磷酸激酶辅助的DNA中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析方法和试剂盒

磷酸激酶辅助的dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析方法和试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种磷酸激酶辅助的dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析方法和试剂盒。


背景技术：

2.5-羟甲基尿嘧啶(5hmu)是一种胸腺嘧啶碱基修饰，存在于从噬菌体到哺乳动物的多种生物基因组中。长期以来，5hmu被认为是胸腺嘧啶被活性氧自由基氧化而产生的dna损伤。酶介导的5hmu核苷酸掺入到噬菌体基因组中表明了5hmu是具有重要的生物学功能的。dna复制后5hmu修饰的形成是通过胸腺嘧啶羟甲基化产生的，在哺乳动物中tet和jbp都可以介导t羟甲基化生成5hmu。还有一种可以产生5hmu的机制，通过aid或者mrna编辑载脂蛋白b(apolipoprotein b mrna-editing catalytic polypeptidelike，apobec)家族蛋白使5hmc脱氨基生成5hmu。胸腺嘧啶羟甲基化生成5hmu可以形成5hmu:a碱基配对，而5hmc脱氨基生成5hmu则可以形成5hmu:g碱基错配。一些研究表明，在小鼠mesc中，5hmu的来源主要是tet蛋白氧化t产生5hmu。仅有很少量的5hmu是通过5hmc脱氨基产生。因此基因组中大部分5hmu的存在形式是5hmu:a碱基配对，而不是5hmu:g碱基错配。研究发现5hmu的含量在小鼠mesc分化过程中是可以动态变化的，这表明了5hmu修饰具有重要的生物学功能。虽然已经有文献报道5hmu可以影响dna-蛋白质间的相互作用和转录因子的结合等生物过程，但是在基因组中5hmu的形成到底起什么样的功能还没有被完全研究透彻。
3.为了揭示5hmu的具体生物学功能，人们需要发展高灵敏度和准确度的方法对基因组中的5hmu修饰进行定位。近年来，研究人员开发了多种定位方法来对基因组中的5hmu修饰进行定位。例如，通过kruo4氧化5hmu生成5-醛基尿嘧啶(5fu)，然后使用酰肼-生物素探针对5hmu进行生物素化从而定位5hmu修饰。然而基因组dna中存在其他类型的醛基，如脱碱基位点也可以和酰肼－生物素探针反应，在定位过程中造成假阳性的结果，最终可能会严重干扰5hmu修饰的精确定位。5hmu通过kruo4氧化转化为5fu，由于5fu中五号位上的醛基的吸电子效应，使5fu能够形成5fu:g的碱基错配。在dna聚合酶延伸的过程中会产生部分的t到c的碱基突变，以此为信号可以对5hmu修饰进行全基因组范围的定位研究。该方法已经通过了标品和实际样品的验证。然而，即使在最优条件下，在5hmu位点的测序过程中也只有大约40％的几率被识别为c，因此该方法需要复杂的生物信息学算法来分析测序数据并识别dna中的5hmu位点。
4.因此，如何建立一种能应用于dna修饰测序领域中，具有富集倍数高的5-羟甲基尿嘧啶修饰定位方法，成为亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

5.为了解决所述技术问题，本发明提供了一种磷酸激酶辅助的dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析方法，富集倍数高。
6.在本发明的第一方面，提供了一种磷酸激酶辅助的dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析方法，所述方法包括：
7.采用5-羟甲基尿嘧啶磷酸激酶5hmudk蛋白对dna进行磷酸化反应，获得磷酸化dna样品；
8.将所述磷酸化dna样品进行点击化学反应以进行生物素标记，获得标记后样品；
9.将所述标记后样品通过链霉亲和素磁珠的富集后进行测序，获得5-羟甲基尿嘧啶的位点信息。
10.进一步地，所述磷酸化反应的温度为36～38℃，所述磷酸化反应的时间为0.5～2h。
11.进一步地，所述磷酸化反应中，反应体系成分包括5-羟甲基尿嘧啶磷酸激酶5hmudk蛋白、dna和反应缓冲液。
12.进一步地，所述反应缓冲液包括终浓度为45～55mm的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)，8～12mm dtt，8～12mm mgcl2和0.5～2mm叠氮-atp。
13.进一步地，所述点击化学反应的温度为36～38℃，所述点击化学反应的时间为1～3h。
14.进一步地，所述点击化学反应的体系包括：dbco-ss-biotin和点击化学反应缓冲液。
15.进一步地，所述点击化学反应的体系包括：0.5～2mm dbco-ss-biotin和8～12％的二甲亚砜水溶液点击化学反应缓冲液。
16.在本发明的第二方面，提供了一种5-羟甲基尿嘧啶磷酸激酶5hmudk蛋白在对dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析中的应用。
17.在本发明的第三方面，提供了一种用于对dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析的试剂盒，所述试剂盒包括：5-羟甲基尿嘧啶磷酸激酶5hmudk蛋白。
