区(v)，它们可被分解成被指派为ch1、ch2、ch3、vh以及c
l
、v
l
的结构域。一个igg抗体经由被包括在fab部分中的可变区结构域而结合至抗原，并且在结合之后可以透过此类恒定结构域(大多数透过fc部分)而与免疫系统的分子和细胞相互作用。根据本发明的全长的抗体涵盖igg分子，其中提供所欲求的特征的突变可能是存在的。全长的igg不应具有此类区域的任何一者的实质部分的删除。但是，当中的一个或数个氨基酸残基被删除而基本上不改变所形成的igg分子的结合特征的igg分子被包罗在术语“全长的igg”的内。举例来说，这样的igg分子可以具有一介于1个和10个氨基酸残基之间的删除，优选地位于非-cdr区中，其中此类被删除的氨基酸对于该igg的抗原或表位结合特异性而言不是必需的。igg抗体的示范例为igg1、igg2、igg3和igg4抗体。在本发明的某些实施方案中，该igg是igg1。
[0080]
优选地该两个或更多个结合部分中的至少一个结合部分是抗体。该抗体可以包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域以及一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域。在另一个实施方案中，该抗体包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域以及一个结合至her3的细胞外部分的可变结构域。
[0081]
该两个或更多个结合部分优选地包括两个或更多个抗体(优选地是多特异性抗体)，此类抗体各自包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域；并且其中此类抗体的一第一者包括一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域以及此类抗体的一第二者包括一个结合至her3的细胞外部分的可变结构域。一包括两个或更多个多特异性抗体的组合物的一优选的示范例是一包括两个或更多个双特异性抗体的组合物。一包括两个如本文所描述的双特异性抗体的组合物的一个非限制性示范例被示意地描绘于图1中。两个双特异性抗体被描绘为各自具有两个重链(1)和两个轻链(4)。该两个抗体共享一个带有一可变区(5)的重链。它们在另一个重链的可变区有差异。一个抗体具有重链可变区(6)。另一个抗体具有重链可变区(7)。所有的重链可变区可与该共同轻链(4)配对以形成有功能的结合结构域。当通过同一个细胞被生成时，所述重链通过一个异二聚体化结构域(2，3)的存在而被引导异二聚体化。该异二聚体化结构域具有两个部分，一个部分位于一重链上，而兼容的部分位于另一重链上。该异二聚体化结构域经常位于igg1 ch3区内。异二聚体化可以通过对被选择的重链提供合适的部分来被引导。
[0082]
在本发明中，egfrxher2和egfrxher3双特异性抗体的被选择的形成可以通过合并
该异二聚体化结构域的一个位于形成该egfr可变结构域的重链中的部分(3)以及位于形成该her2与该her3结合结构域的重链中的相容的部分(2)来被引导。
[0083]
一个具有重链可变区连同轻链形成一个结合抗原(诸如egfr、her2或her3)的可变结构域的重链在本文还被称为egfr重链、her2重链等等。在本发明的一优选的实施方案中，一个第一抗体和/或一个第二抗体的重链的ch3-区被工程化，以促进一egfr重链与一her2重链以及一egfr重链与一her3重链的异二聚体化。在一个优选的实施方案中，用于促进异二聚体化的工程化使用先前被描述于美国专利第9，248，182、9，358，286、9，248，182以及9，758，805号中的dekk残基位置。
[0084]
在某些实施方案中，该组合物的此类抗体对egfr的结合封阻egf对egfr的结合和/或其中该组合物的此类抗体对her3的结合封阻神经调节蛋白-1(neuregulin 1，nrg)对her3的结合。在一个优选的实施方案中，该组合物的此类抗体对egfr的结合封阻egf对egfr的结合，而该组合物的抗体对her3的结合封阻神经调节蛋白-1(nrg)对her3的结合。
[0085]
一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域优选地包括一个包括一个cdr1序列nyamn、一个cdr2序列winantgdptyaqgftg以及一个cdr3序列erflewlhfdy的重链可变区，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸的变异体。
[0086]
一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域优选地包括一个包括一个cdr1序列sygmh、一个cdr2序列visydgsnkyyadsvkg以及一个cdr3序列dyyrrtaragfdy的重链可变区，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸的变异体。
[0087]
一个结合至her3的细胞外部分的可变结构域优选地包括一个包括一个cdr1序列gyymh、一个cdr2序列winpnsggtnyaqkfqg以及一个cdr3序列dhgsrhfwsywgfdy的重链可变区，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸的变异体。
[0088]
在一个优选的实施方案中，组合物包括有两种双特异性抗体，其中此类双特异性抗体的一第一者包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域包括一个包括一个cdr1序列nyamn、一个cdr2序列winantgdptyaqgftg以及一个cdr3序列erflewlhfdy的重链可变区，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸的变异体。在一个优选的实施方案中，此类双特异性抗体的一第一者以及一第二者包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域包括一个包括一个cdr1序列nyamn、一个cdr2序列winantgdptyaqgftg以及一个cdr3序列erflewlhfdy的重链可变区，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸的变异体。
[0089]
在一个优选的实施方案中，此类双特异性抗体的一第一者以及一第二者包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域包括一个包括一个cdr1序列nyamn、一个cdr2序列winantgdptyaqgftg以及一个cdr3序列erflewlhfdy的重链可变区，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸的变异体；并且其中该第双特异性抗体还包括一个可变结构域结合至her2的细胞外部分，该可变结构域优选地包括一个包括一个cdr1序列sygmh、一个cdr2序列visydgsnkyyadsvkg以及一个cdr3序列dyyrrtaragfdy的重链可变区，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸的变异体；并且其中该第二双特异性抗体还包括一个可变结构域结
合至her3的细胞外部分，该可变结构域优选地包括一个包括一个cdr1序列gyymh、一个cdr2序列winpnsggtnyaqkfqg以及一个cdr3序列dhgsrhfwsywgfdy的重链可变区，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸的变异体。
[0090]
在一个优选的实施方案中，该等双特异性抗体的一第一者以及一第二者包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域包括一个包括一个cdr1序列nyamn、一个cdr2序列winantgdptyaqgftg以及一个cdr3序列erflewlhfdy的重链可变区，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸的变异体；并且其中该第双特异性抗体还包括一个可变结构域结合至her2的细胞外部分，该可变结构域优选地包括一个包括一个cdr1序列sygmh、一个cdr2序列visydgsnkyyadsvkg以及一个cdr3序列dyyrrtaragfdy的重链可变区，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3氨基酸的变异体；并且其中该第二双特异性抗体还包括一个可变结构域结合至her3的细胞外部分，该可变结构域优选地包括一个包括一个cdr1序列gyymh、一个cdr2序列winpnsggtnyaqkfqg以及一个cdr3序列dhgsrhfwsywgfdy的重链可变区，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸的变异体。
[0091]
