包含志贺菌毒素a亚基支架的pd-l1结合分子
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年6月19日提交的美国临时申请号63/041,288、2020年2月5日提交的美国临时申请号62/970,610、2019年11月8日提交的美国临时申请号62/933,197和2019年9月18日提交的美国临时申请号62/902,243的优先权，其每一个都通过引用整体纳入本文。
3.关于序列表的声明
4.与本技术相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并在此通过引用纳入说明书中。包含序列表的文本文件的名称是mtem_016_04wo_seqlist_st25.txt。该文件约为490kb，创建于2020年9月18日，正在以电子方式提交。
技术领域
5.本技术涉及包含毒素例如催化活性蛋白毒素或其片段的pd-l1结合分子。在一些实施方案中，本文所述的靶向pd-l1的分子可以由于毒素组分的催化活性而杀死表达pd-l1的细胞。在一些实施方案中，本文所述的pd-l1结合分子可以将cd8 t细胞表位递送至表达pd-l1的细胞的mhci类系统。在一些实施方案中，本文所述的靶向pd-l1的分子包含源自天然存在的志贺菌毒素的a亚基的志贺菌毒素效应多肽。在一些实施方案中，本文所述的靶向pd-l1的分子包含志贺菌毒素效应多肽，所述志贺菌毒素效应多肽包含相对于野生型志贺菌毒素的多个氨基酸置换突变。本文所述的pd-l1结合分子可用于(1)在其他细胞中，选择性杀死特定表达pd-l1的细胞类型和(2)作为治疗分子用于治疗多种涉及表达pd-l1的细胞的疾病、紊乱和病症，包括癌症和肿瘤。
背景技术：
6.以下内容包括可能有助于理解本文所述发明的信息。这不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前描述或要求保护的发明相关，或者本文具体或隐含引用的任何出版物或文件是现有技术。
7.pd-l1，程序性细胞死亡配体1(也称为cd274)，在各种恶性肿瘤的肿瘤细胞表面表达。pd-l1可以与t细胞上的免疫检查点受体pd-1结合，抑制t细胞激活信号，导致肿瘤细胞、肿瘤和/或肿瘤微环境中的其他细胞逃避免疫监视，即t-细胞抑制和/或t细胞无反应性。
8.治疗性抗体阻断pd-l1/pd-1信号轴可对某些不同适应症具有临床疗效，并可允许抗肿瘤t细胞超过正常生理条件增殖和/或激活。可能受益于pd-l1靶向试剂的肿瘤适应症包括但不限于肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤、乳腺癌(包括但不限于三阴性乳腺癌，即her2、雌激素受体和孕酮受体阴性的乳腺癌)，以及其他涉及表达pd-l1的细胞的赘生物，例如具有高突变负荷和/或插入缺失频率的肿瘤细胞。因此，pd-l1是递送抗肿瘤剂(包括用于缓解和治疗某些疾病、紊乱和病症的免疫毒素)的靶点。
9.pd-l1也在某些免疫细胞类型的表面上表达。因此，pd-l1是用于将免疫调节剂(包括免疫毒素、免疫原和疫苗)递送至此类免疫细胞以预防、缓解和治疗某些疾病、紊乱和病
症(例如某些免疫紊乱)的推定靶点。
10.pd-l1表达可作为表征细胞类型、组织、疾病、紊乱或病症的诊断标志物。pd-l1表达可以作为诊断标志物，用于选择或分层最有可能对某些疗法或治疗方法有反应的患者，或监测患者在接受治疗方案或其他干预期间或之后的变化。因此，pd-l1是用于诊断检测和表征的靶点，例如，检测或表征能够内化与免疫毒素连接的诊断剂的细胞，所述与免疫毒素连接的诊断剂用于收集关于某些疾病、紊乱和病症状态的信息，包括其治疗的进展和效果。
11.本领域需要开发包含靶向pd-l1的免疫球蛋白结合结构域和毒素组分的分子，以产生靶向pd-l1的分子，所述靶向pd-l1的分子将毒素递送至表达pd-l1的细胞用于治疗或诊断目的。例如，迫切需要新的疗法来补充当今旨在杀死携带pd-l1的赘生物的疗法。
12.因此，希望有结合pd-l1的细胞毒性分子用作治疗和/或诊断分子来治疗和诊断多种疾病，例如癌症和肿瘤，这些疾病可以通过选择性杀死pd-l1阳性细胞或将有益药剂选择性递送到pd-l1阳性细胞中来治疗。特别地，希望具有pd-l1结合、细胞毒性结合分子，其包含表现出低免疫原性、低脱靶毒性和有效的靶向细胞毒性的毒素。此外，希望具有pd-l1靶向治疗和/或诊断分子，其表现出低免疫原性、低脱靶毒性、高稳定性和/或递送肽表位货物(cargo)以通过靶细胞的mhc i类系统呈递的能力。例如，希望具有包含源自志贺菌毒素a亚基组分的pd-l1结合分子，其保持有效的细胞毒性，同时1)降低不需要的抗原性和/或免疫原性的可能性，2)降低非特异性毒性的可能性，和/或3)具有递送肽表位货物以通过靶细胞的mhc i类系统呈递的能力，并且其还对靶细胞表现出有效的基于志贺菌毒素a亚基的细胞毒性。某些靶向人pd-l1的pd-l1结合分子如果不与已经批准的抗pd-l1治疗剂和/或诊断剂竞争结合，可能会提供额外的优势。如果包含毒素(例如免疫毒素)的pd-l1结合分子与pd-l1的结合起到调节pd-l1/pd-1信号轴的作用，则它们可能表现出独特的作用机制。
13.简要概述
14.本文提供了pd-l1结合分子及其组合物的各种实施方案。例如，在一些实施方案中，pd-l1结合分子包含志贺菌毒素a亚基效应多肽和能够特异性结合pd-l1细胞外部分的结合区，其中所述结合区包含(a)重链可变区(vh)和(b)轻链可变区(vl)，其中所述重链可变区(vh)包含(i)包含氨基酸序列eytmh(seq id no：27)的cdr1，(ii)包含氨基酸序列ginpnnggtwynqkfkg(seq id no：29)的cdr2，和(iii)包含氨基酸序列pyyygsredyfdy(seq id no：32)的cdr3；所述轻链可变区(vl)包含(i)包含氨基酸序列sasssvsymy(seq id no：19、)的cdr1，(ii)包含氨基酸序列ltsnlas(seq id no：20)的cdr2，和(iii)包含氨基酸序列qqwssnppt(seq id no：26)的cdr3。
15.本文还提供了药物组合物，其包含本文所述的pd-l1结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
16.本文还提供了编码本文所述的pd-l1结合分子或其补体的多核苷酸，以及包含它们的表达载体或宿主细胞。
17.本文还提供了用于制备本文所述的pd-l1结合分子的方法，所述方法包括表达pd-l1结合分子和回收所述pd-l1结合分子。
18.本文还提供了用于从包含pd-l1结合分子和至少一种其他生物分子的表达系统组合物中纯化本文所述的pd-l1结合分子的方法，所述方法包括(i)使表达系统组合物与细菌蛋白l接触以产生pd-l1结合分子-蛋白l复合物，以及(ii)回收pd-l1结合分子-蛋白l复合
物。
19.本文还提供了用于杀死表达pd-l1的细胞的方法，包括使细胞与根据本文所述的pd-l1结合分子或药物组合物接触的步骤。
20.本文还提供了用于治疗受试者的疾病、紊乱或病症的方法，包括向需要其的受试者施用治疗有效量的本文所述的pd-l1结合分子或药物组合物的步骤。
21.本文还提供了使用免疫疗法治疗患者的癌症的方法，所述方法各自包括向需要其的患者施用本文所述的pd-l1结合分子和/或药物组合物的步骤。
22.本文还提供了治疗癌症的方法，包括向需要其的受试者施用有效量的本文所述的pd-l1结合分子或药物组合物。在一些实施方案中，癌症是以下任意一种：膀胱癌(例如，尿路上皮癌)、乳腺癌(例如，her2阳性乳腺癌、三阴性乳腺癌)、结肠癌(例如，结肠直肠癌，例如转移性微卫星不稳定性-高或错配修复缺陷型结肠直肠癌)、子宫内膜癌、食道癌、输卵管癌、胃肠道癌(如胃癌、胆道肿瘤、胃食管连接部癌)、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(如头颈的鳞状细胞癌)，肾癌(如肾细胞癌)、肝癌(如肝细胞癌)、肺癌(如非小细胞肺癌、小细胞肺癌)、淋巴瘤(如弥漫性大b细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤)、梅克尔细胞癌、间皮瘤(如胸膜间皮瘤)、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)、鼻咽肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜肿瘤、前列腺癌，皮肤癌(例如，皮肤鳞状细胞癌、黑色素瘤、移行细胞癌或尿路上皮癌。
23.本发明的这些和其他特征、方面和优点将通过以下描述、所附权利要求和附图得到更好的理解。本发明的前述要素可以单独组合或自由地去除，以形成本发明的其他实施方案，下文中不声明反对这种合成或去除。
附图说明
24.图1描述了示例性pd-l1结合分子，其包含一种或多种毒素或毒素亚基和一个或多个pd-l1结合区，所述毒素或毒素亚基例如志贺菌毒素a亚基效应多肽。在一个示例性pd-l1结合分子中，pd-l1结合区是scfv，并且显示scfv参与与相邻scfv的分子间可变结构域交换(左下)。图1中示例性分子的描述是为了说明本文所述的pd-l1结合分子的一些实施方案的结构特征的某些、一般排列的目的。应当理解，这些示例性分子不打算也不应被解释为完全限定为如本文所述的分子的任何结构特征和/或组分的排列。图1的示意图中显示的相对大小、位置或特征数量已被简化。图1中的示意图并非旨在准确地描绘关于如本文所述的任何实施方案中的分子结构的相对大小的任何信息。
25.图2图解地显示了使用来自不同哺乳动物物种的重组pd-l1蛋白的示例性pd-l1结合分子的pd-l1结合特征。使用酶联免疫测定法(elisa)形式测试示例性pd-l1结合分子115749(seq id no：113)和115750(seq id no：114)与源自人、食蟹猴或小鼠的重组pd-l1蛋白的结合。由di-slt-a1融合蛋白(114964)组成的对照pd-l1结合分子(包括存在于阿特珠单抗(atezolizumab)中的免疫球蛋白结合结构域，之前已显示其与来自人、食蟹猴和小鼠的pd-l1蛋白结合)用作pd-l1结合的阳性对照。在y轴上显示了使用酶标仪(plate reader)在450纳米(nm)处检测为吸光度值的背景扣除的elisa信号。在图2-3中，术语“bkg sub”是指“背景扣除”，用于调整相对于仅缓冲液对照的测量值。在该测定中，pd-l1结合分子115749(seq id no：113)和115750(seq id no：114)均与人pd-l1和食蟹猴pd-l1结合，但
不与小鼠pd-l1结合。
26.图3图解地显示了使用人或食蟹猴来源的重组pd-l1蛋白的示例性pd-l1结合分子的pd-l1结合特征。使用elisa形式测试示例性pd-l1结合分子115749(seq id no：113)、116188(seq id no：126)和116297(seq id no：128)与重组pd-l1蛋白的结合。在一系列pd-l1结合分子浓度上测试的115749(seq id no：113)、116188(seq id no：126)和116297(seq id no：128)背景扣除的elisa信号，以在450nm处测量的吸光度，绘制在y-轴上，x轴上是以ng/ml为单位的pd-l1结合分子浓度的以10为底的对数。pd-l1结合分子115749(seq id no：113)、116188(seq id no：126)和116297(seq id no：128)各自以相似的结合特征结合人pd-l1蛋白和食蟹猴pd-l1蛋白两者。图3-5和10a-10b、11和12中使用的术语“结合分子”是指下文实施例中描述的一类pd-l1靶向免疫毒素，作为包含志贺菌毒素a亚基组分和用于pd-l1靶向的抗体免疫球蛋白结构域的pd-l1结合分子。
27.图4图解地显示了使用流式细胞术方法确定的示例性pd-l1结合分子115749(seq id no：113)与pd-l1阳性hcc1954细胞的pd-l1结合特征。将测量为平均荧光强度(mfi)的fitc的荧光信号相对于以微克每毫升(μg/ml)为单位以对数刻度图示的pd-l1结合分子浓度制图。在该测定中，115749(seq id no：113)表现出与表达pd-l1的hcc1954细胞的剂量依赖性结合。
28.图5图解地显示了示例性pd-l1结合分子在一定浓度范围内的体外蛋白质合成抑制活性。对于每个样品分子，在测定期间以相对发光单位(rlu乘以e3)表示的荧光素酶的发光强度相对于以纳克/毫升(ng/ml)为单位测试的pd-l1结合分子浓度的以10为底的对数制图。这些示例性pd-l1结合分子115749(seq id no：113)和115961(seq id no：123)表现出与阳性“对照”分子相当的核糖体抑制活性，阳性“对照”分子为单独的志贺菌毒素效应多肽(di-slta)，不与任何靶向剂或结合区(即包含seq id no：41的多肽)偶联，尽管115961(seq id no：123)表现出略小的蛋白质合成抑制。图5、9和11中使用的术语“di-slta”是指示例性pd-l1结合分子中的志贺菌毒素组分，其中志贺菌毒素组分是去免疫的(在上文的实施例中也称为“di-slt-a1”)。“无结合分子阳性对照”是指缺乏任何pd-l1结合分子(即包含seq id no：41的多肽)的测试样品。术语“阴性对照”是指未添加荧光素酶但仍测量发光信号的样品。
29.图6a-6b图解地显示了研究示例性pd-l1结合分子115749(seq id no：113)(图6a)和115750(seq id no：114)(图6b)对表达来自人类、食蟹猴或小鼠的不同的pd-l1蛋白的cho-k1细胞的细胞毒活性的细胞杀伤测定的结果。每种细胞类型的细胞成活力百分比相对于施用至各个细胞的pd-l1结合分子浓度的以10为底的对数制图。在该测定中，pd-l1结合分子115749(seq id no：113)和115750(seq id no：114)杀死了表达人或食蟹猴pd-l1靶标的细胞，但没有杀死表达鼠pd-l1的细胞。
30.图7-9图解地显示了研究示例性pd-l1结合分子对pd-l1阳性和/或pd-l1阴性细胞类型的活性的细胞杀伤测定的结果。每种细胞类型的细胞成活力百分比相对于施用至各个细胞样品的pd-l1结合分子的浓度的以10为底的对数制图。在某些实验中，细胞靶向的特异性通过使用对pd-l1的细胞表面表达呈阴性的细胞系进行相同的测定来显示。在某些实验中，使用非靶向的催化活性di-slt-a1片段(114951)作为对照(在实施例中也称为“仅di-slt-1a”)。
31.图7显示了115749(seq id no：113)和115750(seq id no：114)对四种不同的表达pd-l1的细胞类型表现出细胞毒性：hcc-1954、hcc-827、jimt-1和mda-mb-231，但不是在细胞表面不表达pd-l1的对照细胞系mda-mb-486。单独的非靶向di slt-1a(“114951”)在测试浓度下表现出相对较低的细胞毒性，并且仅在高浓度下具有细胞毒性。当pd-l1阴性细胞系mda-mb-468与115749(seq id no：113)和115750(seq id no：114)接触时，观察到的细胞毒性与非靶向细胞毒性一致(参见下文图9，单独的非靶向di slt-1a(“仅di-slt-1a”))。
32.图8显示了115744(seq id no：108)、115745(seq id no：109)、115747(seq id no：111)、115748(seq id no：112)、115749(seq id no：113)、115750(seq id no：114)、115751(seq id no：115))、115752(seq id no：116)、115753(seq id no：117)、115754(seq id no：118)、115755(seq id no：119)、115756(seq id no：120)和115757(seq id no：121)对两种不同的表达pd-l1的细胞类型的细胞毒性：hcc-1954和mda-mb-231(转染以表达人pd-l1)。
33.图9显示了116297和116299对四种不同的表达pd-l1的细胞类型表现出细胞毒性：hcc 1954、jimt-1、hcc 827和mda-mb-231。单独的非靶向di slt-1a(“仅di-slt-1a”)在测试浓度下表现出相对较低的细胞毒性(di slt-1a仅在高浓度时具有细胞毒性，并且仅对某些细胞系具有细胞毒性)。当pd-l1阴性细胞skbr3和mcf-7与测试浓度的116297(seq id no：128)和116299(seq id no：129)中任一个接触时，未观察到可测量的细胞毒性。
34.图10a和10b显示了通过示例性pd-l1结合分子研究t细胞应答对病毒抗原货物递送的细胞间接合(engagement)的实验结果。图10a显示了与导致细胞因子分泌增加的t细胞接合相关的结果。测试了示例性pd-l1结合分子对，其中对之间的唯一区别是一个包含羧基末端病毒抗原货物而另一个不包含。图10b显示了与导致肿瘤细胞杀伤的细胞毒性t细胞接合相关的结果(cd50)。
35.图10a图解地显示了干扰素γ(ifn-γ)分泌形式的免疫应答的诱导，干扰素γ(ifn-γ)分泌通过从共培养物中取出的上清液的elisa所测量。测试了示例性pd-l1结合分子对(115749(seq id no：113)和115961(seq id no：123))或(115750(seq id no：114)和115962(seq id no：124))在一系列pd-l1结合分子浓度对ifn-γ的诱导。通过在450nm处的吸光度测量的得到的ifn-γ水平绘制在y轴上，使用对数刻度以ng/ml为单位的pd-l1结合分子浓度绘制在x轴上。短语“无抗原”是指所测试的样品，其中所测试的靶向pd-l1的免疫毒素分子不包含任何羧基末端病毒cd8 t细胞表位货物(在下文的实施例中也称为“无抗原对照”，“对照pd-l1结合分子”，或“匹配对”中的对照)。“具有ast能力的”di-slt-a1融合蛋白115749(seq id no：113)和115750(seq id no：114)能够刺激识别cmv抗原(cmv-ctl)的人类细胞毒性t淋巴细胞以驱动ifn-γ分泌，而“无抗原对照”蛋白115961(seq id no：123)和115962(seq id no：124)不诱导任何显著量的ifn-γ分泌。向表达pd-l1的mda-mb-231细胞施用携带pd-l1结合分子115749(seq id no：113)或115750(seq id no：114)的抗原-货物能够刺激cmv-ctl细胞以增加在cmv-ctl与靶细胞的比例为1∶1的细胞共培养物中的细胞因子ifn-γ分泌。
36.图10b图解地显示了示例性pd-l1结合分子115749(seq id no：113)和115962(seq id no：124)在与cmv-ctl细胞的共培养物中对表达pd-l1的mda-mb-231(“nr”表示细胞被转染核红色染料)细胞表现出细胞毒性。将80小时时间点相对于对照的细胞成活力百分比相
对于以对数刻度图示的施用的pd-l1结合分子的浓度作图。在本共培养细胞杀伤试验测定中测试了示例性pd-l1结合分子对(115749(seq id no：113)和115961(seq id no：123))或(115750(seq id no：114)和115962(seq id no：124))的细胞毒性(cd50)。短语“无抗原”是指测试的样品，其中测试的靶向pd-l1的免疫毒素分子不包含任何羧基末端病毒cd8 t细胞货物。“具有ast能力的”pd-l1结合分子是那些包含羧基末端cmv抗原并能够通过将抗原递送至pd-l1阳性/hla：a2阳性细胞来刺激人细胞毒性t淋巴细胞的分子。
37.图11图解地显示了以ifn-γ分泌形式的免疫应答的诱导，ifn-γ分泌通过取自比例为1：1的表达pd-l1的mda-mb-231(nr)细胞与cmv-ctl的共培养物的上清液的elisa所测量。使用一系列pd-l1结合分子浓度，测试了示例性的pd-l1结合分子115749(seq id no：113)、116297(seq id no：128)、116299(seq id no：129)、115961(seq id no：123)和116187(seq id no：125)对ifn-γ的诱导。通过在450nm处的吸光度测量的ifn-γ水平绘制在y轴上，使用对数刻度以ng/ml为单位的pd-l1结合分子浓度绘制在x轴上。短语“无ag对照”是指所测试的样品，其中所测试的靶向pd-l1的免疫毒素分子不包含任何羧基末端病毒抗原货物(在下文的实施例中也称为“无抗原对照”、“无抗原”、“对照结合分子”或“匹配对”中的对照)。pd-l1结合分子115749(seq id no：113)、116297(seq id no：128)和116299(seq id no：129)能够刺激cmv-ctl细胞分泌ifn-γ，而“无ag对照”蛋白115961(seq id no：123)和116187(seq id no：125)和“仅di-slt-1a”以相同的蛋白质浓度施用，在该测定中没有诱导任何显著量的ifn-γ分泌。
38.图12图解地显示了promega pd-1/pd-l1阻断生物测定实验的结果。以rlu测量的t细胞激活绘制在y轴上，相对于与以对数刻度图示的纳摩尔(nm)的pd-l1结合分子或抗体浓度。示例性的pd-l1结合分子115749(seq id no：113)、115750(seq id no：114)和115962(seq id no：124)在该测定中均显示在某些浓度下阻断pd-l1与pd-1相互作用的能力，但活性低于施用阳性对照单克隆抗体抗-hpd-l1-higg1的样品。
39.图13是显示了与其相关的pd-l1结合分子功能和活性/效力(例如ic50、cd50和kd，以ng/ml计)的表格。
40.图14图解地显示了示例性pd-l1结合分子在一定浓度范围内的体外蛋白质合成抑制活性。对于每个样品分子，在测定期间以相对发光单位(rlu乘以e3)表示的荧光素酶的发光强度相对于以纳克/毫升(ng/ml)为单位的测试的pd-l1结合分子浓度的以10为底的对数绘制。这些示例性pd-l1结合分子116297(seq id no：128)和115749(seq id no：113)表现出与阳性“对照”分子相当的核糖体抑制活性，阳性“对照”分子为单独的志贺菌毒素效应多肽(di-slta)，不与任何靶向剂或结合区(即包含seq id no：41的多肽)偶联。
41.图15是显示相对于结合分子浓度的人或食蟹猴pd-l1结合(450nm处的吸光度)的图。
42.图16是显示相对于pd-l1 细胞系中结合分子浓度(ng/ml)的细胞成活力百分比的图。图16显示116297(seq id no：128)可以表现出比115749(seq id no：113)更大的细胞毒性。
43.图17a显示了测试116297(seq id no：128)与转基因cho-k1细胞表达的人(hu)和食蟹猴(cyno)pd-l1结合的结合测定的结果。在结合测定中使用对照抗人pd-l1抗体(“pd-l1 mab”)阿特珠单抗。图17b显示了细胞成活力测定的结果。相对于结合分子浓度绘制细胞
成活力百分比。
44.图18a和18b报告了多种临床相关肿瘤细胞系的116297(seq id no：128)的细胞表面pd-l1表达水平和cd
50
值。
45.图19显示了使用人供体pbmc样品的流式细胞术测定的结果，其中包括在存在或不存在ifn-γ的情况下培养的单核细胞和淋巴细胞。通过干扰素γ处理诱导单核细胞以提高其pd-l1的表达。
46.图20a-20b显示了pd-l1阳性人免疫细胞的离体成活力百分比，包括在各种浓度的116297(seq id no：128)处理后，以及任选地在用干扰素-γ处理后的cd14阳性单核细胞(上图)和淋巴细胞(下图)。
47.图21a显示了使用平均荧光强度(mfi)在未经处理或用ifn-γ处理的单核细胞或淋巴细胞群中测定的pd-l1表达。图21b显示在未经处理或用ifn-γ处理的单核细胞或淋巴细胞群中相对于效力(ic
50-ng/ml)的pd-l1表达。
48.图22显示了细胞毒性测定的结果，其中预先与116297(seq id no：128)或116296(seq id no：127)一起孵育的mda-mb231细胞(hla：a02阳性)与抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl，共培养物)接触。
49.图23是显示116297在各种细胞系中对干扰素-γ分泌的细胞毒性效力和倍数诱导的图表。
50.图24a显示了在存在或不存在细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的情况下的成活力研究结果，其中相对于116297(ng/ml)的浓度绘制了活细胞百分比(mda-mb231)。图24b显示了在不同浓度116297(ng/ml)的干扰素γ分泌。
51.图25显示了在几种细胞类型中使用表面靶pd-l1和hla：a*02的平均荧光强度(mfi)测量的表达。
52.图26显示了模型中ifn-γ的分泌，其中用不同浓度的116297(seq id no：128)处理后，hla：a*02和pd-l1阳性肿瘤细胞与抗原特异性ctl(“cmv-ctl”)共培养。
53.图27显示在施用各种浓度的116297(seq id no：128)后，hla：a*02阳性肿瘤细胞在与抗原特异性ctl(“cmv-ctl”)共培养中的成活力。
54.图28a是示意图，显示了使用人类患者来源的肿瘤的异种移植物(pdx)动物模型的实验方案。给小鼠注射肿瘤细胞。在肿瘤体积达到100-150mm3后，在第0天，对小鼠给药6mg/kg的115749或116297。在第2、4、7、9、11、21、23和27天给予小鼠2mg/kg的后续剂量。定期测量肿瘤体积，最后一次肿瘤测量发生在第27天。图28b是显示肿瘤体积随时间变化的图。图28c是卡普兰-梅尔(kaplan-meier)生存曲线。
55.图29a是示意图，显示了使用人类患者来源的肿瘤的异种移植物(pdx)动物模型的实验方案。给小鼠注射肿瘤细胞。在肿瘤体积达到100-150mm3后，在第0天，对小鼠给药6mg/kg的115749或116297。随后在第2、4、7、9、11、16、18、21和33天给予小鼠2mg/kg的后续剂量，并在第14天给予6mg/kg的剂量。定期测量肿瘤体积，最后一次肿瘤测量发生在第60天。图29b是显示肿瘤体积随时间变化的图。图29c是卡普兰-梅尔生存曲线。
56.图30是显示在用运载体(vehicle)对照或116297处理的小鼠中，接种后不同天的肿瘤体积的图。
57.图31是显示灵长类动物在施用不同剂量的116297(seq id no：128)后第15天和第
23天血清i型细胞因子水平(白细胞介素-2(il-2)、ifn-γ、肿瘤坏死因子-α(tnf-α))的图。
58.图32是显示示例性pd-l1结合分子例如116297(seq id no：128)的潜在作用机制的示意图。
59.图33显示了示例性pd-l1结合分子116297(seq id no：128)的核糖体抑制测定的结果。
60.图34显示了示例性pd-l1结合分子116297(seq id no：128)的pd-l1靶结合测定的结果。
61.图35是显示pd-l1结合分子处理如何诱导抗肿瘤作用的示意图，例如通过直接杀死表达pd-l1的肿瘤细胞和pd-l1阳性免疫细胞导致肿瘤免疫表型的改变。
62.图36是显示116297的结构和活性的示意图，116297是一种细胞毒性融合蛋白，设计用于耗尽pd-l1肿瘤(tc)和免疫细胞(ic)。116297向细胞递送去免疫的志贺样毒素a和cmv限制性肽抗原。116297包含针对t细胞和免疫细胞表面的pd-l1的特异性靶向结构域。116297被引导至细胞中的核糖体，并通过由di slta介导的酶促和不可逆失活介导细胞杀伤。通过递送非自身抗原肽，116297可以募集cmv反应性cd8 t细胞对肿瘤的应答。116297具有独特的双重作用机制，这是目前的单克隆抗体疗法无法实现的：它直接耗尽t细胞和免疫细胞。pd-l1 tc是指表达pd-l1的肿瘤细胞，pd-l1 ic是指表达pd-l1的免疫细胞。
63.图37a-37d显示116297通过不同的作用模式靶向pd-l1肿瘤细胞(tc)以耗尽。图37a是显示在pd-l1表达水平范围内测量的116297对肿瘤肺、皮肤、乳腺和卵巢肿瘤细胞系的细胞毒效力(cd
50
)范围的图。图37b显示了使用免疫组织化学(22c3)测定的表面pd-l1表达，强度评分为tc0-3(底图)。图37c显示了与细胞毒性t淋巴细胞(ctl)共培养并用116297或对照结合分子处理的表达pd-l1或hla：a02的mda-mb-231细胞中的细胞成活力百分比。短语“无ag结合分子对照”是指测试的样品，其中测试的靶向pd-l1的免疫毒素分子不包含任何羧基末端病毒抗原货物。“无活性结合分子对照”是指包含酶无活性志贺菌毒素亚基a效应子的pd-l1结合分子。“无ctl”是指未添加细胞毒性t淋巴细胞的样品，和“ctl”是指添加了它们的样品。图37d显示了与细胞毒性t淋巴细胞(ctl)共培养的表达pd-l1或hla：a02的mda-mb-231细胞中干扰素γ的分泌。
64.图38a-38d显示116297在体内控制pd-l1阳性肿瘤。在用116297处理后，在植入了各种人类肿瘤细胞系，包括三阴性乳腺癌细胞系mda-mb-231(图38a)和pdx2(图38b)的免疫缺陷小鼠中，肿瘤体积增长。在图38a-38b中，星号表示统计显著性。图38c是显示植入非小细胞肺癌细胞(pdx2b)并用116297处理的免疫缺陷小鼠中的肿瘤体积(作为第0天的百分比)的图。“包含催化失活的slta失活变体的结合分子”是指包含酶失活志贺菌毒素亚基a效应子的pd-l1结合分子。图38d是总结各种细胞类型中的模型和疗效终点的表格。
65.图39a是说明在代表性pd-l1高(hcc1954)中/高(mda-mb-231)和阴性(mcf7)肿瘤和未处理或用ifn-γ处理以诱导pd-l1表达的分离的人cd14阳性单核细胞中用不同剂量的116297处理后的细胞成活力的图。图39b是显示在代表性pd-l1高(hcc1954)中/高(mda-mb-231)和阴性(mcf7)肿瘤细胞上效力(cd50，ng/ml)和pd-l1表面分子之间相关性的图。
66.图40a显示了116297的药代动力学和血清半衰期。图40b是显示116297体外效力和受体占有率与c
max
的图。
67.图41a是显示非人灵长类动物研究的给药方案的示意图。图41b显示了非人灵长类
动物的外周单核细胞水平，作为基线的百分比。单核细胞的耗尽先于t细胞、b细胞、nk细胞和嗜酸性粒细胞的扩增，这些细胞在第15天被外周扩增并持续到研究终点。“无活性变体”是指包含酶无活性志贺菌毒素亚基a效应子的pd-l1结合分子。图41c显示了非人灵长类动物的外周t淋巴细胞水平，作为基线的百分比。图41d对非人类灵长类动物的两项独立研究的血清细胞因子应答的分析。数据显示为研究1(n＝2nhp)和研究2(对于116297，组n＝8nhp和对于失活变体，组n＝5)的应答者百分比。数据反映了研究中第3剂后任何时间的细胞因子的诱导。
68.图42a是在nhp中用116297直接杀死表达pd-l1的细胞和物理抑制pd-l1信号传导(“阻断”)的示意图。图42b是总结在nhp研究中观察到的免疫作用和药效学应答的图表。
69.图43a-43b显示在hcc 1954细胞(图43a)和mda-mb-231细胞(图43b)中不同pd-l1结合分子(116297、115749、115765和114985)的比较体外数据。
70.图44显示了不同pd-l1结合分子(16297、116555、115749、115765和115695)的比较体内数据。
71.图45a-45b显示了其中靶细胞用pd-l1结合分子处理4小时(急性)或24小时(持续)的实验结果。在冲洗掉pd-l1结合分子后，使细胞与ctl接触，并测量ifn-γ产生(图45a)和细胞毒性(图45b)。
72.图46a-46b显示实验结果，其中从供体患者分离的单核细胞(ic)或肿瘤细胞(hcc1954)用20μg/ml(图46a)或2μg/ml(图46b)各种pd-l1靶向分子处理。使用标准细胞滴度glo测定法测量细胞杀伤。
73.详细说明
74.在下文中使用说明性的、非限制性的实施方案并参考附图更全面地描述本发明。然而，本发明可以以许多不同的形式实施并且不应被解释为限于以下阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案是为了使本公开是彻底的并将本发明的范围传达给本领域技术人员。
75.为了使本发明更容易理解，以下定义了某些术语。在本发明的详细描述中可以找到其他定义。
76.如在说明书和所附权利要求中使用的，除非上下文另有明确说明，否则术语“a”、“an”和“the”包括单数和复数指示物。
77.如在说明书和所附权利要求中使用的，术语“和/或”在指两种物种a和b时，是指a和b中的至少一种。如在说明书和所附权利要求中使用的，术语“和/或”在指多于两个物种，例如a、b和c时，是指a、b或c中的至少一种，或a、b或c的任意组合中的至少一种(每个物种有单一或多重可能性)。
78.术语“氨基酸残基”或“氨基酸”包括对掺入蛋白质、多肽或肽中的氨基酸的引用。术语“多肽”包括氨基酸或氨基酸残基的任何聚合物。术语“多肽序列”是指物理上包括多肽的一系列氨基酸或氨基酸残基。“蛋白质”是包含一个或多个多肽或多肽“链”的大分子。“肽”是大小小于约总共15至20个氨基酸残基的小多肽。术语“氨基酸序列”是指一系列氨基酸或氨基酸残基，其根据长度物理地包含肽或多肽。除非另有说明，本文公开的多肽和蛋白质序列从左到右书写，表示它们从氨基末端到羧基末端的顺序。
79.术语“氨基酸”、“氨基酸残基”、“氨基酸序列”或多肽序列包括天然存在的氨基酸
(包括l和d立体异构体(isostereisomer))，除非另有限制，还包括已知的天然氨基酸类似物，它们可以以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥作用，例如硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、n-甲酰基甲硫氨酸、γ-羧基谷氨酸、羟脯氨酸(hydroxyprolinehypusine)、焦谷氨酸和硒代甲硫氨酸。本文所指的氨基酸在表1中以简写形式描述：
80.表1.氨基酸命名
81.名称3-字母1-字母丙氨酸alaa精氨酸argr天冬酰胺asnn天冬氨酸或天冬氨酸盐aspd半胱氨酸cysc谷氨酸或谷氨酸盐glue谷氨酰胺glnq甘氨酸glyg组氨酸hish异亮氨酸ilei亮氨酸leul赖氨酸lysk甲硫氨酸metm苯丙氨酸phef脯氨酸prop丝氨酸sers苏氨酸thrt色氨酸trpw酪氨酸tyry缬氨酸valv
82.关于肽、肽区、多肽区、蛋白质或分子的氨基酸残基的短语“保守置换”是指肽、肽区、多肽区、蛋白质或分子的氨基酸组成的变化，不会显著改变整个肽、肽区、多肽区、蛋白质或分子的功能和结构(参见creighton，proteins：structures and molecular properties(wh freeman and company，new york(第二版，1992)))。
83.当提及多肽或多肽区时，短语“衍生自”是指多肽或多肽区包含最初在“亲本”蛋白质中发现的氨基酸序列，并且现在可以包含某些氨基酸残基添加、缺失、截短、重排，或相对于原始多肽或多肽区的其他改变，只要“亲本”分子的某些功能和结构基本上是保守的。技术人员将能够使用本领域已知的技术，例如蛋白质序列比对软件来鉴定衍生多肽或多肽区的亲本分子。
84.如本文所用，术语“相当的”意味着相似。当“相当的”是指特定值(例如，结合亲和力)时，该术语可涵盖在另一个的约5％、约10％、约15％、约20％、或约25％或更多范围内的值。
85.如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白蛋白并且涵盖具有抗原结合能力的最广
泛的抗体形式，例如包含至少一个免疫球蛋白结构域的各种蛋白质结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、骆驼科动物化抗体或抗原结合抗体片段(例如fab、fv、scfv、sdab片段)，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
86.如本文所用，术语“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的一部分并且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab
′
、fab
′‑
sh、f(ab
′
)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所述，抗体片段可通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生。
87.在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗体片段是单域抗体片段、单链可变片段、抗体可变片段、fd片段、fab(抗原结合片段)、自主vh结构域、单结构域免疫球蛋白衍生区vhh，源自骆驼科动物vhh片段或vh结构域片段的重链抗体结构域，源自软骨鱼vhh片段或vh结构域片段的重链抗体结构域，免疫球蛋白新抗原受体(ignar)，vnar片段，二硫键稳定的抗体可变(fv)片段、犰狳重复多肽、纤连蛋白衍生的第10个纤连蛋白iii型结构域、生腱蛋白iii型结构域、锚蛋白重复基序结构域、低密度脂蛋白受体衍生的a结构域、脂质运载蛋白、kunitz结构域、蛋白a-衍生的z结构域、γ-b结晶衍生结构域、泛素衍生结构域、sac7d衍生多肽、fyn衍生的sh2结构域、小蛋白、c型凝集素样结构域支架等。
88.在一些实施方案中，抗体或抗体片段是多价抗体。例如，抗体或抗体片段可以是多聚化scfv片段，例如双抗体、三链抗体、四抗体、双特异性串联scfv片段、双特异性串联vhh片段、双特异性小抗体或二价小抗体。
89.如本文所用，术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。
90.如本文所用，“人源化抗体”是具有来源于非人来源的氨基酸序列和/或参与抗原结合的残基(例如cdr)并且其中一个或多个其他氨基酸序列是来源于人源(例如框架序列)。