18.进一步地，所述试剂盒还包括：反应缓冲液；所述反应缓冲液包括终浓度为45～55mm的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)，8～12mm dtt，8～12mm mgcl2和0.5～2mm叠氮-atp。
19.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
20.本发明提供的磷酸激酶辅助的dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析方法，包括：采用5-羟甲基尿嘧啶磷酸激酶5hmudk蛋白对dna进行磷酸化反应，获得磷酸化dna样品；将所述磷酸化dna样品进行点击化学反应以进行生物素标记，获得标记后样品；将所述标记后样品通过链霉亲和素磁珠的富集后进行测序，获得5-羟甲基尿嘧啶的位点信息。利用5hmudk将带有叠氮基团的磷酸根转移到5hmu上，再利用生物正交反应将5hmu生物素化，最后通过链霉亲和素磁珠的富集和高通量测序的方法对dna中的5hmu修饰进行定位。该方法灵敏度高、选择性高、操作简便，可以有效地对dna中的5hmu修饰进行定位。具备如下优点：
21.(1)本发明的方法操作简便，无需繁琐的样品前处理。
22.(2)本发明无需利用试剂氧化或衍生化试剂标记，极大的缩短了实验的时间。
23.(3)本发明涉及的点击化学反应具有较高的特异性，利于定位分析。相比于正常dna，带有5hmnu的dna富集倍数可以达到170倍。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
25.图1为本发明中5hmudk对5hmu修饰定位示意图；
26.图2为本发明中所用5hmudk的磷酸化标记示意图；
27.图3为本发明中点击化学反应示意图；
28.图4为本发明实施例提供的一种磷酸激酶辅助的dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析方法的流程图；
29.图5为实验例1的富集倍数结果；
30.图6为实验例1的其中一个5hmu位点展示结果。
具体实施方式
31.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
32.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
33.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
34.本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
35.根据本发明实施例一种典型的实施方式，提供一种磷酸激酶辅助的dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析方法，如图4所示，所述方法包括：
36.s1、采用5-羟甲基尿嘧啶磷酸激酶5hmudk蛋白对dna进行磷酸化反应，获得磷酸化dna样品；
37.所述步骤s1中，
38.所述磷酸化反应的温度为36～38℃，所述磷酸化反应的时间为0.5～2h。所述磷酸化反应的温度过低或过高，反应时间过短或过长均不利于磷酸化反应，从而降低灵敏度。
39.所述磷酸化反应中，反应体系成分包括5-羟甲基尿嘧啶磷酸激酶5hmudk蛋白、dna和反应缓冲液。所述反应缓冲液包括终浓度为45～55mm的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)，8～12mm dtt，8～12mm mgcl2和0.5～2mm叠氮-atp。选择上述成分组成的缓冲液的原因提供反应最适条件和保证5-羟甲基尿嘧啶磷酸激酶5hmudk蛋白的活性。
40.在具体的实施方式中，5-羟甲基尿嘧啶磷酸激酶5hmudk蛋白的浓度具体根据实际蛋白的活性来确定。
41.优选地，获得磷酸化dna样品纯化后再进行步骤s2；纯化步骤可以使用乙醇沉淀的方法纯化dna；
42.s2、将所述磷酸化dna样品进行点击化学反应以进行生物素标记，获得标记后样
品；
43.所述步骤s2中，
44.所述点击化学反应的温度为36～38℃，所述点击化学反应的时间为1～3h。该反应条件有利于使点击化学反应效率最大化；
45.所述点击化学反应的体系包括：dbco-ss-biotin和点击化学反应缓冲液。
46.作为一种具体的实施方式，所述点击化学反应的体系包括：0.5～2mm dbco-ss-biotin和8～12％的二甲亚砜水溶液点击化学反应缓冲液。
47.优选地，获得标记后样品纯化后再进行步骤s3；纯化步骤可以使用乙醇沉淀的方法纯化dna；
48.s3、将所述标记后样品通过链霉亲和素磁珠的富集后进行测序，获得5-羟甲基尿嘧啶的位点信息。
49.本技术利用5hmudk将带有叠氮基团的磷酸根转移到5hmu上，再利用生物正交反应将5hmu生物素化，最后通过链霉亲和素磁珠的富集和高通量测序的方法对dna中的5hmu修饰进行定位。该方法灵敏度高、选择性高、操作简便，可以有效地对dna中的5hmu修饰进行定位。
50.根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供了一种5-羟甲基尿嘧啶磷酸激酶5hmudk蛋白在对dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析中的应用。