出自被详述的cdr序列的1、2或3个氨基酸的守恒的变异被允许，同时保留相同类型的结合活性(在类型上，不必然是在数量上)。因此，所述重链cdr1、cdr2和cdr3序列优选地含有偏离此类被详述的cdr序列不超过3个(优选地不超过两个，更加优选地不超过一个)氨基酸的序列。在某些实施方案中，所述重链cdr1、cdr2和cdr3序列相同于此类被详述的cdr序列。
[0092]
在某些实施方案中，该egfr可变结构域包括一个重链可变区包括被阐述于图7或图8中的egfr vh区的hcdr1、hcdr2和hcdr3。优选地是图7或图8中的mf3755的egfr vh区。
[0093]
在某些实施方案中，该egfr可变结构域包括一个重链可变区包括一个氨基酸序列为至少90％(优选地至少95％，更加优选地至少97％，更加优选地至少98％，更加优选地至少99％)相同于或100％相同于一被阐述于图7或图8中的egfr vh区的氨基酸序列。优选地是图7或图8中的mf3755的egfr vh区。
[0094]
举例来说，在某些实施方案中，该双特异性抗体的结合人类egfr的重链可变区可以在该重链可变区的除了该3个cdr序列以外的序列中具有0-10个(优选地从0至5个)氨基酸插入、删除、取代、加入或者这些的一组合。在某些实施方案中，对于该被表明的氨基酸序列而言，该重链可变区包括有从0至9个、从0至8个、从0至7个、从0至6个、从0至5个、从0至4个，优选地从0至3个，优选地从0至2个，优选地从0至1个以及优选地0个氨基酸插入、删除、取代、加入或者这些的一组合。
[0095]
在某些实施方案中，该egfr可变结构域包括一个重链可变区包括一个氨基酸序列是来自一选自于图7或图8中的egfr vh区。优选地是图7或图8中的mf3755的egfr vh区。
[0096]
在一些实施方案中，该her2可变结构域包括一个重链可变区包括被阐述于图7或图8中的her2 vh区(优选地是图7或图8中的mf2032的her2 vh区)的hcdr1、hcdr2和hcdr3。
[0097]
在一些实施方案中，该her2可变结构域包括一个重链可变区包括一个氨基酸序列为至少90％(优选地至少95％，更加优选地至少97％，更加优选地至少98％，更加优选地至少99％)相同于或100％相同于一被阐述于图7或图8中的her2 vh区(优选地是图7或图8中的mf2032的her2vh区)的氨基酸序列。
[0098]
举例来说，在某些实施方案中，该双特异性抗体的结合人类her2的重链可变区可以在该重链可变区的除了该3个cdr序列以外的序列中具有0-10个(优选地从0至5个)氨基酸插入、删除、取代、加入或者这些的一组合。在某些实施方案中，对于该被表明的氨基酸序列而言，该重链可变区包括有从0至9个、从0至8个、从0至7个、从0至6个、从0至5个、从0至4个，优选地从0至3个，优选地从0至2个，优选地从0至1个以及优选地0个氨基酸插入、删除、取代、加入或者这些的一组合。
[0099]
在某些实施方案中，该her2可变结构域包括一个重链可变区包括一个选自于图7或图8中的mf1849或mf2032(优选地是图7或图8中的mf2032)的氨基酸序列。
[0100]
在一些实施方案中，该her3可变结构域包括一个重链可变区包括有图7或图8中的mf3178的vh区的hcdr1、hcdr2和hcdr3。
[0101]
在一些实施方案中，该her3可变结构域包括一个重链可变区包括一个氨基酸序列为至少90％(优选地至少95％，更加优选地至少97％，更加优选地至少98％，更加优选地至少99％)相同于或100％相同于被阐述于图7或图8中的mf3178的氨基酸序列。
[0102]
举例来说，在某些实施方案中，该双特异性抗体的结合人类her3的重链可变区可以在该重链可变区的除了该3个cdr序列以外的序列中具有0-10个(优选地从0至5个)氨基酸插入、删除、取代、加入或者这些的一组合。在某些实施方案中，对于该被表明的氨基酸序列而言，该重链可变区包括有从0至9个、从0至8个、从0至7个、从0至6个、从0至5个、从0至4个，优选地从0至3个，优选地从0至2个，优选地从0至1个以及优选地0个氨基酸插入、删除、取代、加入或者这些的一组合。
[0103]
在某些实施方案中，该her3可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf3178的氨基酸序列。
[0104]
在一个优选的实施方案中，该等双特异性抗体的一第一者以及一第二者包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括一个氨基酸序列来自一选自于图7或图8的egfr vh区或其一变异体，优选地是图7或图8的mf3755的egfr vh区，或其包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体；并且其中该第双特异性抗体还包括一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括一个选自于图7或图8的mf1849或mf2032的氨基酸序列或其一变异体，优选地是图7或图8的mf2032的氨基酸序列或其一变异体，其中该变异体包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)；并且其中该第二双特异性抗体还包括一个结合至her3的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf3178的氨基酸序列或其一变异体，其中该变异体包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)。
[0105]
在一个优选的实施方案中，该等双特异性抗体的一第一者以及一第二者包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf3755的氨基酸序列或其包括取代、删除和/或插入的1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体；并且其中该第双特异性抗体还包括一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf2032的氨基酸序列或其包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体；并且其中该第二双特异性抗体还包括一个结合至her3的细胞外部分
的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf3178的氨基酸序列或其一变异体，其中该变异体包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)。
[0106]
在一个实施方案中，该等双特异性抗体的一第一者以及一第二者包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf4280的氨基酸序列或其包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体；并且其中该第双特异性抗体还包括一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf1849的氨基酸序列或其包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体；并且其中该第二双特异性抗体还包括一个结合至her3的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf3178的氨基酸序列或其包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体。
[0107]
在一个实施方案中，该等双特异性抗体的一第一者以及一第二者包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf4280的氨基酸序列或其包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体；并且其中该第双特异性抗体还包括一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf2032的氨基酸序列或其包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体；并且其中该第二双特异性抗体还包括一个结合至her3的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf3178的氨基酸序列或其包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体。
[0108]
在一个实施方案中，该等双特异性抗体的一第一者以及一第二者包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf4003的氨基酸序列或其包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体；并且其中该第双特异性抗体还包括一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf1849的氨基酸序列或其包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体；并且其中该第二双特异性抗体还包括一个结合至her3的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf3178的氨基酸序列或其包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体。
