一种虾虹彩病毒PCR检测方法

一种虾虹彩病毒pcr检测方法
技术领域
1.本发明涉及虹彩病毒检测技术领域，具体为一种虾虹彩病毒pcr检测方法。


背景技术：

2.虹彩病毒科包括许多从昆虫和其它一些动物分离的胞浆型dna病毒，最早发现的虹彩病毒是1954年xeros在英国剑桥从沼泽大蚊体内分离到的，以后又分别从金龟甲、带喙伊蚊及蛙和鱼中分离出多种虹彩病毒，虹彩病毒寄生在虾的身上则会形成虾虹彩病毒，目前对于虾虹彩病毒的检测方法有许多，但是在检测虾虹彩病毒时常用试剂盒的检测方法，但是试剂盒的检测方法需要制备试剂盒时不能检查出温度对于试剂的制备影响，为了解决以上问题，现提出一种虾虹彩病毒pcr检测方法。


技术实现要素：

3.为了解决上述技术问题，本发明一种提供虾虹彩病毒pcr检测方法，由以下具体技术手段所达成：
4.本发明为实现技术目的采用如下技术方案：一种虾虹彩病毒pcr检测方法，由以下步骤组成：
5.s1、准备引物组；
6.s2、选取一段dna模板；
7.s3、向dna模板中加入dna聚合酶与核苷酸底物；
8.s4、将s2中的dna模板及其相关酶进行升温至94-100℃；
9.s5、将s3中得到的产物降温至30-36℃；
10.s6、向s4得到产物中加入taqdna聚合酶；
11.s7、向s6得到的产物中加入反转录试剂与pcr扩增试剂，完成制备pcr 试剂后可以大批量的对虾虹彩病毒进行pcr检测。
12.优选的，所述s2中的dna聚合酶为dna聚合酶ⅱ，dna聚合酶ⅱ是一种多酶复合体，有5’—3’聚合酶活性中心和3’—5’外切酶活性中心，但没有5’—3’外切酶活性中心，其催化5’—3’方向合成反应的活性只有dna 聚合酶ⅰ的5％。因该酶缺陷的e.coli突变株的dna复制都正常，所以也不是 dna复制的主要聚合酶，可能是在dna的损伤修复中起到一定的作用。
13.优选的，所述引物组包含5
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acctgtaggctagcaaaccat-3’与5
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ataagctgagtcggactgat-3’。
14.优选的，所述s4中目的双链dna片段解链为单链，目的双链dna片段在 90-100℃的高温下解链为单链。
15.优选的，所述s5中目的基因片段5’与3’端的引物与模板上目的基因的5’、3’端结合，此为“退火”阶段，需要在30-36℃的温度下进行40秒。
16.优选的，所述s6产生一条新的dma片段，反转录试剂包含缓冲液与反转录酶，酶抑
制剂，而pcr扩增试剂里包含pcr扩增缓冲液。
17.有益效果
18.与现有技术相比，本发明提供了一种虾虹彩病毒pcr检测方法及其制备方法，具备以下有益效果：
19.该发明通过先pcr试剂然后将试剂制备成试剂盒，从而方便了对虾虹彩病毒的检测，并且在制备pcr试剂的过程中完成了温度对试剂制备过程中的影响，从而解决了试剂盒的检测方法需要制备试剂盒时不能检查出温度对于试剂的制备影响，从而进一步提高了pcr试剂的制备率，减少了pcr试剂的浪费，进一步地节约了制备试剂的成本。
具体实施方式
20.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.下面通过实施例对本发明做进一步的描述：
22.实施例一：
23.一种虾虹彩病毒pcr检测方法，由以下步骤组成：
24.s1、准备引物组；
25.s2、选取一段dna模板；
26.s3、向dna模板中加入dna聚合酶与核苷酸底物；
27.s4、将s2中的dna模板及其相关酶进行升温至94℃；
28.s5、将s3中得到的产物降温至30℃；
29.s6、向s4得到产物中加入taqdna聚合酶；
30.s7、向s6得到的产物中加入反转录试剂与pcr扩增试剂，完成制备pcr 试剂后可以大批量的对虾虹彩病毒进行pcr检测。
31.其中，所述s2中的dna聚合酶为dna聚合酶ⅱ。
32.其中，所述引物组包含5
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acctgtaggctagcaaaccat-3’与5
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ataagctgagtcggactgat-3’。
33.其中，所述s4中目的双链dna片段解链为单链。
34.其中，所述s5中目的基因片段5’与3’端的引物与模板上目的基因的5’、 3’端结合。
35.其中，所述s6产生一条新的dma片段。
36.实施例二：
37.一种虾虹彩病毒pcr检测方法，由以下步骤组成：
38.s1、准备引物组；
39.s2、选取一段dna模板；
40.s3、向dna模板中加入dna聚合酶与核苷酸底物；
41.s4、将s2中的dna模板及其相关酶进行升温至97℃；
