基于结构片段的药物筛选方法、四环二萜类化合物及应用

1.本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种基于结构片段的药物筛选方法、四环二萜类化合物及应用。


背景技术：

2.药物研发领域一直都是立足于人类健康大事业的重点领域，自二十世纪九十年代组合化学兴起以来，各国药物研究人员随即花费大量人力物力致力于基于组合化学的药物研发，但是近年来的产出却没有预想中那么高。天然产物及其衍生物一直是药物研发领域工作者重点关注的对象，通过1981-2014年这35年fda批准的新药的数据分析可以发现，有近63％的新药源自于天然产物或基于天然产物开发而来，该数据直接体现了天然产物药物在药物发现领域中的重要性。虽然组合化学已经体现了其良好的应用前景，但是天然产物在新药研发事业中仍然具有不可忽视的作用和无法替代的地位。因此，通过与天然产物药物结合的方式，将组合化学应用到新药研发中具有巨大的应用前景。
3.在天然药物的研发中，传统的筛选方法是采用高通量筛选(high throughput screening,hts)。高通量筛选是基于庞大的天然化合物库和药物作用靶点之间的相互结合的体外模拟，再以模拟的结果对化合物进行验证的方法。传统的高通量筛选方法存在很多弊端，比如筛选得到的结果质量差，采用hts往往能够得到许多目标化合物，而在这些化合物里面绝大多数都是无效化合物；筛选的过程复杂费时，hts的过程往往伴随着多个过程，而每个过程都需要对得到的大量靶标化合物进行一一验证，对检验方法要求极高，且耗时费钱；筛选的理论也不完全理性，仅仅是通过模拟软件对化合物与靶标蛋白进行模拟结合来筛选庞大的化合物库，会出现大量的假阳性结果。
4.基于结构片段的药物发现(fragment-based drug discovery,fbdd)作为hts的替代方法出现在上世纪90年代，并且在出现之后迅速地成为了天然产物药物研发中强有力的筛选方法。fbdd主要由两个模块组成：检测板块和化合物库板块。fbdd的核心在于化合物药物的碎片化，通过对药物合理的碎片化，甚至将药物分解成离散的官能团，然后通过配体结合的计算分析方法筛选不同的药效结构的高亲和力元件。通过对高亲和力元件的结合位点进行适当优化，然后并入单个实体分子以产生具有高亲和力的化合物。
5.fbdd的方法比hts的方法更有效，更容易得到具有生物活性的小分子药，这在前人的研究中早已得到了体现。fbdd的方法除了能克服hts的弊端外，还有许多其他的优点。fbdd的操作对象是结构片段库，相比于复杂的化合物结构，分子片段更简单，结构碎片库远小于化合物库；另外，通过对分子碎片库的筛选再重组也可以产生更多的化学多样性。此外，对具有高亲和力的药效结构片段的筛选可以增加药物筛选的命中率，有研究表明，fbdd要比hts的命中率高10-1000倍。
6.然而基于结构片段的药物发现，通常需要受体蛋白的晶体结构图，然而受体蛋白的确定和纯化代价较大、效率较低，影响了基于结构片段的药物发现的应用。


技术实现要素：

7.针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种基于结构片段的药物筛选方法、四环二萜类化合物及应用，其目的在于通过对结构片段的观察，选择决定天然产物分子生物活性密切相关的母核结构和多环结构作为标志性结构片段，无需确知受体蛋白的晶体结构，进行化合物结构筛选，由此解决现有的基于结构片段的药物发现方法需要受体蛋白的晶体结构图来确定标志性结构片段，成本高、代价大且效率低的技术问题。
8.为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种基于结构片段的药物筛选方法，其包括以下步骤：
9.(1)将具有特定生物活性的待改进分子作为先导分子，将其分子结构进行碎片化分解为结构片段，筛选出母核结构作为母核筛选标志结构片段，筛选出多环结构作为结合筛选标志结构片段；
10.(2)分别以步骤(1)获得的母核筛选标志结构片段以及一个或多个结合筛选标志结构片段作为筛选条件，在天然产物数据库中搜索包含所述筛选条件所有筛选标志结构片段的化合物的集合作为备选原料分子集合；
11.(3)从步骤(2)中获得的原料分子集合中挑选一个或多个原料分子，与步骤(1)获得的先导分子进行比较，将原料分子进行官能团修饰获得一个或多个设计分子，使得设计分子与先导分子的结构相似性高于原料分子和先导分子的结构相似性。
12.优选地，所述基于结构片段的药物筛选方法，其多环结构为共享3个及以上原子的多环结构，尤其是共享3个及以上碳原子的多环结构。
13.优选地，所述基于结构片段的药物筛选方法，其所述多环结构为共享6个及以上碳原子的多环结构、优选为共享8个及以上碳原子的多环结构。
14.优选地，所述基于结构片段的药物筛选方法，其步骤(3)所述从原料分子集合中挑选原料分子为：
15.根据影响成药前景的指标，例如宿主中的生物含量，按照成药前景较好则优先选择的原则挑选原料分子。
16.优选地，所述基于结构片段的药物筛选方法，其步骤(3)所述使得设计分子与先导分子的结构相似性高于原料分子和先导分子的结构相似性，具体步骤如下：
17.通过分析先导分子的生理模型或分子对接模型筛选确定先导分子的活性官能团，与原料分子相比较，获得具有差异的活性官能团，将所述具有差异性的官能团构建在所述原料分子母核的相应位置。
18.按照本发明的另一个方面，提供了所述的基于结构片段的药物筛选方法获得的设计分子，其具有式(1)所示的母核结构和式(2)所示的多环结构；
[0019][0020]
优选地，所述设计分子为：15-羰基-甜菊醇。
[0021]
按照本发明的另一个方面，提供了所述的设计分子的应用，其特征在于，应用于制备抗炎症药物或抗代谢综合征药物。
[0022]
