一种EB病毒的中和性抗体及其应用

一种eb病毒的中和性抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及识别eb病毒gp350蛋白的高亲和力单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.eb病毒(epstein-barr virus，ebv)对人体的感染率极高，其潜伏感染与活化与人类多种肿瘤类型的发生密切相关，可引起鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，npc)、胃癌、传染性单核细胞增多症(im)等疾病。ebv已被证明是造成全球人类癌症负担约百分之一的病原体。尤其是，ebv感染与淋巴和上皮来源的肿瘤形成有关。淋巴来源的肿瘤包括地方性伯基特淋巴瘤(ebl)和霍奇金淋巴瘤(hl)，以及上皮来源的鼻咽癌和胃癌。此外，多发性硬化症(ms)是一种涉及ebv感染的炎症性自身免疫性疾病，在经历传染性单核细胞增多症的个体患ms风险较高(ascherio and munger 2010)。
3.gp350是ebv上最丰富的病毒包膜糖蛋白，可以与b细胞表面的受体cr2结合从而引发b细胞感染，从而会形成长期的潜伏感染，从而引起相关的肿瘤疾病的发生。因此，gp350一直是用于开发ebv预防性疫苗的主要抗原。利用gp350的抗体预防和治疗ebv相关疾病的发生近年已经有相关报道，例如us2020/0055924，发明了针对于ebvgp350的单克隆抗体联合其他多肽位点来预防ebv感染和相关疾病的发生；us20200255499(昆士兰医学研究所理事会)发明了名称为“ebv抗体及其用途”，其涉及gp350重组的人源化抗体可应用于针对ebv被动免疫人类和/或治疗或预防ebv相关疾病，同时该抗体或抗体片段也可用于检测爱泼斯坦巴尔病毒；us2021/0115113，发明了名称为“ebv抗体及其用途”，同样涉及gp350重组的抗体、免疫原性肽、缀合物和药物组合物可用于治疗或预防ebv感染和ebv相关病症和疾病。ebv的感染是通过病毒表面的糖蛋白gp350与b细胞表面的受体cr2结合，阻断gp350与cr2的结合可以有效地阻断ebv感染细胞，因此，gp350可以作为靶向治疗ebv相关疾病的理想靶点。
4.双特异性抗体不仅可用于肿瘤治疗，还可运用于病毒的治疗，如hiv、zika和登革热病毒等。双特异性抗体的靶点主要是病毒或者宿主的抗原表位，同时靶向免疫细胞的表位，有利于运用自身的免疫细胞(t细胞、nk细胞、单核巨噬细胞等)杀灭病毒和相关感染细胞。双特异性抗体在抗病毒治疗方面起步较晚，目前未发现ebv相关的双特异性抗体的研究报道，因此，研发双特异性抗体，抑制和清除ebv，治疗ebv相关的肿瘤，是治疗ebv相关疾病的重要的策略。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供新型的中和eb病毒侵染的单克隆抗体，所提供的抗体包括抗体片段(例如单链可变区片段(scfv))和改造的双特异性抗体。还提供了包括特异性结合gp350的抗体、编码抗体的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体以及表达所述核酸分子的分离的宿主细胞。
no：8所示。
25.优选的，所述特异性识别eb病毒gp350蛋白的单链抗体的重链可变区和轻链可变区、cd89单链抗体的重链可变区和轻链可变区可以刚性连接也可以通过连接肽连接。所述连接肽为由gly和ser残基组成的短肽。其中使用最广泛的连接肽的序列为(gly-gly-gly-gly-ser)n，n代表2-50的正整数，优选2-5。本发明一个具体的示例，连接肽选自(gly-gly-gly-gly-ser)3。
26.本发明一个具体的示例所述的双特异性抗体的特异性识别eb病毒gp350蛋白的单链抗体重链可变区氨基酸序列如seq id no:1所示，轻链可变氨基酸序列如seq id no:2所示，重链和轻链可变区之间具有连接肽(gly4ser)3；所述细胞表面特异性抗原或受体为cd89单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列如seq id no：5所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no：6所示，重链和轻链可变区之间具有连接肽(gly4ser)3。