91.如本文所用，“人抗体”是具有与由人或人细胞产生的或衍生自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这一定义明确排除了包含非人抗原结合残基(例如cdr)的人源化抗体。人单域抗体是仅包含人重链或人轻链的抗体；然而，cdr序列可以是天然存在的或合成的(参见例如us.6,248,516)。
92.如本文所用，“骆驼科动物化抗体”是具有源自非骆驼科动物来源的氨基酸序列并且包含两条重链且没有轻链并且包含源自骆驼科动物来源或物种的铰链区的抗体。
93.如本文所用，术语“毒素”、“毒素剂”、“毒素组分”或“细胞毒素”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏，包括组织损伤的物质。结合分子或抗体毒素缀合物的毒素组分可包括但不限于天然毒素、生物毒素、蛋白质毒素、毒液、细胞毒素、小分子毒素和衍生自上述任何物质的合成毒物，例如，abx毒素、核糖体失活蛋白毒素、相思豆毒蛋白、炭疽毒素、aspfl、bouganin、异株泻根毒蛋白、cholix毒素、密蛋白、白喉毒素、白树毒蛋白、不耐热肠毒素、丝林霉素、百日咳毒素、商陆抗病毒蛋白、美丽天人菊内酯、假单胞菌(pseudomonas)外毒素a、局限曲菌素、蓖麻毒蛋白、皂草毒蛋白、帚曲霉素、志贺菌毒素和枯草杆菌酶细胞毒素；以及本文所述的或技术人员已知的各种毒素剂。
94.为了本公开的目的并且关于志贺菌毒素多肽序列或志贺菌毒素衍生的多肽，术语“野生型”通常是指在活物种(例如，病原菌)中发现的天然存在的志贺菌毒素蛋白序列，其中志贺菌毒素蛋白序列是最常出现的变体之一。这与不常出现的志贺菌毒素蛋白序列形成了对比，尽管志贺菌毒素蛋白序列仍然是天然存在的，但在对该物种的大量天然存在的个体生物体(其包括至少一种志贺菌毒素蛋白变体)进行统计上强有力的抽样时，在不到1％的给定物种的个体生物体中发现。天然分离物在其自然环境之外的克隆扩增(无论分离物是生物体还是包含生物序列信息的分子)不会改变天然存在的需求，只要克隆扩增不引入该物种的天然存在的种群中不存在的新序列变种和/或不改变序列变体彼此的相对比例。
95.术语“缔合的”、“缔合”、“连接的”或“连接”是指分子的两个或多个组分被结合、附着、连接或以其他方式偶联以形成单个分子的状态或通过在两个分子之间产生缔合、连接、附着和/或任何其他连接使两个分子彼此缔合以形成单个分子的行为。例如，术语“连接的”可以指通过一种或多种原子相互作用缔合的两种或更多种组分，从而形成单个分子，并且其中原子相互作用可以是共价的和/或非共价的。两种组分之间的共价缔合的非限制性实例包括肽键和半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。两个分子组分之间的非共价缔合的非限制性实例包括离子键。
96.术语“连接的”是指两个或多个分子组分通过一个或多个原子相互作用缔合，从而形成单个分子，并且其中原子相互作用包括至少一个共价键。术语“连接”是指产生如上所述的连接分子的行为。
97.本文中的“接头”是指将两个蛋白质结构域连接在一起的结构域接头，例如在scfv和/或其他蛋白质和蛋白质融合结构中使用的。例如，“结合区接头”可用于连接志贺菌毒素a亚基效应多肽与结合区，“scfv接头”可用于连接scfv中的vh和vl。“可切割的间隔区”是一种接头，其包含一个或多个蛋白酶的切割位点。通常，可以使用许多合适的接头，包括传统的肽键，它们是通过重组技术产生的，以足够的长度和灵活性允许两个结构域重组连接，以允许每个结构域保留其生物学功能。在一些实施方案中，接头肽可以主要包括以下氨基酸残基：gly、ser、ala或thr。接头肽的长度应足以以这样的方式连接两个分子，即它们彼此之间呈现正确的构象，从而保持所需的活性。在一些实施方案中，接头的长度为约1至约50个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为约1至约30个氨基酸。在一个实施方案中，可以使用长度为1至20个氨基酸的接头，在一些实施方案中发现使用约5至约10个氨基酸。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头，所述甘氨酸-丝氨酸聚合物包括例如(gs)n(seq id no：201)、(gsggs)n(seq id no：202)、(ggggs)n(seq id no：203)和(gggs)n(seq id no：204)，其中n是至少为1的整数(通常为3至4)。或者，多种非蛋白质聚合物，包括但不限于聚乙二醇(peg)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，可以用作接头。其他接头序列可以包括任何长度的cl/ch1结构域的任何序列，但不是cl/ch1结构域的所有残基；例如，cl/ch1结构域的前5-12个氨基酸残基。接头也可以来源于免疫球蛋白轻链，例如cκ或cλ。接头可以来源于任何同种型的免疫球蛋白重链，包括例如cγ1、cγ2、cγ3、cγ4、cα1、cα2、cδ、cε和cμ。接头序列也可以衍生自其他蛋白质，例如ig样蛋白(例如tcr、fcr、kir)、铰链区衍生序列和其他蛋白质的其他天然序列。虽然可以使用任何合适的接头，但一些实施方案使用甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(gs)n(seq id no：201)、(gsggs)n(seq id no：202)、(ggggs)n(seq id no：203)
1a。
106.如本文所述，志贺菌毒素效应功能是由衍生自志贺菌毒素a亚基的多肽区赋予的生物学活性。志贺菌毒素效应功能的非限制性实例包括促进细胞进入；脂质膜变形；促进细胞内化；刺激网格蛋白介导的内吞作用；将细胞内按路线发送引导至各种细胞内区室，例如高尔基体、内质网和胞质溶胶；指导带有货物的细胞内路由；抑制核糖体功能；催化活性，例如n-糖苷酶活性和催化抑制核糖体；减少蛋白质合成、诱导半胱天冬酶活性、激活效应半胱天冬酶、实现细胞抑制作用和细胞毒性。志贺菌毒素催化活性包括例如核糖体失活、蛋白质合成抑制、n-糖苷酶活性、多核苷酸：腺苷糖苷酶活性、rna酶活性和dna酶活性。志贺菌毒素是核糖体失活蛋白(rip)。rip可以使核酸、多核苷(polynucleoside)、多核苷酸、rrna、ssdna、dsdna、mrna(和polya)和病毒核酸脱嘌呤(参见例如，barbieri l等人，biochem j 286：1-4(1992)；barbieri l等人，nature 372：624(1994)；ling j等人，febs lett 345：143-6(1994)；barbieri l等人，biochem j 319：507-13(1996)；roncuzzi l，gasperi-campani a，febslett 392：16-20(1996)；stirpe f等人，febs lett 382：309-12(1996)；barbieri l et al.，nucleic acids res 25：518-22(1997)；wang p，tumer n，nucleic acids res 27：1900-5(1999)；barbieri l等人，biochim biophys acta 1480：258-66(2000)；barbieri l等人，j biochem 128：883-9(2000)；brigotti m等人，toxicon 39：341-8(2001)；brigotti m等人，faseb j16：365-72(2002)；bagga s等人，j biol chem 278：4813-20(2003)；picard d等人，j biol chem 280：20069-75(2005))。一些rip显示出抗病毒活性和超氧化物歧化酶活性(erice a等人，antimicrob agents chemother 37：835-8(1993)；au t et al.，febs lett 471：169-72(2000)；parikh b，tumer n，mini rev med chem4：523-43(2004)；sharma n等人，plantphysiol 134：171-81(2004))。在体外和体内均观察到志贺菌毒素催化活性。志贺菌毒素效应物活性测定的非限制性实例测量各种活性，例如蛋白质合成抑制活性、脱嘌呤活性、细胞生长抑制、细胞毒性、超螺旋dna松弛活性和核酸酶活性。
107.本文使用的术语“ic50”或“ic
50”是指使用体外核糖体功能测定法测量的半数最大抑制浓度。本文使用的术语“cd50”或“cd
50”是指体外细胞杀伤和/或存活测定中的半数最大细胞毒性浓度。本文使用的术语“ec50”或“ec
50”是指产生半数最大响应(例如，信号传导抑制)的浓度。结合上下文，本领域技术人员将容易理解这些术语中的每一个的含义。ic
50
、cd
50
和ec
50
中的每一个都可以通过使用不同分子浓度或浓度系列产生多个数据点来测量。对于某些样品，由于无法收集准确曲线拟合所需的数据点，可能无法获得ic
50
或cd
50
的准确值。例如，理论上，如果给定样品的浓度系列中分别没有发生大于50％的核糖体抑制或细胞死亡，则不能确定ic
50
和cd
50
。不足以准确拟合曲线的数据不应被视为实际分子活性的代表。
108.如本文所用，志贺菌毒素效应子功能的保留是指在相同条件下能够表现出与野生型志贺毒素效应多肽对照(例如志贺菌毒素a1片段)或包含野生型志贺菌毒素效应多肽(例如志贺菌毒素a1片段)的pd-l1结合分子相当的志贺菌毒素功能活性水平(如通过具有可重复性的适当定量测定所测量的)。对于核糖体失活或核糖体抑制的志贺菌毒素效应子功能，保留的志贺菌毒素效应子功能在体外环境中表现出10,000pm或更低的ic
50
，例如通过使用技术人员已知的和/或本文描述的测定法。对于靶阳性细胞杀伤测定中细胞毒性的志贺毒
素效应子功能，保留的志贺毒素效应子功能表现出1,000nm或更低的cd
50
，取决于细胞类型及其适当细胞外靶生物分子的表达，例如，通过使用技术人员已知的和/或本文描述的测定法所示。
109.如本文所用，关于核糖体抑制的术语“等效”是指经验测量的核糖体抑制活性水平，如通过具有可重复性的适当定量测定法测量的，在相同条件下其可重复性在参考分子(例如，第二pd-l1结合分子或第三pd-l1结合分子)活性的10％或更少的范围内。
110.如本文所用，关于细胞毒性的术语“等效”是指经验测量的细胞毒性水平，如通过具有可重复性的适当定量测定法测量的，在相同条件下其可重复性在参考分子(例如，第二pd-l1结合分子或第三结合分子)活性的10％或更少的范围内。
111.如本文所用，关于细胞毒性的术语“减弱的”是指在相同条件下，分子表现出(exhibits)或表现出(exhibited)参考分子表现出的cd
50
的10倍至100倍之间的cd
50
。
112.在确定志贺菌毒素效应子功能活性水平时，不应考虑不准确的ic
50
和cd
50
值。对于某些样品，由于无法收集准确曲线拟合所需的数据点，可能无法获得ic
50
或cd
50
的准确值。例如，理论上，如果给定样品的浓度系列中分别没有发生大于50％的核糖体抑制或细胞死亡，则不能确定ic
50
和cd
50
。不足以准确拟合如来自示例性志贺菌毒素效应子功能测定(例如下文实施例中描述的测定)的数据的分析中所述的曲线的数据，不应被视为实际志贺菌毒素效应子功能的代表。
113.未能检测到志贺菌毒素效应子功能的活性可能是由于不正确的表达、多肽折叠和/或蛋白质稳定性，而不是缺乏细胞进入、亚细胞按路线发送和/或酶活性。志贺菌毒素效应子功能的测定可能不需要太多多肽来测量显著量的志贺菌毒素效应子功能活性。就凭经验确定效应子功能低或没有效应子功能的根本原因与蛋白质表达或稳定性相关而言，本领域技术人员可能能够使用本领域已知的蛋白质化学和分子工程技术来补偿此类因素，从而可以恢复和测量志贺菌毒素功能效应子活性。例如，不正确的基于细胞的表达可以通过使用不同的表达控制序列来补偿；不正确的多肽折叠和/或稳定性可能受益于稳定末端序列，或稳定分子三维结构的非效应区中的补偿性突变。
114.某些志贺菌毒素效应子功能不容易测量，例如亚细胞按路线发送功能。例如，没有常规的定量测定来区分志贺菌毒素效应多肽未能具有细胞毒性和/或递送异源表位是否是由于不正确的亚细胞按路线发送，但是在测试可用时，可以分析志贺菌毒素效应多肽与合适的野生型志贺菌毒素效应多肽相比的任何显著水平的亚细胞按路线发送。然而，如果结合分子的志贺菌毒素效应多肽组分表现出与野生型志贺菌毒素a亚基构建体相当或等效的细胞毒性，则推断至少在测试条件下，亚细胞按路线发送活性水平分别与野生型志贺菌毒素a亚基构建体的亚细胞按路线发送活性水平相当或等效。
115.当针对个体志贺菌毒素功能的新测定可用时，志贺菌毒素效应多肽和/或包含志贺菌毒素效应多肽的结合分子可以针对任何水平的那些志贺菌毒素效应子功能进行分析，例如在野生型志贺菌毒素效应多肽的活性的1000倍或100倍或更少以内，或与功能性敲除志贺菌毒素效应多肽相比，表现出3倍至30倍或更高的活性。
116.足够的亚细胞按路线发送可以仅通过在细胞毒性测定中观察分子的细胞毒性活性水平来推断，例如基于t细胞表位呈递或基于涉及细胞溶质和/或内质网定位靶标底物的毒素效应子功能的细胞毒性测定。
117.如本文所用，“显著的”志贺菌毒素效应子功能的保留是指志贺菌毒素功能活性的水平(如通过具有再现性的适当定量测定所测量的)，与野生型志贺菌毒素效应多肽对照(例如志贺菌毒素a1片段)相当。对于体外核糖体抑制，显著的志贺菌毒素效应子功能表现出300pm或更低的ic
50
，取决于测定中使用的核糖体来源(例如细菌、古细菌或真核生物(藻类、真菌、植物或动物)来源)。与催化破坏的slt-1a 1-251双突变体(y77s/e167d)的大约100,000pm的ic
50
相比，这是显著更大的抑制作用。对于实验室细胞培养物中靶标阳性细胞杀伤测定中的细胞毒性，显著的志贺菌毒素效应子功能表现出100、50、30nm或更小的cd
50
，这取决于结合区的靶生物分子和细胞类型，特别是细胞类型的表达和/或适当的细胞外靶生物分子的细胞表面代表和/或被评估的分子靶向的细胞外表位。取决于细胞系，与cd
50
为100-10,000nm的没有细胞靶向结合区的单独志贺菌毒素a亚基(或野生型志贺菌毒素a1片段)相比，这对适当的靶标阳性细胞群具有显著更大的细胞毒性。
118.出于本公开的目的并且关于如本文所述的分子的志贺菌毒素效应子功能，术语“合理的活性”是指与包含天然存在的志贺菌毒素的分子相比，表现出至少中等水平(例如，在11倍至1,000倍内)的志贺菌毒素效应子活性，如本文所定义的，其中志贺菌毒素效应子活性选自由以下组成的组：内化效率、到胞质溶胶的亚细胞按路线发送效率、由靶细胞递送的表位呈递、核糖体抑制和细胞毒性。对于细胞毒性，志贺菌毒素效应子活性的合理水平包括在野生型志贺菌毒素构建体的1,000倍以内，例如，当野生型志贺菌毒素构建体表现出0.5nm的cd
50
时(例如包含野生型志贺菌毒素a1片段的结合分子)，表现出cd
50
为500nm或更低。
119.出于本公开的目的并且关于如本文所述的分子的细胞毒性，术语“最佳”是指志贺菌毒素催化结构域介导的细胞毒性水平在包含野生型志贺菌毒素a1片段(例如志贺菌毒素a亚基或其某些截短变体)和/或天然存在的志贺菌毒素的分子的细胞毒性的2、3、4、5、6、7、8、9或10倍内。
120.应当注意，即使志贺菌毒素效应多肽的细胞毒性相对于野生型志贺菌毒素a亚基或其片段降低，在实践中，使用减弱的志贺菌毒素效应多肽的应用可能与使用野生型志贺菌毒素效应多肽相同或更有效，因为最高效力的变体可能表现出不希望的影响，这些影响在降低的细胞毒性效力的变体中被最小化或降低。野生型志贺菌毒素非常有效，能够在只有一个毒素分子到达中毒细胞的胞质溶胶或可能只有四十个毒素分子被内化到中毒细胞后就能杀死中毒细胞。与野生型志贺菌毒素效应多肽相比，具有甚至大幅度降低的志贺菌毒素效应子功能，例如亚细胞按路线发送或细胞毒性的志贺菌毒素效应多肽对于实际应用可能仍然足够有效，例如涉及靶向的细胞杀伤、异源表位传递和/或检测特定细胞及其亚细胞区室的应用。此外，某些活性降低的志贺菌毒素效应多肽可能特别适用于将货物(例如另外的外源物质或t细胞表位)递送至靶细胞的某些细胞内位置或亚细胞区室。
121.如本文所用，短语“抗体效应子功能”是指可归因于抗体或其衍生物的fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)；fc受体结合(包括新生儿fc受体(fcrn)或brambell受体)，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如pd-l1)；t细胞激活和b细胞激活。
122.关于分子的细胞毒活性的术语“选择性细胞毒性”是指生物分子靶标阳性细胞群
(例如靶向细胞类型)和非靶向旁观者细胞群(例如生物分子靶标阴性细胞类型)之间的相对细胞毒性水平，可以表示为靶向细胞类型的半数最大细胞毒性浓度(cd
50
)与非靶向细胞类型的cd
50
之比，以提供细胞毒选择性的度量或靶向细胞与非靶向细胞的杀伤优先性的指示。
123.给定细胞外靶生物分子(或给定靶生物分子的细胞外表位)的细胞表面表现度和/或密度可能影响某些结合分子最适合使用的应用。细胞之间给定靶生物分子的细胞表面表现度和/或密度的差异可以定量和定性地改变给定结合分子的细胞内化效率和/或细胞毒性效力。给定靶生物分子的细胞表面表现度和/或密度在靶生物分子阳性细胞之间或甚至在细胞周期或细胞分化的不同点上的同一细胞上可能有很大差异。特定细胞或细胞群上给定靶生物分子和/或给定靶生物分子的某些细胞外表位的总细胞表面表现度可以使用技术人员已知的方法来确定，例如涉及荧光激活细胞分选(facs)流式细胞术的方法。
124.如本文所用，就多肽区或多肽内的特征而言，术语“被破坏的(disrupted)”、“破坏(disruption)”或“破坏(disrupting)”及其语法变体是指该区域内至少一个氨基酸的改变或组成破坏的特征。氨基酸改变包括各种突变，例如改变多肽的氨基酸序列的缺失、倒位、插入或置换。氨基酸改变还包括化学改变，例如改变氨基酸官能团中的一个或多个原子或将一个或多个原子添加到氨基酸官能团。
125.如本文所用，“去免疫的”意指与参考分子例如野生型肽区、多肽区或多肽相比，在施用至脊索动物后降低的抗原性和/或免疫原性潜力。这包括尽管与参考分子相比引入了一个或多个从头的抗原性和/或免疫原性表位，但总体抗原性和/或免疫原性潜力降低。在一些实施方案中，“去免疫的”是指与衍生该分子的“亲本”分子(例如野生型志贺菌毒素a1片段或包含上述的结合分子)相比，在施用至哺乳动物后该分子表现出降低的抗原性和/或免疫原性。在一些实施方案中，与参考“亲本”分子相比，去免疫的志贺菌毒素效应多肽能够表现出比在相同条件下通过相同测定法测量的参考分子的抗原性降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的相对抗原性，所述测定法为例如技术人员已知和/或本文描述的测定法，如定量elisa或蛋白质印迹分析。在一些实施方案中，与参考“亲本”分子相比，去免疫的志贺菌毒素效应多肽能够表现出比在相同条件下通过相同测定法测量的参考分子的免疫原性降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或更高的相对免疫原性，所述测定法为例如技术人员已知和/或本文描述的测定法，如在给定时间点接受分子的肠胃外施用后在哺乳动物中产生的抗分子抗体的定量测量。
126.示例性结合分子的相对免疫原性使用在一段时间内重复肠胃外施用后体内抗体对结合分子的应答的测定来确定。
127.短语“b-细胞和/或cd4 t-细胞去免疫”是指该分子在施用至哺乳动物后关于b-细胞抗原性或免疫原性和/或cd4 t-细胞抗原性和/或免疫原性具有降低的抗原性或免疫原性潜力。在一些实施方案中，“b细胞去免疫的”是指与衍生其的“亲本”分子(例如，野生型志贺菌毒素a1段相比)，在施用于哺乳动物后表现出降低的b细胞抗原性和/或免疫原性的分子。在一些实施方案中，“cd4 t细胞去免疫的”是指与衍生其的“亲本”分子(例如，野生型志贺菌毒素a1段相比)，在施用于哺乳动物后表现出降低的cd4 t细胞抗原性和/或免疫原性的分子。
128.关于志贺菌毒素效应多肽中的b细胞表位、cd4 t细胞表位、b细胞表位区或cd4 t细胞表位区的术语“内源性”是指存在于野生型志贺菌毒素a亚基中的表位。
129.短语“cd8 t细胞超免疫”是指当分子存在于活脊索动物内的有核脊索动物细胞内时，在cd8 t细胞抗原性或免疫原性方面具有增加的抗原性和/或免疫原性潜力。通常，由于固有特征或作为结合分子的组分，cd8 t细胞免疫分子能够细胞内化至有核脊索动物细胞的早期内体区室。
130.术语“异源”是指与天然存在的志贺菌毒素的a亚基不同的来源，例如异源多肽不是作为天然志贺菌毒素的任何a亚基的一部分天然发现的。关于结合分子的t细胞表位或t细胞表位-肽组分的术语“异源”是指最初未出现在待修饰的多肽组分的表位或肽序列中，但已添加到多肽，无论是通过本文所述的嵌入、融合、插入和/或氨基酸置换过程，还是通过任何其他工程手段添加。结果是修饰的多肽包含对原始未修饰多肽外源的t细胞表位，即原始多肽中不存在t细胞表位。
131.关于结合分子的t细胞表位或t细胞表位-肽组分的术语“嵌入的”及其语法变体是指多肽区域内的一个或多个氨基酸用不同的氨基酸进行内部替换，以产生与起始多肽区共享相同氨基酸残基总数的新多肽序列。因此，术语“嵌入”不包括任何额外氨基酸、肽或多肽组分与起始多肽的任何外部末端融合，也不包括任何额外氨基酸残基的任何额外内部插入，而是仅包括对现有氨基酸的置换。内部替换可以仅通过氨基酸残基置换或通过一系列置换、缺失、插入和/或倒位来实现。如果使用一个或多个氨基酸的插入，则必须在插入旁边缺失等量的邻近氨基酸，以产生嵌入的t细胞表位。这与关于包含在结合分子的多肽组分内的t细胞表位的术语“插入”的使用相反，“插入”是指在多肽内部插入一个或多个氨基酸，从而产生与起始多肽相比，具有增加的氨基酸残基数量的新多肽。
132.关于包含在结合分子的多肽组分内的t细胞表位的术语“插入”及其语法变体是指在多肽内插入一个或多个氨基酸，从而产生与起始多肽相比，具有增加的氨基酸残基数量的新多肽序列。t细胞表位-肽的“纯”插入是当所得多肽的氨基酸残基数量的长度增加等于整个插入的t细胞表位-肽中的氨基酸残基数量时。关于包含在结合分子的多肽组分内的t细胞表位的短语“部分插入的”、“嵌入的和插入的”及其语法变体是指当所得多肽的长度增加但小于与整个插入的t细胞表位-肽的长度相等的氨基酸残基的数量。插入，无论是“纯的”还是“部分的”，包括任何先前描述的插入，即使不接近多肽内插入位点的多肽的其他区域缺失，从而导致最终多肽的总长度减少，因为最终的多肽仍然包含在多肽区内t细胞表位-肽的一个或多个氨基酸的内部插入。
133.如本文所用，当描述分子的功能活性时，术语“t细胞表位递送”是指分子提供在细胞内定位到亚细胞区室的生物活性，所述亚细胞区室能够导致分子的蛋白质部分的蛋白酶体切割，所述分子包括t细胞表位肽。分子的“t细胞表位递送”功能可以通过观察外源施用该分子的细胞的细胞表面上该分子的t细胞表位-肽货物的mhc呈递来测定，或其中用一个或多个其内体区室中含有该分子的细胞开始测定。通常，可以确定分子将t细胞表位递送至蛋白酶体的能力，其中“t细胞表位递送”分子的初始位置是细胞的早期内体区室，然后，该分子凭经验表明将表位-肽递送至细胞的蛋白酶体。然而，“t细胞表位递送”能力也可以在分子从细胞外位置开始的地方确定，并且经验表明，直接或间接地将表位递送到细胞中和细胞的蛋白酶体中。例如，某些“t细胞表位传递”分子通过细胞的内体区室，例如，内吞进入
该细胞后。或者，对于从细胞外位置开始的分子可以观察到“t细胞表位递送”活性，由此该分子不进入细胞的任何内体区室——相反，“t细胞表位递送”分子进入细胞并递送t细胞表位-肽到细胞的蛋白酶体，大概是因为“t细胞表位递送”分子将其自身的按路线发送引导到亚细胞区室，所述亚细胞区室能够导致其t细胞表位-肽组分的蛋白酶体切割。
134.关于结合分子的志贺菌毒素效应多肽区的位置的短语“邻近氨基末端”是指其中志贺菌毒素效应多肽区的至少一个氨基酸残基在结合分子的氨基末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个，例如最多18-20个氨基酸残基内，只要结合分子能够显示本文所述的适当水平的志贺菌毒素效应子功能活性(例如，一定水平的细胞毒性效力)。因此，在一些实施方案中，与志贺菌毒素效应多肽的氨基末端融合的任何氨基酸残基不降低任何志贺菌毒素效应子功能(例如，通过空间位阻阻碍志贺菌毒素效应多肽区的氨基末端附近的结构)，从而志贺菌毒素效应多肽的功能活性降低至低于本文所需的适当活性水平。
135.关于与另一组分(例如，细胞靶向、结合区、分子部分和/或另外的外源性物质)相比，结合分子内志贺菌毒素效应多肽区的位置，短语“更接近氨基末端”是指这样的位置，其中志贺菌毒素效应多肽的氨基末端的至少一个氨基酸残基，与其他提及的组分相比，更接近结合分子的线性多肽组分的氨基末端。
136.短语“源自志贺菌毒素家族成员的一个a亚基的活性酶结构域”是指具有通过催化核糖体失活机制抑制蛋白质合成的能力。天然存在的志贺菌毒素的酶活性可以通过使用技术人员已知的测定来抑制蛋白质翻译的能力来定义，例如在不存在活细胞的情况下涉及rna翻译的体外测定或在活细胞中涉及rna翻译的体内测定。使用技术人员已知和/或本文所述的测定法，志贺菌毒素酶活性的效力可以通过观察针对核糖体rna(rrna)的n-糖苷酶活性(例如核糖体切口测定法)来直接评估和/或通过观察核糖体功能和/或蛋白质合成的抑制来间接评估。
137.术语“志贺菌毒素a1片段区”是指基本上由志贺菌毒素a1片段组成和/或衍生自志贺菌毒素的志贺菌毒素a1片段的多肽区。
138.关于结合分子的术语“末端”、“氨基末端”或“羧基末端”通常是指结合分子的多肽链(例如，单个连续多肽链)的最后一个氨基酸残基。结合分子可以包含多于一种的多肽或蛋白质，因此，结合分子可以包含多个氨基末端和羧基末端。例如，结合分子的“氨基末端”可以由代表多肽氨基末端的多肽链的第一个氨基酸残基定义，其通常以起始氨基酸残基为特征，所述起始氨基酸残基不与涉及起始氨基酸残基的伯氨基或涉及起始氨基酸残基(其是n-烷基化α氨基酸残基类别的成员)的等效氮的任何氨基酸残基具有肽键。类似地，结合分子的“羧基末端”可以由代表多肽羧基末端的多肽链的最后一个氨基酸残基定义，其通常以最终的氨基酸残基为特征，所述最终的氨基酸残基不具有通过肽键与其伯羧基的α-碳相连的任何氨基酸残基。
139.关于多肽区的术语“末端”、“氨基末端”或“羧基末端”是指该区域的区域边界，而不管额外的氨基酸残基是否通过该区域外的肽键连接。换言之，多肽区的末端与该区域是否融合到其他肽或多肽无关。例如，包含两个蛋白质区域的融合蛋白，例如包含肽或多肽和志贺菌毒素效应多肽的结合区，可以具有志贺菌毒素效应多肽区，其羧基末端在志贺菌毒素效应多肽区的氨基酸残基251处结束，尽管存在涉及残基251和位置252的氨基酸残基的肽键代表另一个蛋白质区域(例如结合区)的开始。在这个实例中，志贺菌毒素效应多肽区
的羧基末端是指残基251，它不是融合蛋白的末端，而是代表内部的区域边界。因此，对于多肽区，术语“末端”、“氨基末端”和“羧基末端”用于指多肽区的边界，无论该边界是物理末端还是嵌入较大的多肽链的内部位置。
140.短语“志贺菌毒素a1片段的羧基末端区域”是指源自天然存在的志贺菌毒素a1片段的多肽区，该区域以疏水残基(例如，stxa-a1和slt-1a1的v236，以及slt-2a1的v235)开始，其后是疏水残基和以在志贺菌毒素a1片段多肽中保守的弗林蛋白酶切割位点结束的区域，并在天然志贺菌毒素a亚基中的a1片段和a2片段之间的连接处结束。志贺菌毒素a1片段的羧基末端区域包括源自志贺菌毒素a1片段多肽的羧基末端的肽区域，例如包含志贺菌毒素a1片段羧基末端或基本上由其组成的肽区域。源自志贺菌毒素a1片段羧基末端的肽区域的非限制性实例包括天然位于从stx1a(seq id no：2)或slt-1a(seq id no：1)中的位置236至位置239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250或251；在slt-2a(seq id no：3)中从位置235到位置239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250的氨基酸残基序列。
141.关于连接的分子部分和/或结合区的短语“邻近a1片段多肽的羧基末端”是指在定义志贺菌毒素a1片段多肽的最后一个残基的氨基酸残基的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基内。
142.短语“在空间上覆盖a1片段衍生区域的羧基末端”包括与a1片段衍生区域的羧基末端氨基酸残基连接和/或融合的任何大小为4.5kda或更大的分子部分(例如，免疫球蛋白型结合区)，例如源白天然位于stx1a(seq id no：2)或slt-1a(seq id no：1)中第236至251位或slt-2a(seq id no：3)中的235至250位的任意一个的氨基酸残基的氨基酸残基。短语“在空间上覆盖a1片段衍生区域的羧基末端”还包括与在a1片段衍生区域的羧基末端中的氨基酸残基连接和/或融合的大小为4.5kda或更大的任何分子部分(例如，免疫球蛋白型结合区)，例如最后一个氨基酸a1片段衍生区域和/或志贺菌毒素效应多肽的氨基酸残基羧基末端。短语“在空间上覆盖a1片段衍生区域的羧基末端”还包括物理上阻止a1片段衍生区域的羧基末端的细胞识别的大小为4.5kda或更大的任何分子部分(例如，免疫球蛋白型结合区域)，例如通过真核细胞的erad机制的识别。
143.结合区，例如免疫球蛋白型结合区，其包含包含至少四十个氨基酸的多肽并且连接(例如，融合)至包含a1片段衍生区域的志贺菌毒素效应多肽区的羧基末端，所述结合区是“在空间上覆盖a1片段衍生区域的羧基末端”的分子部分。
144.结合区，例如免疫球蛋白型结合区，其包含包含至少四十个氨基酸的多肽并且连接(例如，融合)至包含a1片段衍生区域的志贺菌毒素效应多肽区的羧基末端，所述结合区是“阻碍a1片段衍生区域的羧基末端”的分子部分。
145.术语“志贺菌毒素家族成员的a1片段”是指在志贺毒素a亚基中保守的弗林蛋白酶切割位点，志贺毒素a亚基被弗林蛋白酶蛋白水解后剩余的氨基末端片段，位于野生型志贺菌毒素a亚基a1片段和a2片段之间。
146.短语“a1片段区域羧基末端的弗林蛋白酶切割基序”是指在志贺菌毒素a亚基中保守的特异性弗林蛋白酶切割基序，并桥接在天然存在的志贺菌毒素a亚基中a1片段和a2片段之间的连接处。
147.短语“邻近a1片段区域羧基末端的弗林蛋白酶切割位点”是指在小于定义a1片段
区域或a1片段衍生区域中最后一个氨基酸残基的氨基酸残基的1、2、3、4、5、6、7或更多氨基酸残基的距离内具有氨基酸残基的任何可识别的弗林蛋白酶切割位点，包括位于a1片段区域或a1片段衍生区域羧基末端的弗林蛋白酶切割基序，例如在a1片段衍生区域与分子的另一组分(例如结合分子的分子部分)的连接附近的位置。
148.短语“破坏的弗林蛋白酶切割基序”是指(i)在章节i-b中如本文所述的特定弗林蛋白酶切割基序和(ii)其包含与参考分子相比，可赋予分子弗林蛋白酶切割减少的突变和/或截短，例如与在相同条件下相同测定中观察到的参考分子的弗林蛋白酶切割相比，可重复观察到的弗林蛋白酶切割减少为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或更低(包括100％，无切割)。与参考分子相比，弗林蛋白酶切割的百分比可以表示为目标分子的切割：未切割材料除以参考分子的切割：未切割材料的比值(参见例如wo2015/191764；wo2016/196344)。合适的参考分子的非限制性实例包括包含如本文所述的野生型志贺菌毒素弗林蛋白酶切割基序和/或弗林蛋白酶切割位点的某些分子。
149.短语“弗林蛋白酶切割抗性”是指分子或其特定多肽区域表现出可重现地比(i)野生型志贺菌毒素a亚基中志贺菌毒素a1片段的羧基末端或(ii)构建体的志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端更少的弗林蛋白酶切割，其中天然位于a1和a2片段之间的连接处的天然存在的弗林蛋白酶切割位点未被破坏；如通过技术人员可利用的任何手段，包括通过使用本文所述的方法测定的。
150.短语“源自志贺菌毒素家族成员的a亚基的活性酶结构域”是指具有通过基于志贺菌毒素酶活性的核糖体的催化失活来抑制蛋白质合成的能力的多肽结构。分子结构表现出蛋白质合成抑制活性和/或核糖体催化失活的能力可以使用技术人员已知的各种测定来观察，例如在没有活细胞的情况下涉及rna翻译测定的体外测定或涉及活细胞核糖体的体内测定。例如，使用技术人员已知的测定法，可以通过观察针对核糖体rna(rrna)的n-糖苷酶活性(例如核糖体切口测定)来直接评估和/或通过观察核糖体功能、rna翻译和/或蛋白质合成的抑制来间接评估基于志贺菌毒素酶活性的分子的酶活性。
151.如本文所用，关于志贺菌毒素效应多肽，“组合”描述了志贺毒素效应多肽，其包含两个或更多个亚区，其中每个亚区包含以下中的至少一种：(1)内源性表位或表位区域的破坏；(2)嵌入的异源t细胞表位-肽；(3)插入的异源t细胞表位-肽；和(4)a1片段区域羧基末端的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。
152.如本文所用，“结合分子”与“pd-l1结合分子”互换使用，“pd-l1结合分子”包括“di-slt-1a融合蛋白”和“slt-1a融合蛋白”。所有上述分子类型都包括各种“pd-l1结合蛋白”。
153.pd-l1结合分子
154.本文提供了多种结合pd-l1并包含毒素组分的结合分子(本文称为“pd-l1结合分子”或“多个pd-l1结合分子”。所有上述分子类型都包括各种“pd-l1结合蛋白”)。pd-l1结合分子是有用的，例如，(1)作为细胞毒性分子杀死pd-l1表达细胞，(2)在其他细胞中，选择性杀死特异性pd-l1阳性细胞类型，(3)作为用于将cd8 t细胞表位递送至pd-l1表达细胞的mhc i类呈递途径的递送运载体，(4)作为用于将原子或分子递送至pd-l1表达细胞内部的无毒递送运载体，(5)作为诊断分子，用于诊断、预后或表征涉及pd-l1表达细胞的疾病和病症，和(6)作为治疗分子，用于治疗涉及pd-l1表达细胞的各种疾病、紊乱和病症，如各种癌
症和肿瘤。
155.在一些实施方案中，结合分子包含pd-l1结合免疫球蛋白结构域和志贺菌毒素a亚基效应多肽。志贺菌毒素a亚基效应多肽为工程新型结合分子提供了稳固而强效的支架(参见例如wo 2014/164680，wo 2014/164693，wo 2015/138435，wo 2015/138452，wo 2015/113005，wo 2015/113007，wo 2015/191764，wo 2016/196344，wo 2017/019623，wo 2018/106895和wo 2018/140427)。pd-l1结合免疫球蛋白衍生片段作为细胞靶向部分与志贺菌毒素a亚基效应多肽的缔合使靶向pd-l1的治疗和诊断分子的工程化。
156.i.pd-l1结合分子的通用结构
157.本文所述的pd-l1结合分子各自包含(1)用于细胞靶向的pd-l1结合区和(2)毒素。
158.在一些实施方案中，结合分子包含(1)能够特异性结合与细胞表面缔合的pd-l1的细胞外部分的结合区和(2)毒素效应多肽。在一些实施方案中，结合分子包含(1)能够特异性结合与细胞表面缔合的pd-l1的细胞外部分的结合区和(2)包含志贺菌毒素a亚基效应多肽(在本文中称为“志贺菌毒素效应多肽”)的志贺菌毒素效应多肽区。在一些实施方案中，结合分子包含两个或更多个pd-l1结合区(无论相同或不同)，以及两个或更多个志贺菌毒素效应多肽区(无论相同或不同)。结合分子的一个非限制性实例是融合至免疫球蛋白型结合区的志贺菌毒素效应多肽，所述免疫球蛋白型结合区包含单链可变片段或前述的同源或异源二聚体。本文所述的pd-l1结合分子可以任选地包含t细胞表位，用于递送至靶细胞内部和随后的细胞表面呈递。
159.在一些实施方案中，结合分子是同源二聚体或异源二聚体。在一些实施方案中，结合分子是包含两个单体的同源二聚体，其中每个单体包含pd-l1结合区和志贺菌毒素效应多肽。在一些实施方案中，二聚体结合分子表现出比包含相同结合区和毒素区的单体变体的性质更有利的性质。例如，在一些实施方案中，与单体形式的类似分子相比，二聚体形式的结合分子可以更有效地将抗原表位(即，cd8 t细胞表位)递送至靶细胞。
160.在一些实施方案中，结合分子的志贺菌毒素a亚基效应多肽组合结构元件，在单个分子中产生两种或更多种性质，例如，1)与缺乏特定结构元件的分子变体相比，表现出降低的抗原性和/或免疫原性的能力，2)与缺乏特定结构元件的分子变体相比，表现出降低的蛋白酶切割的能力，3)与缺乏特定元件的分子变体相比，在某些剂量下表现出对多细胞生物体的非特异性毒性降低的能力，4)将嵌入或插入的cd8 t细胞表位递送至细胞的mhc i类系统，用于细胞表面呈递的能力，和/或5)表现出有效的细胞毒性的能力。
161.a.pd-l1结合区
162.在一些实施方案中，pd-l1结合分子包含结合区，所述结合区包含能够表现出与存在于细胞的细胞表面上的人pd-l1和/或pd-l1特异性和高亲和力结合的免疫球蛋白型多肽，所述细胞例如，pd-l1表达细胞或pd-l1阳性细胞。
163.在一些实施方案中，结合分子的结合区是细胞靶向组分，例如能够高亲和力地特异性结合细胞表面上pd-l1靶生物分子的细胞外部分的结构域、分子部分或试剂(即细胞外靶生物分子)。如本文所用，术语“pd-l1结合区”是指能够以高亲和力特异性结合pd-l1分子的细胞外部分的分子部分(例如蛋白质分子)或试剂，例如具有关于pd-l1的解离常数10-5
至10-12
摩尔/升。如本文所用，pd-l1结合是指结合pd-l1的细胞外部分的能力，包括人pd-l1的同种型或变体。
164.靶生物分子的细胞外部分是指当分子物理偶联至细胞时，其结构暴露于细胞外环境的部分，例如当靶生物分子由细胞在细胞表面表达时。在本文中，暴露于细胞外环境意味着靶生物分子的一部分可被例如抗体或至少比抗体小的结合部分，如单域抗体结构域、纳米抗体、源自骆驼科动物或软骨鱼类的重链抗体结构域、单链可变片段或任何数量的免疫球蛋白的工程化备选支架接近(见下文)。与细胞物理偶联的靶生物分子的一部分暴露于细胞外环境或可接近性可以由技术人员使用本领域熟知的方法凭经验确定。
165.在一些实施方案中，结合分子包含结合区，所述结合区包含能够选择性和特异性结合pd-l1的细胞外部分的一种或多种多肽。