[0109]
在一个实施方案中，该等双特异性抗体的一第一者以及一第二者包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf4003的氨基酸序列或其包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体；并且其中该第双特异性抗体还包括一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf2032的氨基酸序列或其包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体；并且其中该第二双特异性抗体还包括一个结合至her3的细胞外部分的可变结构域，该可变结构域包括一个重链可变区包括来自图7或图8中的mf3178的氨基酸序列或其包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体。
[0110]
示例性egfr重链可变区被描述于wo 2015/130172和pct/nl2018/050537中，此类专利案在此被并入本案以作为参考。示例性her2重链可变区被描述于wo 2015/130173中，该专利案在此被并入本案以作为参考。示例性her3重链可变区被描述于wo 2015/130172以及wo 2015/130173中，此类专利案在此被并入本案以作为参考。
[0111]
所公开的氨基酸序列的保留egfr、her2或her3结合的附加的变异体可以被获得，例如，如先前所描述的，从含有重排的人类igkvl-39/igkjl v
l
区的噬菌体显示库(de kruif等人.biotechnol bioeng.2010(106)741-50)，以及一个由将氨基酸取代并入至本文所公开的一个egfr、her2或her3 vh区的氨基酸序列中的vh区所构成的集合。编码结合egfr、her2或her3的fab区的噬菌体可以通过流动式细胞测量术来被选择与分析，并且被定序，以鉴别出带有氨基酸取代、插入、删除或加入并保留抗原结合的变异体。
[0112]
本发明进一步提供一个特异性地结合egfr的一細胞外部分以及her2的一細胞外部分的结合部分。该结合部分优选地包括一个结合egfr的可变结构域以及一个结合her2的可变结构域。该结合egfr的可变结构域优选地是如本文所描述的egfr可变结构域。该结合her2的可变结构域优选地是如本文所描述的her2可变结构域。优选地该egfr和该her2可变结构域这两者为如本文所描述的可变结构域。
[0113]
本发明进一步提供一个特异性地结合egfr的一細胞外部分以及her3的一細胞外部分的结合部分。该结合部分优选地包括一个结合egfr的可变结构域以及一个结合her3的可变结构域。该结合egfr的可变结构域优选地是如本文所描述的egfr可变结构域。该结合her3的可变结构域优选地是如本文所描述的her3可变结构域。优选地该egfr和该her3可变结构域这两者为如本文所描述的可变结构域。
[0114]
本发明进一步提供一种组合物包括有：一个特异性地结合egfr的细胞外部分以及her2的细胞外部分的结合部分，以及一个特异性地结合egfr的细胞外部分以及her3的细胞外部分的结合部分。
[0115]
如本文所描述的结合部分优选地为一个抗体，优选地是一个多特异性抗体，优选地是一个双特异性抗体。
[0116]
所述结合部分(诸如此类双特异性抗体)的egfr可变结构域、her2可变结构域以及her3可变结构域的轻链可变区(vls)可以是相同于亲代egfr单特异性抗体的v
l
区、亲代her2单特异性抗体的v
l
区和/或相同于亲代her3单特异性抗体的v
l
区。替代的v
l
区可用于此类vh/v
l
区组合中的一者或多者被使用，只要此类可变结构域分别地保留对egfr、her2或her3的结合。
[0117]
在某些实施方案中，该egfr可变结构域、该her2可变结构域以及该her3可变结构域的v
l
区是相似的。在某些实施方案中，位于所述结合部分的所有可变结构域中的v
l
区为相同的。
[0118]
在某些实施方案中，本发明的所述结合部分的1个、2个、3个或更多个可变结构域的轻链可变区包括一个共同轻链可变区。在某些实施方案中，1个、2个、3个或更多个可变结构域的共同轻链可变区包括一个生殖可变区v-节段。在某些实施方案中，1个、2个、3个或更多个可变结构域的轻链可变区包括有κ轻链v-节段igvκ1-39*01。igvκ1-39是免疫球蛋白可变κ1-39基因的简写。该基因也被称为κ可变1-39、igkv139、igkv1-39。关于该基因的外部标识符是：hgnc：5740；entrez gene：28930；ensembl：ensg00000242371。关于该v-区的氨基酸
序列被提供于图7的序列10的中。该v-区也可被组合以5个j-区中的一者。优选的j-区是jk1和jk5，而被连接的序列被表示为igkv1-39/jk1和igkv1-39/jk5，替代名称为igvκ1-39*01/igjκ1*01或igvκ1-39*01/igjκ5*01(根据位于imgt.org的imgt数据库全球网站的命名)。在某些实施方案中，一个或两个vh/v
l
结合区的轻链可变区包括有κ轻链igvκ1-39*01/igjκ1*01或igvκ1-39*01/igjκ1*05(分别为图7的序列11或序列12)。
[0119]
在某些实施方案中，本发明的所述结合部分的1个、2个、3个或更多个可变结构域的轻链可变区包括有：一个包括有氨基酸序列qsissy的lcdr1(图7的序列7)、一个包括有氨基酸序列aas的lcdr2以及一个包括有氨基酸序列qqsystp的lcdr3(图7的序列9)(即根据imgt，igkv1-39的此类cdrs)。在某些实施方案中，本发明的结合部分的1个、2个、3个或更多个可变结构域的轻链可变区包括有：一个包括有氨基酸序列qsissy的lcdr1(图7的序列7)、一个包括有氨基酸序列aasslqs的lcdr2(图7的序列8)以及一个包括有氨基酸序列qqsystp的lcdr3(图7的序列9)。
[0120]
在某些实施方案中，本发明的结合部分的1个、2个、3个或更多个可变结构域包括一个轻链可变区，该轻链可变区包括一个氨基酸序列为至少90％(优选地至少95％，更加优选地至少97％，更加优选地至少98％，更加优选地至少99％)相同于或100％相同于被阐述于图7中的序列11的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的结合部分的1个、2个、3个或更多个可变结构域包括一个轻链可变区，该轻链可变区包括一个氨基酸序列为至少90％(优选地至少95％，更加优选地至少97％，更加优选地至少98％，更加优选地至少99％)相同于或100％相同于被阐述于图7中的序列11的氨基酸序列。
[0121]
举例来说，在某些实施方案中，对于图7中的序列11或图7中的序列12而言，本发明的所述结合部分的1个、2个、3个或更多个可变结构域的可变轻链可以具有從0至10个(优选地从0至5个)氨基酸插入、删除、取代、加入或者这些的一组合。在某些实施方案中，对于该被表明的氨基酸序列而言，本发明的所述结合部分的1个、2个、3个或更多个可变结构域的轻链可变区包括有从0至9个、从0至8个、从0至7个、从0至6个、从0至5个、从0至4个，优选地从0至3个，优选地从0至2个，优选地从0至1个以及优选地0个氨基酸插入、删除、取代、加入或者这些的一组合。
[0122]
在其他的实施方案中，本发明的所述结合部分的1个、2个、3个或更多个可变结构域的轻链可变区包括有图7中的序列11或图7中的序列12的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的所述结合部分的全部的可变结构域包括有相同的v
l
区。在一个实施方案中，本发明的所述结合部分的全部的可变结构域的v
l
包括有被阐述于图7中的序列11的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的所述结合部分的全部的可变结构域的v
l
包括有被阐述于图7中的序列12或图7中的序列12的氨基酸序列。
[0123]
本文所公开的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)可呈许多的型式被提供。许多不同型式的多特异性抗体被知晓于本技艺中，并且已被kontermann(drug discov today，2015jul；20(7):838-47；mabs,2012 mar-apr；4(2)：182-97)以及spiess等人(alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies.mol.immunol.(2015)http：)dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2015.01.003)所回顾，此类文献各自在此被并入本案以作为参考。举例来说，多特异性抗体型式(诸如非为带有两个可变结构域的典型抗体的双特异性抗体型式)具有至少一个可变结构域包括一个