优选地，所述设计分子的应用，其应用于制备抗急性腹膜炎药物、抗急性痛风性关节炎药物、抗慢性炎症药物，以及用于制备包括神经退行性疾病在内的nlrp3炎症小体介导的炎症相关疾病治疗药物。
[0023]
优选地，所述设计分子的应用，其应用于制备肥胖症和ⅱ型糖尿病治疗药物。
[0024]
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
[0025]
本发明提供的基于结构片段的药物筛选方法，无需受体蛋白结晶图，可通过结构分析，较为准确的确定影响化合物活性或者经改造具有成药潜力的天然产物分子的结构片段，能提高药物分子开发的效率，降低药物分子筛选的成本。
[0026]
优选方案，结合其他影响成药前景的指标，例如宿主中的生物含量，进行原料分子挑选，可以进一步提高药物筛选的理性，提高药物开发成功率。
[0027]
以冬凌草甲素(oridonin,ori)为先导分子，设计的药物分子，具有明显的抗炎尤其是抗慢性炎症的活性、以及具有抗代谢综合症，例如肥胖、ii型糖尿病的活性。尤其是15-羰基-甜菊醇，能应用于制备抗急性腹膜炎药物、抗急性痛风性关节炎药物、抗慢性炎症药物，以及用于制备包括神经退行性疾病在内的nlrp3炎症小体介导的炎症相关疾病治疗药物。
附图说明
[0028]
图1本发明实施例1提供的基于先导化合物的设计方法流程图。
[0029]
图2是实施例1提供的先导分子冬凌草甲素(oridonin,ori)的结构式；
[0030]
图3是具有显著抗肿瘤和/或抗炎和/或抗菌等活性的天然二萜类化合物结构，分别为ori、半边旗5f、半边旗6f以及香茶菜甲素。
[0031]
图4是实施例1中先导分子ori母核结构和生物活性结构的提取。
[0032]
图5是实施例1中基于ori的结构碎片的天然产物的筛选。(a)ori结构碎片。(b)根据结构碎片在天然产物库coconut(天然产物总数422966个)中筛选并构建相应的子碎片集label 1(天然产物数1584个)和label 2(天然产物数1654个)，并取label 1和label 2的交集为候选化合物库(candidate)(天然产物数1033个)。(c)结合生物含量分析有效候选化合物筛选得到的甜菊糖苷分子结构式。
[0033]
图6是实施例1中候选小分子甜菊糖苷的结构修饰方案。
[0034]
图7是实施例1提供的st-2结构鉴定结果图，其中a为核磁共振氢谱，b为核磁共振碳谱。
[0035]
图8是实施例1提供的st-3结构鉴定结果图，其中a为核磁共振氢谱，b为核磁共振碳谱。
[0036]
图9是实施例1提供的st-4结构鉴定结果图，其中a为核磁共振氢谱，b为核磁共振碳谱。
[0037]
图10是实施例1提供的st-5结构鉴定结果图，其中a为核磁共振氢谱，b为核磁共振碳谱。
[0038]
图11是实施例1提供的st-6结构鉴定结果图，其中a为核磁共振氢谱，b为核磁共振碳谱。
[0039]
图12是实施例1中st-4和st-2对bmdms细胞中nlrp3炎症小体激活的影响。脂多糖(lipopolysaccharides,lps)(200ng/ml)提前预处理bmdms细胞3h后，加入不同化合物处理30min，模型组加入等量溶剂处理，再加入nigericin(10μm)处理30min。通过酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,elisa)检测上清中il-1β含量。
[0040]
图13是实施例2中st-4和st-2对肿瘤细胞活力的影响。(a)、(b)、(c)分别是st-2对于不同肿瘤细胞系a549、hepg2、mcf-7活力的影响。(d)、(e)、(f)分别是st-4对于不同肿瘤细胞系a549、hepg2、mcf-7活力的影响。
[0041]
图14实施例2中st-4和st-2对巨噬细胞活力的影响。(a)、(b)分别是st-2对于永生化骨髓来源的巨噬细胞(immortalized bone marrow-derived macrophages,ibmdms)、thp-1细胞活力的影响。(c)、(d)分别是st-4对于ibmdms、thp-1细胞活力的影响。
[0042]
图15是实施例3中st-4对bmdms细胞中nlrp3炎症小体激活的影响。(a、c-e)lps(200ng/ml)提前预处理bmdms细胞3h后，加入不同浓度st-4(0.5、1、2μm)处理30min，模型组加入等量溶剂处理，再加入nigericin(10μm)处理30min。elisa检测细胞培养上清中il-1β、il-18、il-6和tnf-α含量。(b)lps(200ng/ml)提前预处理bmdm细胞3h后，加入不同浓度st-4(0.5、1、2μm)处理30min，模型组加入等量溶剂处理，再加入nigericin(10μm)处理30min。利用蛋白质免疫印迹(western blot,wb)检测细胞培养上清(sn)中il-1β和caspase-1表达情况，细胞裂解液(input)中il-1β前体(pro-il-1β)、caspase-1前体(pro-caspase-1)和β-tublin的表达情况。
[0043]
图16是实施例3中st-4对腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,atp)和单钠尿酸盐(monosodium urate,msu)引起的nlrp3炎症小体激活的影响。lps(200ng/ml)提前预处理bmdms细胞3h后，加入不同浓度st-4(0.5、1、2μm)处理30min，模型组加入等量溶剂处理，再加入atp(2.5mm)(a)处理30min或msu(200μg/ml)(b)处理6h。通过elisa检测细胞培养上清中il-1β含量。
[0044]