166.在一些实施方案中，pd-l1结合区是免疫球蛋白型结合区。在一些实施方案中，免疫球蛋白型pd-l1结合区衍生自免疫球蛋白pd-l1结合区，例如能够结合pd-l1细胞外部分的抗体互补位。该工程化多肽可以任选地包括多肽支架，所述多肽支架包含或基本上由来自如本文所述的免疫球蛋白的互补决定区和/或抗原结合区组成。
167.在一些实施方案中，pd-l1结合区包含重链可变区(hvr-h)，所述重链可变区(hvr-h)包含三个cdr，每个与seq id no：22-24和27-32中的任一项具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id no：22-24和27-32中任一项所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，结合区进一步包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，每个与seq id no：19、seq id no：20、seq id no：21、seq id n0：25和seq id no：26中的任一项具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id n0：19、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：25和seq id no：26中任一项所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，结合区进一步包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，与seq id no：19、seq id no：20和seq id no：21具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id no：19、seq id no：20和seq id no：21中任一项所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，结合区进一步包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，与seq id no：25、seq id no：20和seq id no：21具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id no：25、seq id no：20和seq id no：21中任一项所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，结合区进一步包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，与seq id no：19、seq id no：20和seq id no：26具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id no：19、seq id no：20和seq id no：26中任一项所示的氨基酸序列组成。
168.在一些实施方案中，pd-l1结合区包含重链可变区(hvr-h)，所述重链可变区(hvr-h)包含三个cdr，每个与seq id n0：22-24和27-32中的任一项具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id no：22-24和27-32中任一项所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，结合区进一步包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，与seq id no：19、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：25和seq id no：26具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id n0：19、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：25和seq id no：26中任一项所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案
中，结合区进一步包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，与seq id no：19、seq id no：20和seq id no：26具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id no：19、seq id no：20和seq id no：26中任一项所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，结合区包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，每个cdr包含或基本上由seq id no：19、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：25和seq id no：26中任一项所示的氨基酸序列组成；和(b)重链可变区(hvr-h)，所述重链可变区(hvr-h)包含三个cdr，每个cdr包含或基本上由seq id no：22-24和27-32中任一项所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，结合区包括：a)重链可变区(hvr-h)，其包含(i)hcdr1，所述hcdr1包含或基本上由，或由seq id no：27的氨基酸序列组成；(ii)hcdr2，所述hcdr2包含、基本上由或由seq id no：29或30的氨基酸序列组成；和(iii)hcdr3，所述hcdr3包含、基本上由或由seq id no：32的氨基酸序列组成；和/或b)轻链可变区(hvr-l)，其包含(i)lcdr1，所述lcdr1包含、基本上由或由seq id no：19的氨基酸序列组成；(ii)lcdr2，所述lcdr2包含、基本上由或由seq id no：20的氨基酸序列组成；和(iii)lcdr3，所述lcdr3包含、基本上由或由seq id no：26的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，结合区包括：a)重链可变区(hvr-h)，其包含(i)hcdr1，所述hcdr1由seq id no：27的氨基酸序列组成；(ii)hcdr2，所述hcdr2由seq id no：29或30的氨基酸序列组成；和(iii)hcdr3，所述hcdr3由seq id no：32的氨基酸序列组成；和b)轻链可变区(hvr-l)，其包含(i)lcdr1，所述lcdr1由seq id no：19的氨基酸序列组成；(ii)lcdr2，所述lcdr2由seq id no：20的氨基酸序列组成；和(iii)lcdr3，所述lcdr3由seq id no：26的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，结合区包括：a)重链可变区(hvr-h)，其包含(i)hcdr1，所述hcdr1由seq id no：27的氨基酸序列组成；(ii)hcdr2，所述hcdr2由seq id no：29的氨基酸序列组成；和(iii)hcdr3，所述hcdr3由seq id no：32的氨基酸序列组成；和b)轻链可变区(hvr-l)，其包含(i)lcdr1，所述lcdr1由seq id no：19的氨基酸序列组成；(ii)lcdr2，所述lcdr2由seq id no：20的氨基酸序列组成；和(iii)lcdr3，所述lcdr3由seq id no：26的氨基酸序列组成。
169.在一些实施方案中，结合区包括：(a)轻链区，所述轻链区与seq id no：33、35-36和38中的任一项具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或基本上由seq id no：33、35-36和38中任一项的氨基酸序列组成；和/或(b)重链区，所述重链区与seq id no：34、37和39中的任一项具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或基本上由seq id no：34、37和39中任一项的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，结合区包含多肽，所述多肽与seq id no：85-107和156-157中的任一项具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或基本上由seq id no：85-107和156-157中任一项所示的多肽组成。在一些实施方案中，结合区是单链可变片段，例如由、包含或基本上由seq id no：85-107和156-157中任一项的多肽组成。在一些实施方案中，结合区包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，每个cdr包含或基本上由、或由seq id no：33、seq id no：35、seq id no：36和seq id no：38中任一项所示的氨基酸序列组成；和(b)重链可变区(hvr-h)，所述重链可变区(hvr-h)包含三个cdr，每个cdr包含或基本上由、或由seq id no：34、seq id no：37和seq id no：39中任一项所示的氨基酸序列组成。
170.在一些实施方案中，结合分子的结合区可以是例如单克隆抗体或工程化抗体衍生物。在一些实施方案中，结合区是抗体片段，例如，fv、fab、fab
′
、scfv、双抗体、fab
′‑
sh或f(ab
′
)2片段。在另一个实施方案中，结合区是全长抗体，例如完整的igg1抗体或本文定义和/或技术人员已知的其他抗体类别或同种型。抗体的“类别”是指存在于重链中的恒定结构域或恒定区的类型。有五类主要的抗体：iga、igd、ige、igg和igm，这些中的几个可进一步分为同种型，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
171.在一些实施方案中，结合区是合成工程化的抗体衍生物，例如，例如自主vh结构域(例如，来自骆驼科动物、鼠科动物或人类来源)、单域抗体结构域(sdab)、源自骆驼科动物的重链抗体结构域(vhh片段或vh结构域片段)、源自骆驼科动物的vhh片段或vh结构域片段的重链抗体结构域、源自软骨鱼的重链抗体结构域、免疫球蛋白新抗原受体(，ignar)、v
nar
片段、单链可变(scfv)片段、纳米抗体、包含vh结构域的“骆驼科动物化”支架、由重链和ch1结构域组成的fd片段、单链fv-ch3微抗体(minibody)、fc抗原结合结构域(fcabs)、scfv-fc融合体、多聚化scfv片段(双抗体、三链抗体、四抗体)、二硫键稳定的抗体可变(fv)片段(dsfv)，由v
l
、vh、c
l
和ch1结构域组成的二硫键稳定的抗原结合(fab)片段、包含二硫键稳定的重链和轻链的单链可变区片段(sc-dsfv)、二价纳米抗体、二价微抗体、二价f(ab
′
)2片段(fab二聚体)、双特异性串联vhh片段、双特异性串联scfv片段、双特异性纳米抗体、双特异性微抗体、fab-fcab(mab2′
)，以及保留其互补位和结合功能的前述内容的任何遗传操作的对应物，例如，其中重链和轻链的相对方向或顺序被颠倒或“翻转”。
172.根据一个具体但非限制性的方面，结合区可以包括免疫球蛋白型结合区。如本文所用，术语“免疫球蛋白型结合区”是指能够结合一种或多种靶生物分子例如抗原或表位的多肽区。结合区可以通过它们与靶标分子结合的能力在功能上定义。免疫球蛋白型结合区通常来源于抗体或抗体样结构。
173.免疫球蛋白(ig)蛋白具有称为ig结构域的结构结构域。ig结构域的长度范围为约70-110个氨基酸残基，并具有特征性的ig折叠，其中通常7至9条反平行β链排列成两个β折叠，形成三明治样结构。ig折叠通过夹心内表面上的疏水性氨基酸相互作用和链中半胱氨酸残基之间高度保守的二硫键来稳定。ig结构域可以是可变的(igv或v-set)、恒定的(igc或c-set)或中间的(igi或i-set)。一些ig结构域可能与互补决定区(cdr)相关，也称为“互补决定区”，这对于抗体与其表位结合的特异性很重要。ig样结构域也发现于非免疫球蛋白蛋白质中，并在此基础上被分类为蛋白质ig超家族的成员。hugo基因命名委员会(hgnc)提供了包含ig样结构域家族的成员列表。
174.免疫球蛋白型结合区可以是抗体或其抗原结合片段的多肽序列，其中氨基酸序列已不同于天然抗体或非免疫球蛋白蛋白质的ig样结构域的氨基酸序列，例如通过通过文库筛选进行分子工程化或选择。由于重组dna技术和体外文库筛选在免疫球蛋白型结合区产生中的相关性，可以重新设计抗体以获得所需的特性，例如更小的尺寸、细胞进入或其他体内和/或治疗应用的改进。可能的变异(variation)有很多，范围可以从仅改变一个氨基酸到完全重新设计，例如，可变区。通常，为了改善抗原结合特性、改善可变区稳定性或降低免疫原性反应的潜力，将对可变区进行改变。
175.有许多免疫球蛋白型结合区被认为是本文所述分子的组分。在一些实施方案中，
免疫球蛋白型结合区源自免疫球蛋白结合区，例如能够结合pd-l1的细胞外部分的抗体互补位。在某些其他实施方案中，免疫球蛋白型结合区包含非衍生自任何免疫球蛋白结构域但通过提供与pd-l1的细胞外部分的高亲和力结合而发挥类似于免疫球蛋白结合区的功能的工程化多肽。该工程化多肽可以任选地包括多肽支架，所述多肽支架包含或基本上由本文所述的来自免疫球蛋白的互补决定区组成。
176.现有技术中还有许多结合区可用于通过它们的高亲和力结合特征将多肽靶向特定细胞类型。在一些实施方案中，结合分子的结合区选自包括自主vh结构域、单域抗体结构域(sdab)、源自骆驼科动物的重链抗体结构域(vhh片段或vh结构域片段)、源自骆驼科动物vhh片段或vh结构域片段的重链抗体结构域、来自软骨鱼类的重链抗体结构域、免疫球蛋白新抗原受体(ignar)、v
na
r片段、单链可变(scfv)片段、纳米抗体、由重链和ch1结构域组成的fd片段、单链fv-ch3微抗体、二聚体ch2结构域片段(ch2d)、fc抗原结合结构域(fcabs)、分离的互补决定区3(cdr3)片段、约束的框架区3、cdr3、框架区4(fr3-cdr3-fr4)多肽、小模块化免疫药物(smip)结构域、scfv-fc融合体、多聚化scfv片段(双抗体、三链抗体、四抗体)、二硫键稳定的抗体可变(fv)片段、由v
l
、vh、c
l
和ch1结构域组成的二硫键稳定的抗原结合(fab)片段、二价纳米抗体、二价微抗体、二价f(ab
′
)2片段(fab二聚体)，双特异性串联vhh片段、双特异性串联scfv片段、双特异性纳米抗体、双特异性微抗体和保留其互补位和结合功能的前述内容的任何遗传操作的对应物，例如其中重链和轻链的相对方向或顺序是被颠倒或翻转(参见ward e等人，nature 341：544-6(1989)；davies j，riechmann l，biotechnology(ny)13：475-9(1995)；reiter y et al.，mol biol 290：685-98(1999)；riechmann l，muyldermans s，j immunol methods 231：25-38(1999)；tanha j等人，j immunol methods 263：97-109(2002)；vranken w等人，biochemistry 41：8570-9(2002)；jespers l等人，j mol biol 337：893-903(2004)；jespers l等人，nat biotechnol 22：1161-5(2004)；to r等人，jbiol chem 280：41395-403(2005)；saerens d等人，curr opin pharmacol 8：600-8(2008)；dimitrov d，mabs 1：26-8(2009)；weiner l，cell 148：1081-4(2012)；ahmad z等人，clin dev immunol 2012：980250(2012))。
177.有多种结合区包含衍生自免疫球蛋白恒定区的多肽，例如工程化二聚体fc结构域、单体fc(mfc)、scfv-fc、vhh-fc、ch2结构域、单体ch3s结构域(mch3s)，合成重编程的免疫球蛋白结构域，和/或免疫球蛋白结构域与配体的混合融合体(hofer t等人，proc natl acad sci us.a.105：12451-6(2008)；xiao j等人，jam chem soc 131：13616-13618(2009)；xiao x等人，biochem biophys res commun 387：387-92(2009)；wozniak-knopp g等人，protein eng des sel 23289-97(2010)；gong r等人，plos one 7：e42288(2012)；wozniak-knopp g等人，plos one 7：e30083(2012)；ying t等人，j biol chem 287：19399-408(2012)；ying t等人，j biol chem 288：25154-64(2013)；chiang m等人，jam chem soc 136：3370-3(2014)；rader c，trends biotechnol 32：186-97(2014)；ying t等人，biochimica biophys acta 1844：1977-82(2014))。
178.在一些实施方案中，结合分子的结合区是完整抗体和/或包含fc区。术语“fc区”是指片段可结晶区的一部分，天然免疫球蛋白的某些重链的c末端邻近区，其包含恒定区的至少一部分，例如至少第二和第三恒定(ch)结构域和糖基化位点。然而，如本文所用，术语“fc区”包括天然序列fc区和其变体或突变的fc区或其片段。除非本文另有说明，否则fc区或恒
定区中氨基酸残基的编号是根据eu编号系统，也称为eu索引，如kabat，e.a.，sequences of proteins of immunological interest，第五版public health service，national institutes of health，bethesda，md，usa(1991)中所描述的。
179.根据某些其他实施方案，结合区包含免疫球蛋白结构域的工程化备选支架。工程化的备选支架是本领域已知的，其表现出与免疫球蛋白衍生结构相似的功能特征，例如靶生物分子的高亲和力和特异性结合，并且可能为某些免疫球蛋白结构域提供改进的特征，例如更高的稳定性或降低的免疫原性。通常，免疫球蛋白的备选支架小于20千道尔顿，由单一多肽链组成，缺乏半胱氨酸残基，并表现出相对较高的热力学稳定性。
180.任何上述pd-l1结合分子可适合用作pd-l1结合区或经修饰以产生一个或多个pd-l1结合区以用于结合分子。任何上述结合区结构都可以用作分子的组分，只要结合区组分对pd-l1分子的细胞外部分的解离常数为10-5
至10-12
摩尔/升，优选小于200纳摩尔(nm)。
181.b.志贺菌毒素效应多肽
182.结合分子包含至少一种毒素组分。在一些实施方案中，结合分子包含毒素组分，所述毒素组分是源自志贺菌毒素a亚基的志贺菌毒素效应多肽。志贺菌毒素效应多肽是衍生自志贺菌毒素家族的志贺菌毒素a亚基成员的多肽，其能够表现出一种或多种志贺菌毒素功能(参见例如，cheung m等人，mol cancer 9：28(2010)；wo 2014/164680，wo 2014/164693，wo 2015/138435，wo 2015/138452，wo 2015/113005，wo 2015/113007，wo 2015/191764，wo 2016/196344，wo 2017/019623，wo 2018/106895和wo 2018/140427)。志贺菌毒素功能包括，例如，增加细胞内化、指导从内体区室到胞质溶胶的亚细胞按路线发送、避免细胞内降解、催化灭活核糖体以及实现细胞抑制和/或细胞毒性作用。
183.在一些实施方案中，本文所述的结合分子包含志贺菌毒素效应多肽，其包含seq id no：1-18、40-68、169、170或173中的任一项。在一些实施方案中，本文所述的结合分子包含志贺菌毒素效应多肽，其包含seq id no：1-18、40-68、169、170或173中任一项的变体。在一些实施方案中，本文所述的结合分子包含志贺菌毒素效应多肽，所述志贺菌毒素效应多肽包含与seq id no：1-18、40-68、169、170或173中的任一项具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的结合分子包含志贺菌毒素效应多肽，所述贺菌毒素效应多肽包含具有一个或多个突变，例如2、3、4、5、6、7、8或10个突变的seq id no：1-18、40-68、169、170或173中的任一项。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应子包含具有1-5、5-10、11-5、15-20、10-25、25-30，或超过30个突变的seq id no：1-18、40-68、169、170或173。在一些实施方案中，本文所述的结合分子包含志贺菌毒素效应多肽，所述志贺菌毒素效应多肽包含seq id no：1-18、40-68、169、170或173中任一项的变体，其中所述变体包含s45c突变。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽中的突变使多肽催化失活。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽中的突变不影响多肽的催化活性。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽中的突变增加了多肽的催化活性。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽中的突变降低了多肽的催化活性。
184.在一些实施方案中，本文所述的结合分子包含志贺菌毒素效应多肽seq id no：41。在一些实施方案中，本文所述的结合分子包含志贺菌毒素效应多肽，所述志贺菌毒素效应多肽是seq id no：41的变体。在一些实施方案中，本文所述的结合分子包含志贺菌毒素效应多肽，所述志贺菌毒素效应多肽包含与seq id no：41具有至少90％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的结合分子包含志贺菌毒素效应多肽，所述志贺菌毒素效应多肽包含具有一个或更多个突变，例如2、3、4、5、6、7、8或10个突变的seq id no：41。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应子包含具有1-5、5-10、11-5、15-20、10-25、25-30或超过30个突变的seq id no：41。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽中的突变使多肽催化失活。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽中的突变不影响多肽的催化活性。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽中的突变增加了多肽的催化活性。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽中的突变降低了多肽的催化活性。
185.在一些实施方案中，志贺菌毒素效应子包含seq id no：41加e167d突变、r170s突变或e167d和r170s突变两者。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应子包含seq id no：167、170或173中的任一项。
186.蛋白质毒素的志贺菌毒素家族由各种天然存在的毒素组成，这些毒素在结构和功能上相关，例如志贺菌毒素、志贺样毒素1和志贺样毒素2(johannes l，w，nat rev microbiol 8：105-16(2010))。志贺菌毒素家族的全毒素成员包含优先结合某些宿主细胞表面上存在的特定鞘糖脂的靶向结构域和一旦进入细胞内就能够永久灭活核糖体的酶促结构域(johannes l，w，nat rev microbiol 8：105-16(2010))。志贺菌毒素家族的成员具有相同的整体结构和作用机制(engedal n等人，microbial biotech 4：32-46(2011))。例如，stx、slt-1和slt-2在无细胞系统中显示出无法区分的酶活性(head s等人，jbiol chem 266：3617-21(1991)；tesh v等人，infect immun 61：3392-402(1993)；brigotti m等人，toxicon 35：1431-1437(1997))。
187.志贺菌毒素家族包括分离自痢疾杆菌(s.dysenteriae)血清型1的真志贺菌毒素(stx)、分离自肠出血性大肠杆菌血清型的志贺样毒素1变体(slt1或stx1或slt-1或slt-i)，以及分离自肠出血性大肠杆菌血清型的志贺菌毒素2变体(slt2或stx2或slt-2)。slt1与stx仅相差一个氨基酸残基，两者都被称为vero细胞毒素(verocytotoxins)或vero毒素(verotoxins)(vt)(o’brien a，curr top microbiol immunol 180：65-94(1992))。尽管slt1和slt2变体在一级氨基酸序列水平上彼此只有约53-60％相似，但它们具有志贺菌毒素家族成员共有的酶活性和细胞毒性机制(johannes l，w，natrevmicrobiol 8：105-16(2010))。已经描述了超过39种不同的志贺菌毒素，例如定义的亚型stx1a、stx1c、stxld和stx2a-g(scheutz f et al.，j clinmicrobiol 50：2951-63(2012))。志贺毒素家族的成员自然不限于任何细菌物种，因为志贺菌毒素编码基因可以通过水平基因转移在细菌物种之间传播(strauch e等人，infect immun 69：7588-95(2001)；bielaszewska m等人，appl environ micrbiol 73：3144-50(2007)；zhaxybayeva o，doolittle w，currbiol 21：r242-6(2011))。作为种间转移的实例，在从患者分离的溶血性不动杆菌(a.haemolyticus)菌株中发现了志贺菌毒素(grotiuz g等人，j clin microbiol 44：3838-41(2006))。一旦志贺菌毒素编码多核苷酸进入新的亚种或物种，志贺菌毒素氨基酸序列被推定能够由于遗传漂移和/或选择压力而产生轻微的序列变异，同时仍保持志贺菌毒素家族成员共有的细胞毒性机制(参见scheutz f等人，j clin microbiol 50：2951-63(2012))。
188.在本文所述的pd-l1结合分子的一些实施方案中，志贺菌毒素a亚基效应多肽组分
包含以下志贺菌毒素效应多肽亚区中的两个或更多个的组合：(1)去免疫亚区，(2)志贺毒素a1片段区羧基末端附近的蛋白酶切割抗性亚区，和(3)t胞表位-肽嵌入或插入的亚区。
189.1.去免疫的志贺菌毒素a亚基效应多肽
190.在一些实施方案中，结合分子的志贺菌毒素效应多肽是去免疫的，例如与野生型志贺菌毒素、野生型志贺菌毒素多肽和/或仅包含野生型多肽序列的志贺菌毒素效应多肽相比。志贺菌毒素效应多肽和/或志贺菌毒素a亚基多肽，无论是否天然存在，都可以通过本文描述的方法去免疫，所述方法描述于wo 2015/113005、wo 2015/113007、wo 2016/196344和wo 2018/140427，和/或技术人员已知的方法，其中所得分子保留一种或多种志贺菌毒素a亚基功能。去免疫的志贺菌毒素效应多肽可以包含至少一个推定的内源性表位区的破坏，以在将多肽施用至脊索动物后降低志贺菌毒素效应多肽的抗原性和/或免疫原性潜力。
191.在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含内源性表位或表位区的破坏，例如b细胞和/或cd4 t细胞表位。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含对本文所述的至少一个内源性表位区的破坏，其中在将多肽施用至脊索动物后，该破坏降低志贺菌毒素效应多肽的抗原性和/或免疫原性潜力，并且其中志贺菌毒素效应多肽能够表现出一种或多种志贺菌毒素a亚基功能，例如显著水平的志贺菌毒素细胞毒性。
192.如本文所用的关于表位区的术语“破坏的”或“破坏”是指表位区中至少一个氨基酸残基的缺失、两个或更多个氨基酸残基的倒位，其中至少一个倒位的氨基酸残基在表位区中，将至少一个氨基酸插入表位区，以及在表位区域中至少一个氨基酸残基的置换。由突变引起的表位区破坏包括用非标准氨基酸和/或非天然氨基酸进行的氨基酸置换。备选地，表位区域可以被突变破坏，所述突变包括通过添加掩蔽表位区中的至少一个氨基酸的共价连接的化学结构来修饰氨基酸，参见例如聚乙二醇化(参见zhang c等人，biodrugs 26：209-15(2012)，小分子佐剂(flower d，expert opin drug discov 7：807-17(2012)和位点特异性白蛋白化(albumination)(lim s等人，j control release 207-93(2015))。
193.某些表位区和破坏在本文中通过参考序列表中提供的天然志贺菌毒素a亚基的特定氨基酸位置来指示，注意天然存在的志贺菌毒素a亚基可以包含在其氨基末端处含有约22个氨基酸的信号序列的前体形式，所述信号序列被去除以产生成熟的志贺菌毒素a亚基并且技术人员可识别。此外，某些表位区的破坏在本文中通过参考天然存在于天然志贺菌毒素a亚基内的特定位置的特定氨基酸(例如s代表丝氨酸残基)(例如s33代表氨基末端33位的丝氨酸残基)来指示，随后是在讨论的特定突变中该残基已其被取代的氨基酸(例如，s33i表示在氨基末端的第33位氨基酸残基处用异亮氨酸取代丝氨酸)。
194.在一些实施方案中，去免疫的志贺菌毒素效应多肽包含对本文提供的至少一个表位区的破坏。在一些实施方案中，去免疫的志贺菌毒素效应多肽包含在wo 2015/113005或wo 2015/113007中描述的至少一个表位区的破坏。
195.在一些实施方案中，去免疫的志贺菌毒素效应多肽包含或基本上由全长志贺菌毒素a亚基(例如slt-1a(seq id no：1)、stxa(seq id no：2)或slt-2a(seq id no：3))组成，所述全长志贺菌毒素a亚基包含至少一个氨基酸序列破坏，所述氨基酸序列选自由以下天然定位的氨基酸组成的组：seq id no：1或seq id no：2的1-15；seq id no：3的3-14；seq id no：3的26-37；seq id no：1或seq id no：2的27-37；seq id no：1或seq id no：2的39-48；seq id no：3的42-48；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的53-66；seq id no：
1、seq id no：2或seq id no：3的94-115；seq id no：1或seq id no：2的141-153；seq id no：3的140-156；seq id no：1或seq id no：2的179-190；seq id no：3的179-191；seq id no：3的204；seq id no：1或seq id no：2的205；seq id no：3的210-218；seq id no：3的240-258；seq id no：1或seq id no：2的243-257；seq id no：1或seq id no：2的254-268；seq id no：3的262-278；seq id no：3的281-297；和seq id no：1或seq id no：2的285-293，或志贺菌毒素a亚基多肽、保守的志贺菌毒素效应多肽亚区和/或非天然志贺菌毒素效应多肽序列中的等效位置。
196.在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含seq id no：169的序列。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含seq id no：170的序列。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含seq id no：173的序列。
197.在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含或基本上由截短的志贺菌毒素a亚基组成。志贺菌毒素a亚基的截短可能导致整个表位区的缺失而不影响志贺菌毒素效应子功能。示出的显示显著酶活性的最小的志贺菌毒素a亚基片段是由stxa的残基75-247组成的多肽(al-jaufy a等人，infect immun 62：956-60(1994))。将slt-1a、stxa或slt-2a的羧基末端截短为氨基酸1-251会去除两个预测的b细胞表位区、两个预测的cd4阳性(cd4 )t细胞表位和预测的不连续b细胞表位。将slt-1a、stxa或slt-2a的氨基末端截短至75-293会去除至少三个预测的b细胞表位区和三个预测的cd4 t细胞表位。将slt-1a、stxa或slt-2a的氨基末端和羧基末端两者截短至75-251会缺失至少五个预测的b细胞表位区；四个推定的cd4 t细胞表位；和一个预测的不连续的b细胞表位。
198.在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含或基本上由在提供的表位区中具有至少一个突变(例如的缺失、插入、倒位或置换)的全长或截短的志贺菌毒素a亚基组成。在一些实施方案中，多肽包含破坏，所述破坏包含表位区内至少一个氨基酸的缺失。在一些实施方案中，多肽包含破坏，所述破坏包含在表位区内至少一个氨基酸的插入。在一些实施方案中，多肽包含破坏，所述破坏包含氨基酸的倒位，其中至少一个倒位氨基酸位于表位区内。在一些实施方案中，多肽包含破坏，所述破坏包含突变，例如氨基酸置换为非标准氨基酸或具有化学修饰的侧链的氨基酸。
199.在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含或基本上由与天然序列相比具有一个或多个突变的全长或截短的志贺菌毒素a亚基组成，所述突变包含选自由以下组成的组的至少一个氨基酸置换：a、g、v、l、i、p、c、m、f、s、d、n、q、h和k。在一些实施方案中，多肽包含或基本上由与天然序列相比具有单个突变的全长或截短的志贺菌毒素a亚基组成，其中置换选自由以下组成的组：d到a，d到g，d到v，d到l，d到i，d到f，d到s，d到q，e到a，e到g，e到v，e到l，e到i，e到f，e到s，e到q，e到n，e到d，e到m，e到r，g到a，h到a，h到g，h到v，h到l，h到i，h到f，h到m，k到a，k到g，k到v，k到l，k到i，k到m，k到h，l到a，l到g，n到a，n到g，n到v，n到l，n到i，n到f，p到a，p到g，p到f，r到a，r到g，r到v，r到l，r到i，r到f，r到m，r到q，r到s，r到k，r到h，s到a，s到g，s到v，s到l，s到i，s到f，s到m，t到a，t到g，t到v，t到l，t到i，t到f，t到m，t到s，y到a，y到g，y到v，y到l，y到i，y到f，和y到m。
200.在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含或基本上由与天然氨基酸残基序列相比具有一个或多个突变的全长或截短的志贺菌毒素a亚基组成，所述突变包含免疫原性残基和/或表位区内至少一个氨基酸的置换，其中至少一个置换发生在选自由以下组成的
