一种联合多酚和抗菌肽的纤维膜及其制备方法和应用

1.本发明涉及纤维膜技术领域，具体涉及到一种联合多酚和抗菌肽的纤维膜及其制备方法和应用。


背景技术：

2.骨组织再生是涉及材料学和生物医学等多学科交叉的复杂过程。骨组织支架材料已经被广泛认为可用于骨组织的修复及再生。目前研究者已经设计研发了性能各异的用于骨组织再生的支架材料，然而真正实现血管化骨组织再生仍然面临诸多亟待解决的科学问题和技术瓶颈。静电纺丝技术因其制备的纤维膜具有典型的类细胞外基质结构而广泛应用于组织工程领域，在骨组织工程领域也有其独特的应用。静电纺丝纤维膜可作为屏障膜用于引导口腔牙槽骨再生，也可作为骨膜应用于骨科促进骨组织愈合及神经再生。由于临床问题的复杂性，对应用于骨组织再生的静电纺丝纤维膜具有更加严苛的性能要求。因而对静电纺丝纤维膜进行功能性表面修饰及改性成为提高纤维膜综合性能的有效策略。
3.目前，常用的静电纺丝纤维膜改性方法包括涂层、混合和共价结合。通过聚多巴胺进行表面接枝的传统方法已被广泛使用，但是其存在的问题也不容忽视，如深褐色的聚多巴胺通常会改变基体材料的光学性质，而聚多巴胺中丰富的氨基也会干扰配体的定量。近年来，一些新的纤维膜改性、接枝策略逐渐兴起，如使用功能性的结合肽进行改性、接枝，然而其高昂的成本以及结合肽对底物的选择性限制了其更广泛的应用。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种联合多酚和抗菌肽的纤维膜及其制备方法和应用，可有效改善现有纤维膜的改性方法中无法实现h型血管化骨组织再生的问题。
5.为达上述目的，本发明采取如下的技术方案：
6.本发明提供一种联合多酚和抗菌肽的纤维膜，该纤维膜是通过联合多酚化合物和抗菌肽对纤维膜基底表面进行改性制得；其中，多酚化合物通过非共价结合将抗菌肽接枝至纤维膜表面。
7.本发明的有益效果是：本发明通过多酚化合物可进一步接枝抗菌肽，多酚化合物丰富的酚羟基可以与抗菌肽形成较强的非共价键作用，接枝抗菌肽后消耗了多酚化合物的酚羟基可显著减弱多酚化合物引起的细胞毒性；联合多酚化合物和抗菌肽可赋予纤维膜较好的抗菌性能，且能主动调节植入材料周围局部免疫微环境，进而有效实现h型血管化骨组织再生。
8.进一步地，纤维膜基底是由高分子聚合物和生物活性成分经静电纺丝制备而得。
9.采取上述进一步方案的有益效果是：本发明提供的静电纺丝纤维膜改性方法可简单、有效地将功能性抗菌肽接枝至高分子基纤维膜材料表面，多酚化合物由于其丰富的酚羟基可以与高分子基纤维膜表面形成强的相互作用，且对高分子基底纤维膜具有广泛的适
配性，可与大多数合成高分子及所有天然高分子材料有效结合，有效解决了现有纤维膜的改性方法中存在的对高分子基底纤维膜适配性差和成本高等问题。
10.进一步地，静电纺丝制备的纤维膜基底的主要成分为合成高分子聚合物或天然高分子聚合物，广泛包括聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸、聚氨酯、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、壳聚糖、胶原、明胶及其衍生物。
11.进一步地，纤维膜基底的结构包括单轴纤维膜、核壳结构的同轴纤维膜或多轴结构纤维膜。
12.进一步地，纤维膜基底中添加生物活性成分，生物活性成分包括黄芩苷、黄芩素、鱼胶原、纳米羟基磷灰石和磷酸钙盐中的至少一种。