图17是实施例3中st-4对lps激活的nf-κb信号通路的影响。(a)lps(200ng/ml)提前预处理bmdms细胞3h后，加入不同浓度st-4(0.5、1、2μm)处理30min。或者先加入不同浓度的st-4(0.5、1、2μm)处理bmdms细胞30min，再加入lps(200ng/ml)处理3h。模型组加入等量溶剂处理，再加入nigericin(10μm)处理30min。wb检测细胞培养上清(sn)中il-1β和caspase-1表达情况，细胞裂解液(input)中nlrp3、asc、il-1β前体(pro-il-1β)、caspase-1前体(pro-caspase-1)和β-tublin的表达情况。(b-c)lps(200ng/ml)提前预处理bmdms细胞3h后，加入不同浓度st-4(0.5、1、2μm)处理30min。或者先加入不同浓度的st-4(0.5、1、2μm)处理bmdms细胞30min，再加入lps(200ng/ml)处理3h。模型组加入等量溶剂处理，再加入nigericin(10μm)处理30min。通过elisa检测细胞培养上清中il-1β和tnf-α含量。
[0045]
图18是实施例4中st-4对msu诱导的小鼠急性腹膜炎的影响。(a-c)腹腔注射msu晶体(1mg/mouse)诱导急性腹膜炎，注射msu前30min腹腔注射st-4(20mg/kg)或者oridonin(20mg/kg)，对照组注射等体积的溶剂，诱导6h。通过elisa检测小鼠血清(a)和腹腔灌洗液(b)中il-1β含量，以及通过血常规检测腹腔灌洗液中性粒细胞数量(c)。
[0046]
图19是实施例4中st-4对msu诱导的痛风性关节炎的影响。(a)关节注射st-4
(20mg/kg)或者ori(20mg/kg),对照组注射等体积的溶剂，30min后注射msu晶体(0.5mg/mouse)，记录不同时间点的关节大小。(b)取出关节进行培养24h，elisa检测关节培养上清中il-1β含量。(c)msu诱导24h后小鼠的关节肿胀。
[0047]
图20是实施例4中st-4对高脂饲料(high fat diet,hfd)诱导的肥胖小鼠体重和摄食量的影响。(a)st-4给药干预期间每天的体重变化。(b-c)st-4给药干预6周的hfd诱导16周的肥胖小鼠的体重(b)和摄食量(c)。
[0048]
图21是实施例4中st-4对hfd诱导的ⅱ型糖尿病小鼠的血糖水平以及血糖耐受性和胰岛素敏感性的影响。(a-b)st-4给药干预hfd诱导16周的ⅱ型糖尿病小鼠6周后小鼠的空腹血糖(a)和饲喂血糖(b)。(c-d)st-4给药干预hfd诱导16周的ⅱ型糖尿病小鼠6周后小鼠的血糖耐受性(gtt)(c)和胰岛素敏感性(itt)(d)。
[0049]
图22是实施例4中st-4对hfd诱导的肥胖小鼠的病理状态的影响。(a)st-4给药干预hfd诱导16周的肥胖小鼠6周后小鼠的体型(1：ncd vehicle，2：hfd vehicle，3：hfd oridonin(3mg/kg)，4：hfd st-4(2.5mg/kg)，5：hfd st-4(5mg/kg)，6：hfd st-4(10mg/kg))。(b-c)st-4(2.5mg/kg)给药干预hfd诱导16周的肥胖小鼠6周后小鼠的肝脏组织(b)和白色脂肪组织(c)的h&e染色，标尺，50μm。
[0050]
图23是实施例4中st-4对正常瘦鼠的体重和摄食量的影响。(a)st-4给药干预期间每天的体重变化。(b-c)腹腔注射st-4(10mg/kg)15天后的正常瘦鼠的体重(b)和摄食量(c)。
[0051]
图24是实施例4中st-4对高脂饲料诱导的nlrp3-/-基因缺陷型代谢紊乱小鼠的体重和摄食量的影响。(a)st-4给药干预期间每天的体重变化。(b-c)st-4给药干预6周的hfd诱导16周的nlrp3-/-肥胖小鼠的体重(b)和摄食量(c)。
[0052]
图25是实施例4中st-4对hfd诱导的nlrp3-/-基因缺陷型代谢紊乱小鼠血糖的影响。(a-b)hfd诱导16周的nlrp3-/-基因缺陷型代谢紊乱小鼠，st-4给药干预6周后小鼠的空腹血糖(a)和饲喂血糖(b)。(c-d)hfd诱导16周的nlrp3-/-基因缺陷型代谢紊乱小鼠，st-4给药干预6周后小鼠的血糖耐受性(gtt)(c)和胰岛素敏感性(itt)(d)。
[0053]
图26是实施例4中st-4对hfd诱导的nlrp3-/-基因缺陷型代谢紊乱小鼠肝脏和脂肪的影响。hfd诱导16周的nlrp3-/-基因缺陷型代谢紊乱小鼠，st-4给药干预6周后小鼠的肝脏组织和脂肪组织的h&e染色，标尺，50μm。
[0054]
图27是实施例4中st-4对hfd诱导的代谢紊乱小鼠中nlrp3炎症小体依赖的慢性炎症的影响。(a-c)hfd诱导16周的wt小鼠和nlrp3-/-基因缺陷型小鼠，st-4给药干预6周后小鼠血(a)、肝脏组织(b)和脂肪组织(c)中il-β的含量。(d)hfd诱导16周的wt小鼠和nlrp3-/-基因缺陷型小鼠，st-4给药干预6周后，wb检测小鼠脂肪组织中caspase-1的表达情况。
[0055]
图28是实施例4中st-4对hfd诱导的代谢紊乱小鼠中全身性炎症水平的影响。(a-c)hfd诱导16周的wt小鼠和nlrp3-/-基因缺陷型小鼠，st-4给药干预6周后小鼠血清(a)、肝脏组织(b)和脂肪组织(c)中tnf-α的含量。(d-f)hfd诱导16周的wt小鼠和nlrp3-/-基因缺陷型小鼠，st-4给药干预6周后小鼠血清(d)、肝脏组织(e)和脂肪组织(f)中mcp-1的含量。
[0056]
图29是实施例4中st-4长期处理对正常小鼠的生理指标的影响。(a)st-4(10mg/kg)腹腔注射期间的体重变化。(b)实验小鼠的初始体重和st-4(10mg/kg)腹腔注射3个月后的小鼠体重。(c)st-4(10mg/kg)腹腔注射三个月小鼠的摄食量。(d-e)st-4(10mg/kg)腹腔
注射三个月后小鼠的空腹血糖(d)和饲喂血糖(e)。
[0057]