组的天然定位的氨基酸组：seq id no：1或seq id no：2的1；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的4；seq id n0：1、seq id no：2或seq id no：3的8；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的9；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的11；seq id no：1或seq id no：2的33；seq id n0：1或seq id no：2的43；seq id no：1或seq id no：2的44；seq id no：1或seq id no：2的45；seq id no：1或seq id no：2的46；seq id no：1或seq id no：2的47；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的48；seq id no：1或seq id no：2的49；seq id no：1或seq id no：2的50；seq id no：1或seq id no：2的51；seq id no：1或seq id no：2的53；seq id no：1或seq id no：2的54；seq id no：1或seq id no：2的55；seq id no：1或seq id no：2的56；seq id no：1或seq id no：2的57；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的58；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的59；seq id no：1或seq id no：2的60；seq id no：1或seq id no：2的61；seq id no：1或seq id no：2的62；seq id no：1或seq id no：2的84；seq id no：1或seq id n0：2的88；seq id n0：1、seq id no：2或seq id no：3的94；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的96，seq id no：1或seq id no：2的104；seq id no：1或seq id no：2的105；seq id no：1或seq id no：2的107；seq id no：1或seq id no：2的108；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的109；seq id no：1或seq id no：2的110；seq id no：1或seq id no：2的111；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的112；seq id no：1或seq id no：2的141；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的147；seq id no：1或seq id no：2的154；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的179；seq id no：1或seq id no：2的180；seq id no：1或seq id no：2的181；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的183；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的184；seq id no：1或seq id no：2的185；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的186，seq id no：1或seq id no：2的187；seq id no：1或seq id no：2的188；seq id no：1或seq id no：2的189；seq id no：1或seq id no：2的198；seq id no：3的204；seq id no：1或seq id no：2的205；seq id no：3的241；seq id no：1或seq id no：2的242；seq id no：1或seq id no：2的247；seq id no：3的247；seq id no：1或seq id n0：2的248；seq id no：3的250；seq id no：1或seq id no：2的251；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的264；seq id no：1或seq id no：2的265；和seq id no：1或seq id no：2的286。
201.在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含或基本上由具有免疫原性残基和/或表位区内至少一个置换的全长或截短的志贺菌毒素a亚基组成，其中至少一个氨基酸置换是相对于位于以下天然位置中的一个的天然存在的氨基酸的置换为非保守氨基酸(参见，例如，下文表4)：seq id n0：1或seq id no：2的1；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的4；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的8；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的9；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的11；seq id no：1或seq id no：2的33；seq id no：1或seq id no：2的43；seq id no：1或seq id no：2的44；seq id n0：1或seq id n0：2的45；seq id no：1或seq id no：2的46；seq id no：1或seq id no：2的47；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的48；seq id no：1或seq id no：2的49；seq id no：1或seq id no：2的50；seq id no：1或seq id no：2的51；seq id no：1或seq id no：2的53；seq id no：1或seq id n0：2的54；seq id no：1或seq id no：2的55；seq id no：1或seq id no：2的56；seq id no：1或seq id no：2的57；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的
58；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的59；seq id no：1或seq id no：2的60；seq id no：1或seq id no：2的61；seq id no：1或seq id no：2的62；seq id no：1或seq id no：2的84；seq id no：1或seq id n0：2的88；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的94；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的96，seq id no：1或seq id no：2的104；seq id no：1或seq id no：2的105；seq id no：1或seq id no：2的107；seq id no：1或seq id no：2的108；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的109；seq id no：1或seq id no：2的110；seq id no：1或seq id no：2的111；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的112；seq id no：1或seq id no：2的141；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的147；seq id no：1或seq id no：2的154；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的179；seq id no：1或seq id no：2的180；seq id no：1或seq id no：2的181；seq id no：1、seq id no：2或seq id n0：3的183；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的184；seq id no：1或seq id no：2的185；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的186，seq id no：1或seq id no：2的187；seq id no：1或seq id no：2的188；seq id no：1或seq id no：2的189；seq id no：1或seq id no：2的198；seq id no：3的204；seq id no：1或seq id no：2的205；seq id n0：3的241；seq id no：1或seq id no：2的242；seq id no：1或seq id no：2的247；seq id no：3的247；seq id no：1或seq id no：2的248；seq id no：3的250；seq id no：1或seq id no：2的251；seq id n0：1、seq id no：2或seq id n0：3的264；seq id no：1或seq id no：2的265；和seq id no：1或seq id no：2的286。
202.在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含或基本上由具有选自由以下组成的组的至少一个氨基酸置换的全长或截短的志贺菌毒素a亚基组成：k1到a、g、v、l、i、f、m和h；t4到a、g、v、l、i、f、m和s；d6到a、g、v、l、i、f、s和q；s8到a、g、v、i、l、f和m；t8到a、g、v、i、l、f、m和s；t9到a、g、v、i、l、f、m和s；s9到a、g、v、l、i、f和m；k11到a、g、v、l、i、f、m和h；t12到a、g、v、i、l、f、m和s；s33到a、g、v、l、i、f和m；s43到a、g、v、l、i、f和m；g44到a和l；s45到a、g、v、l、i、f和m；t45到a、g、v、l、i、f和m；g46到a和p；d47到a、g、v、l、i、f、s和q；n48到a、g、v、l和m；l49到a或g；f50；a51到v；d53到a、g、v、l、i、f、s和q；v54到a、g和l；r55到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；g56到a和p；157到a、g、m和f；l57到a、g、m和f；d58到a、g、v、l、i、f、s和q；p59到a、g和f；e60到a、g、v、l、i、f、s、q、n、d、m和r；e61到a、g、v、l、i、f、s、q、n、d、m和r；g62到a；d94到a、g、v、l、i、f、s和q；r84到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；v88到a和g；i88到a、g和v；d94；s96到a、g、v、i、l、f和m；t104到a、g、v、i、l、f、m和s；a105到l；t107到a、g、v、i、l、f、m和s；s107到a、g、v、l、i、f和m；l108到a、g和m；s109到a、g、v、i、l、f和m；t109到a、g、v、i、l、f、m和s；g110到a；d111到a、g、v、l、i、f、s和q；s112到a、g、v、l、i、f和m；d141到a、g、v、l、i、f、s和q；g147到a；v154到a和g；r179到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；t180到a、g、v、l、i、f、m和s；t181到a、g、v、l、i、f、m和s；d183到a、g、v、l、i、f、s和q；d184到a、g、v、l、i、f、s和q；l185到a、g和v；s186到a、g、v、i、l、f和m；g187到a；r188到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；s189到a、g、v、i、l、f和m；d197到a、g、v、l、i、f、s和q；d198到a、g、v、l、i、f、s和q；r204到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；r205到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；c242到a、g、v和s；s247到a、g、v、i、l、f和m；y247到a、g、v、l、i、f和m；r248到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；r250到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；r251到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；c262到a、g、v和s；d264到a、g、v、l、i、f、s和q；g264到a；和t286到a、g、v、l、i、f、m和s。
203.在一些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含或基本上由具有以下氨基酸置换中的至少一个的全长或截短的志贺菌毒素a亚基组成：k1a，k1m，t4i，d6r，s8i，t8v，到t9i，s9i，k11a，k11h，t12k，s33i，s33c，s43n，g44l，s45v，s45i，t45v，t45i，g46p，d47m，d47g，n48v，n48f，l49a，f50t，a51v，d53a，d53n，d53g，v54l，v54i，r55a，r55v，r55l，g56p，i57f，i57m，d58a，d58v，d58f，p59a，p59f，e60i，e60t，e60r，e61a，e61v，e61l，g62a，r84a，v88a，d94a，s96i，t104n，a105l，t107p，l108m，s109v，t109v，g110a，d111t，s112v，d141a，g147a，v154a，r179a，t180g，t181i，d183a，d183g，d184a，d184a，d184f，l185v，l185d，s186a，s186f，g187a，g187t，r188a，r188l，s189a，d198a，r204a，r205a，c242s，s247i，y247a，r248a，r250a，r251a，or d264a，g264a，t286a，和/或t286i。这些表位破坏性置换可以组合以形成去免疫的志贺菌毒素效应多肽，具有每个表位区的多个置换和/或多个表位区被破坏，同时仍保留志贺菌毒素效应子功能。例如，在天然定位的k1a，k1m，t4i，d6r，s8i，t8v，t9i，s9i，k11a，k11h，t12k，s33i，s33c，s43n，g44l，s45v，s45i，t45v，t45i，g46p，d47m，d47g，n48v，n48f，l49a，f50t，a51v，d53a，d53n，d53g，v54l，v54i，r55a，r55v，r55l，g56p，i57f，i57m，d58a，d58v，d58f，p59a，p59f，e60i，e60t，e60r，e61a，e61v，e61l，g62a，r84a，v88a，d94a，s96i，t104n，a105l，t107p_，l108m，s109v，t109v，g110a，d111t，s112v，d141a，g147a，v154a，r179a，t180g，t181i，d183a，d183g，d184a，d184a，d184f，l185v，l185d，s186a，s186f，g187a，g187t，r188a，r188l，s189a，d198a，r204a，r205a，c242s，s247i，y247a，r248a，r250a，r251a，or d264a，g264a，t286a，和/或t286i处的置换可以组合，在可能的情况下，在天然定位的残基k1a，k1m，t4i，d6r，s8i，t8v，，t9i，s9i，k11a，k11h，t12k，s33i，s33c，s43n，g44l，s45v，，s45i，t45v，，t45i，g46p，d47m，d47g，n48v，n48f，l49a，f50t，a51v，d53a，d53n，d53g，v54l，v54i，r55a，r55v，r55l，g56p，i57f，i57m，d58a，d58v，d58f，p59a，p59f，e60i，e60t，e60r，e61a，e61v，e61l，g62a，r84a，v88a，d94a，s96i，t104n，a105l，t107p，l108m，s109v，t109v，g110a，d111t，s112v，d141a，g147a，v154a，r179a，t180g，t181i，d183a，d183g，d184a，d184a，d184f，l185v，l185d，s186a，s186f，g187a，g187t，r188a，r188l，s189a，d198a，r204a，r205a，c242s，s247i，y247a，r248a，r250a，r251a，或d264a，g264a，t286a和/或t286i处进行置换以产生去免疫的志贺菌毒素效应多肽。
204.本文所述的任何去免疫志贺菌毒素效应多肽亚区和/或表位破坏突变可单独使用或与本文所述的每个个体实施方案，包括本文所述的方法组合使用。
205.2.蛋白酶切割抗性的志贺菌毒素a亚基效应多肽
206.在一些实施方案中，结合分子的志贺菌毒素效应多肽包含(1)具有羧基末端的志贺菌毒素a1片段衍生区域和(2)志贺菌毒素a1片段区的羧基末端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。提高结合分子的志贺菌毒素组分与其他组分(例如，细胞靶向结合区)之间连接的稳定性，可以通过减少由连接中断和丢失细胞靶向引起的非特异性毒性来改善其施用至生物体后的毒性特征，例如由于蛋白水解导致的连接中断和丢失细胞靶向。
207.志贺菌毒素家族的成员志贺菌毒素a亚基在其a1片段区域的羧基末端包含保守的弗林蛋白酶切割位点，这对志贺菌毒素的功能很重要。弗林蛋白酶切割位点基序和弗林蛋白酶切割位点可由技术人员使用标准技术和/或通过使用本文的信息来鉴定。
208.志贺菌毒素a亚基和志贺菌毒素效应多肽中的弗林蛋白酶切割基序和弗林蛋白酶切割位点可由技术人员使用标准方法和/或通过使用本文的信息来鉴定。弗林蛋白酶切割
最小的共有基序r-x-x-r(schalken j等人，j clin invest 80：1545-9(1987)；bresnahan p et al.，j cell biol 111：2851-9(1990)；hatsuzawa k等人，j biol chem 265：22075-8(1990)；wise r等人，proc natlacadsci usa 87：9378-82(1990)；molloy s等人，jbiol chem 267：16396-402(1992))。与此一致，许多弗林蛋白酶抑制剂包含肽，所述肽包含基序r-x-x-r。弗林蛋白酶的合成抑制剂的实例是包含肽r-v-k-r的分子(henrich s等人，nat struct biol 10：520-6(2003))。一般而言，包含表面可接近的二碱基氨基酸基序和两个由两个氨基酸残基隔开的带正电荷的氨基酸的肽或蛋白质可以被预测为对弗林蛋白酶切割敏感，切割发生在基序中的最后一个碱性氨基酸的羧基键上。
209.弗林蛋白酶切割底物中的共有基序已用一定程度的特异性来鉴定。已经描述了包含二十个连续氨基酸残基的区域的弗林蛋白酶切割位点基序，其可以标记为p14到p6
′
(tian s等人，int j mol sci 12：1060-5(2011))，使用schechter i，berger，a，biochem biophys res commun 32：898-902(1968)中描述的命名法。根据该命名法，弗林蛋白酶切割位点位于命名为p1的氨基酸残基的羧基键上，弗林蛋白酶切割基序的氨基酸残基在朝向此参考p1残基的氨基末端的方向上编号为p2、p3、p4等。从p1参考残基向羧基末端的基序的氨基酸残基用基本符号p2
′
、p3
′
、p4
′
等编号。使用此命名法，p6至p2
′
区域描绘了由弗林蛋白酶催化结构域结合的弗林蛋白酶切割基序的核心底物。两个侧翼区p14至p7和p3
′
至p6
′
通常富含极性氨基酸残基，以增加位于它们之间的核心弗林蛋白酶切割位点的可及性。
210.在天然志贺菌毒素a亚基中志贺菌毒素a1片段和a2片段之间的连接处的发现的二十个氨基酸残基、弗林蛋白酶切割基序和弗林蛋白酶切割位点在某些志贺菌毒素中得到了很好的表征。例如，在stxa(seq id no：2)和slt-1a(seq id no：1)中，该弗林蛋白酶切割基序天然位于l238至f257，而在slt-2a(seq id no：3)中，该弗林蛋白酶切割基序是天然定位于v237至q256。基于本文所述的氨基酸同源性、实验和/或弗林蛋白酶切割测定，技术人员可以鉴定其他天然志贺菌毒素a亚基或志贺菌毒素效应多肽中的弗林蛋白酶切割基序，其中基序是实际的弗林蛋白酶切割基序或预计会导致真核细胞内的这些分子在弗林蛋白酶切割后产生a1和a2片段。
211.在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含(1)具有羧基末端的志贺菌毒素a1片段衍生的多肽和(2)志贺菌毒素a1片段衍生的多肽的羧基末端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。志贺菌毒素a1片段衍生的多肽的羧基末端可以由技术人员通过使用本领域已知的技术来鉴定，例如通过使用蛋白质序列比对软件来鉴定(i)天然存在的志贺菌毒素中保守的弗林蛋白酶切割基序，(ii)天然存在的志贺菌毒素保守的表面暴露的延伸环，和/或(iii)可能由erad系统识别的主要是疏水性的一段氨基酸残基(即疏水的“补丁”)。
212.结合分子的蛋白酶切割抗性的志贺菌毒素效应多肽(1)可能在其志贺菌毒素a1片段区域的羧基末端完全缺乏任何弗林蛋白酶切割基序和/或(2)在其志贺菌毒素a1片段区域的羧基末端和/或源自志贺菌毒素a1片段的羧基末端的区域包含破坏的弗林蛋白酶切割基序。弗林蛋白酶切割基序的破坏包括弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的各种改变，例如翻译后修饰、氨基酸官能团中一个或多个原子的改变、向氨基酸官能团添加一个或多个原子，与非蛋白质部分的缔合，和/或与氨基酸残基、肽、多肽的连接，例如产生支链蛋白质结构。
213.可使用本文所述、wo 2015/191764中描述的和/或技术人员已知的方法从志贺菌
毒素效应多肽和/或志贺菌毒素a亚基多肽(无论是否天然存在)产生蛋白酶切割抗性的志贺菌毒素效应多肽，其中所得分子仍保留一种或多种志贺菌毒素a亚基功能。
214.关于弗林蛋白酶切割位点或弗林蛋白酶切割基序，术语“破坏”或“被破坏的”是指天然存在的弗林蛋白酶切割位点和/或弗林蛋白酶切割基序的改变，例如突变，与野生型志贺菌毒素a亚基或衍生自仅包含野生型多肽序列的野生型志贺菌毒素a亚基的多肽的弗林蛋白酶切割相比，导致志贺毒素a1片段区域或其衍生的可识别区域的羧基末端附近的弗林蛋白酶切割减少。弗林蛋白酶切割基序中氨基酸残基的改变包括弗林蛋白酶切割基序中的突变，例如弗林蛋白酶切割基序的缺失、插入、倒位、置换和/或羧基末端截短以及翻译后修饰，例如糖基化、白蛋白化等的结果，其涉及将分子缀合或连接到氨基酸残基的官能团。因为弗林蛋白酶切割基序由大约二十个氨基酸残基组成，理论上，涉及这二十个位置中任何一个的一个或多个氨基酸残基的改变、修饰、突变、缺失、插入和/或截短都可能导致弗林蛋白酶切割敏感性降低(tian s等人，sci rep 2：261(2012))。弗林蛋白酶切割位点和/或弗林蛋白酶切割基序的破坏可能会或可能不会增加对其他蛋白酶(例如哺乳动物血管系统中常见的胰蛋白酶和细胞外蛋白酶)切割的抗性。技术人员可以使用本领域已知的技术测试给定破坏对给定蛋白酶的切割敏感性的影响。
[0215]“被破坏的弗林蛋白酶切割基序”是这样的弗林蛋白酶切割基序，其包含对衍生自20个氨基酸残基区域的一个或更多个氨基酸残基的改变，所述20个氨基酸残基区域代表在天然志贺菌毒素a亚基中志贺菌毒素a1片段和a2片段区域之间的连接处发现的保守的弗林蛋白酶切割基序，并定位为使得志贺菌毒素a亚基的弗林蛋白酶切割导致a1和a2片段的产生；其中与包含野生型志贺菌毒素a1片段区域的参考分子相比，被破坏的弗林蛋白酶切割基序以实验可重复的方式表现出降低的弗林蛋白酶切割，所述野生型志贺菌毒素a1片段区域融合到大小足以使用技术人员已知的和/或本文所述的适当测定监测弗林蛋白酶切割的羧基末端多肽。
[0216]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含(1)具有羧基末端的志贺菌毒素a1片段衍生的多肽和(2)在志贺菌毒素a1片段多肽区域的羧基末端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序；其中志贺菌毒素效应多肽(和包含它的任何结合分子)与参考分子相比具有更强的弗林蛋白酶切割抗性，所述参考分子例如包含a1片段的羧基末端和/或a1和a2片段之间的保守的弗林蛋白酶切割基序的野生型志贺菌毒素多肽。例如，与参考分子相比，一个分子的弗林蛋白酶切割减少可以使用wo 2015/191764中描述的体外弗林蛋白酶切割测定来确定，使用相同的条件进行，然后对切割产生的任何片段的条带密度进行定量，以定量测量弗林蛋白酶切割的变化。
[0217]
在一些实施方案中，与野生型志贺菌毒素a亚基相比，志贺毒素效应多肽在体外和/或体内对弗林蛋白酶切割具有更强的抗性。
[0218]
一般而言，结合分子的蛋白酶切割敏感性是通过将其与具有其弗林蛋白酶切割抗性的志贺菌毒素效应多肽替换为包含志贺菌毒素a1片段的野生型志贺菌毒素效应多肽的相同分子进行比较来测试的。在一些实施方案中，包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序的pd-l1结合分子表现出与包含在其羧基末端与肽或多肽融合的野生型志贺菌毒素a1片段的参考分子相比，体外弗林蛋白酶切割减少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％，97％、98％或更大。
[0219]
已经描述了几种弗林蛋白酶切割基序破坏。例如，将最小r-x-x-r基序中的两个保守精氨酸突变为丙氨酸完全阻断了弗林蛋白酶和/或弗林蛋白酶样蛋白酶的加工(参见例如duda a等人，j virology 78：13865-70(2004))。因为弗林蛋白酶切割位点基序由大约20个氨基酸残基组成，理论上，涉及这20个氨基酸残基位置中的任一个的一个或多个的某些突变，可能会消除弗林蛋白酶切割或降低弗林蛋白酶切割效率(参见例如tian s等人，sci rep 2：261(2012))。
[0220]
在一些实施方案中，本文所述的分子包含源自志贺菌毒素家族成员的至少一个a亚基的志贺菌毒素效应多肽，其中志贺菌毒素效应多肽包含源自志贺菌毒素a亚基的保守、高度可及的蛋白酶切割敏感环的一个或多个氨基酸中的破坏。例如，在stxa和slt-1a中，这个高度可及的蛋白酶敏感环天然位于氨基酸残基242到261，而在slt-2a中，这个保守环天然位于氨基酸残基241到260。基于多肽序列同源性，技术人员可以在其他志贺菌毒素a亚基中鉴定这种保守的、高度可及的环结构。该环中氨基酸残基的某些突变可以降低环内某些氨基酸残基对蛋白水解切割的可及性，这可能会降低弗林蛋白酶切割的敏感性。
[0221]
在一些实施方案中，pd-l1结合分子包含志贺菌毒素效应多肽，所述志贺菌毒素效应多肽包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述弗林蛋白酶切割基序包含在志贺菌毒素a亚基中保守的表面暴露的蛋白酶敏感环中的突变。在一些实施方案中，pd-l1结合分子包含志贺菌毒素效应多肽，所述志贺菌毒素效应多肽包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述弗林蛋白酶切割基序包含志贺菌毒素a亚基的该蛋白酶敏感环中的突变，所述突变降低环中某些氨基酸残基的表面可及性，从而降低了弗林蛋白酶切割的敏感性。
[0222]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽的被破坏的弗林蛋白酶切割基序包括共有氨基酸残基p1和p4之一或两者的存在、位置或官能团方面的破坏，例如在最小弗林蛋白酶切割基序r/y-x-x-r的位置1和4中的氨基酸残基。例如，将最小的弗林蛋白酶共有位点r-x-x-r中的两个精氨酸残基中的一个或两个突变为丙氨酸将破坏弗林蛋白酶切割基序并阻止该位点的弗林蛋白酶切割。类似地，将最小弗林蛋白酶切割基序r-x-x-r中的一个或两个精氨酸残基替换为技术人员已知的任何非保守氨基酸残基的氨基酸残基置换将降低该基序的弗林蛋白酶切割敏感性。特别地，精氨酸的氨基酸残基置换为缺乏正电荷的任何非碱性氨基酸残基，例如a、g、p、s、t、d、e、q、n、c、i、l、m、v、f、w和y将导致被破坏的弗林蛋白酶切割基序。
[0223]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽的被破坏的弗林蛋白酶切割基序包括在共有氨基酸残基p4和p1之间的间隔中的破坏，其间插氨基酸残基的数量不是两个，因此，将p4和/或p1更改为不同的位置并取消p4和/或p1名称。例如，最小弗林蛋白酶切割位点的弗林蛋白酶切割基序或核心弗林蛋白酶切割基序内的缺失将降低弗林蛋白酶切割基序的弗林蛋白酶切割敏感性。
[0224]
在一些实施方案中，与野生型志贺菌毒素a亚基相比，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个氨基酸残基置换。在一些实施方案中，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点r/y-x-x-r内的一个或多个氨基酸残基置换，例如对于stxa和slt-1a衍生的志贺菌毒素效应多肽，天然定位的氨基酸残基r248被任何非正电荷氨基酸残基置换和/或r251被任何非正电荷氨基酸残基置换；对于slt-2a衍生的志贺菌毒素效应多肽，天然定位的氨基酸残基y247被任何非正电荷氨基酸残基置换和/或r250被任何非正
电荷氨基酸残基置换。
[0225]
在一些实施方案中，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含未破坏的最小弗林蛋白酶切割位点r/y-x-x-r，而是包含破坏的侧翼区，例如，在弗林蛋白酶切割基序侧翼区中的一个或多个氨基酸残基中的氨基酸残基置换，所述侧翼区天然位于例如241-247和/或252-259。在一些实施方案中，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包括位于弗林蛋白酶切割基序的p1-p6区中的一个或多个氨基酸残基的置换；将p1
′
突变为大体积氨基酸，例如r、w、y、f和h；将p2
′
突变为极性和亲水性氨基酸残基；将位于弗林蛋白酶切割基序p1
′‑
p6
′
区的一个或多个氨基酸残基置换为一个或多个大体积疏水性氨基酸残基。
[0226]
在一些实施方案中，弗林蛋白酶切割基序的破坏包括弗林蛋白酶切割基序内至少一个氨基酸残基的缺失、插入、倒位和/或突变。在一些实施方案中，蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应多肽包含天然位于志贺样毒素1(seq id no：1)或志贺菌毒素(seq id no：2)的a亚基的249-251，或志贺样毒素2(seq id no：3)的a亚基的247-250或保守志贺菌毒素效应多肽和/或非天然志贺菌毒素效应多肽序列中的等效位置的的氨基酸序列的破坏。在一些实施方案中，蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应多肽包含破坏，所述破坏包括弗林蛋白酶切割基序内至少一个氨基酸的缺失。在一些实施方案中，蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应多肽包含破坏，所述破坏包括在蛋白酶切割基序区域内至少一个氨基酸的插入。在一些实施方案中，蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应多肽包含破坏，所述破坏包含氨基酸的倒位，其中至少一个倒位的氨基酸在蛋白酶基序区域内。在一些实施方案中，蛋白酶切割抗性志贺菌菌毒素效应多肽包含破坏，所述破坏包含突变，例如氨基酸置换为非标准氨基酸或具有化学修饰的侧链的氨基酸。
[0227]
在一些实施方案中，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包括弗林蛋白酶切割基序内9、10、11或更多个羧基末端氨基酸残基的缺失。在这些实施方案中，被破坏的弗林蛋白酶切割基序将不包含弗林蛋白酶切割位点或最小的弗林蛋白酶切割基序。换言之，某些实施方案在a1片段区的羧基末端缺少弗林蛋白酶切割位点。
[0228]
在一些实施方案中，与野生型志贺菌毒素a亚基相比，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失和氨基酸残基置换两者。在一些实施方案中，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点r/y-x-x-r内的一个或多个氨基酸残基缺失和置换，例如对于stxa和slt-1a衍生的志贺菌毒素效应多肽，天然定位的氨基酸残基r248被任何非正电荷氨基酸残基置换和/或r251被任何非正电荷氨基酸残基取代；和对于slt-2a衍生的志贺菌毒素效应多肽，天然定位的氨基酸残基y247被任何非正电荷氨基酸残基置换和/或r250被任何非正电荷氨基酸残基置换。
[0229]
在一些实施方案中，与野生型志贺菌毒素a亚基相比，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失和氨基酸残基置换以及羧基末端截短。在一些实施方案中，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点r/y-x-x-r内的一个或多个氨基酸残基缺失和置换，例如对于stxa和slt-1a衍生的志贺菌毒素效应多肽，天然定位的氨基酸残基r248被任何非正电荷氨基酸残基置换和/或r251被任何非正电荷氨基酸残基取代；和对于slt-2a衍生的志贺菌毒素效应多肽，天然定位的氨基酸残基y247被任何非正电荷氨基酸残基置换和/或r250被任何非正电荷氨基酸残基置换。
[0230]
在一些实施方案中，与野生型志贺菌毒素a亚基相比，被破坏的弗林蛋白酶切割基
序包含最小弗林蛋白酶切割位点r/y-x-x-r内的氨基酸置换和羧基末端截短两者，例如，对于stxa和slt-1a衍生的志贺菌毒素效应多肽，在适当情况下，终止于在天然氨基酸位置249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大处的截短，且包含天然定位的氨基酸残基r248和/或r251被任何非带正电荷的氨基酸残基置换；对于slt-2a衍生的志贺菌毒素效应多肽，在合适的情况下，终止于天然氨基酸位置248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大处的截短，并且包含天然定位的氨基酸残基y247和/或r250被任何非带正电荷的氨基酸残基置换。
[0231]
在一些实施方案中，与野生型志贺菌毒素a亚基相比，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个氨基酸残基的插入，只要插入的氨基残基不产生从头的弗林蛋白酶-切割位点。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸残基的插入破坏了最小弗林蛋白酶切割位点r/y-x-x-r中精氨酸残基之间的天然间隔，例如stxa和slt-1a衍生的多肽在249或250包含一个或更多个氨基酸残基的插入，因此破坏了r248和r251之间的天然间隔；或slt-2a衍生的多肽在248或249包含一个或更多个氨基酸残基的插入，因此破坏了y247和r250之间的天然间隔。
[0232]
在一些实施方案中，与野生型志贺菌毒素a亚基相比，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基插入和羧基末端截短两者。在一些实施方案中，与野生型志贺菌毒素a亚基相比，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基插入和氨基酸残基置换两者。在一些实施方案中，与野生型志贺菌毒素a亚基相比，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基插入和氨基酸残基缺失两者。
[0233]
在一些实施方案中，与野生型志贺菌毒素a亚基相比，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失、氨基酸残基插入和氨基酸残基置换。
[0234]
在一些实施方案中，与野生型志贺菌毒素a亚基相比，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失、插入、置换和羧基末端截短。
[0235]
在一些实施方案中，包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺菌毒素效应多肽通过肽键直接融合至包含氨基酸、肽和/或多肽的分子部分，其中融合结构涉及单个连续多肽。在这些融合实施方案中，被破坏的弗林蛋白酶切割基序之后的氨基酸序列不应在融合连接处产生从头的弗林蛋白酶切割位点。
[0236]
任何上述蛋白酶切割抗性的志贺菌毒素效应多肽亚区和/或被破坏的弗林蛋白酶切割基序可以单独使用或与本文所述的每个单独的实施方案，包括本文所述的方法组合使用。
[0237]
3.t细胞超免疫志贺菌毒素a亚基效应多肽
[0238]
在一些实施方案中，结合分子的志贺菌毒素效应多肽包含嵌入或插入的表位肽。在一些实施方案中，表位-肽是异源的t细胞表位-肽，例如被认为与志贺菌毒素a亚基异源的表位。在一些实施方案中，表位-肽是cd8 t细胞表位。在一些实施方案中，cd8 t细胞表位-肽对mhc i类分子的亲和力的特征在于解离常数(kd)为10-4
摩尔或更小和/或所得mhc i类-表位-肽复合物对t细胞受体(tcr)具有结合亲和力，其特征在于解离常数(kd)为10-4
摩
尔或更小。
[0239]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含嵌入或插入的异源t细胞表位，例如人cd8 t细胞表位。在一些实施方案中，嵌入或插入异源t细胞表位以破坏可在天然存在的志贺菌毒素多肽或衍生志贺菌毒素效应多肽的亲本志贺菌毒素效应多肽中鉴别的內源表位或表位区(例如b细胞表位和/或cd4 t细胞表位)。
[0240]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽(和包含它的任何结合分子)是cd8 t细胞超免疫的，例如与野生型志贺菌毒素多肽相比。每个cd8 t细胞超免疫的志贺菌毒素效应多肽包含嵌入或插入的t细胞表位-肽。使用本文所述、wo 2015/113005中描述的和/或技术人员已知的方法，可以从志贺菌毒素效应多肽和/或志贺毒素a亚基多肽(无论是否天然存在)产生超免疫的志贺菌毒素效应多肽，其中所得分子仍保留一种或多种志贺菌毒素a亚基功能。