重链可变区和一个轻链可变区。这个可变结构域可以被连接至提供一第二结合活性的一个单链fv-片段、单体、一个vhh以及一个fab-片段。
[0124]
在某些实施方案中，被使用于本文所提供的方法中的此类多特异性抗体一般地是属于人类igg次型(例如，举例来说igg1、igg2、igg3、igg4)。在某些实施方案中，此类抗体是属于人类igg1次型。全长的igg抗体因为它们的有利的半衰期以及为了低免疫原性的缘故而被偏好。这样的多特异性抗体可以具有两个不相同的重链包括一个异二聚体化结构域。于是，在某些实施方案中，此类egfr/her2以及egfr/her3双特异性抗体为全长的igg分子。在一个实施方案中，此类egfr/her2以及egfr/her3双特异性抗体为全长的igg1分子。
[0125]
因此，在某些实施方案中，此类多特异性egfr/her2以及egfr/her3抗体包括一个可结晶的片段(fc)。此类多特异性抗体的fc区优选地由一个人类恒定区所构成。此类多特异性抗体的一恒定区或fc对于一个天然存在的人类抗体的恒定区可以含有一个或更多个(优选地不超过10个，优选地不超过5个)氨基酸差异。举例来说，在某些实施方案中，此类双特异性抗体的各个fab-臂可以进一步地包括一个fc-区包括有促进该双特异性抗体的形成的修饰、影响fc-媒介的效应子功能的修饰和/或本文所描述的其他特点。
[0126]
在优选的实施方案中，该多特异性(优选地双特异性)全长的igg抗体具有一个下方铰链和/或ch2结构域，而使得该双特异性igg抗体与fc gamma(fcγ)受体的相互作用被增强。一个抗体的抗体依赖型细胞毒性(还被称为adcc活性)，当该抗体本身具有一低adcc活性的时，经常可以被改善。这举例来说可以通过从该抗体的醣化部分移除岩藻糖残基而被达成。一种用于通过非岩藻糖化(afucosylation)来增强adcc的技术被描述于例如junttila，t.t.，k.parsons，等人(2010).“superior in vivo efficacy of afucosylated trastuzumab in the treatment of her2-amplified breast cancer.”cancer research 70(11)：4481-4489)的中。如本文所描述的多特异性抗体优选地被非岩藻糖化。优选地该两个多特异性抗体被非岩藻糖化。其他的策略曾经被报导用来达成adcc增强，举例来说包括糖化工程(kyowa hakko/biowa，glycart(roche)and eureka therapeutics)以及突变诱发(mutagenesis)(xencor and macrogenics)，所有这些都寻求改善fc对于低亲和力活化型fcγriiia(low-affinity activating fcγriiia)的结合，和/或降低对于低亲和力抑制型fcγriib(low affinity inhibitory fcγriib)的结合。
[0127]
双特异性抗体通常通过表现编码该抗体的核酸的细胞而被生成。于是，在某些实施方案中，一种用于生成包括一个结合egfr和her2的多特异性抗体以及一个结合egfr和her3的多特异性抗体的组合物的方法被提供，该方法包括提供一具有下列的细胞：
[0128]
–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同共同轻链形成一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域；
[0129]
–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同该共同轻链形成一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域；
[0130]
–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同该共同轻链形成一个结合至her3的细胞外部分的可变结构域；以及
[0131]
–
编码包括该共同轻链的多肽的核酸；
[0132]
其中所述核酸中的两个或更多个核酸可以是或者不是物理连接的，并且其中该核酸中的每一个核酸还包括一个表达调控序列以允许所述被编码的重链和轻链在该细胞中
的表达，并且其中该方法还包括培养该细胞以允许该重链和轻链的表达，以及任选地，收集该两个或更多个抗体。该两个或更多个抗体可以从该细胞和/或上澄液来被收集。
[0133]
此类相应的链在细胞中被生成的电平可被特制，举例来说通过选择适当的表达调控序列或通过选择被引入的核酸拷贝的数目或者这两者。在一个优选的实施方案中，一由细胞所构成的集合被提供以该核酸，而一表现此类相应的链的适当电平的选殖株被选择出。该选殖株通常还根据被生成的抗体的数量来被选择。在一个实施方案中，该方法包括提供该核酸给一由细胞所构成的集合以及从该集合选择出一个具有各别的重链和轻链的一所欲的表达比例的细胞。在某些实施方案中，该两个或更多个结合部分为抗体，优选地是双特异性抗体。在某些实施方案中，所述细胞优选地生成基本上等摩尔数量的该两个或更多个结合部分。在其他实施方案中，所述细胞生成该两个或更多个结合部分中的一个结合部分要多于另外一个结合部分。
[0134]
本发明还提供一种包括下列的细胞：
[0135]
–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同共同轻链形成一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域；
[0136]
–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同该共同轻链形成一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域；
[0137]
–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同该共同轻链形成一个结合至her3的细胞外部分的可变结构域；以及
[0138]
–
编码包括该共同轻链的多肽的核酸；
[0139]
其中所述核酸中的两个或更多个核酸可以是或者不是物理连接的，并且其中该核酸中的每一个核酸还包括一个表达调控序列以允许所述被编码的重链和轻链在该细胞中的表达。
[0140]
本发明进一步提供一种包括核酸的容器，该核酸包括有：
[0141]
–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同共同轻链形成一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域；
[0142]
–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同共同轻链形成一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域；
[0143]
–
编码包括重链的多肽的核酸，该重链连同共同轻链形成一个结合至her3的细胞外部分的可变结构域；以及
[0144]
–
编码包括该共同轻链的多肽的核酸；
[0145]
其中所述核酸中的两个或更多个核酸可以是或者不是物理连接的，并且其中该核酸中的每一个核酸还包括一个表达调控序列以允许所述被编码的重链和轻链在细胞中的表达。
[0146]
生成所述结合部分的该细胞优选地为一动物细胞，更加优选地是一哺乳动物细胞，更加优选地是一灵长类动物细胞，最优选地是一人类细胞。一合适的细胞为任何一种能够包括有而且优选地生成如本文所描述的所述结合部分(优选地是此类多特异性抗体以及优选地是此类双特异性抗体)的细胞。
[0147]
供抗体生成的合适的细胞被知晓于本技艺中，并且包括一种融合瘤细胞、一种中国仓鼠卵巢(cho)细胞、一种ns0细胞、一种hek293细胞、一种293-f细胞或一种per-c6细胞。
各种不同的机构和公司已发展出用于抗体(例如供临床应用)的大规模生产的细胞株。这样的细胞株的非限制性示范例是cho细胞、ns0细胞或per.c6细胞。在一个特别优选的实施方案中，该细胞是一人类细胞。优选地，一种被一腺病毒e1区或其一功能等效物所转形的细胞。在一个特别优选的实施方案中，该细胞是cho细胞或其一变异体。优选地，一种利用一麸胺酰胺合成酶(gs)载体系统来供一抗体的表达的变异体。在一个优选的实施方案中，该细胞是一种cho细胞。
[0148]
在某些实施方案中，该细胞表现3个不相同的重链以及至少一个轻链。在一个优选的实施方案中，该细胞表现如本文所描述的“共同轻链”，以降低不相同的抗体种类(由不相同的重链和轻链所构成的组合)的数目。举例来说，连同重排的人类igkv1 39/igkj1(huvκ1 39)轻链，相应的vh区使用本技艺中已知用于双特异性igg的生成的方法(wo2013/157954，在此被并入本案以作为参考)而被转殖至表现载体的内。该huvκ1 39先前被显示能够与一个以上的重链配對，因而导致具有互异的特异性的抗体，这促进双特异性分子的产生(wo2009/157771)。
[0149]