图30是实施例4中st-4长期处理对正常小鼠的血生化指标的影响。(a-g)溶剂或者st-4(10mg/kg)腹腔注射三个月后小鼠血清中alt(a)、ast(b)、cre(c)、urea(d)、ldh(e)、alp(f)、t-bil(g)的水平。
具体实施方式
[0058]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0059]
自然界中存在着很多具有很好生物活性的化合物资源，例如广谱性强效抗癌症药物紫杉醇和强效抗疟疾药物青蒿等。但是绝大多数药效显著的天然产物药物的可获得性极差，这也导致很多天然产物药物的应用前景受到了极大的限制。
[0060]
本发明提供了一种基于结构片段的药物筛选方法，包括以下步骤：
[0061]
(1)将具有特定生物活性的待改进分子作为先导分子，将其分子结构进行碎片化分解为结构片段，筛选出母核结构作为母核筛选标志结构片段，筛选出多环结构作为结合筛选标志结构片段；其中：
[0062]
母核结构为一类活性分子所具有共性的基本骨架结构，例如五环三萜结构、四环二萜结构，有机药物的化学组成都是由一个基本母核加上官能团组成的，母核结构是药物特性的基本特征，故宜用作筛选标志结构片段；
[0063]
而多环结构，优选共享3个及以上原子的多环结构，尤其是共享3个及以上碳原子的多环结构，则会给分子带来立体构象，较大程度上决定整个分子的立体形态，从而决定了与活性分子与靶点的相互作用能力，在较大程度上影响其生物学活性，故宜用作筛选标志结构片段；经统计显示，天然产物结构中常见影响活性的立体结构包括：共享6个及以上碳原子的多环结构、共享8个及以上碳原子的多环结构；此处环结构是指在该分子结构内，可通过化学键形成闭合路径的结构，当形成立体结构时，则会出现至少三个环共享c原子的构象，而其中任意两个环回共享至少2个原子，形成多环结构，当立体结构中存在两个环共享3个及以上原子时，称该结构为共享3个及以上原子的多环结构；类似的，当存在两个环共享n个原子时，称该结构为共享n个原子的多环结构。为了更方便的进行结构比较，取多环结构片段中多个环中两两共享原子数目最多的原子数，用于定义多环结构共享的原子数目，例如当第一至第三环共享原子形成立体构象，第一环与第二环共享n1个原子，第二环与第三环共享n2个原子，第一环与第三环共享n3个原子，且n1≥n2≥n3，则称该结构片段为共享n1个原子的多环结构。
[0064]
(2)分别以步骤(1)获得的母核筛选标志结构片段以及一个或多个结合筛选标志结构片段作为筛选条件，在天然产物数据库中搜索包含所述筛选条件所有筛选标志结构片段的化合物的集合作为备选原料分子集合；
[0065]
所述天然产物数据库可为公共数据库，例如coconut(collection of open natural products)，亦可自行收集。可以根据筛选结果，选择适当的结合筛选标志结构片段，如果筛选结果过多，则增加用作筛选条件的结合筛选标志结构片段的数量，反之，则减
少用作筛选条件的结合筛选标志结构片段。
[0066]
(3)从步骤(2)中获得的原料分子集合中挑选一个或多个原料分子，与步骤(1)获得的先导分子进行比较，将原料分子进行官能团修饰获得一个或多个设计分子，使得设计分子与先导分子的结构相似性高于原料分子和先导分子的结构相似性；
[0067]
所述从原料分子集合中挑选原料分子，优选为：
[0068]
根据影响成药前景的指标，例如宿主中的生物含量，按照成药前景较好则优先选择的原则挑选原料分子；
[0069]
所述使得设计分子与先导分子的结构相似性高于原料分子和先导分子的结构相似性，优选具体步骤如下：
[0070]
通过分析先导分子的生理模型或分子对接模型筛选确定先导分子的活性官能团，与原料分子相比较，获得具有差异的活性官能团，将所述具有差异性的官能团构建在所述原料分子母核的相应位置。由于先导分子和原料分子具有相同的母核，因此可确定活性官能团的相应位置，获得设计分子，确保设计分子与先导分子的相似性高于原料分子和先导分子的相似性，即相对于原料分子，设计分子与先导分子更为相似。
[0071]
(4)将所述设计分子进行药物有效性以及安全性实验，从而开发为药物分子。
[0072]
按照本发明提供的基于结构片段的药物筛选方法，筛选一种具有抗炎作用的四环二萜类候选药物化合物，其具有式(1)所示的母核结构和式(2)所示的多环结构；
[0073][0074]
具体为：15-羰基-甜菊醇。
[0075]
该化合物应用于制备抗炎症药物，例如抗急性腹膜炎药物、抗急性痛风性关节炎药物，优选为用于制备抗慢性炎症药物，用于制备包括神经退行性疾病在内的nlrp3炎症小体介导的炎症相关疾病治疗药物；或代谢综合症治疗药物，例如肥胖症和ⅱ型糖尿病.
[0076]
炎症性疾病是人们生活中及其常见的一类疾病，在中医领域炎症通常表现为红、肿、热、痛以及功能紊乱等症状。而在免疫和代谢领域，炎症与多种自身炎症和自身免疫性疾病有关，包括神经退行性疾病以及代谢紊乱疾病等。在慢性炎症反应中，nod样受体蛋白3(nod-like receptor pyrin domain containing 3,nlrp3)炎症小体起关键作用，其与各种慢性疾病紧密关联。来源于中药冬凌草(rabdosia rubescens(hemsl.)hara)的冬凌草甲素(oridonin,ori)是nlrp3炎症小体的特异性抑制剂，它不仅能够在体外高效地抑制nlrp3炎症小体的激活，而且对nlrp3炎症小体关联的几类小鼠炎症性病理模型中表现出很好的治疗作用，但是ori过低的生物含量以及过于复杂的全化学合成限制了其进一步的应用。以ori作为先导分子，按照本发明提供的基于结构片段的药物筛选方法，获得设计分子15-羰基-甜菊醇，具有良好的抗炎活性和成药前景。
[0077]
以下为实施例：
[0078]
以一种四环二萜类化合物为例按照本发明提供的方法获取设计分子，四环二萜类