13.采取上述进一步方案的有益效果是：生物活性成分可提高纤维膜的生物相容性、抗炎作用及促成骨作用。
14.进一步地，多酚化合物为单宁酸和表没食子儿茶素没食子酸酯中的一种或两种。
15.采取上述进一步方案的有益效果是：多酚化合物具有丰富的酚羟基，可有效地通过非共价结合作用将抗菌肽接枝到纤维膜基底材料表面。
16.进一步地，具有诸多功能性的抗菌肽为ll-37和gl13k中的一种或两种。
17.采取上述进一步方案的有益效果是：抗菌肽可显著减弱多酚化合物引起的细胞毒性，抗菌肽还可赋予纤维膜较好的抗菌性能，且能主动调节植入材料周围局部免疫微环境，进而有效实现h型血管化骨组织再生。
18.进一步地，多酚化合物与抗菌肽之间为非共价结合作用。
19.本发明还提供上述联合多酚和抗菌肽的纤维膜的制备方法，包括以下步骤：
20.s1、将生物活性成分分散于有机溶剂中，加入高分子化合物，震荡摇匀得到纺丝溶液，通过静电纺丝制备纤维膜基底，将所得纤维膜基底置于醇类溶剂中浸泡处理；
21.s2、将s1所得的纤维膜基底置于多酚化合物溶液中，静置存放后取出，冲洗，得到接枝多酚化合物的纤维膜；
22.s3、将s2所得的接枝多酚化合物的纤维膜置于抗菌肽的水溶液中，于2～10℃静置存放后取出，冲洗，得到联合多酚和抗菌肽的纤维膜。
23.进一步地，步骤s1中有机溶剂为三氟乙醇或六氟异丙醇或丙酮或三氟乙酸或二氯甲烷或n,n-二甲基甲酰胺。
24.进一步地，步骤s1中醇类溶剂优选为75
±
5％乙醇，浸泡20～40分钟。
25.进一步地，步骤s1中静电纺丝工艺参数设置为：电压4-20kv，推注速度为0.2-1ml/h，接收距离10-20cm；其中优选的工艺参数为电压6-10kv，推注速度0.3-0.6ml/h，接收距离14-17cm。
26.进一步地，步骤s2中多酚化合物溶液的浓度为1-50mg/ml，静置存放时间为1-12小时；其中优选的条件为多酚化合物溶液的浓度5-25mg/ml，静置存放时间为4-8小时。
27.进一步地，步骤s3中抗菌肽溶液的浓度为0.5-10mg/ml，静置存放时间为1-24小时；其中优选的条件为抗菌肽溶液的浓度1-3mg/ml，静置存放时间为4-8小时。
28.上述制备方法的有益效果是：高分子基纤维膜作为基底材料，对整个材料体系的理化性能、降解性能、生物相容性等起着重要作用，可根据具体的应用场景选择相应的高分子基底材料；多酚化合物的含量在对高分子基底进行改性的过程中起着极其重要的作用，
静电纺丝纤维膜在多酚溶液中浸泡时间过长，纤维膜表面富集大量多酚化合物，极易引起细胞毒性，在多酚溶液中浸泡时间过短则无法有效与高分子基底材料产生相互作用并进一步接枝抗菌肽；抗菌肽的含量则主要影响纤维膜的抗菌性能、细胞相容性、免疫调节性、促血管化成骨作用等生物学性能，太高或太低均无法实现上述功能性特点。因此，本发明通过高分子基底纤维膜、多酚和抗菌肽三者的相互协同增效作用，解决了现有纤维膜的改性方法中无法实现h型血管化骨组织再生的问题。
29.本发明还提供上述联合多酚和抗菌肽的纤维膜在制备和/或用作h型血管化骨组织再生材料中的应用。
30.综上所述，本发明具有以下优点：
31.1、本发明提供的静电纺丝纤维膜改性方法可简单、有效地将功能性抗菌肽接枝至高分子基纤维膜材料表面，多酚化合物由于其丰富的酚羟基可以与高分子基纤维膜表面形成强的相互作用，且对高分子基底纤维膜具有广泛的适配性，可与大多数合成高分子及所有天然高分子材料有效结合；通过多酚化合物可进一步接枝抗菌肽，多酚化合物丰富的酚羟基可以与抗菌肽形成较强的非共价键作用。