一种表现一个共同轻链以及同等数量的两个重链的抗体生成细胞通常生成50％双特异性抗体以及25％的各个此类单特异性抗体(即具有相同的重链轻链组合)。几种方法已经被发表而有利于双特异性抗体的生成胜过相应的单特异性抗体的生成。这通常通过修饰所述重链的恒定区来被达成，而使得它们有利于异二聚体化(即与另一个重链/轻链组合的重链的二聚体化)胜过同质二聚体化(homodimerization)。在一个优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体包括两个不相同的免疫球蛋白重链带有兼容的异二聚体化结构域。各式各样的相容的异二聚体化结构域已被描述于本技艺中。此类兼容的异二聚体化结构域优选地为兼容的免疫球蛋白重链ch3异二聚体化结构域。本技艺描述了各种不同的方式，其中重链的这样的异-二聚体化(hetero-dimerization)可以被达成。
[0150]
一种用于生成如本文所描述的多特异性抗体的优选的方法被公开于us 9,248,181和us 9,358,286中。具体地，用来生成基本上仅有双特异性全长的igg分子的优选的突变为位于该第一ch3结构域(该“kk-变异体”重链)中的氨基酸取代l351k和t366k(eu编号)以及位于该第二结构域(该“de-变异体”重链)的氨基酸取代l351d和l368e，或者反的还然。如先前所描述的，该de-变异体和kk-变异体优先地配对以形成异二聚体(所谓的“dekk”双特异性分子)。de-变异体重链的同质二聚体化(dede同质二聚体)或kk-变异体重链的同质二聚体化(kkkk同质二聚体)由于位于相同重链的间的ch3-ch3接口中的带电荷残基的间的强烈排斥而几乎不会发生。引入具有de-或kk-变异体重链的另外一个重链允许另外一个dekk双特异性分子的生成。一个新引入的de-重链(de2)可与现有的kk重链相联。该细胞因此生成两个双特异性抗体，一个de1kk以及一个de2kk双价抗体。如果一个新的kk重链(kk2)而非该新的de重链被引入，具有dekk1和dekk2组合的双特异性抗体被生成。不同的抗体可被该细胞所生成的电平可以通过调整此类her2链和her3链相对于彼此的相对表现来被调整。该轻链通常被充分地生成以降低单一重链的电平，而此类egfr链被生成的电平通常足以允许与此类her2链、her3链的有效配对。
[0151]
因此，在一个实施方案中，包括有结合egfr的可变结构域的重链/轻链组合包括有该重链的一个de变异体。在这个实施方案中，包括有结合her2的可变结构域的重链/轻链组合以及包括有结合her3的可变结构域的重链/轻链组合包括有该重链的一个kk变异体。
[0152]
候选egfr/her2或egfr/her3 igg双特异性抗体可以使用任何合适的分析而针对结合来被测试。举例来说，对膜-表现的egfr、her2或her3的结合。这通常在一个通常不表现该egfr、her2或her3或是被转形以表现egfr、her2或her3中的一者的细胞上被完成。该抗体对被转形的细胞而非未转形的細胞的结合表示该抗体的特异性结合。结合可以通过例如流动式细胞测量术(根据如先前被描述于wo 2015/130172、pct/nl2018/050537以及wo2015/130173中的facs程序))来被评定。相应的单特异性抗体可作为对照组被一起使用，此外一个无关的igg1同型对照组mab。
[0153]
结合部分(诸如抗体)可从一细胞培养物的细胞和/或上澄液来被收集。通常，它们从此类生成细胞之上澄液被收集。结合部分(诸如抗体)可从该上澄液来被纯化。许多纯化方法被知晓于本技艺中。一些更常见的方法使用亲和力纯化。
[0154]
由一细胞所生成的抗体可以通过亲和力纯化来被纯化。这有利地通过蛋白质a萃取来被完成。被洗提出的抗体可以就特异性结合性质(即结合至egfr、her2以及her3)的存在而通过elisa来被测试。抗体制备物可以进一步通过离子交换管柱层析法来被分析。个别的双特异性抗体可以彼此通过例行技术来被纯化，例如使用离子交换层析法。相应的双特异性抗体的存在也可以通过elisa来被分析。该制备物对her2的结合以及清洗应可移除所有的egfr/her3抗体。采用经标示的可溶性her3的染色没有供予一个信号，而采用经标示的可溶性egfr则有。该制备物对her3的结合以及清洗应可移除所有的egfr/her2抗体。采用经标示的可溶性her2的染色没有供予一个信号，而采用经标示的可溶性egfr则有。该制备物对egfr的结合以及清洗应该不会移除egfr/her2和egfr/her3抗体。采用经标示的可溶性her2的染色此外经标示的可溶性her3的染色应会供予一个信号。采用具有此类单双特异性抗体的已知电平的适当对照组，此类相应的抗体在一制备物中的电平也可以使用这样一个elisa来被估算。
[0155]
一种用于生成包括两个或更多个双特异性抗体的组合物的方法，该方法包括：
[0156]
–
提供带有编码该等双特异性抗体的核酸的细胞；
[0157]
–
培养该等细胞；
[0158]
–
收获物澄清(harvest clarification)；
[0159]
–
从培养物来收集此类双特异性抗体；以及
[0160]
–
通过离子交换层析法(iex)而将被生成的双特异性抗体与半抗体分开；
[0161]
该方法的特征在于：在所使用的iex条件下，此类双特异性抗体展现出类似的iex滞留时间，优选地与此类个别的抗体的滞留时间的平均值偏差为10％或者更低。在一个实施方案中，在所使用的iex条件下，此类抗体被选择为具有iex滞留时间与此类个别的抗体的滞留时间的平均值偏差为10％或者更低。此类抗体可以首先从该培养物内的其他蛋白质中被纯化出。这通常通过亲和力纯化而被完成，优选地通过蛋白质a萃取。此类双特异性抗体优选地被选择为具有半抗体带有落在此类抗体的滞留时间所跨距的范围的外的滞留时间。在双特异性抗体的组合被生成而单特异性抗体非为所企求的情况下，此类双特异性抗体优选选地被选择为具有滞留时间不相同于此类单特异性抗体的滞留时间。在这个实施方案中的此类单特异性抗体滞留时间优选地落在此类相应的双特异性抗体的滞留时间所跨距的范围的外。位于该培养物中的细胞优选地同时表现该3个重链，其中所述重链包括有促进egfr/her2和egfr/her3重链异二聚体化的形成的ch3异二聚体化结构域。所述细胞优选
地表现图7中的一个共同轻链。在一个实施方案中的此类双特异性抗体具有等电点(isoelectric points，pi)为类似的，并且优选地与该至少两个双特异性抗体的平均pi差异不超过0.5单位。
[0162]
候选egfr/her2或egfr/her双特异性抗体的egfr、her2以及her3 fabs对于它们的标靶的亲和力可以通过表面电浆共振(surface plasmon resonance，spr)技术使用一个biacore t100来被测量。一种抗人类igg小鼠单株抗体(becton and dickinson，cat.nr.555784)使用自由胺化学(nhs/edc)而被偶合至一个cm5传感器芯片的表面。接着该bsab被捕捉于该传感器芯片上。随后，重组型纯化的抗原人类egfr-fc、her2-fc和her3-fc蛋白质在一浓度范围内被运行于该传感器表面上，以测量结合与分离速率(on-and off-rates)。在每个循环之后，该传感器表面通过hcl的一脉冲而被再生，而该bsab被再次捕捉。从所获得的感应图谱(sensorgrams)，关于结合至人类egfr、her2和her3的结合与分离速率以及亲和力数值使用biaevaluation软件来被测定。
[0163]
本发明还提供如本文所描述的组合物用于一癌症的治疗。在实施方案中，该癌症是一物理上皮癌。优选地，该组合物被使用于一表现egfr、her2和/或her3的癌症。该组合物优选地被使用于胰脏癌、大肠直肠癌、头颈癌、上皮性卵巢癌、上皮性输卵管癌、上皮性腹膜癌、膀胱癌或前列腺癌。在实施方案中，通过使用该组合物被治疗的癌症是晚期癌症。该组合物优选地被使用于转移癌。该组合物优选地被使用于转移性胰脏癌、转移性大肠直肠癌、转移性头颈癌、转移性上皮性卵巢癌、转移性上皮性输卵管癌、转移性上皮性腹膜癌、转移性膀胱癌或转移性前列腺癌。在实施方案中，该组合物优选地被使用于为胃癌、肺癌、乳癌或食道癌的癌症。优选地，该组合物被使用于转移性胃癌、转移性肺癌、转移性乳癌或转移性食道癌。
[0164]
本发明进一步提供用于癌症的治疗的两个或更多个结合部分，所述结合部分各自包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域；其中所述结合部分中的第一结合部分包括一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域，并且所述结合部分中的第二结合部分包括一个结合至her3的细胞外部分的可变结构域。还被提供的是一种含有两个或更多个结合部分的产物，所述结合部分各自包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域；其中所述结合部分中的第一结合部分包括一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域，并且所述结合部分中的第二结合部分包括一个结合至her3的细胞外部分的可变结构域，在治疗癌症上作为同时、分开或依序使用的组合剂。
[0165]