化合物具有先导分子同样的母核结构，同时还具有和先导分子与靶蛋白的结合位点一样的结构，以及具有先导分子与所述具有类似生物活性的天然产物具有的活性官能团。
[0079]
实施例1应用本发明提供的基于结构片段的药物筛选方法，对先导分子ori进行改进筛选抗炎活性分子，如图1所示，包括以下步骤：
[0080]
(1)将具有特定生物活性的待改进分子作为先导分子，将其分子结构进行碎片化分解为结构片段，筛选出母核结构作为母核筛选标志结构片段，筛选出多环结构作为结合筛选标志结构片段；具体地：
[0081]
选择ori作为待改进的天然产物分子，即先导分子；
[0082]
ori是从唇形科香茶菜属植物冬凌草中提取得到的活性二萜天然产物，结构如图2所示。尽管ori具有很好的抗炎、抗肿瘤等活性，但是ori过低的生物含量和复杂的化学合成途径又严重限制了其应用前景。ori不是一个药物特性优良的药物分子，但是却是一个很好的药物研究先导分子。
[0083]
通过分析ori的化合物分子结构及其发挥抗炎活性与靶蛋白结合的结构位点，提取出ori的母核结构作为母核筛选标志结构片段(label 1)和多环结构作为结合筛选标志结构片段(label 2)，如图3所示。
[0084]
(2)分别以步骤(1)获得的母核筛选标志结构片段以及一个或多个结合筛选标志结构片段作为筛选条件，在天然产物数据库中搜索包含所述筛选条件所有筛选标志结构片段的化合物的集合作为备选原料分子集合；具体地：
[0085]
依据提取的结构碎片与coconut数据库进行模拟比对，以构建相应的结构碎片库，并取结构碎片库的交集作为候选化合物库，进一步通过整理候选化合物基础信息构建有效候选化合物库，即备选原料分子集合；其中以包含label 1结构的有1584个分子，包含label 2结构的有1654个分子，同时包含label1和label2结构的共有1033个分子，组成备选原料分子集合。
[0086]
(3)从步骤(2)中获得的原料分子集合中挑选一个或多个原料分子，与步骤(1)获得的先导分子进行比较，将原料分子进行官能团修饰获得一个或多个设计分子，使得设计分子与先导分子的结构相似性高于原料分子和先导分子的结构相似性；具体地：
[0087]
结合宿主生物含量等分析有效候选化合物的可获得性进行筛选，由于化合物的可获得性制约了成药可能性以及药物制备的成本，本实施例最终优选选择来自于菊科作物甜叶菊的天然二萜衍生物甜菊糖苷作为原料分子，甜菊糖苷的结构如图5所示。
[0088]
通过分析先导分子(ori)与其他类似生物活性的小分子的生理模型或分子对接模型筛选确定前导分子的活性官能团，与有效候选小分子相比较，获得具有差异的活性官能团，并将其引入有效候选小分子中，如图6所示。
[0089]
(4)将所述设计分子进行药物有效性以及安全性实验，从而开发为药物分子。
[0090]
抗炎活性细胞实验：
[0091]
通过模拟小鼠骨髓细胞来源的巨噬细胞(bmdms)中nlrp3炎症小体诱导激活表达分泌炎症因子白细胞介素1β(il-1β)这一炎症生理模型，来筛选并验证设计分子的四环二萜类化合物：15-羰基-甜菊醇(st-4)的抗炎活性。
[0092]
化合物抑制小鼠骨髓细胞来源的巨噬细胞(bmdms)中nlrp3炎症小体诱导激活表达分泌炎症因子白细胞介素1β(il-1β)的药理实验方法与结果：
[0093]
1)小鼠骨髓来源的巨噬细胞(bmdms)的分离与培养:在动物房内，取6周龄的小鼠，颈椎脱臼法处死小鼠，用无菌剪刀将小鼠两条后腿取下，除肌肉剩腿骨，将小鼠尸体及其他垃圾放置于小鼠停尸间。将小鼠腿骨拿到细胞间超净台，将剪刀镊子用75％酒精浸泡，准备培养基，pbs，20ml注射器以及0.65mm的医用针头。用pbs将小鼠腿骨洗三次，将20ml注射器内吸满dmem培养基，并换上0.65mm的医用针头，用镊子夹取骨头，用剪刀从两端剪开，然后用注射器将骨髓吹至50ml离心管，反复多次，直至骨髓全部冲出，骨头由红变白，1500rpm，离心5min。弃上清，用1ml的红细胞裂解液重悬，并反复吹打，然后静置2min裂解红细胞，然后加入正常dmem培养基9ml进行中和，1500rpm，离心5min。弃上清，用含有20ng/ml的m-csf培养基或者l929培养上清的dmem进行重悬(每只鼠40ml培养基重悬，l929培养上清含量30％)，然后转移至non-treated培养皿中进行培养(每皿10ml)。6-7天后，可观察细胞状态，呈长梭形，说明状态良好，可用于后续实验。
[0094]
2)nlrp3炎症小体激活与化合物抗炎活性分析:分化第6-7天的bmdms，弃上清，用pbs洗一次，加入10ml含1％edta的pbs进行消化，1-2min后，用移液器吹打细胞，然后转移至50ml离心管1500rpm离心10min。弃上清，用10ml培养基重悬，然后计数至5
×
106个/ml，然后分板至12孔板，1ml/孔，过夜。配制含有1％fbs以及200ng/ml lps的opti-mem(每孔500μl)，弃上清，加入配制好的培养基进行预刺激，刺激时间为3h。加入药物处理30min。加入刺激剂nigericin(10μm)刺激0.5h。收集上清至1.5ml ep管，13000rpm离心5min去除死细胞，然后转移至新的1.5ml ep管，直接用于elisa检测细胞因子。每个浓度设三复孔，并设pbs作为空白对照，2um浓度ori设为阳性对照，分析不同浓度药物对il-1β表达分泌水平的抑制作用。
[0095]
如图12显示，结果表明st-4对于nlrp3炎症小体活化的抑制作用最好，其表现出来的活性比阳性对照ori效果更好，此外st-6(结构如附图6所示)也显示出与ori相似的抑制效果。
[0096]
实施例2本发明提供的四环二萜化合物st-4及其前体候选小分子对肿瘤细胞和巨噬细胞活力的影响，包括以下步骤：
[0097]