[0241]
t细胞表位是由抗原肽组成的分子结构，可以由线性氨基酸序列表示。通常，t细胞表位是大小为8到11个氨基酸残基的肽(townsend a，bodmer h，annu rev immunol 7：601-24(1989))；然而，某些t细胞表位-肽的长度小于8个或大于11个氨基酸长(参见例如livingstone a，fathman c，annu rev immunol 5：477-501(1987)；green k等人，eur j immunol 34：2510-9(2004))。在一些实施方案中，嵌入或插入的表位长度至少为七个氨基酸残基。在一些实施方案中，嵌入的或插入的表位由tcr结合，结合亲和力的特征在于kd小于10mm(例如1-100μm)，如使用stone j等人，immunology 126：165-76(2009)中的公式计算的。然而，应该注意的是，在给定范围内mhc表位和tcr之间的结合亲和力可能与抗原性和/或免疫原性无关(参见例如a1-ramadi b等人，j immunol 155：662-73(1995))，例如由于诸如mhc-肽-tcr复合物稳定性、mhc-肽密度和tcr辅因子如cd8的mhc非依赖性功能等因素(baker b等人，immunity 13：475-84(2000)；hornell t等人，j immunol 170：4506-14(2003)；woolridge l等人，j immunol 171：6650-60(2003))。
[0242]
在一些实施方案中，该分子包含cd8 t细胞表位。在一些进一步的实施方案中，cd8 t细胞表位是关于人免疫系统的cd8 t细胞表位。在一些实施方案中，cd8 t细胞表位是具有至少七个、八个、九个或十个氨基酸残基的肽。在一些实施方案中，cd8 t细胞表位包含或由九个氨基酸残基组成。在一些实施方案中，cd8 t细胞表位可以被人tcr结合，结合亲和力的特征在于kd小于10mm(例如，1-100μm)，例如使用技术人员已知的体外测定法确定的。
[0243]
在一些实施方案中，该分子包含具有nlvpmvatv(seq id no：78)的序列的cd8 t细胞表位。在一些实施方案中，该分子包含具有vtehdtlly(seq id no：79)的序列的cd8 t细胞表位。在一些实施方案中，该分子包含具有siinfekyl(seq id no：80)的序列的cd8 t细胞表位。在一些实施方案中，该分子包含具有gldrnsgny(seq id no：81)的序列的cd8 t细胞表位。在一些实施方案中，该分子包含具有gvmtrgrlk(seq id no：82)的序列的cd8 t细胞表位。在一些实施方案中，该分子包含具有gilgfvftl(seq id no：83)的序列的cd8 t细胞表位。在一些实施方案中，该分子包含具有ilrgsvahk(seq id no：84)的序列的cd8 t细胞表位。
[0244]
在一些实施方案中，本文所述的结合分子包含志贺菌毒素效应多肽和cd8 t细胞表位，所述志贺菌毒素效应多肽包含seq id no：1-18、40-68、169、170或173中的任一项，所
述cd8 t细胞表位包含seq id no：78-84中任一项的序列。在一些实施方案中，结合分子包含志贺菌毒素效应多肽和cd8 t细胞表位，所述志贺菌毒素效应多肽包含seq id no：41，所述cd8 t细胞表位包含seq id no：78-84中任一项的序列。在一些实施方案中，结合分子包含志贺菌毒素效应多肽和cd8 t细胞表位，所述志贺菌毒素效应多肽包含seq id no：41，所述cd8 t细胞表位包含seq id no：78的序列。在一些实施方案中，结合分子包含志贺菌毒素效应多肽和cd8 t细胞表位，所述志贺菌毒素效应多肽包含seq id no：41，所述cd8 t细胞表位包含seq id no：79的序列。在一些实施方案中，结合分子包含志贺菌毒素效应多肽和cd8 t细胞表位，所述志贺菌毒素效应多肽包含seq id no：41，所述cd8 t细胞表位包含seq id no：80的序列。在一些实施方案中，结合分子包含志贺菌毒素效应多肽和cd8 t细胞表位，所述志贺菌毒素效应多肽包含seq id no：41，所述cd8 t细胞表位包含seq id no：81的序列。在一些实施方案中，结合分子包含志贺菌毒素效应多肽和cd8 t细胞表位，所述志贺菌毒素效应多肽包含seq id no：41，所述cd8 t细胞表位包含seq id no：82的序列。在一些实施方案中，结合分子包含志贺菌毒素效应多肽和cd8 t细胞表位，所述志贺菌毒素效应多肽包含seq id no：41，所述cd8 t细胞表位包含seq id no：83的序列。在一些实施方案中，结合分子包含志贺菌毒素效应多肽和cd8 t细胞表位，所述志贺菌毒素效应多肽包含seq id no：41，所述cd8 t细胞表位包含seq id no：84的序列。
[0245]
异源t细胞表位是野生型志贺菌毒素a亚基；天然存在的志贺菌毒素a亚基；和/或用作用于通过本文描述的、描述于wo 2015/113005和/或技术人员已知的方法进行修饰的源多肽的亲本志贺菌毒素效应多肽中尚未存在的表位。
[0246]
异源t细胞表位-肽可以通过技术人员已知的多种方法掺入源多肽中，包括例如在源多肽内产生一个或多个氨基酸置换、将一个或多个氨基酸融合到源多肽、将一个或多个氨基酸插入到源多肽中，将肽连接到源多肽的过程，和/或上述过程的组合。这种方法的结果是产生了源多肽的修饰变体，其包含一个或多个嵌入或插入的异源t细胞表位-肽。
[0247]
t细胞表位可以选自或衍生自多种源分子以供如本文所述使用。t细胞表位可以产生自或衍生自各种天然存在的蛋白质。t细胞表位可以产生自或衍生自对哺乳动物来说是外源的各种天然存在的蛋白质，例如微生物的蛋白质。t细胞表位可以产生自或衍生自突变的人类蛋白质和/或恶性人类细胞异常表达的人类蛋白质。t细胞表位可以合成产生或衍生自合成分子(参见例如carbone f等人，jexpmed 167：1767-9(1988)；del val m等人，j virol 65：3641-6(1991)；appella e等人，biomed pept proteins nucleic acids 1：177-84(1995)；perez s等人，cancer 116：2071-80(2010))。
[0248]
尽管任何t细胞表位肽都被考虑用作异源t细胞表位，但可以基于期望的性质选择某些表位。本文所述的一个目标是产生用于施用至脊椎动物的cd8 t细胞超免疫志贺菌毒素效应多肽，这意味着异源t细胞表位具有高度免疫原性，并且当显示与细胞表面的mhci类分子复合时可以在体内引发强烈的免疫应答。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含一个或多个嵌入或插入的异源t细胞表位，其是cd8 t细胞表位。包含异源cd8 t细胞表位的志贺菌毒素效应多肽被认为是cd8 t细胞超免疫的志贺菌毒素效应多肽。
[0249]
t细胞表位成分可以从已知能够引发脊椎动物免疫应答的许多源分子中选择或衍生。t细胞表位可以来源于各种对脊椎动物来说是外源的天然存在的蛋白质，例如病原微生物的蛋白质和非自身的癌症抗原。特别地，感染性微生物可能含有许多具有已知抗原性和/
或免疫原性特性的蛋白质。此外，感染性微生物可能含有许多具有已知抗原性和/或免疫原性亚区或表位的蛋白质。
[0250]
例如，哺乳动物宿主细胞内病原体的蛋白质是t细胞表位的来源。有许多细胞内病原体，例如病毒、细菌、真菌和单细胞真核生物，具有经过充分研究的抗原蛋白或肽。t细胞表位可以从人类病毒或其他细胞内病原体中选择或鉴定，例如细菌例如分枝杆菌、真菌例如弓形体和原生生物例如锥虫。
[0251]
例如，由许多来自对人类具有传染性的病毒的病毒蛋白的免疫原性病毒肽组分。许多人类t细胞表位已被定位到来自甲型流感病毒的蛋白质中的肽，例如蛋白质ha糖蛋白fe1 7、s139/1、ch65、c05、血凝素1(ha1)、血凝素2(ha2)、非结构性蛋白质1和2(ns1和ns 2)、基质蛋白1和2(m1和m2)、核蛋白(np)、神经氨酸酶(na))中的肽并且这些肽中有许多已被证明可引发人体免疫应答，例如通过使用离体测定。类似地，许多人类t细胞表位已被定位到来自人类巨细胞病毒(hcmv)的蛋白质的肽成分，例如蛋白质pp65(ul83)、ul128-131、即时早期1(ie-1；ul123)、糖蛋白b、壳皮蛋白中的肽并且这些肽中有许多已被证明可以引发人体免疫应答，例如通过使用离体测定。
[0252]
另一个实例是人类中有许多免疫原性癌症抗原。技术人员可以使用本领域已知的技术鉴定癌症和/或肿瘤细胞抗原的cd8 t细胞表位，例如差异基因组学、差异蛋白质组学、免疫蛋白质组学、预测然后验证和遗传方法如反向-基因转染(参见例如admon a等人，mol cell proteomics 2：388-98(2003)；purcell a，gorman j，mol cell proteomics 3：193-208(2004)；comber j，philip r，ther adv vaccines 2：77-89(2014))。许多抗原性和/或免疫原性t细胞表位已被鉴定或预测会出现在人类癌症和/或肿瘤细胞中。例如，已经在肿瘤细胞中通常突变或过表达的人类蛋白质中预测了t细胞表位，例如alk、cea、n-乙酰氨基葡糖胺转移酶v(gnt-v)、hca587、pd-l1/neu、mage、melan-a/mart-1、muc-1、p53和trag-3(参见例如van der bruggen p等人，science 254：1643-7(1991)；kawakami y等人，j exp med 180：347-52(1994)；fisk b等人，jexp med 181：2109-17(1995)；guilloux y等人，jexp med 183：1173(1996)；skipper j等人，jexp med 183：527(1996)；brossart p等人，93：4309-17(1999)；kawashima i等人，cancer res 59：431-5(1999)；papadopoulos k等人，clin cancer res5：2089-93(1999)；zhu b等人，clin cancer res 9：1850-7(2003)；li b等人，clin exp immunol 140：310-9(2005)；ait-tahar k等人，int j cancer 118：688-95(2006)；akiyama y等人，cancer immunol immunother 61：2311-9(2012))。此外，已经产生了来自人类癌细胞的t细胞表位的合成变体(参见例如lazoura e，apostolopoulos v，curr med chem 12：629-39(2005)；douat-casassus c等人，j med chem 50：1598-609(2007))。
[0253]
此外，用于mhc i类呈递的多个免疫原性t细胞表位可以嵌入相同的志贺菌毒素效应多肽中以用于例如同时靶向递送多个t细胞表位。
[0254]
本文所述的任何蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应多肽亚区和/或被破坏的弗林蛋白酶切割基序可单独使用或与本文所述的每个单独的实施方案，包括本文所述的方法组合使用。
[0255]
c.另外的外源物质
[0256]
在一些实施方案中，结合分子包含另外的外源物质。如本文所用，“另外的外源物
质”是指可以通过结合分子转运到细胞内部的一种或多种原子或分子。在一些实施方案中，另外的外源物质是通过结合分子转运到细胞内部的任何物质，无论它是否通常存在于天然靶细胞中或天然志贺菌毒素中。在一些实施方案中，另外的外源物质是通常不存在于志贺菌毒素和/或天然靶细胞中的物质。从某种意义上说，整个结合分子是一种将进入细胞的外源物质；因此，“另外的”外源物质是与核心结合分子本身相连但不是核心结合分子本身的异源物质。另外的外源物质的非限制性实例是放射性核素、肽、检测促进剂、蛋白质、小分子化疗剂和多核苷酸。
[0257]
在结合分子的一些实施方案中，另外的外源物质是一种或多种放射性核素，例如
211
at、
131
i、
125
i、
90
y、
111
in、
186
re、
188
re、
153
sm、
212
bi、
32
p、
60
c和/或镥的放射性同位素。
[0258]
在一些实施方案中，另外的外源物质包括促凋亡肽、多肽或蛋白质，例如bcl-2、半胱天冬酶(例如半胱天冬酶3或半胱天冬酶6的片段)、细胞色素、粒酶b、凋亡诱导因子(aif)、bax、tbid(截短的bid)以及促凋亡片段或其衍生物(参见例如ellerby h等人，nat med 5：1032-8(1999)；mai j等人，cancer res 61：7709-12(2001)；jia l等人，cancer res 63：3257-62(2003)；liu y等人，mol cancer ther2：1341-50(2003)；perea s等人，cancer res 64：7127-9(2004)；xu y等人，j immunol 173：61-7(2004)；b等人，cell death differ 13：576-85(2006)；wang t等人，cancer res 67：11830-9(2007)；kwon m等人，mol cancer ther 7：1514-22(2008)；qiu x等人，mol cancer ther 7：1890-9(2008)；shan l等人，cancer biol ther 11：1717-22(2008)；wang f等人，clin cancer res 16：2284-94(2010)；kim j等人，j virol 85：1507-16(2011))。
[0259]
在一些实施方案中，另外的外源物质包括包含酶的蛋白质或多肽。在某些其他实施方案中，另外的外源物质是核酸，例如核糖核酸，其用作小抑制rna(sirna)或微小rna(mirna)。在一些实施方案中，另外的外源物质是抗原，例如源自病原体的抗原、细菌蛋白、病毒蛋白、在癌症中突变的蛋白质、在癌症中异常表达的蛋白质或t细胞互补决定区。例如，外源物质包括抗原，例如被细菌感染的抗原呈递细胞的那些特征，以及能够作为外源性抗原起作用的t细胞互补决定区。包含多肽或蛋白质的外源物质可以任选地包含一种或多种抗原，无论是技术人员已知的还是未知的。
[0260]
在结合分子的一些实施方案中，与志贺菌毒素效应多肽缔合的所有异源抗原和/或表位排列在结合分子氨基末端至志贺菌毒素效应多肽的志贺菌毒素a1片段区的羧基末端中。在一些实施方案中，与志贺菌毒素效应多肽缔合的所有异源抗原和/或表位直接或间接地与志贺菌毒素效应多肽在志贺菌毒素效应多肽的志贺毒素a1片段区的氨基末端至羧基末端的位置缔合。在一些实施方案中，作为抗原的所有另外的外源物质排列在志贺菌毒素效应多肽的氨基末端，例如直接或间接地与志贺菌毒素效应多肽的氨基末端融合。
[0261]
在结合分子的一些实施方案中，另外的外源物质是细胞毒剂，例如小分子化疗剂、抗肿瘤剂、细胞毒性抗生素、烷化剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。适用于本文所述使用的细胞毒剂的非限制性实例包括氮丙啶、顺氯氨铂、四嗪、甲基苄肼、六甲基三聚氰胺、长春花生物碱、紫杉烷、喜树碱、依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌、替尼泊苷、新生霉素、阿柔比星、蒽环类、放线菌素、鹅膏蕈碱、鹅膏毒素、博来霉素、centanamycin(吲哚甲酰胺)、普卡霉素、丝裂霉素、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、海兔毒素、美登素、美登木素生物碱、耐久霉素、多西紫杉醇、倍癌霉素、阿霉素、刺孢霉素、澳瑞他汀
(auristatins)、吡咯并苯二氮卓类、吡咯并苯二氮卓类二聚体(pbd)、卡铂、5-氟尿嘧啶(5-fu)、卡培他滨、丝裂霉素c、紫杉醇、1，3-双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲(bcnu)、利福平、顺铂、甲氨蝶呤、吉西他滨、醋葡醛内酯、多聚乙酰(acetogenins)(例如布拉它辛和布拉它辛酮)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、ag1478、ag1571、醛磷酰胺糖苷、烷基磺酸盐(如白消安、胺丙磺酯和哌泊舒凡)、烷化剂(例如噻替哌和环磷酰胺)、氨基乙酰丙酸、氨蝶呤、安吖啶、安西他滨、蒽霉素、阿拉伯糖苷、阿扎胞苷、重氮丝氨酸、氮杂环丙烷(例如苯并多巴、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌多巴)、氮杂尿苷、bestrabucil、比生群、双膦酸盐(如氯膦酸盐)、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素、放线菌素、callystatin、卡柔比星、洋红霉素、卡巴呋喃、卡莫司汀、嗜癌素、cc-1065、苯丁酸氮芥、瘤可宁、萘氮芥、氯脲霉素、色霉素、色蛋白烯二炔抗生素发色团、cpt-11、念珠藻素(例如念珠藻素1和念珠藻素8)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、道诺霉素、地怜酸胺(defofamine)、秋水仙胺(demecolcine)、地托比星(detorubicin)、亚丝醌(diaziquone)、6-重氮-5-氧-l-正亮氨酸、二脱氧尿苷、二氟甲基鸟氨酸(dmfo)、去氧氟尿苷、多柔比星(例如，吗啉代多柔比星、氰吗啉代多柔比星、2-吡咯啉代多柔比星和脱氧多柔比星)、dynemicins、依达曲沙、依达曲沙、五加素(eleutherobins)、伊尔福尼辛(elformithine)、依利醋铵、烯二炔抗生素(例如刺孢霉素)、恩尿嘧啶、依诺他滨、表柔比星、埃博霉素、依索比星、埃斯培拉霉素(esperamicins)、雌莫司汀、乙烯亚胺、2-乙基酰肼、乙环氧啶、氟达拉滨、叶酸类似物(例如，二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤和三甲曲沙(trimetrexate))、叶酸补充剂(例如亚叶酸(frolinic acid))、福莫司汀、氟维司群、甲托辛(gacytosine)、硝酸镓、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、伊班膦酸、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、厄洛替尼、氟维司群、来曲唑、ptk787/zk 222584(novartis，巴塞尔，ch)、奥沙利铂、亚叶酸、雷帕霉素、拉帕替尼、洛那法尼、索拉非尼、甲基戊胺(例如，六甲蜜胺、三乙烯基三聚氰胺、三乙烯基磷酰胺、三乙烯基硫代磷酰胺和三甲基氧三聚氰胺(trimethylomelamine))、水鬼蕉碱(pancratistatins)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyins)、海绵抑制素(spongistatins)、氮芥(例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、甲二氯二乙胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥)、亚硝基脲(nitrosureas)(例如，卡莫司汀、福莫司汀、环己亚硝脲、尼莫司汀和雷诺氮芥)、dynemicins、新制癌菌素发色团、安曲霉素、地托比星、表柔比星、麻西罗霉素(marcellomycins)、丝裂霉素(例如丝裂霉素c)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycins、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycins)、罗多比星、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星、嘌呤类似物(例如，氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤)、嘧啶类似物(例如，安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷)、醋葡醛内酯、香菇多糖、氯尼达明(lonidainine)、美登木素生物碱类(例如美登素和安丝菌素)、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶(nitraerine)、喷司他丁(pentostatin)、蛋氨氮芥、吡柔比星、鬼臼酸、2-乙基酰肼、根霉素、西佐喃、锗螺胺、细格孢氮杂酸(tenuazonic acid)、三亚胺苯醌、2，2
′
，2
″
三氯三乙胺、单端孢菌烯(例如，t-2毒素、疣孢霉素(verracurin)a、杆孢菌素a和蛇形菌素)、尿烷、长春地辛、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、阿拉伯糖苷、环磷酰胺、类毒素(例如紫杉醇和多烯紫杉醇(doxetaxel))、6-硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、铂、铂类似物(例如顺铂和卡铂)、依托泊苷(vp-16)、米托蒽醌、长春瑞滨、米托蒽醌(novantrone)、道诺霉素、希罗达(xeloda)、拓扑异构酶抑制剂rfs 2000、类
维生素a(例如视黄酸)、卡培他滨、罗氮芥、洛索蒽醌、巯基嘌呤、尼莫司汀、nitraerine、雷帕霉素、雷佐生、杆孢菌素a、海绵抑制素、链黑霉素、链脲霉素、索坦、t-2毒素、硫咪嘌呤、噻替派、类毒素(例如紫杉醇和多烯紫杉醇)、块菌素、verracurin a、长春花碱、长春新碱和任何上述物质的结构类似物(例如合成类似物)，和/或任何上述物质的衍生物(参见例如lindell t等人，science 170：447-9(1970)；remillard s等人，science 189：1002-5(1975)；ravry m等人，am j clin oncol 8：148-50(1985)；ravry m等人，cancer treat rep 69：1457-8(1985)；sternberg c等人，cancer 64：2448-58(1989)；bai r等人，biochem pharmacol 39：1941-9(1990)；boger d，johnson d，proc natl acad sci usa 92：3642-9(1995)；beck j等人，leuklymphoma 41：117-24(2001)；cassady j等人，chem pharm bull(tokyo)52：1-26(2004)；sapra p等人，clin cancer res 11：5257-64(2005)；okeley n等人，clinc cancer res 16：888-97(2010)；oroudjev e等人，mol cancer ther 9：2700-13(2010)；ellestad g，chirality 23：660-71(2011)；kantarjian h等人，lancet oncol13：403-11(2012)；moldenhauer g等人，j natl cancer inst 104：622-34(2012)；meulendijks d等人，invest new drugs 34：119-28(2016))
[0262]
下表2中提供了说明性的羧基末端外源物质的非限制性列表。例如，这些羧基末端外源物质可以通过结合分子递送到靶细胞中。
[0263]
表2说明性的羧基末端部分
[0264]
序列seq id no：hhaanlvpmvatv176hhaanlvpmvatvrrnlvpmvatvrrnlvp177nlvpmvatvrrnlvpmvatvrrnlvpmvatv175nlvpmvatvrrnlvpmvatvrrnlvp174nlvpmvatvrrnlvpmvatv178nlvpmvatvhhaanlvpmvatv179rrnlvpmvatv180rrnlvpmvatvrrnlvpmvatvrrnlvp181nlvpmvatvrrnlvpmvatvhhaanlvpmvatv182nlvpmvatvrraanlvpmvatvhhaanlvp183nlvpmvatvhhaanlvpmvatvrrnlvpmvatv184nlvpmvatvhhaanlvpmvatvrrnlvp185nlvpmvatvhhaanlvpmvatvhhaanlvpmvatv186nlvpmvatvhhaanlvpmvatvhhaanlvp187
[0265]
在一些实施方案中，结合分子包含志贺菌毒素效应多肽和羧基末端部分，例如包含seq id no：174-187中任一项的序列的羧基末端部分。在一些实施方案中，结合分子包含志贺菌毒素效应多肽和羧基末端部分，其中志贺菌毒素效应多肽包含seq id no：1-18、40-68、169、170或173中任一项的序列。在一些实施方案中，结合分子包含志贺菌毒素效应多肽和羧基末端部分，其中志贺菌毒素效应多肽包含seq id no：41的序列。在一些实施方案中，结合分子包含志贺菌毒素效应多肽和羧基末端部分，其中志贺菌毒素效应多肽包含seq id no：41的序列，并且羧基末端部分包含seq id no：174-178中任一项的序列。
[0266]
ii.连接组分和/或其亚组分的键
[0267]
本文所述的结合分子的各个pd-l1结合区、毒素组分和/或其他组分可以适当地彼此连接，例如，彼此直接融合或通过本领域中熟知的和/或本文描述的一种或多种接头彼此间接连接。结合区的单个多肽亚组分，例如重链可变区(vh)、轻链可变区(v
l
)、cdr和/或abr区可通过本领域熟知的和/或本文描述的一种或多种接头(例如，scfv接头)适当地彼此连接，包括通过化学缀合。蛋白质组分，例如多链结合区，可以适当地直接通过肽键和/或间接通过本领域熟知的一种或多种接头彼此或与其他多肽组分连接。肽组分，例如，kdel家族内质网保留/回收信号基序(参见seq id no：205-252)，可以适当地直接通过肽键或间接通过一个或多个接头(例如蛋白质接头)连接至另一组分，其在本领域中是众所周知的。例如，在结合分子的一些实施方案中，单独的pd-l1结合区和志贺菌毒素效应多肽(和/或结合分子的另外组分，例如t细胞表位、另外的外源物质、和/或kdel基序)通过本领域熟知和/或本文所述的一种或多种结合区接头适当地彼此连接和/或缀合。
[0268]
合适的接头通常是那些允许每个多肽组分折叠成与没有任何接头或其他组分个体单独地产生的多肽组分非常相似的三维结构。合适的接头包括单个氨基酸、肽、多肽和缺少任何上述的接头，例如各种非蛋白质碳链，无论是支链的还是环状的。
[0269]
合适的接头可以是蛋白质的并且包含一种或多种氨基酸、肽和/或多肽。蛋白质接头适用于重组融合蛋白和化学连接的缀合物两者。蛋白质接头通常具有约2至约50个氨基酸残基，例如约5至约30或约6至约25个氨基酸残基。选择的接头的长度将取决于多种因素，例如，选择接头的所需特性或多个特性。在一些实施方案中，接头是蛋白质的并且在蛋白质组分的末端附近连接，通常在末端的约20个氨基酸内。
[0270]
合适的接头可以是非蛋白质的，例如，例如化学接头。本领域已知的各种非蛋白质接头可用于将细胞靶向结合区与结合分子的志贺菌毒素效应多肽组分连接，例如通常用于将免疫球蛋白多肽与异源多肽缀合的接头。例如，多肽区可以使用它们的氨基酸残基和碳水化合物部分的功能性侧链连接，例如羧基、胺、巯基、羧酸、羰基、羟基和/或环基。例如，二硫键和硫醚键可用于连接两个或更多个多肽。此外，非天然氨基酸残基可以与其他功能性侧链一起使用，例如酮基(参见例如axup j等人.，proc natl acad sci u.s.a.109：16101-6(2012)；sun s等人，chembiochem jul 18(2014)；tian f et al.，proc natlacadsci usa 111：1766-71(2014))。此外，非天然氨基酸残基可与其他功能性侧链一起使用，例如酮基、炔基或叠氮化物(参见例如使用经工程改造以包含对乙酰基-l-苯丙氨酸或对叠氮基甲基-n-苯丙氨酸残基的抗体用于与货物缀合，美国专利申请公开号14/786,402，us 2017/0362334))。非蛋白质化学接头的实例包括但不限于n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs酯)，例如磺基-nhs酯、异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤化物、亚氨酸酯、碳二亚胺、酸酐和氟苯基酯。非蛋白质化学接头的其他实例包括但不限于n-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯、s-(n-琥珀酰亚胺基)硫代乙酸酯(sata)、n-琥珀酰亚胺基-氧羰基-cu-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(smpt)，n-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)-戊酸酯(spp)、琥珀酰亚胺4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(smcc或mcc)、磺基琥珀酰亚胺(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯、4-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯、磺基琥珀酰亚胺基-6-(α-甲基-α-(吡啶基二硫醇)-甲苯酰胺基)己酸酯、n-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶二硫代)-丙酸酯(spdp)、琥珀酰亚胺基6(3(-(-2-吡
啶二硫代)-丙酰胺基)己酸酯、磺基琥珀酰亚胺基6(3(-(-2-吡啶二硫代)-丙酰胺基)己酸酯、马来酰亚胺己酰基(mc)、马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(mc-vc-pab)、3-马来酰亚胺苯甲酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(mbs)、α-烷基衍生物、磺基nhs-atmba(磺基琥珀酰亚胺基n-[3-(乙酰基硫代)-3-甲基丁酰基-β-丙氨酸])、磺基二氯苯酚、2-亚氨基四氢噻吩、3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰酰肼、埃尔曼试剂、二氯三嗪酸和s-(2-硫代吡啶基)-l-半胱氨酸。
[0271]
合适的接头，无论是蛋白质的还是非蛋白质的，可以包括例如蛋白酶敏感的、环境氧化还原电位敏感的、ph敏感的、酸可切割的、光可切割的和/或热敏感的接头。
[0272]
可选择蛋白质接头以掺入重组融合结合分子中。对于重组融合细胞靶向蛋白，接头通常包含约2至50个氨基酸残基，优选约5至30个氨基酸残基。通常，蛋白质接头包含大部分具有极性、不带电荷和/或带电荷残基的氨基酸残基，例如苏氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸。蛋白质接头的非限制性实例包括丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸(asggpe)、缬氨酸-甲硫氨酸(vm)、丙氨酸-甲硫氨酸(am)、am(g2至4s)
x
am，其中g是甘氨酸，s是丝氨酸，x是从1到10的整数。
[0273]
可基于所需性质选择蛋白质接头。技术人员可以考虑特定特征来选择蛋白质接头，例如在融合构建体的上下文，与同一结构域本身的活性相比，优化融合分子的折叠、稳定性、表达、溶解度、药代动力学性质、药效学性质和/或融合结构域的活性中的一种或多种。例如，可以基于柔韧性、刚性和/或可切割性来选择蛋白质接头。技术人员在选择接头时可以使用数据库和接头设计软件工具。在某些接头中，可以选择优化表达。在某些接头中，可以选择促进相同多肽或蛋白质之间的分子间相互作用以形成同源多聚体或不同的多肽或蛋白质之间的分子间相互作用以形成异源多聚体。例如，可以选择允许结合分子的多肽组分之间的期望的非共价相互作用的蛋白质接头，例如与形成二聚体和其他更高级多聚体相关的相互作用。
[0274]
柔性蛋白质接头的长度通常大于12个氨基酸残基并且富含小的非极性氨基酸残基、极性氨基酸残基和/或亲水性氨基酸残基，例如甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸。可选择柔性蛋白质接头以增加组分之间的空间分离和/或允许组分之间的分子内相互作用。例如，各种“gs”接头是技术人员已知的并且由多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸组成，有时在重复单元中，例如(g
x
s)n、(s
x
g)n、(ggggs)n和(g)n，其中x为1至6，n为1至30(seq id no：262-264、266)。柔性蛋白质接头的非限制性实例包括gkssgsgsesks(seq id no：188)、egkssgsgseskef(seq id no：189)、gstsgsgkssegkg(seq id no：190)、gstsgsgkssegsgstkg(seq id no：191)、gstsgsgkpgsgegstkg(seq id no：192)、srssg(seq id no：193)和sgssc(seq id no：194)。
[0275]
刚性蛋白质接头通常是不易弯曲的α-螺旋结构，富含脯氨酸残基和/或一种或多种策略性放置的脯氨酸。可选择刚性接头以防止连接组分之间的分子内相互作用。
[0276]
可以选择合适的接头以允许在体内分离组分，例如由于切割和/或环境特异性不稳定性。体内可切割的蛋白质接头能够通过通常在生物体内或特定细胞类型内的特定位点的蛋白水解加工和/或还原环境断开连接。体内可切割的蛋白质接头通常包含蛋白酶敏感基序和/或由一个或多个半胱氨酸对形成的二硫键。体内可切割的蛋白质接头可以设计为对仅存在于生物体中的某些位置、细胞内的区室和/或仅在某些生理或病理条件下变得有
活性的蛋白酶敏感(例如，涉及具有异常高水平的蛋白酶，在某些疾病部位过表达的蛋白酶，以及由病原微生物特异性表达的蛋白酶)。例如，本领域已知的蛋白质接头被仅存在于细胞内的蛋白酶、仅存在于特定细胞类型中的蛋白酶和仅在诸如癌症或炎症的病理条件γ存在的蛋白酶切割，例如r-x-x-r基序和amgrsgggcagnrvgsslscgglnlqam(seq id no：195)。
[0277]
在结合分子的一些实施方案中，可以使用包含一个或多个蛋白酶敏感位点的接头以提供被靶细胞内存在的蛋白酶切割。在一些实施方案中，可以使用不可切割的接头以减少在施用至脊椎动物生物体之后不需要的毒性。
[0278]
合适的接头可以包括例如蛋白酶敏感、环境氧化还原电位敏感、ph敏感、酸可切割、光可切割和/或热敏感接头，无论是蛋白质的还是非蛋白质的(参见例如doronina s等人，bioconjug chem 17：114-24(2003)；saito g等人，adv drug deliv rev 55：199-215(2003)；jeffrey s等人，j med chem 48：1344-58(2005)；sanderson r等人，clin cancer res 11：843-52(2005)；erickson h等人，cancer res 66：4426-33(2006)；chen x等人，adv drug deliv rev 65：1357-69(2013))。合适的可切割接头可包括包含本领域已知的可切割基团的接头。
[0279]
合适的接头可以包括ph敏感接头。例如，可以选择某些合适的接头，因为它们在较低ph环境中的不稳定性以提供在靶细胞的亚细胞区室内解离(参见例如van der velden v等人，blood 97：3197-204(2001)；ulbrich k，subr v，adv drug deliv rev 56：1023-50(2004))。例如，包含一个或多个三苯甲基基团、衍生的三苯甲基基团、双马来酰亚胺乙氧基丙烷基团、已二酸二酰肼基团和/或酸不稳定转铁蛋白基团的接头可以提供在具有特定ph范围的环境中，结合分子的组分的释放，例如多肽组分。在某些接头中，可以选择在对应于组织之间生理ph差异的ph范围内被切割的接头，例如肿瘤组织的ph低于健康组织中的ph。
[0280]
光可切割接头是在暴露于某些波长范围的电磁辐射，例如可见光范围内的光时切割的接头。光可切割接头可用于在暴露于某些波长的光时，释放结合分子的组分，例如多肽组分。光可切割接头的非限制性实例包括作为半胱氨酸的光可切割保护基团的硝基苄基、硝基苄氧基羰基氯交联剂、羟丙基甲基丙烯酰胺共聚物、甘氨酸共聚物、荧光素共聚物和甲基罗丹明共聚物。光可切割接头在连接组分以形成结合分子方面可能具有特殊用途，所述结合分子设计用于治疗可以暴露于使用光纤的光的疾病、紊乱和病症。
[0281]
在结合分子的一些实施方案中，使用本领域技术人员已知的任何数量的手段，包括共价和非共价键两者，将pd-l1结合区连接至志贺菌毒素效应多肽。
[0282]
在结合分子的一些实施方案中，分子包含结合区，所述结合区是具有连接重链可变(vh)结构域和轻链可变(v
l
)结构域的接头(即，scfv接头)的scfv。本领域已知有许多适用于此目的的接头，例如15-残基(gly4ser)3肽。可用于形成非共价多价结构的合适的scfv接头包括ggs、gggs(seq id no：196)、ggggs(seq id no：72)、ggggsggg(seq id no：197)、ggsgggg(seq id no：198)、gstsgggsgggsggggss(seq id no：199)和gstsgsgkpgssegstkg(seq id no：200)。
[0283]