通过本发明的实施方案被治疗的癌症优选地为一如本文其他地方所表明的癌症。该癌症优选地包括有带有egfr-突变的细胞，该egfr-突变致使该细胞对于利用酪氨酸激酶抑制剂(tki)的治疗具有抗性。在某些实施方案中，该癌症包括有带有egfr r521k多型性的细胞。以本文所描述的一发明的治疗方法被治疗的癌症优选地为胃癌、肺癌或食道癌。在一个进一步的实施方案中，本发明提供一种用于治疗具有癌症或者是存在癌症的复发、恶化的风险的个体的方法，该方法包括对需要该治疗的该个体投药两个或更多个结合部分，所述结合部分各自包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域；其中所述结合部分中的第一结合部分包括一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域，并且所述结合部分中的第二结合部分包括一个结合至her3的细胞外部分的可变结构域。
[0166]
如本文所使用的，术语“个体”和“病患”被互换地使用并且意指一哺乳动物，诸如
一人类、小鼠、大鼠、仓鼠、天竺鼠、兔子、猫、狗、猴、乳牛、马、猪等等的类(例如，一个具有一癌症的病患，诸如一个人类病患)。
[0167]
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”，如本文所使用的，意指在该个体身上被执行的任何型式的介入或过程或者对该个体投药一种活性试剂或一由活性试剂所构成的组合，目的是要逆转、减轻、改善、抑制或者减缓或预防一种与一疾病相关的症状、并发症、病况或生化指标的进展、发展、严重度或复发。
[0168]
如本文所使用的，“有效的治疗”或“阳性治疗反应”意指一种生成有益的效用的治疗，例如一种疾病或障碍(例如癌症)的至少一个症状的改善)。一有益的效用可以呈一高于基线的改善的形式，包括对于一个在根据本案方法的疗法的起始的前所做的测量或观察的一改善。举例来说，如通过该疾病的一临床的或诊断的症状或者癌症的一标记的减低或消被证明的，一有益的效用可以呈减缓、稳定、停止或逆转一处在任何临床阶段的个体体内的一癌症的进展的形式。有效的治疗举例来说可以减低肿瘤大小，减低循环的肿瘤细胞的存在，降低或防止一肿瘤的转移，减缓或停滞肿瘤生长和/或防止或延迟肿瘤复发或恶化。
[0169]
术语“有效量”或“治疗有效量”意指一种试剂或一种试剂的组合能提供所欲求的生物性、治疗性和/或预防性结果的一数量。该结果可以是一疾病的征象、症状或病因中的一者或多者的降低、改善、缓和、减少、延迟和/或减轻，或者一生物系统的任何其他所欲求的改变。在某些实施方案中，一有效量是一个足够来延迟肿瘤发展的数量。在某些实施方案中，一有效量是一个足够来防止或延迟肿瘤复发的数量。一有效量可呈一次或多次投药而被投药。药物或组合物的有效量可以：(i)降低癌细胞的数目；(ii)降低肿瘤大小；(iii)在某种程度上抑制、延缓、减缓以及可以停止癌细胞至外围器官内的浸润；(iv)抑制肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)防止或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在某种程度上缓解与该癌症相关的一种或多种症状。在一个示范例中，一“有效量”为本发明的组合物的数量，以达成一癌症中的一减低(例如癌细胞数目的一减低)或者减缓一癌症的进展。一有效數量的组合疗法呈一“有效方案”(这意指如本文所表明的所述结合部分的一组合)而根据本文所描述的此类方法被投药，其中投药的顺序以及剂量频率足以达成治疗。
[0170]
如本文所使用的，术语“协同(synergy)”、“治疗性协同(therapeutic synergy)”和“协同效应(synergistic effect)”意指一种现象，其中病患使用如本文所表明的所述结合部分的一组合(例如，一种包括结合egfr和her2的结合部分以及一结合egfr和her3的结合部分的组合物)的治疗彰显出一治疗优越的成果胜过该组合的各个个别组份当被单独使用时所达致的成果(参见，例如t.h.corbett等人，1982，cancer treatment reports，66，1187)。在这个情况下，一治疗优越的成果包括下列中的一者或多者：(a)在治疗反应上的一增高，该增高大于各个结合部分本身在相同于它在该组合中的剂量下的独立效应的总合；(b)该组合中的一种或多种试剂在剂量上的一减低而无治疗功效上的一减低；(c)在不良事件的发生率上的一减低，同时收受一为等于或大于各个试剂在相同于它在该组合中的剂量下的单一疗法的治疗效益；(d)在剂量限制性毒性上的一降低，同时收受一为大于各个试剂的单一疗法的治疗效益；(e)药物抗性的诱发的一延迟或最小化。
[0171]
在异种移植物模型(xenograft models)中，一种在其最大耐受剂量下被使用的组合(其中此类组份的每一者将会以一通常不超过它的个别最大耐受剂量的剂量而存在)，当通过该组合的投药而被达致的肿瘤生长的减低大于最佳组份被单独投药的时的肿瘤生长
的减低的数值，该组合彰显出治疗性协同。一种药物组合的协同作用举例来说可以根据chou-talalay的组合指数(ci)定理(chou等人，adv.enzyme regul.1984；22:27-55；chou,cancer res.2010；70(2)：440-446)来被测定。
[0172]
本发明进一步提供本发明的组合物用于癌症的治疗。被使用的实施方案优选地治疗一胃癌、大肠直肠癌、结肠癌、胃食道癌、食道癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肝癌、包括非小细胞肺癌的肺癌、明亮细胞肉瘤、唾液腺癌、头颈癌、脑癌、膀胱癌、胰脏癌、前列腺癌、肾脏癌、皮肤癌、黑色素瘤，诸如这些。在一个实施方案中，该实施方案治疗一为胃癌、肺癌或食道癌的癌症。该应用优选地治疗一为胃癌的癌症。
[0173]
本文所描述的一个发明适用于一癌症的治疗，该癌症优选地为一种就egfr、her2和/或her3在细胞膜上的存在而被测试的癌症。这可以通过例行方法来被完成，而且通常通过免疫组织化学法来被分析。
[0174]
该癌症优选地表现her2。该癌症优选地还表现egfr或her3。该癌症优选地表现egfr。该癌症优选地还表现her2或her3。该癌症优选地表现her3。该癌症优选地还表现egfr或her2。在某些实施方案中，通过本文所公开的发明来被治疗的癌症的细胞和/或该癌症中的基质细胞(stromal cells)表现一egfr配体、一her3配体或者这两者。该配体以及受体的表达因此可对该癌症的细胞提供一生长刺激。本发明的一组合特别适合于治疗包括有这样的细胞的癌症。
[0175]
在本发明的治疗中，egfr、her2与her3的中一者的表达可以至少延迟某些肿瘤的逃逸。使用一单特异性疗法被标靶的肿瘤可通过开始表现egfr、her2或her3中的另一者或者通过表现一受体的一配体而逃离治疗。
[0176]
这样的细胞，如果它们存在，也可以通过本发明的结合部分来被攻击，而因此可以在它们长大并且将它们自己多样化的前将的移除。在一个实施方案中，该癌症就一突变的egfr的存在来被测试。许多egfr-阳性肿瘤具有一致使该等细胞对于利用酪氨酸激酶抑制剂的治疗具有抗性的基因突变。
[0177]
本发明的组合物适合于治疗带有egfr-突变的癌症，该egfr-突变致使该等癌细胞对于利用酪氨酸激酶抑制剂(tki)的治疗具有抗性。在一个实施方案中，该癌症包括有带有egfr r521k多型性的细胞。在某些实施方案中，该癌症被知晓对于第一代tki抑制剂(诸如吉非替尼以及厄洛替尼)具有抗性。
[0178]
如本文所表明的癌症治疗可以被组合以一进一步的癌症治疗。这样的治疗可以包括进一步的结合部分，诸如一抗体和/或一细胞生长抑制药物(cytostatic drug)或蛋白质激酶抑制剂。该蛋白质激酶抑制剂优选地是一种非为一egfr或her3酪氨酸激酶抑制剂的抑制剂。该进一步的治疗的非限制性示范例包括放射疗法、化学疗法、外科手术、血管生长抑制疗法以及热疗。
[0179]
本发明的组合物可以适合于用于一对egfr抑制具有抗性的癌症的治疗，其中egfr抗性为her2和/或her3的过度表现的一结果。
[0180]
本发明的组合物可以适合于用于一对her2抑制具有抗性的癌症的治疗，其中her2抗性为egfr和/或her3的过度表现的一结果。
[0181]
本发明的组合物可以适合于用于一对her3抑制具有抗性的癌症的治疗，其中her3抗性为egfr和/或her2的过度表现的一结果。
[0182]
术语在如本文所描述的抗体、结合部分、组合物或产物的背景下意指在一制备品中存在多于一种而且通常是10种或更少的不相同抗体或结合部分，包括一双特异性的存在。的一示范例包括一由两种双特异性抗体所构成的组合。
[0183]
本发明进一步提供一种结合部分或双特异性抗体包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域以及一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域；其中该efgr可变结构域包括重链可变区包括有图8中的重链可变区mf3755、mf4280、mf4003或mf4016的cdrs，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸的变异体，并且其中该her2可变结构域包括重链可变区包括有重链可变区mf2032或mf1849的cdrs，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸的变异体。