s1、细胞复苏及培养：将水浴锅提前升温至37℃，然后将冻存细胞(a549、hepg2和mcf-7；ibmdms和thp-1)从液氮罐中取出，置于37℃水浴锅中至其融化。细胞融化后将其转移至50ml离心管，然后a549、hepg2、mcf-7和ibmdms加入正常的完全培养基(90％dmem 10fbs 1％双抗)10ml，thp-1细胞加入其专有完全培养基(90％rpmi-1640 10％fbs 1％双抗 0.05mm/lβ-巯基乙醇)轻柔混匀，1000rpm离心5min。弃上清，加入新鲜的正常培养基10ml重悬细胞，然后转移至合适的培养容积中，置于细胞培养箱中进行培养。次日观察细胞，如死亡细胞较多，可将细胞培养基进行换液，待细胞丰度为80-90％时，弃培养上清，用pbs洗三次去除残留的培养基，然后加入胰酶消化2min，后加入正常培养基中和，1000rpm离心5min。弃上清，加入10ml正常培养基进行重悬，取2ml用于传代，其余用于实验或者丢弃，用正常培养基补齐至10ml。待细胞传至2-3代状态良好时通过mtt法检测化合物对细胞活力的影响。
[0098]
mtt法检测细胞活力：将待测细胞按照1
×
104细胞/孔接种到96孔细胞培养板中，于37℃、5％co2、100％湿度中培养，待细胞长至80-90％时，加入不同浓度的化合物处理24h，用对应溶剂处理的细胞用作为阴性对照。除去各孔的培养基，用无菌pbs洗涤一遍，然后加入100μl含有mtt的培养基(10ml培养基中含有1mlmtt溶液(5mg/ml))，将细胞放入培养
箱中继续培养4h。吸弃每孔中培养基，加入200μl二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,dmso)，避光处理，轻微振荡10min，通过酶标仪检测570nm和630nm的吸光度。每个化合物进行3次独立实验，计算相对细胞活力(％)：
[0099][0100]
st-4及其前体候选小分子st-2对肿瘤细胞的影响如图13所示，其中前体候选小分子st-2如图6中所示，结果显示不具有d环烯酮结构的st-2对这三种癌细胞的活力都没有影响，而形成d环烯酮结构的st-4对这三种肿瘤细胞系均表现出一定的抑制作用(ic50分别为55.39μm、72.13μm、64.07μm)。结果说明st-4在分子结构上形成d环烯酮结构之后，对于a549、hepg2、mcf-7这三种肿瘤细胞系均产生了一定的抑制活性。
[0101]
st-4及其前体候选小分子st-2对巨噬细胞的影响如图14所示，结果显示，st-2对ibmdms和thp-1细胞的细胞活力没有影响；st-4表现出对ibmdms和thp-1细胞的剂量依赖性毒副作用(st-4对于ibmdms和thp-1细胞的ic50值分别为10.15μm、56.19μm)，在高剂量时表现出较强的毒性，而在给药浓度(2μm)及以下，st-4对ibmdms和thp-1细胞的细胞活力影响不大。
[0102]
实施例3本发明提供的四环二萜化合物st-4体外抗炎活性评估：
[0103]
1)小鼠骨髓来源的巨噬细胞(bmdms)的分离与培养:在动物房内，取6周龄的小鼠，颈椎脱臼法处死小鼠，用无菌剪刀将小鼠两条后腿取下，除肌肉剩腿骨，将小鼠尸体及其他垃圾放置于小鼠停尸间。将小鼠腿骨拿到细胞间超净台，将剪刀镊子用75％酒精浸泡，准备培养基，pbs，20ml注射器以及0.65mm的医用针头。用pbs将小鼠腿骨洗三次，将20ml注射器内吸满dmem培养基，并换上0.65mm的医用针头，用镊子夹取骨头，用剪刀从两端剪开，然后用注射器将骨髓吹至50ml离心管，反复多次，直至骨髓全部冲出，骨头由红变白，1500rpm，离心5min。弃上清，用1ml的红细胞裂解液重悬，并反复吹打，然后静置2min裂解红细胞，然后加入正常dmem培养基9ml进行中和，1500rpm，离心5min。弃上清，用含有20ng/ml的m-csf培养基或者l929培养上清的dmem进行重悬(每只鼠40ml培养基重悬，l929培养上清含量30％)，然后转移至non-treated培养皿中进行培养(每皿10ml)。6-7天后，可观察细胞状态，呈长梭形，说明状态良好，可用于后续实验。
[0104]
2)nlrp3炎症小体激活与化合物抗炎活性分析:分化第6-7天的bmdms，弃上清，用pbs洗一次，加入10ml含1％edta的pbs进行消化，1-2min后，用移液器吹打细胞，然后转移至50ml离心管1500rpm离心10min。弃上清，用10ml培养基重悬，然后计数至5
×
106个/ml，然后分板至12孔板，1ml/孔，过夜。配制含有1％fbs以及200ng/ml lps的opti-mem(每孔500μl)，弃上清，加入配制好的培养基进行预刺激，刺激时间为3h。加入不同浓度药物处理30min。加入刺激剂：nigericin(10μm)或atp(2.5mm)，刺激0.5h；或msu(150μg/ml)刺激4h。收样:收集上清至1.5ml ep管；细胞加入100μl sample buffer裂解，然后转移至新的1.5ml ep管，101℃金属浴10min。上清13000rpm离心5min去除死细胞，然后转移至新的1.5ml ep管，可直接用于elisa检测细胞因子，也可浓缩蛋白用于wb，500μl上清加入500μl甲醇和125μl氯仿，混匀，13000rpm，离心5min；此时溶液分层，中间层为蛋白，去除上层溶液，加入500μl甲醇混匀，13000rpm，离心5min；此时蛋白沉淀于下层，去除上清，晾5min除去残余的甲醇溶液，然后加入80μl sample buffer，101℃金属浴，10min，可直接用于wb或者-20℃保存。每个浓度
设三复孔，并设pbs作为空白对照，2um浓度ori设为阳性对照，分析不同浓度药物对il-1β表达分泌水平的抑制作用。
[0105]