32.此外，纤维膜接枝抗菌肽后消耗了多酚化合物的酚羟基可显著减弱多酚化合物引起的细胞毒性，有利于细胞增殖、分化，进而促进骨组织再生。
33.此外，联合多酚化合物和抗菌肽可赋予纤维膜较好的抗菌性能。
34.此外，纤维膜表面接枝抗菌肽后能主动调节植入材料周围局部免疫微环境，进而有效实现h型血管化骨组织再生。
35.此外，纤维膜表面可进一步负载抗炎因子或生长因子，如il-4、bmp-2等。
36.本发明提供的联合多酚和抗菌肽的纤维膜具有典型的类细胞外基质结构，该制备方法技术工艺稳定、可重复，操作简单，易于规模化生产。
附图说明
37.图1为本发明中表面未接枝单宁酸(图1左)与接枝单宁酸(图1右)的纤维膜在硝酸银溶液中浸泡后结果；
38.图2为本发明中单宁酸和ll-37多肽改性后的纤维膜的扫描电镜图；
39.图3为本发明中大肠杆菌在单宁酸和ll-37多肽改性纤维膜上培养后的扫描电镜图；
40.图4为本发明中金黄色葡萄球菌在单宁酸和ll-37多肽改性纤维膜上培养后的扫描电镜图；
41.图5为本发明中单宁酸和ll-37多肽改性纤维膜的引导大鼠颅骨再生效果图。
具体实施方式
42.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
43.因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有
做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
44.实施例1
45.一种联合多酚和抗菌肽的纤维膜的制备方法，原料包括山东济南岱罡生物科技有限公司的聚乳酸-羟基乙酸，生工生物股份有限公司的鱼胶原，阿拉丁公司的单宁酸和六氟异丙醇，南京杰肽生物科技有限公司的ll-37肽，具体步骤如下：
46.步骤1：称取0.04g鱼胶原分散于1ml六氟异丙醇中，称取0.2g聚乳酸-羟基乙酸并加入到所得分散液中，用恒温振荡器震荡摇匀60min得纺丝液，通过静电纺丝制备鱼胶原/聚乳酸-羟基乙酸纤维膜，纺丝电压为8kv，推注速度为0.5ml/h，接收距离为15cm，将静电纺丝纤维膜置于真空干燥箱中干燥一周；
47.步骤2：将步骤1所得纤维膜置于75％乙醇中浸泡30min；
48.步骤3：将步骤2所得的纤维膜置于浓度为40mg/ml单宁酸溶液中，静置存放2小时后取出，用去离子水轻轻冲洗两次，得到接枝单宁酸的纤维膜；
49.步骤4：将步骤3所得接枝单宁酸的纤维膜置于浓度为2mg/ml ll-37肽的溶液中，于4℃静置存放6小时后取出，用去离子水轻轻冲洗两次，得到经单宁酸和ll-37肽改性的纤维膜。
50.实施例2
51.一种联合多酚和抗菌肽的纤维膜的制备方法，原料包括山东济南岱罡生物科技有限公司的聚乳酸-羟基乙酸，深圳光华伟业股份有限公司的聚己内酯，生工生物股份有限公司的鱼胶原，阿拉丁公司的单宁酸、黄芩苷、六氟异丙醇和三氟乙醇，南京杰肽生物科技有限公司的ll-37肽，具体步骤如下：
52.步骤1：称取0.015g黄芩苷分散于1ml三氟乙醇中，称取0.12g聚己内酯并加入到所得分散液中，用恒温振荡器震荡摇匀45min，得纺丝液a，称取0.08g鱼胶原分散于2ml六氟异丙醇中，称取0.4g聚乳酸-羟基乙酸并加入到所得分散液中，用恒温振荡器震荡摇匀60min，得纺丝液b；