[0184]
还被提供的是一种结合部分或双特异性抗体包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域以及一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域；其中该efgr可变结构域包括重链可变区包括有图8中的重链可变区mf3755的cdrs，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸的变异体，并且其中该her2可变结构域包括重链可变区包括有重链可变区mf2032的cdrs，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸的变异体。
[0185]
本发明进一步提供一种结合部分或双特异性抗体包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域以及一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域；其中该efgr可变结构域包括重链可变区包括有图8中的重链可变区mf3755、mf4280、mf4003或mf4016的氨基酸序列，或者该重链可变区的包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体，并且其中该her2可变结构域包括重链可变区包括有重链可变区mf2032或mf1849的氨基酸序列，或者该重链可变区的包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体。
[0186]
本发明进一步提供一种结合部分或双特异性抗体包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域以及一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域；其中该efgr可变结构域包括重链可变区包括有图8中的重链可变区mf3755的氨基酸序列，或者该重链可变区的包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体，并且其中该her2可变结构域包括重链可变区包括有重链可变区mf2032的氨基酸序列，或者该重链可变区的包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体。
[0187]
还被提供的是一种结合部分或双特异性抗体包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域以及一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域；其中该efgr可变结构域包括重链可变区包括有图8中的重链可变区mf3755的cdrs，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸的变异体，并且其中该her2可变结构域包括重链可变区包括有重链可变区mf1849的cdrs，或者该重链可变区的一个包括在所述cdrs中取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸的变异体。
[0188]
本发明进一步提供一种结合部分或双特异性抗体包括一个结合至egfr的细胞外部分的可变结构域以及一个结合至her2的细胞外部分的可变结构域；其中该efgr可变结构域包括重链可变区包括有图8中的重链可变区mf3755的氨基酸序列，或者该重链可变区的
包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体，并且其中该her2可变结构域包括重链可变区包括有重链可变区mf1849的氨基酸序列，或者该重链可变区的包括取代、删除和/或插入1、2或3个氨基酸(非优选地是不位于所述cdrs中)的变异体。
[0189]
为了明确性以及一个简洁的发明说明的目的，特征在此被描述以作为相同的或独立的实施方案的部分，然而，将会被理解的是：本发明的范围可以包括具有全部的或者一些的所述特征的组合的实施方案。
[0190]
实施例
[0191]
细胞株
[0192]
hek293细胞、nci-87细胞(crl-5822
tm
)、bxpc-3(atcc crl-1687)、bxpc-3-luc2以及cho-k1被维持于补充有10％热失活的胎牛血清(fbs)的生长培养基中。
[0193]
双特异性抗体的产生
[0194]
双特异性抗体使用上述的用于双特异性抗体的有效异二聚体化与形成的dekk ch3技术而被产生。如的前所述的(wo 2013/157954 a1)，该ch3技术利用位于该ch3区中的以电荷为基础的点突变，以允许两个不相同的重链分子的有效配对。
[0195]
一个vh基因被转殖到两个不相同架构的igg1载体中的一者内。端视结合伙伴而定，该vh被选殖至一个包括有带有异二聚体化变异体“de”的ch3变异体的igg1架构或者包括有互补的ch3异二聚体化变异体“kk”的igg1架构中。在其中的两个或更多个抗体共享一个重链的双-或多特异性抗体的情况下，该共享链优选地具有该ch3异二聚体化变异体“de”(还被称为该de-重链)，而该两个或更多个独特的重链具有该ch3异二聚体化变异体“kk”(还被称为该kk-重链)。
[0196]
贴附的hek293细胞被培养于6-孔培养盘内至一为80％的汇合(confluency)。所述细胞被短暂转染以dna-fugene混合物并且被进一步的培养。在转染之后7天，上澄液被收获，而培养基被更新。在转染之后14天，上澄液被合并并且被过滤通过(0.22μm。无菌上澄液被储存在4℃下。经悬浮调適的hek293细胞被培养于位于一个振荡器盘上的t125培养瓶(t125 flasks)内直到一为3.0
×
106个细胞/ml的密度。细胞在一为0.3-0.5
×
106个活细胞/ml的密度的下被播种至一个24深孔培养盘的每一个孔的内。该等细胞被短暂转染以个别的无菌dna：pel-mix并且被进一步的培养。在转染之后7天，上澄液被收获并且被过滤通过0.22μm。无菌上澄液被储存在4℃下。
[0197]
共表达两个双特异性抗体的安定的细胞株池的产生
[0198]
cho细胞被以3种重链构造物以及一种共同轻链构造物转染，共同轻链构造物(clc)：egfr重链：her2重链：her3重链的摩尔比为2.5:2:1:1。10个由被安定地转染的细胞所构成的池(a-j)被获得。抗-egfr、抗-her2以及抗-her3抗体的elisa分析于该10个池的第3天与第6天之上澄液来被执行。全部3种特异性可以在所有的池中被测定出。
[0199]
共表达两种双特异性抗体的安定的细胞株选殖株通过将此类池平板接种于半固体培养基中而被产生。被平板接种的细胞被允许生长历时7-10天。两回合的单一细胞选殖法通过单一群落的播种与挑选来被进行。oligoclonics通过分批补料发酵(fed-batch fermentation)而从一个单细胞被产生出。
[0200]
抗体效价(antibody titers)的测定
[0201]
根据总igg浓度，细胞上澄液以1：4和1：50被稀释于pbs的中。单一抗原elisas首先被执行以便测定所有3种抗体的存在。下面的抗原在2.5μg/ml的稀释下被使用，以涂覆一个elisa盘的孔：重组型人类egfr-ecd fc(r&d systems，344-er)、重组型人类erbb2-ecd fc(r&d systems，1129-er)以及重组型人类erbb3-ecd fc(r&d systems，348-er)。
[0202]
两种三明治型elisas(sandwich elisas)接而被展开以测定以及定量两种双特异性分子，而允许介于该两种双特异性物之间的比率的估算。关于egfrxher2双特异性的测定，egfr-fc(r&d systems，344-er)抗原被涂覆在此类孔之上并且使用erbb2-fc(r&d systems，1129-er)来被测定。关于egfrxher3双特异性的测定，egfr-fc抗原被涂覆在此类孔之上并且使用erbb3-fc(r&d systems，348-rb)来被测定。
[0203]
igg纯化
[0204]
igg的纯化使用亲和力层析法来被执行。纯化在无菌条件下使用真空过滤来被执行。首先，培养基的ph值被调整至ph 8.0，而生成物随后于25℃的下、在一设为600rpm的平板摇动仪上，以蛋白质asepharose cl-4b珠粒(50％v/v)(pierce)被培育历时2小时。其次，此类珠粒通过真空过滤而被收获。珠粒以pbs ph 7.4被清洗2次。igg在ph 3.0的下使用0.1m柠檬酸盐缓冲液来被洗提，而igg分馏物立即通过tris ph 8.0来被中和。缓冲液交换通过使用ultracel(millipore)的离心法来被执行。此类样品最后处于一为pbs ph 7.4的最终缓冲液中。
[0205]
阳离子交换层析法(ciex)
[0206]
cex-hplc層析法使用tskgel sp-stat(7μm粒径，4.6mm i.d.