42.s5、将s3中得到的产物降温至30℃；
43.s6、向s4得到产物中加入taqdna聚合酶；
44.s7、向s6得到的产物中加入反转录试剂与pcr扩增试剂，完成制备pcr 试剂后可以大批量的对虾虹彩病毒进行pcr检测。
45.其中，所述s2中的dna聚合酶为dna聚合酶ⅱ。
46.其中，所述引物组包含5
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acctgtaggctagcaaaccat-3’与5
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ataagctgagtcggactgat-3’。
47.其中，所述s4中目的双链dna片段解链为单链。
48.其中，所述s5中目的基因片段5’与3’端的引物与模板上目的基因的5’、 3’端结合。
49.其中，所述s6产生一条新的dma片段。
50.实施例三：
51.一种虾虹彩病毒pcr检测方法，由以下步骤组成：
52.s1、准备引物组；
53.s2、选取一段dna模板；
54.s3、向dna模板中加入dna聚合酶与核苷酸底物；
55.s4、将s2中的dna模板及其相关酶进行升温至100℃；
56.s5、将s3中得到的产物降温至30℃；
57.s6、向s4得到产物中加入taqdna聚合酶；
58.s7、向s6得到的产物中加入反转录试剂与pcr扩增试剂，完成制备pcr 试剂后可以大批量的对虾虹彩病毒进行pcr检测。
59.其中，所述s2中的dna聚合酶为dna聚合酶ⅱ。
60.其中，所述引物组包含5
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acctgtaggctagcaaaccat-3’与5
’ꢀ‑
ataagctgagtcggactgat-3’。
61.其中，所述s4中目的双链dna片段解链为单链。
62.其中，所述s5中目的基因片段5’与3’端的引物与模板上目的基因的5’、 3’端结合。
63.其中，所述s6产生一条新的dma片段。
64.实施例四：
65.一种虾虹彩病毒pcr检测方法，由以下步骤组成：
66.s1、准备引物组；
67.s2、选取一段dna模板；
68.s3、向dna模板中加入dna聚合酶与核苷酸底物；
69.s4、将s2中的dna模板及其相关酶进行升温至94℃；
70.s5、将s3中得到的产物降温至33℃；
71.s6、向s4得到产物中加入taqdna聚合酶；
72.s7、向s6得到的产物中加入反转录试剂与pcr扩增试剂，完成制备pcr 试剂后可以大批量的对虾虹彩病毒进行pcr检测。
73.其中，所述s2中的dna聚合酶为dna聚合酶ⅱ。
74.其中，所述引物组包含5
’‑
acctgtaggctagcaaaccat-3’与5
’ꢀ‑
ataagctgagtcggactgat-3’。
75.其中，所述s4中目的双链dna片段解链为单链。
76.其中，所述s5中目的基因片段5’与3’端的引物与模板上目的基因的5’、 3’端结合。
77.其中，所述s6产生一条新的dma片段。
78.实施例五：
79.一种虾虹彩病毒pcr检测方法，由以下步骤组成：
80.s1、准备引物组；
81.s2、选取一段dna模板；
82.s3、向dna模板中加入dna聚合酶与核苷酸底物；
83.s4、将s2中的dna模板及其相关酶进行升温至94℃；
84.s5、将s3中得到的产物降温至36℃；
85.s6、向s4得到产物中加入taqdna聚合酶；
86.s7、向s6得到的产物中加入反转录试剂与pcr扩增试剂，完成制备pcr 试剂后可以大批量的对虾虹彩病毒进行pcr检测。
87.其中，所述s2中的dna聚合酶为dna聚合酶ⅱ。
88.其中，所述引物组包含5
’‑
acctgtaggctagcaaaccat-3’与5
’ꢀ‑
ataagctgagtcggactgat-3’。
89.其中，所述s4中目的双链dna片段解链为单链。
90.其中，所述s5中目的基因片段5’与3’端的引物与模板上目的基因的5’、 3’端结合。
91.其中，所述s6产生一条新的dma片段
92.性能测试：
93.试验选取五个实施例首先在步骤s5的温度不变的情况下改变步骤s4的温度从而测试pcr试剂的制备率，然后在步骤s4的温度不变的情况下改变步骤s5的温度，从而测试pcr试剂的制备率。实验结果如下表所示：
94.[0095][0096]
上表为步骤s5的温度不变的情况下改变步骤s4的温度从而测试pcr试剂的制备率；
[0097][0098]
上表在步骤s4的温度不变的情况下改变步骤s5的温度，从而测试pcr 试剂的制备率。
[0099]
根据上述表格可以简单的得出实施例二中制备得出的pcr试剂具有较高的制备率，并且可以看出在制备pcr试剂的时候温度的把控十分重要，温度可以影响pcr试剂的制备率的。
[0100]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。