53.步骤2：将步骤1所得纺丝液a和b分别装入5ml注射器中，并分别置于静电纺丝机的两个推注装置，纺丝液a和b分别与同轴针头的内层和外层相连接，通过静电纺丝制备鱼胶原/聚乳酸-羟基乙酸/聚己内酯-黄芩苷复合纤维膜，采用平板接收器，纺丝电压为7kv，纺丝液a和b的推注速度分别为0.2ml/h和0.4ml/h，接收距离为15cm；
54.步骤3：将步骤2所得纤维膜置于真空干燥箱中干燥一周后置于75％乙醇中浸泡30min；
55.步骤4：将步骤3所得的纤维膜置于浓度为10mg/ml单宁酸溶液中，静置存放2小时后取出，用去离子水轻轻冲洗两次，得到接枝单宁酸的纤维膜；
56.步骤5：将步骤4所得接枝单宁酸的纤维膜置于浓度为2mg/ml ll-37肽的溶液中，于4℃静置存放6小时后取出，用去离子水轻轻冲洗两次，得到经单宁酸和ll-37肽改性的纤维膜。
57.实施例3
58.一种联合多酚和抗菌肽的纤维膜的制备方法，原料包括山东济南岱罡生物科技有限公司的聚乳酸-羟基乙酸，深圳光华伟业股份有限公司的聚己内酯，生工生物股份有限公司的鱼胶原，阿拉丁公司的单宁酸、黄芩苷、六氟异丙醇和三氟乙醇，南京杰肽生物科技有
限公司的ll-37肽，具体步骤如下：
59.步骤1：称取0.015g黄芩苷分散于1ml三氟乙醇中，称取0.12g聚己内酯并加入到所得分散液中，用恒温振荡器震荡摇匀45min，得纺丝液a，称取0.08g鱼胶原分散于2ml六氟异丙醇中，称取0.4g聚乳酸-羟基乙酸并加入到所得分散液中，用恒温振荡器震荡摇匀60min，得纺丝液b；
60.步骤2：将步骤1所得纺丝液a和b分别装入5ml注射器中，并分别置于静电纺丝机的两个推注装置，纺丝液a和b分别与同轴针头的内层和外层相连接，通过静电纺丝制备鱼胶原/聚乳酸-羟基乙酸/聚己内酯-黄芩苷复合纤维膜，采用平板接收器，纺丝电压为7kv，纺丝液a和b的推注速度分别为0.2ml/h和0.4ml/h，接收距离为15cm；
61.步骤3：将步骤2所得纤维膜置于真空干燥箱中干燥一周后置于75％乙醇中浸泡30min；
62.步骤4：将步骤3所得的纤维膜置于浓度为5mg/ml单宁酸溶液中，静置存放4小时后取出，用去离子水轻轻冲洗两次，得到接枝单宁酸的纤维膜；
63.步骤5：将步骤4所得接枝单宁酸的纤维膜置于浓度为1mg/ml ll-37肽的溶液中，于4℃静置存放12小时后取出，用去离子水轻轻冲洗两次，得到经单宁酸和ll-37肽改性的纤维膜。
64.实施例4
65.一种联合多酚和抗菌肽的纤维膜的制备方法，原料包括山东济南岱罡生物科技有限公司的聚乳酸-羟基乙酸，深圳光华伟业股份有限公司的聚己内酯，生工生物股份有限公司的鱼胶原，阿拉丁公司的单宁酸、黄芩苷、六氟异丙醇和三氟乙醇，南京杰肽生物科技有限公司的ll-37肽，具体步骤如下：
66.步骤1：称取0.015g黄芩苷分散于1ml三氟乙醇中，称取0.12g聚己内酯并加入到所得分散液中，用恒温振荡器震荡摇匀45min，得纺丝液a，称取0.08g鱼胶原分散于2ml六氟异丙醇中，称取0.4g聚乳酸-羟基乙酸并加入到所得分散液中，用恒温振荡器震荡摇匀60min，得纺丝液b；
67.步骤2：将步骤1所得纺丝液a和b分别装入5ml注射器中，并分别置于静电纺丝机的两个推注装置，纺丝液a和b分别与同轴针头的内层和外层相连接，通过静电纺丝制备鱼胶原/聚乳酸-羟基乙酸/聚己内酯-黄芩苷复合纤维膜，采用平板接收器，纺丝电压为7kv，纺丝液a和b的推注速度分别为0.2ml/h和0.4ml/h，接收距离为15cm；
68.步骤3：将步骤2所得纤维膜置于真空干燥箱中干燥一周后置于75％乙醇中浸泡30min；