×
10cml，tosoh 21964)系列的离子交换管柱而被完成。此类管柱被填充以用于生物分子的速度与高解析分析此外分离的无孔树脂粒子。位于tskgel stat管柱中的粒子含有一由多层离子交换基团所构成的开放式出入网状结构来供装载容量，而相对较大的粒径使得这些管柱适合于供hplc和fplc系统的使用。
[0207]
tskgel sp-stat(7μm粒径，4.6mm i.d
×
10cml，tosoh 21964)使用缓冲液a(磷酸钠缓冲液，25mm，ph 6.0)来被平衡，在这之后抗体通过提高盐浓度以及运行缓冲液b(25mm磷酸钠，1mm nacl，ph 6.0)的一梯度而从该管柱被排出。流速被设定在0.5ml/min。关于所有的测试样品以及对照组(配于pbs中)的注入样品质量为10μg，而注入体积是10-100μl。层析图根据220nm的结果就所观察到的波峰型态、滞留时间以及主要波峰的波峰面积来被分析。
[0208]
bxpc-3-luc2以及n87生长抑制分析
[0209]
抗体组合物在总抗体的一个浓度范围(下被测试。此类抗体根据相等数量的重量/重量来被两两汇集。hrg和egf对于bxpc3-luc2细胞在0.1ng/ml的egf与10ng/ml的hrg的下被加入至培养物中，或者对于n87细胞在0.1ng/ml的egf与1ng/ml的hrg的下被加入至培养物中。有配体的基础值(basal w/ligand)为一个没有抗体但有相应的生長因子的对照组。无配体的基础值(basal w/o ligand)为一个没有被表明的生长因子且无抗体的对照组。
[0210]
抗体被稀释于化学性限定的饥饿培养基(chemically defined starvation medium)(cds：rpmi 1640培养基，含有每毫升为80u的青霉素和80μg的链霉素、0.05％(w/v)bsa以及10μg/ml的全铁转铁蛋白(holo-transferrin))中，而50μl的稀释抗体被加入至一个96井黑色井透明底板平盘(costar)的此类井中。配体被加入(每井为50μl的一个储备溶
液，含有被稀释于cds中的40ng/ml或4ng/ml的hrg与400ng/ml的egf：r&d systems，cat.nr.396-hb及236-eg)。平盘被留置在室温下历时1小时然后被放到位于一个37℃细胞培养培育箱内的一个容器中历时3天(n87细胞)或4天(bxpc-3-luc2细胞)。在第4天时，阿拉玛蓝(alamar blue)(invitrogen，#dal1100)被加入(20μl/井)，而荧光在使用阿拉玛蓝的培育(在37℃下)6小时(n87细胞)或4小时(bxpc-3-luc2细胞)之后，于一个biotek synergy 2多功能微盘式分析仪上使用560nm的激发以及590nm的读出来被测量。荧光值针对非抑制型生长(没有抗体，但两种配体被加入)来被标准化。
[0211]
各种不同的的adcc活性
[0212]
adcc报导子生物分析(adcc reporter bioassay)(promega)被使用。两种不同的细胞株被测试：egfr表现型胰脏癌细胞株bxpc3以及胃癌n87细胞株。
[0213]
该生物分析使用经工程化的jurkat细胞，所述细胞要么安定地表现fcγriiia受体v158(高亲和力)变异体，以及一个驱动萤火虫荧光素酶(它是一个用于fcγr活化的测量)的表达的nfat反应要素。该分析已通过将使用这个adcc报导子生物分析所获得的数据来跟传统的
51
cr释放分析做比较而被验证，而这两种分析得出类似的结果。此类adcc分析使用promega adcc生物分析套组、使用384白色井平盘来被执行。在这个实验设置中，bxpc3细胞和n87细胞在该分析的前的20-24小时以一为配于30μl分析培养基(带有4％低igg血清的rpmi)内的1000个细胞/井的密度被平板接种。隔天，培养基被移除。其次，的一系列稀释以及一比较器抗体(comparator antibody)西妥昔单抗以两次重复来被制备。10μl的这些抗体稀释物被加入至此类井中。没有抗体的对照组井还被包括(基础值)。从此类抗体的起始浓度，5倍系列稀释物被产生，以提供剂量-反应曲线。最后，5μl的adcc生物分析效应子细胞(adcc bioassay effector cells)(15000个细胞/井，v158)被加入。所述细胞在37℃下被培育历时6小时。其次，15μl的bio-glo荧光素酶基质被加入，并且在5分钟之后发光在一个盘读取机内被测定。所得到的数据被显示于图3中。西妥昔单抗显示对于bxpc3以及n87细胞的adcc活性。各种不同的寡株抗体在bxpc3和/或n87细胞上也显示出adcc活性。
[0214]
测试包括有双特异性抗体pb4516和pb6892的有关它对于bxpc-3-luc2肿瘤(被原位植入)以及n87肿瘤(被植入于腹脇部内的胃细胞)的生长的作用
[0215]
8-10周大的cb17 scid雌性小鼠于研究开始的时在胰脏内被原位植入以配于20μl内的1
×
106个bxpc-3-luc2肿瘤细胞。小鼠被麻醉并且使其从右侧躺下以暴露出左侧，而一个0.5cm的切口在左侧腹胁部区域上被做出。胰脏和脾脏从腹部被取出，而配于20μl内的1
×
106个肿瘤细胞被注入至胰尾的囊下空间的内。在植入后的一周，生物发光(bli)数据被产生。关于bli显像(每周一次或两次)左侧视图，所有的小鼠接受在该显像的15分钟的前所有的小鼠接受150mg/kg荧光素(luciferin)(d-荧光素-ef钾盐，cat.#e6552，promega)的腹膜内注射(i.p.injections)。异常值动物(outlier animals)
–
根据bli/肿瘤体积
–
被移除，而此类小鼠被随机地分布于每组7只小鼠的组别中。在实验第8天，治疗被开始。
[0216]
位于抗体治疗组中的动物每周被给药0.3mg/kg的抗体经历连续4周(第0天、第7天、第14天和第21天)。在该治疗的第0天，此类动物接受两倍的负载剂量，即0.6mg/kg的抗体。最后的显像在第35天或第40天来被进行。只有载体以及西妥昔单抗治疗的组别充当对
照组。
[0217]
西妥昔单抗以及oligoclonic显着地减低该模型中的bxpc-3肿瘤过度生长(p《0.05)(图5)。使用pb4516和pb6892的肿瘤过度生长明显地低于使用西妥昔单抗。西妥昔单抗没有显着地降低n87细胞的过度生长。显着地减低该模型中的n87肿瘤过度生长(p《0.05)(图5)。
[0218]
n87肿瘤：
[0219]
8-12周大的cb17 scid雌性小鼠于研究开始的时在腹胁部内被皮下(s.c.)接种以配于50％基质胶(matrigel)内的1
×
107个n87肿瘤细胞。细胞注射体积是0.2ml/小鼠。治疗在肿瘤达到为150-200mm3的平均尺寸时被开始。抗体通过以25mg/kg的小鼠的腹膜内注射被每周投药一次经历4周。体重测量在肿瘤细胞注射之后每周一次，以及从治疗开始至结束每两周测量一次。肿瘤生长每两周通过测径器测量(caliper measurements)来被监控。实验的终点是一为800mm3的肿瘤体积或者60天，以先到者为准。
[0220]
pb11244和pb4516在各种不同的pdx模型中的活性
[0221]
包括有双特异性抗体pb11244和pb4516的的活性在一系列的pdx模型中被评定。在大量数目的癌症模型中测试候选治疗促进了临床性能的预测，并且可以鉴定出用于病患-选择策略的因素(factors for patient-selection strategies)。
[0222]
双特异性抗体pb4516和pb11244具有一个igg1恒定区以及两个可变结构域。
[0223]
pb4516的her3可变结构域具有图7或图8中的mf3178的重链可变区。egfr可变结构域具有图7或图8中的mf3755的重链可变区。
[0224]
pb11244的her2可变结构域具有图7或图8中的mf2032的重链可变区。egfr可变结构域具有图7或图8中的mf3755的重链可变区。
[0225]
这两种抗体中的轻链可变区为相同的并且具有图7中的序列识别编号：11(seq id no：11)的共同轻链可变区的氨基酸序列。
[0226]
数种胃癌、食道癌以及非小细胞肺癌pdx模型的一选择被做出来(图6)。
[0227]
包括有双特异性抗体pb4516和pb11244的被生成与纯化。此类抗体呈一为1：1的比例被混合。在此类模型中被测试并且与西妥昔单抗和载体(pbs)来做比较。
[0228]
此类pdx模型首先于供体balb/c裸鼠体内被皮下地(s.c.)扩展。肿瘤被提取，被切成小块(直径为2-3mm)并且被皮下植入至新的受体balb/c裸鼠体内。肿瘤接受者为6-8周大的雌性balb/c裸鼠。肿瘤生长通过测径器测量来被追踪直到肿瘤达到为100-200mm3的平均尺寸。在这个阶段(被注明为第1天)，动物被随机分配为每一个模型有3个组别。治疗在同一天被起始并且包括：
[0229]
–
pb4516
×
pb6892 25mg/kg，5周的剂量，腹膜内注射
[0230]
–
西妥昔单抗25mg/kg，5周的剂量，腹膜内注射
[0231]
–
载体(pbs)，5周的剂量，腹膜內注射
[0232]
可被看出的是：显着地降低模型中的肿瘤细胞的过度生长。过度生
长的降低等于西妥昔单抗或者更优选。
[0233]
表1.落在her3中的arg 426的半径内的残基
[0234][0235]