用于连接结合分子的组分的合适方法可以是通过本领域目前已知的用于实现这种连接的任何方法，只要该连接基本上不阻碍靶向细胞的结合区的结合能力，志贺菌毒素效应多肽组分的细胞内化，和/或在适当时通过适当的测定法测量的所需志贺菌毒素效应
子功能，包括本文描述的测定法。
[0284]
结合分子的组分，例如志贺菌毒素a亚基效应多肽和/或免疫球蛋白型pd-l1结合区可以通过结合区接头连接。在一些实施方案中，可对组分进行遗传改造以提供合适的连接部分以用于连接另外的组分，例如另外的外源物质(参见wo 2018/106895)。
[0285]
就结合分子而言，除非特别说明，否则特定的顺序或方向对于组分：志贺菌毒素效应多肽、结合区和任何可选的接头，相互之间或整个结合分子是不固定的(参见例如图1)。只要结合区和志贺菌毒素效应多肽的所需活性不被消除，结合分子的组分可以任何顺序排列。
[0286]
iii.结合分子的结构变异实例
[0287]
在一些实施方案中，结合分子的志贺菌毒素效应多肽包含或基本上由截短的志贺菌毒素a亚基组成。志贺菌毒素a亚基的截短可能导致整个表位和/或表位区域、b细胞表位、cd4 t细胞表位和/或弗林蛋白酶切割位点的缺失，而不影响志贺菌毒素效应子功能，例如催化活性和细胞毒性。被示出的显示出完全酶活性的最小的志贺菌毒素a亚基片段是由slt1a的残基1-239组成的多肽(lapointe p等人，j biol chem 280：23310-18(2005))。被示出的显示出显著酶活性的最小的志贺菌毒素a亚基片段是由stxa的残基75-247组成的多肽(al-jaufy a等人.，infect immun 62：956-60(1994))。
[0288]
尽管志贺菌毒素效应多肽通常可能小于全长志贺菌毒素a亚基，但优选结合分子的志贺菌毒素效应多肽区维持氨基酸位置77至239的多肽区域(slt-1a(seq id no：1)或stxa(seq id no：2))或志贺菌毒素家族成员的其他a亚基中的等价物(例如(seq id no：3)的77至238)。例如，在一些实施方案中，源自slt-1a的志贺菌毒素效应多肽可包含或基本上由seq id no：1的氨基酸75至251、seq id no：1的1至241、seq id no：1的1至251或seq id no：1的氨基酸1至261组成，其中相对于野生型志贺菌毒素a亚基，至少一个氨基酸残基在内源性表位和/或表位区突变或缺失，和/或其中志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端具有被破坏的弗林蛋白酶切割基序区域。类似地，源自stxa的志贺菌毒素效应多肽区可以包含或基本上由seq id no：2的氨基酸75至251、seq id no：2的1至241、seq id no：2的1至251或seq id_no：2的氨基酸1至261组成，其中相对于野生型志贺毒素a亚基，至少一个氨基酸残基在内源表位和/或表位区中突变或缺失，和/或其中志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端具有被破坏的弗林蛋白酶切割基序区域。此外，源自slt-2的志贺菌毒素效应多肽区可以包含或基本上由seq id no：3的氨基酸75至251、seq id no：3的1至241、seq id no：3的1至251或seq id no：3的氨基酸1至261组成，其中相对于野生型志贺菌毒素a亚基，至少一个氨基酸残基在内源表位和/或表位区中突变或缺失，和/或其中志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端具有被破坏的弗林蛋白酶切割基序区域。
[0289]
本文还提供志贺菌毒素效应多肽和结合分子的变体，其中志贺菌毒素效应多肽与天然存在的志贺菌毒素a亚基仅相差或最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多氨基酸残基(但不超过保留至少85％、90％、95％、99％或更多氨基酸序列同一性的氨基酸残基)。因此，源自志贺菌毒素家族成员的a亚基的分子可以包含对原始序列的添加、缺失、截短或其他改变，只要与天然存在的志贺菌毒素a亚基至少85％、90％、95％、99％或更多的氨基酸序列同一性被保持，并且其中相对于野生型志贺菌毒素a亚基，至少一个氨基酸残基在内源表位和/或表位区中突变或缺失，和/或其中志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基
末端具有被破坏的弗林蛋白酶切割基序区域。
[0290]
因此，在一些实施方案中，本文所述分子的志贺菌毒素效应多肽包含或基本上由与天然存在的志贺菌毒素a亚基例如slt-1a(seq id no1)、stxa(seq id no2)和/或slt-2a(seq id no3)具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％的总体序列同一性的氨基酸序列组成，其中相对于野生型志贺菌毒素a亚基，至少一个氨基酸残基在内源表位和/或表位区中突变或缺失，和/或其中志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端具有被破坏的弗林蛋白酶切割基序区域。
[0291]
任选地，志贺菌毒素a亚基的全长或截短形式可以包含分子的志贺菌毒素效应多肽区，其中志贺菌毒素衍生的多肽与天然存在的志贺菌毒素相比，包含一个或多个突变(例如取置换、缺失、插入，或倒位)。在一些实施方案中，优选志贺菌毒素效应多肽与天然存在的志贺菌毒素a亚基具有足够的序列同一性，以通过宿主细胞转化、转染、感染或诱导的众所周知的方法，或通过与志贺菌毒素效应多肽连接的细胞靶向结合区介导的内化，在进入细胞后保持细胞毒性。志贺菌毒素a亚基中酶活性和/或细胞毒性最关键的残基已被定位到以下残基位置：天冬酰胺-75、酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170和精氨酸-176等(di r等人，toxicon 57：525-39(2011))。在本文所述的任一项实施方案中，志贺菌毒素效应多肽可优选但不一定在以下位置处保持一个或多个保守氨基酸，例如在stxa、slt-1a中的位置77、167、170和176处发现的那些氨基酸，或在志贺菌毒素家族的其他成员中的等效保守位置，这通常是细胞毒活性所必需的。细胞毒性分子引起细胞死亡的能力，例如其细胞毒性可以使用本领域熟知的多种测定中的任何一种或多种来测量。
[0292]
a.去免疫的志贺菌毒素效应多肽的实例
[0293]
在一些实施方案中，结合分子的去免疫的志贺菌毒素效应多肽可以基本上由具有两个或更多个突变的截短的志贺菌毒素a亚基组成。志贺菌毒素a亚基的截短可能导致整个表位和/或表位区、b细胞表位、cd4 t细胞表位和/或弗林蛋白酶切割位点的缺失，而不影响志贺菌毒素效应子功能，例如催化活性和细胞毒性。将slt-1a、stxa或slt-2a的羧基末端截短为氨基酸1-251会去除两个预测的b细胞表位区、两个预测的cd4阳性(cd4 )t细胞表位和预测的不连续b细胞表位。将slt-1a、stxa或slt-2a的氨基末端截短至75-293会去除至少三个预测的b细胞表位区和三个预测的cd4 t细胞表位。将slt-1a、stxa或slt-2a的氨基末端和羧基末端两者截短至75-251会缺失至少五个预测的b细胞表位区、四个推定的cd4 t细胞表位和一个预测的不连续的b细胞表位。
[0294]
在一些实施方案中，去免疫的志贺菌毒素效应多肽可以包含或基本上由具有至少一个突变(相对于野生型志贺菌毒素多肽)的全长或截短的志贺菌毒素a亚基组成，所述突变例如在所提供的内源性b细胞和/或cd4 t细胞表位区中的缺失、插入、倒位或置换。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含破坏，所述破坏包含突变(相对于野生型志贺菌毒素多肽)，所述突变包含在内源性b细胞和/或cd4 t细胞表位区中的至少一个氨基酸残基的缺失。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含破坏，所述破坏包含在内源性b细胞和/或cd4 t细胞表位区内至少一个氨基酸残基的插入。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含破坏，所述破坏包含氨基酸残基倒位，其中至少一个倒位的氨基酸残基位于内源性b细胞和/或cd4 t细胞表位区内。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含破坏，所述破坏包含突变(相对于野生型志贺菌毒素多肽)，例如氨基酸置换、氨基酸置换为非标
准氨基酸、和/或具有化学修饰的侧链的氨基酸残基。适用于如本文所述用途的去免疫志贺菌毒素效应亚区域的非限制性实例描述于wo 2015/113005、wo 2015/113007、wo 2015/191764、wo 2016/196344和wo 2018/140427。
[0295]
在其他实施方案中，去免疫的志贺菌毒素效应多肽包含截短的志贺菌毒素a亚基，其比全长志贺菌毒素a亚基短，其中至少一个氨基酸残基在天然定位的b细胞和/或cd4 t细胞表位区中被破坏。
[0296]
为了产生去免疫的志贺菌毒素效应多肽，原则上通过各种方式修饰所提供的表位区中的任何氨基酸残基可导致表位的破坏，例如相对于野生型志贺菌毒素多肽，代表缺失、插入、倒位、重排、置换的修饰，和侧链的化学修饰。然而，修饰某些氨基酸残基和使用某些氨基酸修饰更有可能成功地降低抗原性和/或免疫原性，同时保持一定水平的志贺菌毒素效应子功能。例如，末端截短和内部氨基酸置换是优选的，因为这些类型的修饰保持志贺菌毒素效应多肽中氨基酸残基的总体间隔，因此更可能保持志贺菌毒素效应多肽的结构和功能。
[0297]
在一些实施方案中，去免疫的志贺菌毒素效应多肽包含或基本上由slt-1a(seq id no：1)、stxa(seq id no：2)和/或slt-2a(seq id no：3)的氨基酸75至251组成，其中至少一个氨基酸残基在天然定位的表位区中被破坏。在某些其他实施方案中，去免疫的志贺菌毒素效应多肽包含或基本上由slt-1a(seq id no：1)、stxa(seq id no：2)和/或slt-2a(seq id no：3)的氨基酸1至241组成，其中至少一个氨基酸残基在天然定位的表位区中被破坏。进一步的实施方案是去免疫的志贺菌毒素效应多肽包含或基本上由slt-1a(seq id no：1)、stxa(seq id no：2)和/或slt-2a(seq id no：3)的氨基酸1至251组成，其中至少一个氨基酸残基在提供的天然定位的表位区中被破坏。进一步的实施方案是志贺菌毒素效应多肽，其包含slt-1a(seq id no：1)、stxa(seq id no：2)和/或slt-2a(seq id no：3)的氨基酸1至261，其中至少一个氨基酸残基在天然定位的表位区中被破坏。
[0298]
有许多不同的内部氨基酸置换可用于产生去免疫的志贺菌毒素效应多肽。在表位区内可能使用的置换氨基酸中，预测以下置换氨基酸残基最有可能降低表位的抗原性和/或免疫原性-g、d、e、s、t、r、k和h。除了甘氨酸，这些氨基酸残基都可以归类为极性和/或带电荷残基。在可能置换的氨基酸中，以下氨基酸a、g、v、l、i、p、c、m、f、s、d、n、q、h和k被预测为最有可能降低抗原性和/或免疫原性，同时提供保留显著水平的志贺菌毒素效应子功能，这取决于所置换的氨基酸。通常，置换应将极性和/或带电荷的氨基酸残基改变为非极性和不带电荷的残基(参见例如wo 2015/113007)。此外，表位破坏以减少氨基酸残基的r基团功能侧链的总体大小和/或长度可能是有益的(参见例如wo2015/113007)。然而，尽管这些置换的普遍性最有可能带来表位破坏，因为目的是保留显著的志贺菌毒素效应子功能，如果其与置换的氨基酸类似，则置换氨基酸更有可能保留志贺菌毒素效应子功能，例如，类似大小的非极性和/或不带电残基置换极性和/或带电荷残基。
[0299]
wo2015/113007和wo2016/196344报道了许多不同突变和突变组合对各种志贺菌毒素效应多肽和结合分子的志贺菌毒素效应子功能的影响的经验测试结果。表3总结了wo2015/113007和wo2016/196344中描述的结果，其中单独或与一个或多个其他置换组合的氨基酸置换不会阻止志贺菌毒素效应子功能的有效水平的展示。表3使用wo2016/196344中描述的表位区编号方案。
[0300]
表3.志贺菌毒素效应多肽中的氨基酸置换
[0301]
[0302]
[0303]
[0304][0305]
基于wo2015/113007和wo2016/196344中的经验证据，预计志贺毒素a亚基中的某些氨基酸位置可耐受表位破坏，同时仍保留显著的志贺毒素效应子功能。例如，以下天然存在的位置可以耐受单独或组合的氨基酸置换，同时保留志贺菌毒素效应子功能，例如细胞毒性-seq id no：1或seq id no：2的1；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的4；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的8；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的9；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的11；seq id no：1或seq id no：2的33；seq id no：1或seq id no：2的43；seq id no：1或seq id no：2的44；seq id no：1或seq id no：2的45；seq id no：1或seq id no：2的46；seq id no：1或seq id no：2的47；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的48；seq id no：1或seq id no：2的49；seq id no：1或seq id no：2的50；seq id no：1或seq id no：2的51；seq id no：1或seq id no：2的53；seq id no：1或
seq id no：2的54；seq id no：1或seq id no：2的55；seq id no：1或seq id no：2的56；seq id no：1或seq id no：2的57；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的58；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的59；seq id no：1或seq id no：2的60；seq id no：1或seq id no：2的61；seq id no：1或seq id no：2的62；seq id no：1或seq id no：2的84；seq id no：1或seq id no：2的88；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的94；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的96；seq id no：1或seq id no：2的104；seq id no：1或seq id no：2的105；seq id no：1或seq id no：2的107；seq id no：1或seq id no：2的108；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的109；seq id no：1或seq id no：2的110；seq id no：1或seq id no：2的111；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的112；seq id no：1或seq id no：2的141；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的147；seq id n0：1或seq id n0：2的154；seq id no：1、seq idn0：2或seq id no：3的179；seq id no：1或seq id no：2的180；seq id no：1或seq id no：2的181；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的183；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的184；seq id no：1或seq id no：2的185；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的186；seq id no：1或seq id no：2的187；seq id no：1或seq id no：2的188；seq id no：1或seq id no：2的189；seq id no：1或seq id no：2的198；seq id no：3的204；seq id no：1或seq id no：2的205；seq id no：3的241；seq id no：1或seq id no：2的242；seq id no：1或seq id no：2的247；seq id no：3的247；seq id no：1或seq id no：2的248；seq id no：3的250；seq id no：1或seq id no：2的251；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的264；seq id no：1或seq id no：2的265；和seq id no：1或seq id no：2的286。
[0306]
wo2015/113007和wo2016/196344中的经验数据指向可以降低志贺菌毒素效应多肽的抗原性和/或免疫原性同时保留志贺菌毒素效应多肽的表现出显著的志贺菌毒素效应子功能的能力的其他表位破坏置换和表位破坏置换的组合，例如上述截短和耐受置换的位置的新组合以及相关志贺菌毒素a亚基中相同位置或保守位置的新置换。
[0307]
可以预见，本文测试的置换的保守官能团的氨基酸残基的其他氨基酸置换可以降低抗原性和/或免疫原性，同时保留显著的志贺毒素效应子功能。例如，技术人员已知的与k1a、k1m、t4i、d6r、s8i、t8v、t9i、s9i、k11a、k11h、t12k、s33i、s33c、s43n、g44l、s45v、s45i、t45v、t45i、g46p、d47m、d47g、n48v、n48f、l49a、f50t、a51v、d53a、d53n、d53g、v54l、v54i、r55a、r55v、r55l、g56p、i57f、i57m、d58a、d58v、d58f、p59a、p59f、e60i、e60t、e60r、e61a、e61v、e61l、g62a、r84a、v88a、d94a、s96i、t104n、a105l、t107p、l108m、s109v、t109v、g110a、d111t、s112v、d141a、g147a、v154a、r179a、t180g、t181i、d183a、d183g、d184a、d184a、d184f、l185v、l185d、s186a、s186f、g187a、g187t、r188a、r188l、s189a、d198a、r204a、r205a、c242s、s247i、y247a、r248a、r250a、r251a、或d264a、g264a、t286a、和/或t286i中的任一项相似的其他置换，可能会破坏内源性表位，同时保持至少一种志贺菌毒素效应子功能。具体而言，将氨基酸置换为保守氨基酸残基，其类似于k1a、k1m、t4i、s8i、t8v、t9i、s9i、k11a、k11h、s33i、s33c、s43n、g44l、s45v、s45i、t45v、t45i、g46p、d47m、n48v、n48f、l49a、a51v、d53a、d53n、v54l、v54i、r55a、r55v、r55l、g56p、i57f、i57m、d58a、d58v、d58f、p59a、e60i、e60t、e61a、e61v、e61l、g62a、r84a、v88a、d94a、s96i、t104n、t107p、l108m、s109v、t109v、g110a、d111t、s112v、d141a、g147a、v154a、r179a、t180g、t181i、d183a、d183g、
d184a、d184f、l185v、s186a、s186f、g187a、r188a、r188l、s189a、d198a、r204a、r205a、c242s、s247i、y247a、r248a、r250a、r251a、d264a、g264a、t286a和t286i，可能具有相同或相似的效果。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽可类似的保守氨基酸置换为经验测试的氨基酸，例如，k1到g、v、l、i、f和h；t4到a、g、v、l、f、m和s；s8到a、g、v、l、f和m；t9到a、g、l、f、m和s；s9到a、g、l、i、f和m；k11到g、v、l、i、f和m；s33到a、g、v、l、f和m；s43到a、g、v、l、i、f和m；s45到a、g、l、f和m；t45到a、g、l、f和m；d47到a、v、l、i、f、s和q；n48到a、g、l和m；l49同g；y49垤a；d53到v、l、i、f、s和q；r55到g、i、f、m、q、s、k和h；d58到g、l、i、s和q；p59到g；e60到a、g、v、l、f、s、q、n、d和m；e61到g、i、f、s、q、n、d、m和r；r84到g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；v88到g；i88到g；d94到g、v、l、i、f、s和q；s96到a、g、v、l、f和m；t107到a、g、v、l、i、f、m和s；s107到a、g、v、l、i、f和m；s109到a、g、i、l、f和m；t109到a、g、i、l、f、m和s；s112到a、g、l、i、f和m；d141到v、l、i、f、s和q；v154到g；r179到g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；t180到a、v、l、i、f、m和s；t181到a、g、v、l、f、m和s；d183到v、l、i、f、s和q；d184到g、v、l、i、s和q；s186到g、v、i、l和m；r188到g、v、i、f、m、q、s、k和h；s189到g、v、i、l、f和m；d197到v、l、i、f、s和q；d198到a、v、l、i、f、s和q；r204到g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；r205到g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；s247到a、g、v、i、l、f和m；y247到a、g、v、l、i、f和m；r248到g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；r250到g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；r251到g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；d264到a、g、v、l、i、f、s和q；和t286到、g、v、l、i、f、m和s。
[0308]
类似地，去除电荷、极性和/或减少侧链长度的氨基酸取代可以破坏表位，同时保持至少一种志贺菌毒素效应子功能。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽可包含一个或多个被置换破坏的表位，从而去除侧链电荷、去除极性和/或减少侧链长度，例如选自下组a、g、v、l、i、p、c、m、f、s、d、n、q、h或k的适当氨基酸置换位于以下位置的氨基酸残基：seq id no：1或seq id no：2的1；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的4；seq id no：1或seq id no：2的6；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的8；seq id no：1、seq id到 no：2或seq id no：3的9；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的11；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的12；seq id no：1或seq id no：2的33；seq id n0：1或seq id n0：2的43；seq id no：1或seq id no：2的44；seq id no：1或seq id no：2的45；seq id no：1或seq id no：2的46；seq id no：1或seq id no：2的47；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的48；seq id no：1或seq id no：2的49；seq id no：1或seq id no：2的50；seq id no：1或seq id no：2的51；seq id no：1或seq id no：2的53；seq id no：1或seq id no：2的54；seq id no：1或seq id no：2的55；seq id no：1或seq id no：2的56；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的57；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的58；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的59；seq id no：1或seq id no：2的60；seq id no：1或seq id no：2的61；seq id no：1或seq id no：2的62；seq id no：1或seq id no：2的84；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的88；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的94；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的96；seq id no：1或seq id n0：2的104；seq id no：1或seq id no：2的105；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的107；seq id no：1或seq id no：2的108；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的109；seq id no：1或seq id no：2的110；seq id no：1或seq id no：2的111；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的112；seq id no：1或seq id no：2的141；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的147；seq id no：1或seq id no：2的154；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的
179；seq id no：1或seq id no：2的180；seq id no：1或seq id no：2的181；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的183；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的184；seq id no：1或seq id no：2的185；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的186；seq id no：1或seq id n0：2的187；seq id no：1或seq id no：2的188；seq id n0：1或seq id n0：2的189；seq id n0：3的197；seq id no：1或seq id no：2的198；seq id no：3的204；seq id no：1或seq id no：2的205；seq id no：3的241；seq id no：1或seq id no：2的242；seq id no：1或seq id no：2的247；seq id no：3的247；seq id no：1或seq id no：2的248；seq id no：3的250；seq id no：1或seq id no：2的251；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的264；seq id no：1或seq id no：2的265；和seq id no：1或seq id no：2的286。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽可包含以下氨基酸置换中的一个或多个：k1到a、g、v、l、i、f、m和h；t4到a、g、v、l、i、f、m和s；d6到a、g、v、l、i、f、s和q；s8到a、g、v、i、l、f和m；t8到a、g、v、i、l、f、m和s；t9到a、g、v、i、l、f、m和s；s9到a、g、v、l、i、f和m；k11到a、g、v、l、i、f、m和h；t12到a、g、v、i、l、f、m和s；s33至a、g、v、l、i、f和m；s43至a、g、v、l、i、f和m；g44到a和l；s45到a、g、v、l、i、f和m；t45到a、g、v、l、i、f和m；g46到a和p；d47到a、g、v、l、i、f、s和q；n48到a、g、v、l和m；l49到a或g；f50；a51到v；d53到a、g、v、l、i、f、s和q；v54到a、g和l；r55到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；g56到a和p；i57到a、g、m和f；l57到a、g、m和f；d58到a、g、v、l、i、f、s和q；p59到a、g和f；e60到a、g、v、l、i、f、s、q、n、d、m和r；e61到a、g、v、l、i、f、s、q、n、d、m和r；g62到a；d94到a、g、v、l、i、f、s和q；r84到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；v88到a和g；i88到a、g和v；d94；s96到a、g、v、i、l、f和m；t104到a、g、v、i、l、f、m和s；a105到l；t107到a、g、v、i、l、f、m和s；s107到a、g、v、l、i、f和m；l108到a、g和m；s109到a、g、v、i、l、f和m；t109到a、g、v、i、l、f、m和s；g110到a；d111到a、g、v、l、i、f、s和q；s112到a、g、v、l、i、f和m；d141到a、g、v、l、i、f、s和q；g147到a；v154到a和g；r179到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；t180到a、g、v、l、i、f、m和s；t181到a、g、v、l、i、f、m和s；d183到a、g、v、l、i、f、s和q；d184到a、g、v、l、i、f、s和q；l185到a、g和v；s186到a、g、v、i、l、f和m；g187到a；r188到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；s189到a、g、v、i、l、f和m；d197到a、g、v、l、i、f、s和q；d198到a、g、v、l、i、f、s和q；r204到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；r205到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；c242到a、g、v和s；s247到a、g、v、i、l、f和m；y247到a、g、v、l、i、f和m；r248到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；r250到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；r251到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；c262到a、g、v和s；d264到a、g、v、l、i、f、s和q；g264到a；和t286到a、g、v、l、i、f、m和s。
[0309]
此外，志贺菌毒素效应多肽的一个表位区中破坏表位同时保留显著志贺毒素效应子功能的任何氨基酸置换可与相同或不同表位区中破坏表位同时保留显著的志贺菌毒素效应子功能的任何其他氨基酸置换组合，以形成具有多个表位区被破坏同时仍保留显著水平的志贺菌毒素效应子功能的去免疫的志贺毒素效应子多肽。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽可以包含两个或更多个上述置换的组合和/或wo2015/113007、wo2016/196344和/或wo2018/140427中描述的置换组合。
[0310]
根据wo2015/113007、wo2016/196344和wo 2018/140427中描述的工作，预计志贺菌毒素a亚基中的某些氨基酸区域可耐受表位破坏，同时仍保留显著的志贺菌毒素效应子功能。例如，天然位于1-15、39-48、53-66、55-66、94-115、180-190、179-190和243-257的表位区同时耐受多个氨基酸置换组合，而不会损坏志贺菌毒素酶活性和细胞毒性。
[0311]
b.弗林蛋白酶切割抗性的志贺菌毒素效应多肽的实例
[0312]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽可在志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端包含破坏的弗林蛋白酶切割基序和/或弗林蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽不包含任何已知的补偿结构，所述补偿结构可在志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端附近提供弗林蛋白酶切割。被破坏的弗林蛋白酶切割基序和弗林蛋白酶切割位点的非限制性实例描述于wo2015/191764。
[0313]
本文通过参考序列表中提供的天然志贺菌毒素a亚基的特定氨基酸位置来指示某些弗林蛋白酶切割基序破坏，注意天然存在的志贺菌毒素a亚基包括在其氨基末端上含有约22个氨基酸的信号序列的前体形式-去除信号序列以产生成熟的志贺菌毒素a亚基并且技术人员可识别。此外，包含突变的某些弗林蛋白酶切割基序破坏在本文中通过参考天然存在于天然志贺菌毒素a亚基内的特定位置的特定氨基酸(例如，r代表精氨酸残基)(例如r251代表氨基末端的第251位的精氨酸残基)，随后是在讨论的特定突变中用其对该残基进行置换的氨基酸(例如，r251a表示在氨基末端的氨基酸残基251处用丙氨酸对精氨酸的氨基酸置换)来指示。
[0314]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽在志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端包含破坏的弗林蛋白酶切割基序，并且此类实施方案在本文中被称为“弗林蛋白酶切割抗性”或“蛋白酶切割抗性”志贺菌毒素效应多肽，来描述其相对于野生型志贺菌毒素a亚基和/或野生型志贺菌毒素a1片段融合蛋白的特性。
[0315]
在一些实施方案中，蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应多肽基本上由具有两个或更多个突变的截短的志贺菌毒素a亚基组成。
[0316]
在一些实施方案中，蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应多肽包含破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含用a、g或h对最小弗林蛋白酶切割位点共有基序中精氨酸残基之一或两者进行氨基酸残基置换(相对于野生型志贺菌毒素多肽)。在一些实施方案中，蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应多肽包含破坏，所述破坏包括在弗林蛋白酶切割基序区域内的氨基酸置换，其中置换发生在选自由以下组成的组的天然定位的氨基酸处：seq id no：3的247、seq id no：1或seq id no：2的248、seq id no：3的250、seq id no：1或seq id no：2的251，或在保守志贺菌毒素效应多肽和/或非天然志贺菌毒素效应多肽序列内的等效位置。在一些实施方案中，置换是对任何非保守氨基酸并且置换发生在天然定位的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，所述突变包含选自由以下组成的组的氨基酸置换：r247a、r248a、r250a r251a，或保守志贺菌毒素效应多肽和/或非天然志贺菌毒素效应多肽序列中的等效位置。
[0317]