27.本发明还提供了一种重组蛋白，包括本发明所述特异性识别eb病毒gp350蛋白的单克隆抗体或双特异性抗体和协助表达和/或纯化的标签序列。所述的标签序列包括但不限于hfc标签。
28.本发明还提供了一种免疫缀合物，包含本发明所述特异性识别eb病毒gp350蛋白的单克隆抗体或双特异性抗体和效应分子。效应分子包括但不限于毒素、药物或可检测的标记物。所述毒素是具有细胞毒性或抗肿瘤活性的蛋白，包括但不限于相思豆毒蛋白或其变体、蓖麻毒蛋白或其变体、假单胞菌外毒素或其变体、白喉毒素或其变体、肉毒杆菌毒素或其变体。所述药物是具有细胞毒性或抗肿瘤活性的化合物，包括但不限于长春碱、道诺霉素、monomethyl auristatin e,monomethylauristatin f,pyrrolobenzodiazepine dimer,n2
′‑
deacetyl-n2
′‑
(3-mercapto-1-oxopropyl)-maytansine。所述可检测的标记物是可以被同位素分析仪、酶标仪、生物发光检测仪、化学发光检测仪、电化学发光检测仪、荧光分析仪器检测，或裸眼可视化的物质，这些物质包括但不限于放射性同位素(如125i、131i、32p、14c、3h和35s)、可用于检测的酶类(如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等)、荧光蛋白(如绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、别藻蓝蛋白apc、藻红蛋白pe)、生物发光标记物(如萤光素酶)、荧光化合物(如荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲基氨基-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、荧光染料cy3、cy5、稀土无机发光材料、量子点等)、生物素、磁性试剂(例如钆)、电化学发光试剂(如三联吡啶钌)、胶体金。
29.本发明另一目的在于提供一种多核苷酸，编码本发明所述特异性识别eb病毒gp350蛋白的单克隆抗体，重组蛋白或者双特异性抗体。
30.本发明另一目的在于提供一种载体，含有本发明所述的多核苷酸。所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
31.本发明另一目的在于提供一种药物组合物，包括本发明所述特异性识别eb病毒gp350蛋白的单克隆抗体、双特异性抗体、重组蛋白、免疫缀合物、多核苷酸、载体或遗传工程化的宿主细胞中的一种或几种。所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。所述特异性识别eb病毒gp350蛋白的单克隆抗体、双特异性抗体、重组蛋白、免疫缀合物、多核苷酸、载体或遗传工程化的宿主细胞可溶于水性载体，例如缓冲盐水等。还可以含有接近生理条件所需要的可药用辅料，例如ph调节剂和缓冲试剂等，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳
酸钠等。
32.本发明另一目的在于提供本发明所述特异性识别eb病毒gp350蛋白的单克隆抗体、双特异性抗体、重组蛋白、免疫缀合物、多核苷酸、载体或遗传工程化的宿主细胞在制备自身免疫疾病、病毒感染或癌症的治疗药物或诊断试剂中的应用。
33.所述癌症为ebv相关的癌症
34.本发明公开的特异性识别eb病毒gp350蛋白的单克隆抗体还可用于制备嵌合抗原受体(car；也称为嵌合t细胞受体、人造t细胞受体或嵌合免疫受体)。
35.本发明具体实施例中公开了高亲和力的特异性识别eb病毒gp350蛋白的单克隆抗体r1。本发明还公开gp350/cd89双特异性抗体治疗ebv相关b淋巴瘤或t淋巴瘤、nk淋巴瘤的效果。
36.本发明所提供的特异性识别eb病毒gp350蛋白的单克隆抗体可用于多种目的，例如用于肿瘤的分子诊断，在ebv相关肿瘤方面的胶体金试剂盒。所述样品可以为任何样品，包括但不限于来自活组织检查、尸体解剖和病理标本的组织。生物样品还包括组织的切片，例如为组织学目的获取的冷冻切片。生物样品还包括体液，例如血液、血清、血浆、痰、脊髓液或尿。生物样品一般获自哺乳动物，包括人，非人灵长类，小鼠等。同时双特异性抗体可以治疗ebv gp350相关的淋巴瘤。