通过诱导激活小鼠骨髓细胞来源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,bmdms)中nlrp3炎症小体，检测st-4对相关蛋白因子的表达分泌的影响来评估st-4抑制nlrp3炎症小体激活的效果，elisa分析结果显示，st-4能够以剂量依赖性的抑制il-1β和il-18等炎症因子的分泌(图15a和c)，而对lps诱导的nf-κb信号通路激活的产物il-6和tnf-α没有影响(图15d和e)。wb分析结果也显示，st-4能够以剂量依赖性的抑制caspase-1和il-1β的分泌，而对lps激活的nl-κb信号通路的产物pro-il-1β和pro-caspase-1没有影响(图15b)。结果说明st-4可以剂量依赖性的特异性抑制nlrp3炎症小体的激活，而对nf-κb信号途径没有影响。此外，在bmdms细胞中，st-4也可以剂量依赖性的抑制atp和msu激活的nlrp3炎症小体活化产物il-1β的分泌(图16)。说明st-4可以抑制多种nlrp3炎症小体激活剂引起的nlrp3炎症小体的激活。
[0106]
nlrp3炎症小体的激活过程分为两个阶段，分别为lps诱导的nf-κb信号通路激活阶段和第二刺激信号(nigericin、atp、msu等)诱导的以nlrp3蛋白为骨架结构的nlrp3炎症小体的组装激活阶段。通过比较在加lps之前以st-4干预和在加lps之后以st-4干预的方式，检测两种不同的st-4干预方式对nf-κb信号通路活化的产物的表达和分泌的影响，结果如图17所示。结果显示，在lps处理bmdms细胞之前或者之后加入st-4干预对nf-κb信号通路的激活没有影响，nf-κb信号通路活化的产物nlrp3、asc、pro-caspase-1以及pro-il-1β蛋白前体的表达和炎症因子tnf-α的分泌都没有变化，以及nlrp3炎症小体活化的产物il-1β和caspase-1的分泌也没有发生改变。说明st-4对于lps诱导激活的nf-κb信号通路没有影响，而特异性的抑制以nlrp3蛋白为骨架的nlrp3炎症小体的组装活化阶段。
[0107]
实施例4本发明提供的四环二萜化合物st-4体内抗炎症相关疾病效果验证试验。
[0108]
抗炎症相关疾病效果验证实验方法如下：
[0109]
1)建立msu诱导的小鼠腹膜炎及药物治疗试验
[0110]
试验方法为：取6-8周龄spf雄性c57bl/6小鼠(购于湖北省疾病预防控制中心)和nlrp3-/-基因缺陷型小鼠(华中农业大学动物科学技术学院张安定教授团队馈赠),进行称重,然后进行分组，使每组情况相似。实验组腹腔注射st-4(20mg/kg，溶于dmso)，对照组注射相同体积的溶剂。0.5h后腹腔注射无菌msu晶体(1mg msu，溶于0.5ml无菌pbs)。6h后，眼球取血，血液室温静置60min，然后5000rpm离心10min以收集血清。颈椎脱臼处死小鼠，先用1ml无菌pbs冲洗腹腔,取出腹腔灌洗液后，3000rpm离心5min，上清用来检测细胞因子，沉淀细胞用于检测中性粒细胞数。再用9ml无菌pbs冲洗腹腔，取出腹腔灌洗液，离心去上清，沉淀细胞与上步细胞混合，用于血常规分析中性粒细胞。
[0111]
2)建立msu诱导的小鼠痛风性关节炎及药物治疗试验
[0112]
试验方法为：取6-8周龄spf雄性c57bl/6小鼠(购于湖北省疾病预防控制中心)和nlrp3-/-基因缺陷型小鼠(华中农业大学动物科学技术学院张安定教授团队馈赠),进行称重,然后进行分组,使每组情况相似，并测量左右踝关节的周长。实验组左踝关节注射st-4(20mg/kg，溶于dmso)，对照组左踝关节注射相同体积的溶剂。30min后,左踝关节注射msu晶体(0.5mg，溶于20μl无菌pbs)，右踝关节注射等体积无菌pbs。分别在l，6，12，24h后测量左右踝关节的周长，然后再颈椎脱臼处死小鼠，将左踝关节取出，放置于含有200μl opti-mem
(1％双抗)的12孔板中培养2h。将培养上清用elisa方法检测il-lβ，根据测量的关节周长处理相关数据。
[0113]
3)建立代谢综合征的肥胖小鼠模型及药物治疗实验
[0114]
饲养方法为：6周龄spf级c57bl/6小鼠(购于湖北省疾病预防控制中心)和nlrp3-/-基因缺陷型小鼠(华中农业大学动物科学技术学院张安定教授团队馈赠)以4只/笼饲养于室温22℃的spf动物房中，采用60％卡路里高脂饲料(购于bio-medicine)持续饲喂14-16周，小鼠自由饮食，每两天更换垫料，每周检测体重与血糖。待血糖大于11mmol/l,体重大于42g后开始给药，药物溶解于dmso溶剂中，按2.5，5，10mg/kg三个剂量以腹腔注射给药方式连续给药42天，注射体积为每天25ul，同时设置溶剂(25ul dmso)和3mg/kg阳性药物(ori)对照。每天测定每组小鼠摄食量和体重变化，第0天和第42天监测血常规、血生化参数，同时进行葡萄糖耐受(gtt)和胰岛素敏感(itt)实验；对空白组和st-4处理组小鼠进行病理解剖，观察给药处理前后脏器变化，并取样制备病理切片。
[0115]
建立瘦鼠模型及药物治疗实验
[0116]
饲养和实验方法为：6周龄spf雄性c57bl/6小鼠(购于湖北省疾病预防控制中心)以4只/笼饲养于室温22℃的spf动物房于，采用普通小鼠饲料持续饲喂2周，小鼠自由饮食，每两天更换垫料，每周检测体重与血糖。待体重达到22g后开始给药，药物溶解于dmso溶剂中，给药方式为腹腔注射，注射体积为每天25ul，同时设置溶剂和阳性药物对照。每天监测各组小鼠摄食量和体重。
[0117]
建立瘦鼠st-4长期毒性检测模型
[0118]