69.步骤4：将步骤3所得的纤维膜置于浓度为1mg/ml单宁酸溶液中，静置存放2小时后取出，用去离子水轻轻冲洗两次，得到接枝单宁酸的纤维膜；
70.步骤5：将步骤4所得接枝单宁酸的纤维膜置于浓度为0.5mg/ml ll-37肽的溶液中，于4℃静置存放6小时后取出，用去离子水轻轻冲洗两次，得到经单宁酸和ll-37肽改性的纤维膜。
71.实验例1接枝单宁酸的检测
72.本例对实施例3所得的纤维膜进行如下检测：将鱼胶原/聚乳酸-羟基乙酸/聚己内酯-黄芩苷纤维膜置于浓度为5mg/ml单宁酸溶液中，静置存放4小时后取出，用去离子水轻
轻冲洗两次，得到接枝单宁酸的纤维膜，进一步将接枝单宁酸及未接枝单宁酸的纤维膜置于100mm agno3溶液中12小时。结果如图1所示(其中，图1为表面未接枝单宁酸(图1左)与接枝单宁酸(图1右)的纤维膜在硝酸银溶液中浸泡后的照片)，接枝单宁酸的纤维膜表面生成了棕褐色的沉淀，表明纤维膜表面成功接枝了单宁酸。
73.实验例2形貌和结构观察
74.本例使用扫描电镜对实施例3所得的纤维膜进行观察，通过单宁酸和ll-37肽改性的鱼胶原/聚乳酸-羟基乙酸/聚己内酯-黄芩苷纤维膜的形貌，结果如图2所示，纤维膜呈典型的类细胞外基质结构，纤维表面接枝上ll-37肽的颗粒。
75.实验例3抗菌性能检测
76.本例使用扫描电镜对实施例3所得的纤维膜进行抗菌性能实验，具体步骤如下：
77.步骤1：将直径为1cm的圆片状纤维膜置于24孔细胞培养板中；
78.步骤2：将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌按照106cfu/ml的密度接种至纤维膜上，培养2小时；
79.步骤3：吸弃培养液，用pbs轻轻冲洗两次，用乙醇和叔丁醇混合溶液进行梯度脱水；
80.步骤4：喷金后通过扫描电镜观察纤维膜上细菌形态。
81.结果如图3、4所示，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌体结构在单宁酸和ll-37肽改性的纤维膜表面均受到一定程度的破坏，表面联合单宁酸和ll-37多肽对纤维膜进行改性赋予了纤维膜较好的抗菌性能。
82.实验例5骨组织再生性能检测
83.将单宁酸和ll-37多肽改性的纤维膜(实施例3)植入大鼠颅骨极限缺损模型中，12周后观察颅骨修复效果，micro-ct重建结果如图5所示，缺损区有大量新生骨形成，几乎完全覆盖缺损区，表明制备的多酚联合抗菌肽改性的纤维膜具有很好的引导骨组织再生作用，在骨组织工程领域具有广阔的应用前景。
84.本例在实施例3制备纤维膜的基础上，采用控制变量法单一改变纤维膜在多酚溶液中浸泡时间和抗菌肽的含量来考察所得纤维膜的骨组织再生性能，发现多酚溶液中浸泡时间过长(＞12小时)极易引起细胞毒性，在多酚溶液中浸泡时间过短(＜1小时)则无法有效与高分子基底材料产生相互作用并进一步接枝抗菌肽，从而大大降低了所得纤维膜的骨组织再生性能；抗菌肽的含量太高(＞10mg/ml)或太低(＜0.5mg/ml)均会影响纤维膜的抗菌性能、细胞相容性、免疫调节性、促血管化成骨作用等生物学性能，降低了所得纤维膜的骨组织再生性能。
85.以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本领域的技术人员不经创造性劳动即对所描述的具体实施例做的修改或补充或采用类似的方式替代仍属本专利的保护范围。