37.本发明优点：
38.本发明所述的eb病毒中和性抗体r1，不仅具有高效的亲和力，可以有效降低血液中的eb病毒的滴度，还能够阻断gp350和cr2的互作，且能阻断eb病毒进入b细胞。本发明所提供的单克隆抗体具有高效的亲和力，能降低血液中的eb病毒的滴度。本发明所述eb病毒中和性单克隆抗体联合cd89抗体制备的双特异性抗体在体外能强烈杀伤ebv gp350阳性的肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的生长和转移，可用于ebv相关的肿瘤，如移植后淋巴增殖性疾病(post-transplant lymphoproliferative disorders,ptld)、淋巴增殖性疾病(lymphoproliferative disorders,lpd)、单核细胞增多症、嗜血综合征(hlh)、淋巴瘤的预防和治疗。
附图说明
39.图1elisa检测本发明的单克隆抗体r1/r9与gp350重组蛋白(a)和uv-ebv病毒颗粒(b)的结合活性。
40.图2elisa考察本发明的单克隆抗体r1/r9中和gp350和其配体cr2的结合能力。
41.图3流式细胞术考察本发明的单克隆抗体r1/r9中和gp350和其配体cr2的结合能力。
42.图4流式细胞术考察本发明的单克隆抗体r1/r9阻断ebv结合cr2阳性的细胞的能力。
43.图5流式细胞术(a)和qpcr技术(b)考察本发明的单克隆抗体r1阻断ebv感染cr2阳性的细胞的能力。
44.图6基于knob-into-hole技术的双特异性抗体结构构建的gp350/cd89双特异性抗体r1-kh的抗体结构(a)及其sds-page电泳图(b)(左侧为蛋白maker，右侧条带分别为纯化的双特异性抗体二聚体和单体)。
45.图7流式细胞术考察双特异性抗体r1-kh分别与raji和b95-8细胞的结合能力(a)以及双特异性抗体r1-kh与对巨噬细胞thp1细胞及健康人pbmc细胞的结合能力。
46.图8cck8检测双特异性抗体r1-kh对ebvgp350 的肿瘤细胞系的杀伤活性，在效靶比为10:1的条件下，未激活的人pbmc细胞与肿瘤细胞raji(a)和b95-8(b)共孵育，检测r1-kh对肿瘤细胞的杀伤活性。利用cck-8测定细胞中的脱氢酶含量来表示肿瘤细胞的细胞活力。
47.图9本发明的单克隆抗体r1和双特异性抗体r1-kh降低nsg小鼠模型中ebv的血清载量和对实体器官的感染能力(a)qpcr分析第6天和第18天的血液中eb病毒载量的变化；(b)qpcr分析不同器官组织样品中eb病毒感染载量的变化。
48.图10本发明的单克隆抗体r1、双特异性抗体r1-kh体内抑制ebv阳性b淋巴瘤的生长和转移(a)qpcr分析第7天和第14天的血液中raji和b95-8肿瘤细胞的含量水平；(b)qpcr分析不同器官组织样品中肿瘤细胞转移载量的变化；(c)不同处理组小鼠的生命终点的器官组织观察图；(d)双特异性抗体r1-kh处理后小鼠的生存期变化。
具体实施方式
49.本发明公开描述了结合gp350的单克隆抗体的制备和鉴定。具体的实施方案公开了靶向gp350的中和性单克隆抗体的表征。本发明公开的具体数据证明了这些抗体以高亲和力结合eb病毒和相关肿瘤细胞表面相关的gp350。本发明所述单克隆抗体联合cd89抗体制备的双特异性抗体在体外能强烈杀伤ebvgp350阳性的肿瘤细胞，为抗肿瘤药物开发提供了实验依据。
50.下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明，应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在本发明中使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
51.下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
52.缩写
53.cdr互补决定区
54.ctl细胞毒性t淋巴细胞