试验方法为：取6-8周龄c57bl/6小鼠，进行称重，并检测随机血糖，选取体重和血糖相近的小鼠进行分组，使每组情况相似。实验组小鼠经溶剂处理3天(25μl dmso/day)后腹腔注射st-4(10mg/kg；每次注射量25μl)，对照组注射相同体积的溶剂，每天18:00开始给药，连续给药处理90天，每天记录小鼠体重与摄食量。实验结束后眼球取血，一半血液经抗凝剂(edta二钠)处理，置于冰上，用于血常规检测；另一半血液室温静置60min，然后5000rpm离心10min以收集血清。血清用于血生化检测，分别检测碱性转氨酶(alt)、碱性磷酸酶(alp)、天冬氨酸转氨酶(ast)、乳酸脱氢酶(ldh)、肌酸酐(cre)、尿素(urea)以及总胆红素(t-bil)等因子的含量。
[0119]
通过msu诱导小鼠急性腹膜炎病理模型，并通过腹腔注射st-4干预，通过检测小鼠血清和腹腔积液中il-1β的水平以及腹腔积液里中性粒细胞的水平来评估st-4对于msu诱导的小鼠急性腹膜炎病理模型的治疗效果。如图18所示，结果显示st-4对于msu诱导的小鼠急性腹膜炎病理模型有显著的缓解作用，可以显著的降低小鼠血清和腹腔积液中il-1β炎症因子的水平，以及可以显著降低腹腔积液里中性粒细胞的数量。而在nlrp3基因缺陷型小鼠中，st-4没有表现出这种影响。结果说明st-4对于msu诱导的小鼠急性腹膜炎的抑制作用依赖于nlrp3炎症小体。
[0120]
通过关节注射msu晶体来诱导小鼠急性痛风性关节炎，并通过st-4干预小鼠关节肿胀大小以及关节内il-1β水平来评估st-4对于小鼠急性痛风性关节炎病理模型的治疗效果。如图19所示，结果显示st-4能够缓解msu诱导的小鼠急性痛风性关节炎病理状态，表现为关节肿胀度的明显减小，以及关节内炎症因子il-1β的显著降低。而在nlrp3缺陷型小鼠上，st-4没有作用。结果说明st-4能够缓解msu诱导的小鼠急性痛风性关节炎，并且这种作
用依赖于nlrp3炎症小体。
[0121]
通过hfd诱导小鼠的肥胖症和ⅱ型糖尿病模型，通过hfd饲喂14-16周，并选取造模成功小鼠分组，st-4腹腔注射干预，并通过检测小鼠生理生化等指标来评估st-4对于hfd诱导的小鼠代谢紊乱的药理效果。结果显示，st-4腹腔注射能够显著降低hfd诱导的肥胖小鼠的体重和摄食量(图20)。另外，通过分析模型组和st-4给药组的血糖数据我们发现，st-4干预能够显著降低hfd诱导的ⅱ型糖尿病小鼠的饲喂血糖和空腹血糖，同时能够显著改善hfd诱导的ⅱ型糖尿病小鼠的血糖耐受性和胰岛素敏感性(图21)。此外，通过h&e染色分析小鼠的肝组织和白色脂肪组织细胞形态发现，st-4给药干预能够显著减少hfd诱导的肥胖小鼠肝脏组织中脂肪的堆积(图22b)，以及经过st-4处理后，小鼠的脂肪组织中脂肪细胞比模型组小鼠的脂肪细胞更加小而紧密(图22c)，说明st-4给药能够改善hfd诱导的肥胖小鼠的病理状态。
[0122]
st-4能够影响hfd诱导的肥胖小鼠和ⅱ型糖尿病小鼠的体重和摄食量，那么对于ncd喂养的正常小鼠的体重和摄食量是否有影响？通过腹腔注射来研究st-4对ncd饲喂的瘦鼠的影响，如图23所示，结果显示st-4对ncd饲喂的正常小鼠的体重和摄食量均没有影响。
[0123]
通过hfd饲喂nlrp3-/-基因缺陷型小鼠来诱导其代谢紊乱，并通过腹腔注射st-4来进行药物干预，通过检测模型组和st-4给药组的生理生化指标来评估st-4对hfd诱导的nlrp3-/-基因缺陷型小鼠代谢紊乱的影响。结果显示，st-4高剂量处理组的体重会降低，而st-4低剂量组的体重则没有显著变化(图24a和b)，而与之对应的是摄食量的变化，高剂量组的摄食量显著降低，低剂量组的摄食量显著升高(图24c)。st-4对hfd诱导的nlrp3-/-基因缺陷型代谢紊乱小鼠的血糖的影响结果如图25所示。结果显示st-4处理对hfd诱导的nlrp3-/-基因缺陷型代谢紊乱小鼠的空腹血糖(图25a)和饲喂血糖(图25b)没有显著影响。同时，gtt和itt分析表明，st-4处理组和模型组的血糖耐受性(图25c)和胰岛素敏感性(图25d)也没有区别。另外，肝脏组织和脂肪组织的h&e染色结果显示，st-4对hfd诱导的nlrp3-/-基因缺陷型代谢紊乱小鼠的肝脏组织和脂肪组织没有显著影响(图26)。
[0124]
通过检测代谢紊乱模型组和st-4处理组小鼠的血清、肝脏和脂肪组织中各种炎性因子的水平来评估st-4对于hfd诱导的小鼠全身性炎症水平的影响。结果显示，st-4处理组的c57bl/6小鼠中血清、肝脏和脂肪组织中的il-1β含量有显著的降低，对于脂肪组织的wb分析也显示出st-4能够显著的抑制caspase-1的活化，而与之对应的是st-4对nlrp3-/-基因缺陷型小鼠没有影响(图27)。此外，我们还分析了hfd诱导的代谢紊乱小鼠血清和组织中其他炎性因子的含量，结果同样表现出一致的效果，st-4也可以显著的降低病理模型小鼠血清、肝脏和脂肪组织中炎性因子tnf-α和趋化因子mcp-1的水平，但是对nlrp3-/-基因缺陷型小鼠没有影响(图28)。结果说明，st-4能够抑制hfd诱导的代谢紊乱模型小鼠nlrp3炎症小体依赖的慢性炎症以及缓解模型小鼠的炎症状态。
[0125]
通过对正常小鼠进行长达3个月的溶剂或者st-4(10mg/kg)腹腔注射，并检测溶剂组和st-4处理组的生理生化水平来评估st-4的长期毒性。对溶剂组和st-4处理组的体重、摄食量、空腹血糖以及饲喂血糖等生理指标检测结果显示，溶剂组和st-4处理组的体重、摄食量和血糖等生理指标均没有显著性差异(图29)。另外，通过血生化检测溶剂组和st-4处理组血清的碱性转氨酶(alt)、碱性磷酸酶(alp)、天冬氨酸转氨酶(ast)、乳酸脱氢酶(ldh)、肌酸酐(cre)、尿素(urea)以及总胆红素(t-bil)等各种生化因子的水平。结果同样
显示，溶剂组和st-4处理组血清中各种生化因子水平也没有显著性差异(图30)。结果说明，在注射剂量(10mg/kg)下，st-4对正常小鼠没有毒性。
[0126]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。