在一些实施方案中，蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应多肽包含破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含作为缺失的突变。在一些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含突变，所述突变是天然位于stxa(seq id no：2)和slt-1a(seq id no：3)中247-252的区域或天然位于slt-2a(seq id no：3)中246-251的区域中的缺失；天然位于stxa(seq id no：2)和slt-1a(seq id no：3)中244-246的区域，或天然位于slt-2a(seq id no：3)中243-245的区域的缺失；或天然位于stxa(seq id no：2)和slt-1a(seq id no：3)中253-259的区域，或天然位于slt-2a(seq id no：3)中252-258的区域的缺失。
[0318]
在一些实施方案中，蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应多肽包含破坏的弗林蛋白酶
2a衍生的志贺毒素效应多肽，其包含天然定位的氨基酸残基y247和/或r250的内部缺失，其可与周围残基例如248、249、246、251等的缺失组合。在一些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含缺失四个连续氨基酸残基的突变，所述突变缺失最小弗林蛋白酶切割位点r/y-x-x-r，例如stxa和slt-1a衍生的志贺毒素效应多肽缺乏r248-r251和slt-2a衍生的志贺菌毒素效应多肽缺乏y247-r250。在一些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在核心弗林蛋白酶切割基序侧翼的氨基酸残基中具有一个或多个氨基酸残基缺失的突变，例如slt-1a或stxa中的244-247和/或252-255的缺失。在一些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含与野生型志贺菌毒素a基相比是整个暴露于表面的蛋白酶切割敏感环的内部缺失的突变，例如对于stxa和slt-1a衍生的志贺菌毒素效应多肽，天然定位的氨基酸残基241-262的缺失；和对于slt-2a衍生的志贺菌毒素效应多肽，天然定位的氨基酸残基240-261的缺失。
[0322]
在一些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含与野生型志贺菌毒素a亚基相比，弗林蛋白酶切割基序内的内部氨基酸残基缺失的突变和羧基末端截短的突变。在一些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含与野生型志贺菌毒素a亚基相比，最小弗林蛋白酶切割位点r/y-x-x-r内的氨基酸残基缺失的突变和羧基末端截短的突变。例如，蛋白酶切割抗性志贺菌毒素效应多肽可包含破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含突变，所述突变是截短的stxa或slt-1a多肽中天然定位的氨基酸残基248-249和/或250-251的缺失，其仍具有氨基酸残基247和/或252，或截短的slt-2a中的氨基酸残基247-248和/或249-250的缺失，其仍具有氨基酸残基246和/或251。在一些实施方案中，破坏的弗林蛋白酶切割基序包含缺失四个连续氨基酸残基的突变，与野生型志贺氏菌毒素a亚基相比，其缺失最小的弗林蛋白酶切割位点r/y-x-x-r和羧基末端截短，例如，对于stxa和slt-1a衍生的志贺菌毒素效应多肽，截短终止于天然氨基酸残基位置252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、或更大且缺少r248-r251；和对于slt-2a衍生的志贺菌毒素效应多肽，截短终止于天然氨基酸残基位置251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大，且缺少y247-r250。
[0323]
c.具有嵌入表位的志贺菌毒素效应多肽的实例
[0324]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽可包含一个或多个嵌入或插入的异源t细胞表位，用于去免疫和/或递送至靶细胞的mhc i类呈递途径。在一些实施方案和/或某些志贺毒素效应多肽亚区中，嵌入或部分嵌入t细胞表位可能优于插入t细胞表位，因为例如嵌入型修饰更可能在不同的志贺菌毒素效应多肽的亚区中成功，而成功的插入可能更局限于志贺菌毒素效应多肽亚区的较小子集。此处使用的术语“成功”是指对志贺菌毒素效应多肽的修饰(例如异源t细胞表位的引入)导致修饰的志贺菌毒素效应多肽，其在单独或作为结合分子的组分时，保留一种或多种志贺菌毒素效应子功能在所需的活性水平。
[0325]
wo2015/113007中描述的任何志贺菌毒素效应多肽亚区都是合适的。在一些实施方案中，wo2015/113007中描述的任何志贺菌毒素效应多肽都可以修饰为结合分子的志贺菌毒素效应多肽，例如，通过添加一个或多个新的表位区破坏用于去免疫化(如本文所述的
一种)和/或弗林蛋白酶切割基序破坏(如本文所述的一种)。
[0326]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽基本上由截短的志贺毒素a亚基组成，所述截短的志贺毒素a亚基包含嵌入或插入的异源t细胞表位和一个或多个其他突变。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含嵌入的或插入的异源t细胞表位并且小于全长志贺菌毒素a亚基，例如由slt-1a(seq id no：1)或stxa(seq id no：2)的氨基酸77至239表示的多肽或志贺菌毒素家族成员的其他a亚基中的等效物(例如slt-2a(seq id no：3)的氨基酸77至238)组成。例如，在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽衍生自seq id no：1的氨基酸75至251、seq id no：1的1至241、seq id no：1的1至251或seq id no：1的氨基酸1至261，其中志贺菌毒素效应多肽包含至少一个嵌入或插入的异源t细胞表位，并且至少一个氨基酸在内源性b细胞和/或cd4 t细胞表位区中被破坏，并且其中被破坏的氨基酸不与嵌入或插入的表位重叠。类似地，在其他实施方案中，志贺菌毒素效应多肽衍生自seq id no：2的氨基酸75至251、seq id no：2的1至241、seq id no：2的1至251或seq id no：2的氨基酸1至261，其中志贺菌毒素效应多肽包含至少一个嵌入或插入的异源t细胞表位，并且至少一个氨基酸在内源性b细胞和/或cd4 t细胞表位区域中破坏，并且其中被破坏的氨基酸不与嵌入或插入的表位重叠。此外，志贺菌毒素效应多肽可以衍生自seq id no：3的氨基酸75至251、seq id no：3的1至241、seq id no：3的1至251或seq id no：3的氨基酸1至261，其中志贺菌毒素效应多肽包含至少一个嵌入或插入的异源t细胞表位，并且至少一个氨基酸在内源性b细胞和/或cd4 t细胞表位区中被破坏并且其中被破坏的氨基酸不与嵌入或插入的表位重叠。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含嵌入或插入的异源t细胞表位和在志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。例如，在一些实施方案中，志贺毒素效应多肽衍生自seq id no：1的氨基酸75至251、seq id no：1的1至241、seq id no：1的1至251或seq id no：1的氨基酸1至261，其中志贺菌毒素效应多肽包含至少一个嵌入或插入的异源t细胞表位和在志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。类似地，在其他实施方案中，志贺菌毒素效应多肽衍生自seq id no：2的氨基酸75至251、seq id no：2的1至241、seq id no：2的1至251或seq id no：2的氨基酸1至261，其中志贺菌毒素效应多肽包含至少一个嵌入或插入的异源t细胞表位和在志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。此外，志贺菌毒素效应多肽可以衍生自seq id no：3的氨基酸75至251、seq id no：3的1至241、seq id no：3的1至251或seq id no：3的氨基酸1至261，其中志贺菌毒素效应多肽包含至少一个嵌入或插入的异源t细胞表位和在志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。
[0327]
d.组合志贺菌毒素效应多肽的实例
[0328]
组合志贺菌毒素效应多肽包含两个或更多个亚区(即非重叠亚区)，其中每个亚区包含以下中的至少一种：(1)内源性表位或表位区的破坏；(2)嵌入的异源t细胞表位-肽；(3)插入的异源t细胞表位-肽；和(4)a1片段衍生区域羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序。
[0329]
组合志贺菌毒素效应多肽的某些实施方案包含(1)内源性表位或表位区的破坏和(2)a1片段衍生区域的羧基末端的破坏的弗林蛋白酶切割基序两者。预计在wo 2015/113007、wo 2016/196344和wo 2018/140427(参见例如上文的表3)中描述的任何单独的、去免疫的志贺菌毒素效应亚区通常可以与包含本文所述、wo2015/191764中描述和/或本领域
已知的破坏的弗林蛋白酶切割基序的任何志贺菌毒素效应亚区组合，以产生用作结合分子的组分的志贺菌毒素效应多肽。
[0330]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含至少一个内源性b细胞和/或t细胞表位区的破坏，所述内源性b细胞和/或t细胞表位区不与嵌入或插入的异源cd8 t细胞表位重叠；其中所述破坏包含相对于野生型志贺菌毒素的一个或多个氨基酸残基置换。在一些实施方案中，置换选自由以下组成的组：k1到a、g、v、l、i、f、m和h；t4到a、g、v、l、i、f、m和s；d6到a、g、v、l、i、f、s、q和r；s8到a、g、v、i、l、f和m；t9到a、g、v、i、l、f、m和s；s9到a、g、v、l、i、f和m；k11到a、g、v、l、i、f、m和h；t12到a、g、v、i、l、f、m、s和k；s12到a、g、v、i、l、f和m；s33到a、g、v、l、i、f、m和c；s43到a、g、v、l、i、f和m；g44到a或l；s45到a、g、v、l、i、f和m；t45到a、g、v、l、i、f和m；g46到a和p；d47到a、g、v、l、i、f、s、m和q；n48到a、g、v、l、m和f；l49到a、v、c和g；y49到a、g、v、l、i、f、m和t；f50到a、g、v、l、i和t；a51；d53到a、g、v、l、i、f、s和q；v54到a、g、i和l；r55到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；g56到a和p；i57到a、g、v和m；l57到a、v、c、g、m和f；d58到a、g、v、l、i、f、s和q；p59到a、g和f；e60到a、g、v、l、i、f、s、q、n、d、m、t和r；e61到a、g、v、l、i、f、s、q、n、d、m和r；g62到a；r84到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；v88到a和g；i88到a、v、c和g；d94到a、g、v、l、i、f、s和q；s96到a、g、v、i、l、f和m；t104到a、g、v、l、i、f、m；和n；a105到l；t107到a、g、v、l、i、f、m和p；s107到a、g、v、l、i、f、m和p；l108到a、v、c和g；s109到a、g、v、i、l、f和m；t109到a、g、v、i、l、f、m和s；g110到a；s112到a、g、v、l、i、f和m；d111到a、g、v、l、i、f、s、q和t；s112到a、g、v、l、i、f和m；d141到a、g、v、l、i、f、s和q；g147到a；v154到a和g；r179到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；t180到a、g、v、l、i、f、m和s；t181到a、g、v、l、i、f、m和s；d183到a、g、v、l、i、f、s和q；d184到a、g、v、l、i、f、s和q；l185到a、g、v和c；s186到a、g、v、i、l、f和m；g187到a；r188到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；s189到a、g、v、i、l、f和m；d198到a、g、v、l、i、f、s和q；r204到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；r205到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；s247到a、g、v、i、l、f和m；y247到a、g、v、l、i、f和m；r248到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；r250到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；r251到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；d264到a、g、v、l、i、f、s和q；g264到a；和t286到a、g、v、l、i、f、m和s。在一些实施方案中，存在多个内源性b细胞和/或cd8 t细胞表位区的多个破坏，其中每个破坏涉及至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基置换：k1到a、g、v、l、i、f、m和h；t4到a、g、v、l、i、f、m和s；d6到a、g、v、l、i、f、s、q和r；s8到a、g、v、i、l、f和m；t9到a、g、v、i、l、f、m和s；s9到a、g、v、l、i、f和m；k11到a、g、v、l、i、f、m和h；t12到a、g、v、i、l、f、m、s和k；s12到a、g、v、i、l、f和m；s33到a、g、v、l、i、f、m和c；s43到a、g、v、l、i、f和m；g44到a或l；s45到a、g、v、l、i、f和m；t45到a、g、v、l、i、f和m；g46到a和p；d47到a、g、v、l、i、f、s、m和q；n48到a、g、v、l、m和f；l49到a、v、c和g；y49到a、g、v、l、i、f、m和t；f50到a、g、v、l、i和t；a51；d53到a、g、v、l、i、f、s和q；v54到a、g、i和l；r55到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；g56到a和p；i57到a、g、v和m；l57到a、v、c、g、m和f；d58到a、g、v、l、i、f、s和q；p59到a、g和f；e60到a、g、v、l、i、f、s、q、n、d、m、t和r；e61到a、g、v、l、i、f、s、q、n、d、m和r；g62到a；r84到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；v88到a和g；i88到a、v、c和g；d94到a、g、v、l、i、f、s和q；s96到a、g、v、i、l、f和m；t104到a、g、v、l、i、f、m；和n；a105到l；t107到a、g、v、l、i、f、m和p；s107到a、g、v、l、i、f、m和p；l108到a、v、c和g；s109到a、g、v、i、l、f和m；t109到a、g、v、i、l、f、m和s；g110到a；s112到a、g、v、l、i、f和m；d111到a、g、v、l、i、f、s、q和t；s112到a、g、v、l、i、f和m；d141到a、g、v、l、i、f、s和q；g147到a；v154到a和g；r179到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；t180到a、g、v、l、i、f、m和s；t181到
l1结合区。对于本文所述的每个pd-l1结合分子，所述至少一个结合区与衍生所述毒素效应多肽的毒素是异源的，例如包含与所述毒素无关的免疫球蛋白结构域的pd-l1结合区。在一些实施方案中，至少一种毒素组分包含毒素效应多肽。在一些实施方案中，毒素效应多肽是源自志贺菌毒素a亚基的志贺菌毒素a亚基效应多肽。
[0339]
在一些实施方案中，pd-l1结合分子包含(1)至少一种志贺菌毒素a亚基效应多肽，其衍生自志贺菌毒素家族的至少一个成员的a亚基和(2)至少一个pd-l1结合区，其能够特异性结合pd-l1分子的细胞外部分。
[0340]
在一些实施方案中，pd-l1结合区包含重链可变区(hvr-h)，所述重链可变区(hvr-h)包含三个cdr，每个与seq id no：22-24和27-32中的任一项具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id no：22-24和27-32中任一项所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，结合区进一步包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，每个与seq id no：19、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：25和seq id no：26中的任一项具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id no：19、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：25和seq id no：26中任一项所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，结合区进一步包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，与seq id no：19、seq id no：20和seq id no：21具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id no：19、seq id no：20和seq id no：21中任一项所示的氨基酸序列组成。在某些其他进一步的实施方案中，结合区进一步包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，与seq id no：25、seq id no：20和seq id no：21具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id no：25、seq id no：20和seq id no：21中任一项所示的氨基酸序列组成。在某些其他进一步的实施方案中，结合区进一步包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，与seq id no：19、seq id no：20和seq id no：26具有至少 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id no：19、seq id no：20和seq id no：26中任一项所示的氨基酸序列组成。
[0341]
在一些实施方案中，结合区包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，每个cdr包含或基本上由seq id no：19、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：25和seq id no：26中任一项所示的氨基酸序列组成；和(b)重链可变区(hvr-h)，所述重链可变区(hvr-h)包含三个cdr，每个cdr包含或基本上由seq id no：22-24和27-32中任一项所示的氨基酸序列组成。
[0342]
在一些实施方案中，结合区包括：(a)轻链区，所述轻链区与seq id no：33、35-36和38中的任一项具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或基本上由seq id no：33、35-36和38中任一项的氨基酸序列组成；和/或(b)重链区，所述重链区与seq id no：34、37和39中的任一项具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或基本上由seq id no：34、37和39中任一项的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，结合区包含多肽，所述多肽与seq id no：85-107和156-157中的任一项具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％的同一性，或基本上由seq id no：85-107和156-157中任一项所示的多肽组成。在一些实施方案中，结合区是单链可变片段，例如由、包含或基本上由seq id no：85-107和156-157中任一项的多肽组成。
[0343]
在一些实施方案中，pd-l1结合分子包含志贺菌毒素a亚基效应多肽和能够特异性结合pd-l1细胞外部分的结合区；其中结合区包含(a)重链可变区(vh)，所述重链可变区(vh)包含(i)cdr1，所述cdr1包含氨基酸序列eytmh(seq id no：27)，(ii)cdr2，所述cdr2包含氨基酸序列ginpnnggtwynqkfkg(seq id no：29)，和(iii)cdr3，所述cdr3包含氨基酸序列pyyygsredyfdy(seq id no：32)；和(b)轻链可变区(vl)，所述轻链可变区(vl)包含(i)cdr1，所述cdr1包含氨基酸序列sasssvsymy(seq id no：19)，(ii)cdr2，所述cdr2包含氨基酸序列ltsnlas(seq id no：20)，和(iii)cdr3，所述cdr3包含氨基酸序列qqwssnppt(seq id no：26)。在一些实施方案中，pd-li结合分子包含志贺菌毒素a亚基效应多肽和能够特异性结合pd-l1细胞外部分的结合区；其中结合区包含(a)重链可变区(vh)，所述重链可变区(vh)包含(i)cdr1，所述cdr1由氨基酸序列eytmh(seq id no：27)组成，(ii)cdr2，所述cdr2由氨基酸序列ginpnnggtwynqkfkg(seq id no：29)组成，和(iii)cdr3，所述cdr3由氨基酸序列pyyygsredyfdy(seq id no：32)组成；和(b)轻链可变区(vl)，所述轻链可变区(vl)包含(i)cdr1，所述cdr1由氨基酸序列sasssvsymy(seq id no：19)组成，(ii)cdr2，所述cdr2由氨基酸序列ltsnlas(seq id no：20)组成，和(iii)cdr3，所述cdr3由氨基酸序列qqwssnppt(seq id no：26)组成。在一些实施方案中，pd-l1结合分子包含志贺菌毒素a亚基效应多肽和能够特异性结合pd-l1细胞外部分的结合区；其中结合区包含(a)重链可变区(vh)，所述重链可变区(vh)包含(i)cdr1，所述cdr1具有氨基酸序列eytmh(seq id no：27)，(ii)cdr2，所述cdr2具有氨基酸序列ginpnnggtwynqkfkg(seq id no：29)，和(iii)cdr3，所述cdr3具有氨基酸序列pyyygsredyfdy(seq id no：32)；和(b)轻链可变区(vl)，所述轻链可变区(vl)包含(i)cdr1，所述cdr1具有氨基酸序列sasssvsymy(seq id no：19)，(ii)cdr2，所述cdr2具有氨基酸序列ltsnlas(seq id no：20)，和(iii)cdr3，所述cdr3具有氨基酸序列qqwssnppt(seq id no：26)。
[0344]
在一些实施方案中，志贺菌毒素a亚基效应多肽包含seq id no：41的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。
[0345]
在一些实施方案中，vh包含seq id no：34的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，vl包含seq id no：35的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，vh包含seq id no：34的序列并且vl包含seq id no：35的序列。
[0346]
在一些实施方案中，结合区包含scfv接头，所述scfv接头连接vh和vl。在一些实施方案中，scfv接头的长度为3至12个氨基酸。在一些实施方案中，scfv接头的长度为3至约12个氨基酸。在一些实施方案中，scfv接头的长度为约3至约12个氨基酸。在一些实施方案中，scfv接头的长度为约10至20个氨基酸。在一些实施方案中，scfv接头的长度为大于20个氨基酸。在一些实施方案中，scfv接头是柔性接头。在一些实施方案中，scfv接头包含seq id no：72的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，结合区是单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，结合区包含seq id no：106的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。
[0347]
如本文所用，术语“结合结构域接头”是指连接志贺菌毒素a亚基效应多肽和结合区(例如，scfv)的接头。在一些实施方案中，pd-l1结合分子包含结合结构域接头。在一些实施方案中，结合结构域接头包含seq idno：73的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，结合结构域接头包含seq id no：74-77中任一项的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。
[0348]
在一些实施方案中，结合分子包含与志贺菌毒素a亚基异源的cd8 t细胞表位。在一些实施方案中，cd8 t细胞表位包含序列nlvpmvatv(seq id no：78)，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，cd8 t细胞表位通过可切割的间隔区连接至结合区。在一些实施方案中，结合分子具有间隔区，所述间隔区具有序列hhaa(seq id no：265)。
[0349]
在一些实施方案中，结合分子从n末端到c末端包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头和结合区。在一些实施方案中，结合分子从n末端到c末端包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头、vh和vl。在一些实施方案中，结合分子从n末端到c末端包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头、vh、scfv接头和vl。
[0350]
在一些实施方案中，结合分子从n末端到c末端包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头、结合区和cd8 t细胞表位。在一些实施方案中，结合分子从n末端到c末端包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头、vh、scfv接头、vl和cd8 t细胞表位。在一些实施方案中，结合分子从n末端到c末端包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头、结合区、可切割间隔区和cdg t细胞表位。
[0351]
在一些实施方案中，结合分子是单个连续多肽。在一些实施方案中，结合分子包含seq id no：128的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，结合分子包含seq id no：108-155、158-159或160-168中任一项的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。
[0352]
在一些实施方案中，结合分子包含两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个或八个)多肽。在一些实施方案中，每个多肽包含seq id no：128的序列。在一些实施方案中，两个多肽彼此非共价连接，例如通过结合区。
[0353]
在一些实施方案中，结合分子是细胞毒性的。在一些实施方案中，pd-l1结合分子是非细胞毒性的。例如，如果志贺菌毒素亚基效应多肽被截短或包含一个或多个消除其细胞毒性活性的突变，则pd-l1结合分子可以是非细胞毒性的。
[0354]
在pd-l1结合分子的一些实施方案中，在向表达pd-l1的细胞施用pd-l1结合分子后，导致(i)pd-l1结合分子被细胞内化和(ii)细胞的死亡。在pd-l1结合分子的一些实施方案中，在向表达pd-l1的细胞施用pd-l1结合分子后，导致(i)pd-l1结合分子被细胞内化和(ii)由于具有催化活性的志贺菌毒素a亚基效应多肽的细胞死亡。在pd-l1结合分子的一些实施方案中，在向表达pd-l1的细胞施用pd-l1结合分子后，导致(i)pd-l1结合分子被细胞内化和(ii)由于t细胞表位货物的递送和呈递的细胞死亡。在一些实施方案中，pd-l1结合分子在被引入细胞时能够表现出半数最大抑制浓度(cd
50
)值为300nm或更小的细胞毒性和/或能够表现出显著水平的志贺菌毒素细胞毒性。
[0355]
在pd-l1结合分子的一些实施方案中，志贺菌毒素a亚基效应多肽能够表现出具有小于10,000、5,000、1,000、500或200皮摩尔的半数最大抑制浓度(ic
50
)值的核糖体抑制活
性。
[0356]
在pd-l1结合分子的一些实施方案中，至少一种志贺菌毒素a亚基衍生的多肽包含特征的组合(例如，去免疫亚区、包含亚区的异源表位、蛋白酶切割抗性亚区和/或羧基末端内质网保留/回收信号基序)。本文所述的某些pd-l1结合分子在单个分子中提供了几种特性的组合，例如，有效的细胞内化、有效的细胞靶向细胞毒性、选择性细胞毒性、去免疫、高剂量下的低非特异性毒性、高稳定性、cd8 t细胞超免疫和/或将异源t细胞表位递送至靶细胞的mhc i类途径的能力。
[0357]
在一些实施方案中，pd-l1结合分子可用于向脊索动物施用，例如当需要(1)减少或消除由施用的分子产生的某些免疫应答时，(2)减少或消除由施用的分子引起的非特异性毒性，(3)在体内特异性杀死表达pd-l1的靶细胞，和/或(4)将有益的免疫应答靶向靶细胞类型、包含靶细胞类型的肿瘤块和/或包含这种靶细胞类型的组织位点，例如通过刺激脊索动物的cd8 t细胞与特定的显示靶细胞类型的mhc i类-表位复合体的细胞间接合。
[0358]
在一些实施方案中，pd-l1结合分子包含或基本上由seq id no：85-107和156-157中任一项所示的多肽组成，并且任选地，pd-l1结合分子包含氨基末端甲硫氨酸残基。
[0359]
如本文所用，术语“cmax”是指结合分子在其被施用于受试者之后达到的峰值血清浓度。在一些实施方案中，本文所述的pd-l1结合分子具有约1000至约50,000ng/ml范围内的cmax。例如，pd-l1结合分子的cmax可在约1至约1,000ng/ml、约1,000至约3,000ng/ml、约2,000至约5,000ng/ml、约5,000至约10,000ng/ml，约10,000ng/ml至约15,000ng/ml，约15,000ng/ml至约20,000ng/ml，约20,000ng/ml至约25,000ng/ml，约25,000ng/ml至约30,000ng/ml，或约30,000ng/ml至约35,000ng/ml，或约35,000ng/ml至约50,000ng/ml的范围内。在一些实施方案中，cmax为约1,000、约2,000、约3,000、约4,000、约5,000、约6,00、约7,000、约8,000、约9,000或约10,000ng/ml。在一些实施方案中，cmax为约21,000、约22,000、约23,000、约24,000、约25,000、约26,000、约27,000、约28,000、约29,000或约30,000ng/ml。在一些实施方案中，cmax为2,096、27,063或22,375ng/ml。
[0360]
如本文所用，术语“半衰期”或“t
1/2”是指施用的pd-l1结合分子的初始剂量的一半从体内消除所用的时间。在一些实施方案中，本文所述的pd-l1分子的半衰期为约1分钟至约1小时、约1小时至约3小时、约3小时至约5小时、或约5小时至约10小时。在一些实施方案中，pd-l1结合分子的半衰期为约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟分钟、约50分钟、约55分钟或约60分钟。在一些实施方案中，pd-l1结合分子的半衰期为约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约9.6小时或约10小时。在一些实施方案中，pd-l1结合分子的半衰期为约2.8小时、约3.7小时或约5.6小时。
[0361]
在pd-l1结合分子的一些实施方案中，在向表达pd-l1的细胞施用pd-l1结合分子后，导致(i)pd-l1结合分子被细胞内化和(ii)细胞在细胞表面呈递由与mhc i类分子复合的pd-l1结合分子递送的异源cd8 t细胞表位-肽货物。
[0362]
其他结构变异
[0363]
在一些实施方案中，使用结合分子的片段、变体和/或衍生物，其包含与pd-l1靶生物分子的任何细胞外部分的功能性结合位点，甚至更优选能够以高亲和力结合靶生物分子
(例如，如kd所示)。例如，任何以10-5
至10-12
摩尔/升，优选小于200nm的解离常数(kd)结合靶生物分子的细胞外部分的结合区，可被置换以用于制备如本文所述的结合分子和方法。
[0364]
技术人员将认识到，可以对志贺菌毒素效应多肽、抗体和结合分子以及编码任何前者的多核苷酸进行变异，而不降低它们的生物活性，例如，通过保持志贺菌毒素效应多肽的整体结构和功能，例如与一种或多种1)降低抗原性和/或免疫原性潜力的内源性表位破坏，2)减少蛋白水解切割的弗林蛋白酶切割基序破坏，和/或3)降低抗原性和/或免疫原性潜力或能够被递送至mhc i分子以呈递在细胞表面上的嵌入或插入的表位结合。例如，一些修饰可以促进表达、促进纯化、改善药代动力学特性和/或改善免疫原性。此类修饰是技术人员熟知的，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点，在任一末端放置另外的氨基酸以产生方便定位的限制性位点或终止密码子，以及融合到任一末端以提供方便的检测和/或纯化的生化亲和标签。提高使用非脊索动物系统(例如原核细胞)产生的多肽的免疫原性的常见修饰是在产生多肽之后去除起始甲硫氨酸残基，所述甲硫氨酸残基可能在产生过程中被甲酰化，例如，在细菌宿主系统中，因为例如n-甲酰甲硫氨酸(fmet)的存在可能会在脊索动物中诱导不需要的免疫应答。
[0365]
本文还考虑在结合分子的氨基和/或羧基末端包含另外的氨基酸残基，或结合分子的蛋白质组分，例如表位标签或其他部分的序列。另外的氨基酸残基可用于多种目的，包括例如促进克隆、促进表达、翻译后修饰、促进合成、纯化、促进检测和施用。表位标签和部分的非限制性实例是几丁质结合蛋白结构域、肠肽酶切割位点、xa因子切割位点、fiash标签、flag标签、绿色荧光蛋白(gfp)、谷胱甘肽-s-转移酶部分、ha标签、麦芽糖结合蛋白结构域、myc标签、多组氨酸标签、reash标签、链霉素标签、链霉素标签ii、tev蛋白酶位点、硫氧还蛋白结构域、凝血酶切割位点和v5表位标签。
[0366]
在某些上述实施方案中，志贺菌毒素效应物多肽和/或结合分子的多肽序列通过引入多肽区域的一个或多个保守氨基酸置换而改变，只要所有需要的结构特征仍然存在，并且志贺菌毒素效应多肽能够单独或作为结合分子的组分表现出任何所需的功能。如本文所用，术语“保守置换”表示一个或多个氨基酸被另一个生物学上相似的氨基酸残基替换。实例包括用具有相似特征的氨基酸残基，例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸(参见例如表4)置换。用在内源性哺乳动物肽和蛋白质中通常不存在的残基进行保守置换的实例是用例如鸟氨酸、刀豆氨酸、氨乙基半胱氨酸或另一种碱性氨基酸对精氨酸或赖氨酸残基进行保守置换。关于肽和蛋白质中的表型沉默置换的进一步信息参见，例如，bowie j等人，science 247：1306-10(1990)。
[0367]
表4.保守氨基酸置换的实例
[0368][0369]
在表4中的保守置换方案中，示例性的氨基酸保守置换按物理化学性质分组-i：中性，亲水；ii：酸和酰胺；iii：碱性的；iv：疏水性的；v：芳香族、大体积氨基酸、vi亲水不带电荷、vii脂肪族不带电荷、viii非极性不带电荷、ix环烯基缔合的、x疏水、xi极性、xii小、xiii转向允许和xiv柔性。例如，保守氨基酸置换包括以下：1)s可以置换c；2)m或l可以置换f；3)y可以置换m；4)q或e可以置换k；5)n或q可以置换h；和6)h可以置换n。
[0370]
另外的保守氨基酸置换包括以下：1)s可以置换c；2)m或l可以置换f；3)y可以置换m；4)q或e可以置换k；5)n或q可以置换h；和6)h可以置换n。
[0371]
志贺菌毒素效应多肽和结合分子的变体可通过改变本文所述的多肽来制备，通过例如在结合区或志贺菌毒素效应多肽区内改变一个或多个氨基酸残基或缺失或插入一个或多个氨基酸残基，以实现所需的特性，例如改变的细胞毒性、改变的细胞抑制作用、改变的免疫原性和/或改变的血清半衰期。志贺菌毒素效应多肽和结合分子可以进一步带有或不带有信号序列。在一些实施方案中，结合分子可以包含本文所述的多肽区域的功能片段或变体，与本文所述的多肽序列相比，其具有至多20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸置换。