55.elisa酶联免疫吸附测定
56.facs荧光激活细胞分选
57.ebvgp350eb病毒糖蛋白350
58.pfu菌落形成单位
59.hfc人fc
60.mab单克隆抗体
61.hrp辣根过氧化酶
62.apc别藻蓝蛋白
63.实施例1：本发明所述ebvgp350单克隆抗体的制备
64.本实施例描述了针对eb病毒的糖蛋白gp350的高亲和力中和性单克隆抗体的生成。
65.将2只6周左右(体重大约2kg)的新西兰大白兔用重组的gp350蛋白免疫，每14天免疫一次，免疫3次后，采集兔的脾脏，提取脾脏中的总rna，逆转录为cdna，构建噬菌体展示的抗体文库，经过4轮亲和筛选后，获得特异性结合gp350的单克隆r1和r9。
66.所述r1抗体的重链可变区氨基酸序列如seq id no:1所示，轻链可变氨基酸序列如
67.seq id no:2所示。
68.所述的r9抗体的重链可变区氨基酸序列如seq id no:3所示，轻链可变氨基酸序列如seq id no:4所示。
69.r1与r9的vh与vl中间引入(gly4ser)3(简写作(g4s)3)氨基酸序列接头的连接肽。
70.表1单克隆抗体的cdr氨基酸序列(根据kabat和imgt)
[0071][0072]
实施例2：本发明所述单克隆抗体r1的结合活性测定
[0073]
将r1/r9单克隆抗体的scfv与flag标签序列或hfc融合，并在哺乳动物细胞293f中表达。表达产物经过纯化后，采用夹心elisa方法测试纯化的抗体对gp350蛋白和ebv病毒颗粒的结合。将gp350-hfc或ebv颗粒蛋白包被在elisa板上，加入梯度稀释的单抗r1/r9进行孵育，用hrp-鼠抗flag或hrp-羊抗人的抗体来检测r1/r9和gp350以及ebv的结合能力(图1)。结果显示r1、r9和cr2都与重组蛋白gp350和ebv颗粒同样有高度的亲和力，其中r1的结合活性优于r9和cr2
[0074]
实施例3：本发明的单克隆抗体r1的病毒中和活性测试
[0075]
1、本发明的单克隆抗体r1/r9阻断gp350和cr2的结合活性
[0076]
elisa验证单抗体外的中和活性。将gp350-hfc包被在板底，添加梯度稀释的r1-hfc进行结合，加入2μg/ml的重组cr2蛋白，通过检测cr2的结合来判断抗体能否有效的阻断两者结合，结果表明r1/r9能够有效地阻断cr2和gp350的结合，其中r1的中和活性优于r9(图2)。
[0077]
流式细胞术测试r1/r9阻断gp350和cr2的结合。在cr2阴性的上皮细胞a431基础上构建cr2超表达的细胞系g4。将gp350-his标记上生物素，然后与g4共孵育，加入不同浓度的r1抗体进行阻断，最后加入pe标记的抗生物素二抗，检测结合在细胞表面的gp350-his-biotin。结果表明，r1抗体能剂量依赖性地阻断gp350和cr2的结合，r1抗体浓度越高，阻断效果越明显(图3)
[0078]
2、本发明的单克隆抗体r1/r9阻断eb病毒颗粒和cr2的结合活性
[0079]
通过cy5.5 nhs ester标记ebv，将cy5.5-ebv和单克隆抗体r1/r937℃共孵育1小时，然后将其与g4和raji细胞共孵育45min，将细胞收集并用pbs洗两次，通过流式检测cy5.5-ebv结合细胞的能力。结果显示r1、r9和cr2均有中和ebv与a431(cr2)和raji结合的能力，r1相较于r9或cr2更能有效地阻断ebv与cr2阳性细胞的结合(图4)3、本发明的单克隆
抗体r1/r9阻断eb病毒颗粒感染cr2阳性的细胞
[0080]
将cy5.5-ebv与不同浓度的r1-hfc 37℃共孵育30min，将1*10^6raji加入到相应孵育好的ebv/r1-hfc混合物中，37℃共孵育60min。将细胞收集并用pbs洗两次，再用新的rpmi1640培养48h。经流式细胞分析(a)和qpcr分析(b)感染效率。(a)通过流式检测raji细胞中的细胞中的荧光强度。(b)qpcr技术检测单抗中和ebv感染raji细胞。通过检测细胞基因组中ebv的拷贝数来确定中和活性。结果显示r1相对于未加抗体阻断的荧光密度降低了58.09％，而cr2和r9中和能力则依次降低，同时通过qpcr分析显示了r1在100μg/ml的浓度下能够有效地阻断ebv感染raji细胞。结果表明，r1能够明显降低eb病毒感染raji细胞，且活性优于r9(图5)。