51.根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供了一种用于对dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析的试剂盒，所述试剂盒包括：5-羟甲基尿嘧啶磷酸激酶5hmudk蛋白。
52.所述试剂盒还包括：反应缓冲液；所述反应缓冲液包括终浓度为45～55mm的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)，8～12mm dtt，8～12mm mgcl2和0.5～2mm叠氮-atp。
53.下面将结合实施例及实验数据对本技术的效果进行详细说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段包括核酸的提取、酶解以及聚合酶链式反应为本领域技术人员所熟知的常规手段。
54.实施例1
55.1、用于对dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析的试剂盒，所述试剂盒包括：
56.5-羟甲基尿嘧啶磷酸激酶5hmudk蛋白。
57.反应缓冲液：包括终浓度为50mm的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)，10mm dtt，10mm mgcl2和1mm叠氮-atp。
58.2、一种磷酸激酶辅助的dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析方法，所述方法包括：
59.(1)商品化合成的含有5hmu的dna0.1ng和布氏锥虫基因组dna 10μg，加入10-20u的5hmudk蛋白，2μl反应缓冲液，加去离子水至反应体系为20μl，在37℃水浴中温育30分钟，随后使用试剂盒纯化dna。
60.(2)取上述反应dna进行点击化学反应，加入1mm的dbco-ss-biotin在37℃水浴中反应2小时，随后使用试剂盒纯化dna。
61.(3)将所述标记后样品通过链霉亲和素磁珠的富集后进行测序，获得5-羟甲基尿嘧啶的位点信息。位点展示结果如图6所示。
62.实施例2
63.1、用于对dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析的试剂盒，所述试剂盒包括：
64.5-羟甲基尿嘧啶磷酸激酶5hmudk蛋白。
65.反应缓冲液：终浓度为45mm的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)，8mm dtt，8mm mgcl2和0.5mm叠氮-atp。
66.2、一种磷酸激酶辅助的dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析方法，所述方法包括：
67.(1)商品化合成的分别含有5hmu的dna 0.1ng和普通基因组dna 10μg，加入一定量的5hmudk蛋白，2μl反应缓冲液，加去离子水至反应体系为20μl，在37℃水浴中温育30分钟，随后使用试剂盒纯化dna。
68.(2)取上述反应dna进行点击化学反应，加入1mm的dbco-ss-biotin在37℃水浴中反应2小时，随后使用试剂盒纯化dna。
69.(3)将所述标记后样品通过链霉亲和素磁珠的富集后进行测序，获得5-羟甲基尿嘧啶的位点信息。
70.实施例3
71.1、用于对dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析的试剂盒，所述试剂盒包括：
72.5-羟甲基尿嘧啶磷酸激酶5hmudk蛋白。
73.反应缓冲液：包括终浓度为55mm的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)，12mm dtt，12mm mgcl2和2mm叠氮-atp。
74.2、一种磷酸激酶辅助的dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析方法，所述方法包括：
75.(1)商品化合成的分别含有5hmu的dna 0.1ng和普通基因组dna 10μg，加入一定量的5hmudk蛋白，2μl反应缓冲液，加去离子水至反应体系为20μl，在37℃水浴中温育30分钟，随后使用试剂盒纯化dna。
76.(2)取上述反应dna进行点击化学反应，加入1mm的dbco-ss-biotin在37℃水浴中反应2小时，随后使用试剂盒纯化dna。
77.(3)将所述标记后样品通过链霉亲和素磁珠的富集后进行测序，获得5-羟甲基尿嘧啶的位点信息。
78.对比例1
79.该对比例为正常的dna，其他操作步骤同实施例1。
80.实验例1、性能测定
81.实施例1和对比例1的dna富集倍数结果如图5所示，表明相比于正常dna，带有5hmnu的dna富集倍数可以达到170倍。
82.最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
83.尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
84.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。