[0081]
实施例4利用本发明的单克隆抗体r1构建gp350/cd89双特异性抗体r1-kh
[0082]
1、双特异性抗体的制备与表达
[0083]
双特异性抗体为igg形态，可变区分别为本发明的单克隆抗体r1的scfv和cd89特异性抗体的scfv。所述cd89单克隆抗体的vh氨基酸序列如seq id no：5所示，vl氨基酸序列如seq id no：6所示，重链和轻链可变区之间具有连接肽(gly4ser)3；hfc(knob)的氨基酸序列如seq id no：7所示，hfc(hole)的氨基酸序列如seq id no：8所示。cd89单链抗体的vh
cd89
和vl
cd89
片段之间引入(gly4ser)3(简写作(g4s)3)氨基酸序列。编码r1的scfv与hfc(knob)融合，编码cd89抗体的scfv与hfc(hole)融合，如图6a所示。
[0084]
将编码r1-hfc(knob)和cd89抗体-hfc(hole)的表达载体质粒按1:1混合，瞬时转染到hek-293f细胞中。每6
×
108个细胞转染600μg混合质粒。转染后培养细胞约6-8天，期间需要每日检测细胞存活率，当细胞存活率低于85％时收取培养基上清。离心，收集上清液，然后用protein a柱子亲和层析，纯化双特异性抗体，sds-page检测双特异抗体的纯度，结果显示，双特异性抗体两者单体大小约为50kd，形成二聚体蛋白约为100kd，结果表明所表达的双特异性抗体大小符合预期蛋白大小(图6b)。
[0085]
2、gp350/cd89双特异性抗体r1-kh与靶细胞的结合特异性测试
[0086]
将纯化的双特异性抗体r1-kh分别与ebv阳性的细胞(raji和b95-8)和cd89阳性的巨噬细胞thp1以及未激活的人外周血单形核细胞(pbmc)进行结合，加入pe标记的羊抗人的二抗，检测结合至细胞表面上的抗体。结果如图7a-b所示，r1-kh能很强地结合raji、b95-8、thp1和pbmc，说明gp350/cd89双特异性抗体r1-kh既能特异性地识别并结合细胞表面的gp350蛋白，又能结合到含有cd89蛋白的巨噬细胞。
[0087]
3、gp350/cd89双特异性抗体r1-kh介导的对肿瘤细胞的杀伤作用
[0088]
未激活的pbmc作为免疫效应细胞(effector cell)，不同的肿瘤细胞作为靶细胞(target cell)，将效应细胞：靶细胞按10:1的比例混匀，再加入不同浓度的r1-kh双特异抗体，共孵育36h，利用cck-8测定活细胞中的脱氢酶含量来定量分析肿瘤细胞的存活率。双特异抗体r1-kh在一定浓度范围内对肿瘤细胞raji和b95-8均具有明显的杀伤活性(图8a-b)。
[0089]
实施例5本发明的单克隆抗体r1和双特异性抗体r1-kh均能有效降低血液和实体器官中的eb病毒载量
[0090]
采用小鼠感染模型，将ebv(b95-8株，10μg/mice)和10
×
106pbmc通过尾静脉注射到小鼠体内，然后通过单抗r1-hfc(50mg/kg)和双特异抗体r1-kh(5mg/kg)进行治疗，并在接毒后第6天和第18天，通过尾静脉取血检测eb病毒在外周血中的载量，并于接毒后第42天
处死小鼠，分析各组织器官中的病毒载量。结果如图9所示，单抗r1-hfc和双特异抗体r1-kh均能有效地降低血液和各组织器官中的eb病毒载量，双特异性抗体r1-kh在注射浓度低的情况下效果优于单克隆抗体r1。
[0091]
实施例6本发明的双特异抗体r1-kh对ebv阳性淋巴瘤的治疗活性
[0092]
实验采用nsg荷瘤小鼠治疗模型。通过尾静脉注射ebv阳性的raji和b95-8淋巴瘤细胞。2小时后，尾静脉注射5
×
106人pbmc细胞，3小时后，再注射r1-kh(5mg/kg)进行治疗，并在接瘤后第1、7、14和21天以尾静脉注射的方式补充pbmc，同时每隔3天注射双特异抗体r1-kh进行治疗。在结瘤后第7和14天，尾静脉取血，分析血液及各组织器官中的eb病毒载量(gp350的基因拷贝数)，并统计治疗后小鼠的生存期。结果如图10所示，双特异抗体r1-kh能够有效地清除血液和各组织器官中的ebv病毒，并能抑制淋巴瘤细胞的生长和转移。