[0372]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽和结合分子可包含本文所述多肽区域的功能片段或变体，与本文所述的多肽序列相比，其具有至多20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸置换，只要它(1)包含至少一个嵌入或插入的异源t细胞表位，和至少一个氨基酸在内源性b细胞和/或cd4 t细胞表位区中被破坏，其中破坏的氨基酸不与嵌入或插入的表位重叠；(2)在志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端包含至少一个嵌入或插入的异源t细胞表位和破坏的弗林蛋白酶切割基序；或(3)在志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端包
含破坏的弗林蛋白酶切割基序并且包含在内源性b细胞和/或cd4 t细胞表位区域中破坏的至少一个氨基酸，其中被破坏的氨基酸不与被破坏的弗林蛋白酶切割基序重叠。
[0373]
因此，在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含或基本上由与天然存在的志贺菌毒素a亚基或其片段，例如志贺菌毒素a亚基，例如slt-1a(seq id no：1)、stxa(seq id no：2)和/或slt-2a(seq id no：3)具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的总体序列同一性的氨基酸序列组成，其中志贺菌毒素效应多肽(1)包含至少一个嵌入或插入的异源t细胞表位，和至少一个氨基酸在内源性b-细胞和/或cd4 t细胞表位区域中被破坏，其中破坏的氨基酸不与嵌入或插入的表位重叠；(2)在志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端包含至少一个嵌入或插入的异源t细胞表位和破坏的弗林蛋白酶切割基序；或(3)在志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端包含破坏的弗林蛋白酶切割基序并且包含在内源性b细胞和/或cd4 t细胞表位区域中被破坏的至少一个氨基酸，并且其中被破坏的氨基酸不与被破坏的弗林蛋白酶切割基序重叠。
[0374]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽具有可被突变、插入或缺失的一个或多个氨基酸残基，以增加志贺菌毒素效应多肽的酶活性。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽具有可被突变或缺失的一个或多个氨基酸残基，以降低或消除志贺菌毒素效应多肽的催化和/或细胞毒活性。例如，志贺菌毒素家族成员的a亚基的催化和/或细胞毒活性可以通过突变或截短而降低或消除。
[0375]
志贺菌毒素家族成员的a亚基的细胞毒性可通过突变和/或截短而改变、降低或消除。标记为酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、酪氨酸-114和色氨酸-203的位置已被证明对stx、stx1和stx2的催化活性很重要(hovde c等人，proc natl acad sci usa 85：2568-72(1988)；deresiewicz r等人，biochemistry 31：3272-80(1992)；deresiewicz r等人，mol gen genet 241：467-73(1993)；ohmura m等人，microb pathog 15：169-76(1993)；cao c等人，microbiol immunol 38：441-7(1994)；suhan m，hovde c，infect immun 66：5252-9(1998))。在无细胞核糖体失活测定中，谷氨酸-167和精氨酸-170两者的突变消除了slt-i a1的酶活性(lapointe p等人，j biol chem 280：23310-18(2005))。在另一种使用slt-i a1在内质网从头表达的方法中，谷氨酸-167和精氨酸-170两者的突变消除了slt-ia1片段在该表达水平上的细胞毒性(lapointe p等人，jbiol chem 280：23310-18(2005))。截短分析表明，残基75至268的stxa片段在体外仍保留显著的酶活性(haddad j等人，jbacteriol 175：4970-8(1993))。含有残基1-239的slt-i a1的截短片段显示出显著的体外酶活性和胞质溶胶中从头表达的细胞毒性(lapointe p等人，j biol chem 280：23310-18(2005))。被截短为残基1-239的slt-ia1片段在内质网中的表达没有细胞毒性，因为它不能逆向转运至胞质溶胶(lapointe p等人，jbiol chem 280：23310-18(2005))。
[0376]
志贺菌菌毒素a亚基中酶活性和/或细胞毒性最关键的残基已被定位到以下残基位置：天冬酰胺-75、酪氨酸-77、酪氨酸-114、谷氨酸-167、精氨酸-170、精氨酸-176和色氨酸-203等(di r等人，toxicon 57：525-39(2011))。特别是，含有谷氨酸-e167-到-赖氨酸和精氨酸-176-到-赖氨酸突变的stx2a双突变构建体完全失活；而stx1和stx2中的许多单突变显示细胞毒性降低了10倍。此外，将stx1a截短为1-239或1-240降低其细胞毒性，类似地，将stx2a截短为保守的疏水残基降低其细胞毒性。志贺菌毒素a亚基中结合真核核糖体和/或真核核糖体抑制的最关键残基已被定位到以下残基位置精氨酸-172、精氨酸-176、精氨
酸-179、精氨酸-188、酪氨酸-189、缬氨酸-191和亮氨酸233等(mccluskey a等人，plos one 7：e31191(2012)。然而，某些修饰可以增加志贺菌毒素效应多肽所展示的志贺菌毒素功能活性。例如，将stx1a中的残基位置丙氨酸-231突变为谷氨酸会增加stx1a在体外的酶活性(suhan m，hovde c，infect immun 66：5252-9(1998))。
[0377]
在一些实施方案中，源自slt-1a(seq id no：1)或stxa(seq id no：2)的志贺菌毒素效应多肽具有一个或多个突变的氨基酸残基，包括位置75的天冬酰胺、位置77的酪氨酸、位置114的酪氨酸、位置167的谷氨酸、位置170的精氨酸、位置176的精氨酸的置换，和/或位置203的色氨酸的置换。基于现有技术，技术人员已知此类置换的实例，例如第75位的天冬酰胺置换为丙氨酸，第77位的酪氨酸置换为丝氨酸，第114位的酪氨酸置换为丝氨酸，第167位的谷氨酸置换为谷氨酸、第170位的精氨酸置换为丙氨酸、第176位的精氨酸置换为赖氨酸、第203位的色氨酸置换为丙氨酸和/或第231位的丙氨酸置换为谷氨酸。增强或降低志贺菌毒素酶活性和/或细胞毒性的其他突变在本公开的范围内并且可以使用本文公开的众所周知的技术和测定来确定。
[0378]
志贺菌毒素效应多肽和结合分子可以任选地缀合至一种或多种另外的试剂，所述另外的试剂可以包括治疗剂、诊断剂和/或本领域已知的其他另外的外源物质，包括如本文所述的这些试剂。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽或结合分子被聚乙二醇化或白蛋白化，例如以通过掩蔽志贺菌毒素a1片段衍生区域羧基末端的延伸环和/或弗林蛋白酶切割基序提供去免疫、破坏的弗林蛋白酶切割，改善药代动力学性质，和/或改善免疫原性(参见例如，wang q等人，cancer res 53：4588-94(1993)；tsutsumi y等人，proc natl acad sci usa 97：8548-53(2000)；buse j，e1-aneed a，nanomed 5：1237-60(2010)；lim s等人，j control release 207-93(2015))。
[0379]
1.抗体组分变体
[0380]
在一些实施方案中，考虑了本文所述的结合分子(例如抗体-毒素缀合物)的抗体组分的氨基酸序列变体。例如，可能需要提高抗体-毒素缀合物的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码抗体组分的核苷酸序列中，或通过肽合成来制备。此类修饰包括，例如，抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或置换。可以进行缺失、插入和置换的任何组合以获得最终构建体，前提是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合和/或毒素递送。
[0381]
a)置换、插入和缺失变体
[0382]
在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。置换诱变目标位点包括hvr和fr。可以将氨基酸置换引入目标抗体，并筛选抗体-毒素缀合物产物的所需活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的adcc或cdc。
[0383]
一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体的一个或多个高变区残基(例如以产生人源化抗体)。通常，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体将在某些生物学特性(例如增加的亲和力或降低的免疫原性)方面具有修饰(例如改进)和/或具有亲本抗体基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟的抗体，其可以方便地产生，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术。简而言之，一个或多个hvr残基被突变，变体抗体被展示并筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)(参见例如wo 2015/120058)。
[0384]
可以在hvr中进行改变(例如置换)，例如，使用技术人员已知的方法来提高抗体亲
和力。例如，可以在hvr“热点”或由在体细胞成熟过程中发生高频突变的密码子编码的残基(chowdhury p，methods mol biol 207：179-196(2008))，和/或sdr(a-cdr)中进行改变，对所得变体重链和/或轻链进行结合亲和力测试。在一些实施方案中，置换、插入或缺失可在一个或多个hvr内发生，只要此类改变不会显著降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在hvr中，包括在hvr“热点”或sdr之外进行不会显著降低结合亲和力的保守改变。在上面提供的变体vh和vl序列的一些实施方案中，每个hvr或者是未改变的，或者包含不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
[0385]
氨基酸序列插入包括长度从一个残基到包含一百个或更多残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有氨基末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的氨基末端和/或羧基末端与酶(例如用于抗体导向的酶前药治疗)或增加抗体血清半衰期的多肽的融合。
[0386]
b)去免疫和/或嵌合变体
[0387]
在一些实施方案中，结合分子(例如抗体-毒素缀合物)的抗体组分是嵌合的。例如，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物的可变区)和人恒定区。在进一步的实施例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或同种型已从其衍生的亲本抗体的类别或同种型中改变。在一些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
[0388]
在一些实施方案中，结合分子(例如抗体-毒素缀合物)的抗体组分是人源化的。通常，非人类抗体被人源化以降低人中的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中hvr，例如cdr，(或其部分)源自非人抗体，而fr(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选还将包含来自人抗体的恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些fr残基已被来自非人抗体(例如hvr残基所源自的抗体)的相应残基置换，例如以恢复或提高抗体特异性和/或亲和力。
[0389]
c)fc区变体
[0390]
在一些实施方案中，结合分子(例如抗体-毒素缀合物)的抗体组分包含fc区。例如，fc区变体可以包含人fc区序列(例如，来自人igg1、igg2、igg3或igg4的fc区)并且可以任选地包含一个或多个氨基酸改变(例如一个或多个氨基酸位置的置换)。在一些实施方案中，抗体组分包含具有adcc和/或cdc活性的fc区。这样的抗体对于介导靶表达细胞的杀伤特别有用。例如，可以通过改变参与fc结构域和fc受体(fcr)(例如fcγri、fcγriia、fcγriib或fcγriii与fcrn)之间相互作用的氨基酸残基来产生具有改进的fc效应子功能的抗体，这可能导致细胞毒性增加和/或药代动力学改变，例如血清半衰期增加。与fcr的结合提高或减少的某些抗体变体是技术人员已知的和/或在shields r等人，j biol chem 9：6591-6604(2001)中描述的。
[0391]
在一些实施方案中，抗体组分包含缺乏一种或多种效应子功能(例如，缺乏adcc和/或cdc活性)的fc区。例如，通过将一个或多个氨基酸置换引入天然fc区序列来获得缺乏或具有显著降低的效应子功能的fc区，使得fc区不与溶细胞性fc受体(例如dana突变体)和/或c1q补体蛋白(参见例如wilson n等人，cancer cell 19：101-113(2011)；idusogie e等人jimmunol 164：4178-4184(2000))结合，或具有显著降低的结合。在一些实施方案中，抗体组分的变化在于它具有一些但不是所有的抗体效应子功能，这使其成为其中结合分子
在体内的半衰期很重要但某些效应子功能(例如cdc或adcc)是不希望的或有害的应用的理想候选物。
[0392]
在一些实施方案中，抗体组分包含具有一个或多个提高adcc的氨基酸置换的fc区，例如，在fc区的位置298、333和/或334的置换(残基的eu编号)。
[0393]
在一些实施方案中，抗体组分包含具有一个或多个氨基酸置换的fc区，该置换导致改变的clq结合和/或cdc效应子功能(例如改善或减少)(参见例如wo 1999/051642；us.6,194,551)。
[0394]
d)糖基化变体
[0395]
在一些实施方案中，改变结合分子(例如抗体-毒素缀合物)的抗体组分以增加或减少抗体糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可以方便地通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以改变包含糖基化fc区的抗体组分，从而改变与其连接的碳水化合物。在另一个实施例中，可以使用技术人员已知的方法改变与抗体组分连接的碳水化合物。
[0396]
e)半胱氨酸工程化抗体变体
[0397]
在一些实施方案中，结合分子(例如抗体-毒素缀合物)的抗体组分具有一个或多个工程化的半胱氨酸残基。在抗体的一些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程化抗体，例如其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基(例如thiofab)置换。在一些实施方案中，置换的残基出现在抗体的容易用于缀合的位点处(参见例如junutula j等人，nature biotech 26：925-32(2008)；dornan d等人，blood114：2721-29(2009))。通过用半胱氨酸置换那些残基，反应性硫醇基团由此定位在抗体的可接近位点并且可用于将抗体缀合至其他部分，例如药物部分或接头-药物部分，以产生如本文进一步描述的免疫连接物。在抗体的一些实施方案中，可能需要通过一个或多个半胱氨酸残基置换产生半胱氨酸工程化抗体，所述半胱氨酸残基置换不会显著干扰抗体折叠和组装，也不会显著改变抗原结合和/或抗体效应子功能。
[0398]
2.免疫连接物
[0399]
本文还提供了pd-l1结合分子的各种实施方案，其中每个pd-l1结合分子包含(1)至少一个毒素组分和(2)至少一个能够特异性结合pd-l1分子的细胞外部分的pd-l1结合区，包括包含与一种或多种毒素组分(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)缀合的抗pd-l1抗体的免疫连接物。“免疫连接物”是与一种或多种异源分子缀合的抗体(包括抗原结合抗体片段)，所述一种或多种异源分子包括但不限于细胞毒剂。
[0400]
在结合分子的一些实施方案中，免疫连接物是抗体-毒素缀合物，其是与毒素缀合的抗体，所述毒素例如白喉a链、外毒素a链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白a链、相思豆毒蛋白a链、塑莲根毒蛋白ii a链、α-帚曲霉素、油桐(aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(phytolaca americana)蛋白(例如papi、papii或pap-s)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白、米托霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素、志贺菌毒素a亚基和单端孢霉烯。包含与pd-l1结合区(例如抗体或抗体片段)连接的毒素(例如志贺菌毒素a亚基片段)的生物免疫连接物可用作治疗性或诊断性生物分子。此外，这样的治疗或诊断分子
可以通过使志贺菌毒素效应多肽与另外的试剂(例如溶解度改变剂、药代动力学改变剂、免疫原性改变剂和/或药效学改变剂)缀合来改进(参见例如wo 2018/106895)。通常，生物药物免疫连接物是通过使用涉及生物分子的一个或多个官能团和试剂或货物的官能团的化学反应，或者设计用于在生物分子和药剂或货物之间桥接的接头，将抗体与其他试剂或货物缀合来产生的(见章节ii.连接组分和/或其亚组分的键，如上所述)。
[0401]
在一些实施方案中，结合分子是利用工程化到pd-l1结合区中的半胱氨酸的免疫连接物，例如，其中结合分子包含半胱氨酸工程化抗体。在一些实施方案中，结合分子是利用工程化到免疫球蛋白可变区的框架区(例如fri)中用于缀合的半胱氨酸的免疫连接物(参见例如wo 2011/000054)。
[0402]
在一些实施方案中，结合分子是利用与fc区连接的碳水化合物部分的免疫连接物，例如，其中结合分子包含糖基化抗体或抗体片段。
[0403]
在一些实施方案中，结合分子是包含抗体或抗体片段和志贺菌毒素a亚基效应多肽的免疫连接物。
[0404]
如本文所述的结合分子或抗体毒素缀合物的毒素组分可包括但不限于天然毒素、生物毒素、蛋白质毒素、毒液、细胞毒素、小分子毒素和衍生自上述任何物质的合成毒物，例如，乌头碱、阿霉素、鹅膏蕈碱、鹅膏菌素、蒽环类、aroin、蜂毒素、阿托品、蟾蜍毒素、强心苷、加利车霉素(calicheamycin)、白屈菜、毒芹素、秋水仙碱、毒芹碱、铃兰毒甙、响尾蛇胺、箭毒、麻风树毒蛋白、蝙蝠葛碱、毛地黄、海兔毒素、倍癌霉素(duocarmycin)、伊夫单甙(evomonoside)、木藜芦毒素、钩吻碱、钩吻宁、嚏根草因、嚏根草苷、莨菪碱、ligatoxin、女贞素(ligustrin)、美登素、丝裂霉素c、蕈毒碱、毒蕈肽、phoratoxin、植物毒素、印防己毒素、海荨麻毒素、紫杉碱生物碱、硫素、长春花生物碱、粘毒素和本文所述的各种毒素剂。适合用作毒素组分的药学活性细胞毒素还包括但不限于abx毒素、核糖体失活蛋白毒素、炭疽毒素、cholix毒素、密蛋白、白喉毒素、不耐热肠毒素、百日咳毒素、假单胞菌外毒素a、蓖麻毒蛋白、志贺菌毒素和枯草杆菌酶细胞毒素；烷化剂(例如苯达莫司汀、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、罗氮芥、双氯乙基甲胺、美法仑、氮芥、噻替派和曲奥舒凡)、抗生素(例如蒽环类)、抗微管剂(例如长春花生物碱，如长春新碱、长春碱和依托泊苷或类毒素，如紫杉醇和多烯紫杉醇)，嵌合剂(例如柔红霉素、博来霉素、放线菌素、多柔比星、表柔比星、米托蒽醌、伊达比星、普卡霉素、丝裂霉素和链唑霉素)、抗代谢物(例如甲氨蝶呤、嘧啶拮抗剂和嘌呤拮抗剂)、生长抑制剂(例如拓扑异构酶抑制剂和纺锤体毒素，如喜树碱、秋水仙碱、柔红霉素、非瑟酮、染料木黄酮、伊立替康、片螺素(lamellarins)、杨梅酮、紫杉醇、塔斯品碱、三柠檬醇b(tricitrinol b)、拓扑替康、长春花生物碱)；酶及其片段，例如溶核酶，例如天冬酰胺酶和某些核糖核酸酶，例如细菌核糖核酸酶、真菌核糖体毒素、argonaute多肽、binase、两栖类核糖核酸酶、豹蛙酶(ranpimase)、和哺乳动物核糖核酸酶，例如牛精液核糖核酸酶和人核糖核酸酶；毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体，例如相思豆蛋白、agrostin、amarandins、苋红素(amaranthin)、苋属抗病毒/rip、血管生成素、银莲花(a.patens)rip、问荆色甙d、asparins、曲霉素、aspf1、香脂素(balsamin)、冬瓜(b.hispida)rip、bougain、杂交三角梅(bougainvillea x buttiana)抗病毒蛋白1、benincasins、三角梅核糖体失活蛋白(bouganin)、b.rubra rip、异株泻根毒蛋白(例如异株泻根毒蛋白1、异株泻根毒蛋白
2)、簕杜鹃(b.spectabilis)rip、糖甜菜(b.vulgaris)rip、灰藜(c.album)rip、克木毒蛋白、月光花(c.aculeatum)-系统抗性诱导蛋白、鸡冠花(c.cristata)rip、野生甜瓜(c.figarei)rip、苦瓜甙、charybdin、辛纳毒蛋白、克累文、香矢车菊(c.moschata)rip、cochinin b、colocins、巴豆毒蛋白、南瓜蛋白、麻风树毒蛋白、石竹花(dianthus spp.)rip，棒状杆菌属白喉毒素(溃疡杆菌、c.omega、假性结核棒状杆菌中的白喉毒素)、商陆毒蛋白、ebulins、ebulitins、菟葵(e.hyemalis)rip、euserratins、eutirucallin、flammin、火菇毒素(flammulin)、foetidissimin、白树毒蛋白、大曲菌素(gigantin)、丝石竹毒蛋白、响盒子(h.crepitans)rip、heterotepalin、hispin、hirsutellin a、东方铁筷子(h.orientalis)rip、多棱大麦(h.vulgare)rip、hypsin、海岛轮环藤碱(insularin)、i.hollandica rips、lagenin、lamjapin、剑叶波斯菊苷、圆筒丝瓜(l.cylindrical)rip、luffacylin、八棱丝瓜蛋白(luffaculin)、luffagulin、luffins、亚麻(l.usitatissimum)rip、剪秋罗苷、离褶啉(lyophyllin)、manutins、marmorin、mapalmin、苦瓜凝集素(m.charantia lectin)、冰叶日中花(mcrystallinum)rip、melonin、mexin、紫茉莉属(mirabilis spp.)rip、丝林霉素、modeccins、mor、苦瓜属(mormordica spp.)rip、momorsgrovin、moschatin、musarmins、n.tabacum rips、链霉黑菌素(nigrins)、nigritins、ocymoidin、pachyerosin、p.californicum凝集素、西葫芦毒蛋白、petroglaucin、petrograndin、商陆属(phytolacca spp.)rip、pisavin、pleuturegin、pluturegin、拟南芥果胶甲基转移酶(pme)、何首乌(p.multiforum)rip、美洲商陆抗病毒蛋白(pap)、黄樟毒蛋白(porrectin)，气单胞菌属假单胞菌毒素(嗜水气单胞菌假单胞菌样毒素)、美丽天人菊内酯、quinqueginsin、蓖麻凝集素、局限曲菌素、蓖麻毒蛋白、riproximin、皂草素、帚曲霉素、蒜头素、黑麦(s.cereale)rip、sechiumin、志贺菌毒素、志贺样毒素、蓝筛朴毒蛋白b、s.黑接骨木rip(例如黑接骨木凝集素iv)、岩石碱花(s.ocymoides)rip、菠菜(spinacia oleracea)蛋白、stellarin、stenodactylin、破伤风菌毒素、tricholin、栝楼属(trichosanthes spp.)rip(例如karasurins、kirilowins、trichoanguin、栝楼素、天花粉蛋白、tychi)、小麦属(triticum spp.)rip、v.album rips、velin、毡毛美洲茶素(velutin)、vero细胞毒素、v.hispanica rips、vircumin、沃氏藤黄辛(volkensin)、麦蓝菜(v.volvacea)rip、volvarin、丝兰叶蛋白、二倍体多年生玉米(z.diploperennis)rip、z.mays rip和任何上述的任何核糖毒性片段；和本文所述的各种抗肿瘤或抗癌剂。
[0405]
有许多蛋白质毒素适合用作本文所述的毒素组分。例如，由真菌核糖体毒素和argonaute序列组成的argonaute酶结构域或杂合酶结构域可被改造为用于核糖体失活(参见pichinuk e，wreschner d，protein sci 19：1272-8(2010))。具有可用作核糖体毒性区域的酶结构域的核糖核酸酶的实例包括细菌核糖核酸酶，例如binase、两栖类核糖核酸酶，例如豹蛙酶和以及哺乳动物核糖核酸酶，例如牛精液核糖核酸酶和人核糖核酸酶：核糖核酸酶2、核糖核酸酶3和核糖核酸酶5(newton d等人，jbiol chem 269：739-45(1994)；netwon d等人，jimmunolmeth 231：159-67(1999)；yoon j等人，life sci 64：1435-45(1999)；hugh m等人，cancer res 61：8737-42(2001)；makarova，ilinskaya n，febslett 540：15-20(2003))。
[0406]
表5示例性蛋白质毒素和毒素效应多肽的来源
[0407]
[0408][0409]
iv.结合分子的一般功能
[0410]
结合分子可用于多种应用，涉及例如细胞杀伤；细胞生长抑制；细胞内货物递送；生物信息收集；免疫应答刺激和/或健康状况的补救。结合分子可用作治疗和/或诊断分子，例如，作为细胞靶向、细胞毒性、治疗分子；细胞靶向、无毒、递送运载体；和/或细胞靶向诊
断分子；例如在涉及特定细胞类型的体内靶向的应用中，用于诊断或治疗多种疾病，包括癌症、免疫紊乱和微生物感染。
[0411]
在一些实施方案中，结合分子能够结合与特定细胞类型的细胞表面缔合的pd-l1分子的细胞外部分并进入那些细胞。一旦在靶向细胞类型内内化，结合分子的某些实施方案就能够通过毒素组分的作用杀死细胞。例如，一旦在靶细胞类型内内化，结合分子的某些实施方案能够将酶活性、细胞毒性、志贺菌毒素效应多肽片段按特定路线发送到靶细胞的胞质溶胶中并最终杀死细胞。在另一个实施例中，一旦在靶细胞类型内内化，由于毒素组分的作用，结合分子的某些实施方案能够将cd8 t细胞表位货物递送至靶细胞的mhc i类呈递途径，导致与mhc i类分子复合的该表位的细胞表面呈递，并最终导致细胞死亡。在另一个实施例中，一旦内化在靶细胞类型中，由于毒素组分的作用，结合分子的某些实施方案能够将细胞毒性货物递送至靶细胞，从而导致细胞死亡。
[0412]
或者，结合分子的无毒或毒性降低的变体可用于将另外的外源物质递送到靶细胞中，例如表位、肽、蛋白质、多核苷酸和检测促进剂。该系统是模块化的，因为任何数量的不同毒素组分可以与一个或多个pd-l1结合区缔合，以产生具有不同功能特征的结合分子的变体，例如，用于将结合分子施用于脊索动物的去免疫毒素效应物、降低蛋白酶切割敏感性的毒素效应物以提高特别是在体内的稳定性，以及用于免疫治疗应用的包含cd8 t细胞表位的毒素效应子。
[0413]
a.通过毒素组分细胞毒性杀死细胞
[0414]
结合分子的一些实施方案是细胞毒性的。结合分子的一些实施方案仅由于一种或多种志贺菌毒素效应多肽组分的存在而具有细胞毒性。志贺菌毒素家族成员的a亚基每个都包含酶活性多肽区域，一旦进入细胞的胞质溶胶，就能够杀死真核细胞。因为志贺菌毒素家族的成员适于杀死真核细胞，所以源自志贺菌毒素的分子，例如包含志贺菌毒素效应多肽的某些实施方案的pd-l1结合分子可以表现出有效的细胞杀伤活性。
[0415]
在一些实施方案中，在接触与通过结合分子的结合区结合的pd-l1物理偶联的细胞(例如pd-l1阳性细胞)时，结合分子能够引起细胞死亡。对于一些实施方案，结合分子的cd
50
值小于5、2.5、1、0.5或0.25nm，这比未靶向的野生型志贺菌毒素效应多肽(例如seq id no：1-18)极大地更有效。
[0416]
可以使用本文所述的分子在靶细胞的不同条件下实现细胞杀伤，例如离体操作的靶细胞、体外培养的靶细胞、体外培养的组织样品内的靶细胞，或体内环境中的靶细胞，例如多细胞生物体内。
[0417]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽和结合分子包含(1)去免疫的志贺菌毒素效应亚区，(2)志贺菌毒素a1片段衍生区域的羧基末端附近的蛋白酶切割抗性区，(3)羧基末端的内质网滞留/回收信号基序；和/或(4)异源t细胞表位嵌入或插入区域；然而，对于一些实施方案，与包含野生型志贺菌毒素a亚基多肽(例如野生型志贺菌毒素a1片段)的参考分子相比，这些结构修饰不会显著改变志贺菌毒素细胞毒性的效力。因此，去免疫、抗蛋白酶切割和/或携带嵌入或插入的异源表位的志贺菌毒素效应多肽和结合分子可以保持有效的细胞毒性，同时提供一种或多种其他功能或特性。
[0418]
已经包含志贺菌毒素效应多肽的细胞毒性结合分子可以由技术人员使用本文提供的信息和方法进行工程改造，使其更具细胞毒性和/或具有通过完全不同的机制起作用
的大量的备用细胞毒性。这些多种细胞毒机制可以通过其功能的多样性相互补充(例如通过直接和间接两种细胞杀伤机制以及对局部区域的免疫刺激机制提供强效杀伤)，相互大量备份(例如通过在没有其他机制的情况下提供一种细胞杀伤机制——例如，如果靶细胞对先前活跃机制的子集产生抗性或获得某种免疫)，和/或防止产生抗性(通过限制对于恶性或感染细胞同时阻断多种不同的细胞杀伤机制的可能性较小的情况的抗性)。
[0419]
b.用于在细胞表面呈递mhc i类的t细胞表位的递送
[0420]
在一些实施方案中，结合分子包含t细胞表位，其使得能够工程化“t细胞表位递送”分子，其具有几乎无限的表位-肽货物选择，用于通过有核脊索动物细胞进行递送和细胞表面呈递。在一些实施方案中，结合分子包含含有t细胞表位的毒素效应子。在一些实施方案中，结合分子能够通过其毒素组分将一种或多种t细胞表位递送至细胞的蛋白酶体。递送的t细胞表位随后被蛋白水解处理并由细胞表面的mhc i类途径呈递。通过将mhc i类表位改造成结合分子，可以实现免疫刺激性抗原的靶向递送和呈递，以利用和指导脊索动物免疫系统的有益功能。
[0421]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽或结合分子能够将t细胞表位递送至细胞的mhc i类分子用于细胞表面呈递。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽或结合分子包含异源t细胞表位，无论是作为另外的外源物质还是嵌入或插入志贺菌毒素效应多肽中。对于一些实施方案，志贺菌毒素效应多肽或结合分子能够将嵌入或插入的t细胞表位递送至mhc i类分子用于细胞表面呈递。
[0422]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽能够将嵌入或插入志贺菌毒素效应多肽中的t细胞表位递送至存在志贺菌毒素效应多肽的细胞的mhc i类分子，用于mhc i类分子在细胞表面呈递t细胞表位。对于一些实施方案，t细胞表位是异源t细胞表位。对于一些实施方案，t细胞表位作为cd8 t细胞表位起作用，无论是已知的还是将来使用技术人员常规的方法鉴定的。
[0423]
在一些实施方案中，结合分子能够将与结合分子缔合的t细胞表位递送至细胞的mhci类分子，以通过mhc i类分子在细胞表面上呈递t细胞表位。对于一些实施方案，t细胞表位是嵌入或插入志贺菌毒素效应多肽中的异源t细胞表位。对于一些实施方案，t细胞表位作为cd8 t细胞表位起作用，无论是已知的还是将来使用技术人员常规的方法鉴定的。
[0424]
在一些实施方案中，在使细胞与结合分子接触后，结合分子能够将与结合分子缔合的t细胞表位-肽递送至细胞的mhc i类分子以通过mhc i类分子在细胞表面上呈递t细胞表位-肽。对于一些实施方案，t细胞表位-肽是嵌入或插入志贺菌毒素效应多肽中的异源表位。对于一些实施方案，t细胞表位-肽作为cd8 t细胞表位起作用，无论是已知的还是将来使用技术人员常规的方法鉴定的。
[0425]
将异源表位添加到结合分子中或异源表位存在于结合分子中，无论是作为另外的外源物质还是嵌入或插入志贺菌毒素效应多肽中，使得能够使用此类结合分子的方法，用于细胞靶向递送选择的表位，通过脊索动物内的有核靶细胞进行细胞表面呈递。
[0426]
某些cd8 t细胞超免疫的志贺菌毒素效应多肽和结合分子的一个功能是将一个或多个t细胞表位-肽递送至mhc i类分子以供细胞呈递mhc i类。将外源性t细胞表位-肽递送至靶细胞的mhc i类系统可用于诱导靶细胞以在细胞表面上呈递与mhc i类分子结合的t细胞表位肽，这随后导致cd8 效应t细胞激活以攻击靶细胞。
[0427]
技术人员使用本领域已知的技术可以将某些志贺菌毒素效应多肽与各种其他靶向pd-l1的结合区缔合、偶联和/或连接，以产生靶向与细胞物理偶联的特异性细胞外靶生物分子的结合分子并促进这些结合分子的靶细胞内化。所有有核脊椎动物细胞都被认为能够使用mhc i类系统呈递细胞内表位。因此，结合分子的细胞外靶生物分子原则上可以靶向任何有核脊椎动物细胞，以将t细胞表位递送至这种细胞的mhc i类呈递途径。
[0428]
志贺菌毒素效应多肽和结合分子的表位递送功能可以通过本领域技术人员已知的和/或本文所述的多种标准方法来检测和监测。例如，结合分子递送t细胞表位-肽和驱动通过靶细胞的mhc i类系统的表位-肽呈递的能力可以使用各种体外和体内测定来研究，包括，例如，mhc i类/肽复合物的直接检测/可视化，异源t细胞表位-肽对mhc i类分子的结合亲和力的测量，和/或通过监测细胞毒性t淋巴细胞(ctl)反应来检测mhc i类-肽复合物在靶细胞上呈递的功能后果的测量(参见例如下文中的实施例)。
[0429]
监测多肽和分子的这种功能的某些测定涉及在体外或离体直接检测特定的mhc i类/肽抗原复合物。用于直接可视化和定量肽-mhc i类复合物的常用方法涉及技术人员已知的各种免疫检测试剂。例如，可以开发特异性单克隆抗体来识别特定的mhc/i类/肽抗原复合物。类似地，可溶性多聚体t细胞受体，例如tcr-star试剂(altor bioscience corp.，mirmar，fl，u.s.a.)可用于直接可视化或定量特定的mhc i/抗原复合物(zhu x等人，j immunol 176：3223-32(2006))。这些特异性mab或可溶性多聚体t细胞受体可用于各种检测方法，包括例如免疫组织化学、流式细胞术和酶联免疫测定(elisa)。
[0430]
用于直接鉴定和定量mhc i/肽复合物的备选方法涉及质谱分析，例如propresent抗原呈递测定(proimmune，inc.，sarasota，fl，u.s.a.)，其中肽-mch i类复合物是从细胞表面提取的，然后通过测序质谱法纯化和鉴定肽(falk k等人，nature 351：290-6(1991))。
[0431]
在某些用于监测本文所述多肽和分子的t细胞表位递送和mhc i类呈递功能的测定中，涉及监测mhc i类和肽结合和稳定性的计算和/或实验方法。若干软件程序可供技术人员用于预测肽对mhc i类等位基因的结合反应，例如免疫表位数据库和分析资源(iedb)分析资源mhc-i结合预测共有序列工具(kim y等人，nucleicacidres 40：w525-30(2012)。已经常规应用了几种实验测定，例如细胞表面结合测定和/或表面等离子体共振测定以定量和/或比较结合动力学(miles k等人，mol immunol 48：728-32(2011))。此外，已经开发了与已知对照相比，基于肽稳定给定mhc i类等位基因的三元mhc-肽复合物的能力的测量的其他mhc-肽结合测定法(例如，proimmune，inc.的mhc-肽结合测定)。
[0432]
或者，可以通过监测细胞毒性t细胞(ctl)对特定复合物的反应来测量细胞表面上mhc i类/肽抗原复合物呈递的结果。这些测量包括用mhc i类四聚体或五聚体试剂直接标记ctl。四聚体或五聚体直接与特定特异性的t细胞受体结合，通过主要组织相容性复合体(mhc)等位基因和肽复合物确定。此外，通常通过elisa或酶联免疫斑点(elispot)对释放的细胞因子(如干扰素γ或白细胞介素)进行定量，以识别特定的ctl反应。ctl的细胞毒性能力可以使用多种测定法来测量，包括经典的51铬(cr)释放测定法或备选的非放射性细胞毒性测定法(例如，非放射性试剂盒和celltox
tm
试剂盒，可从promega corp.，麦迪逊，wi，usa购买)、粒酶b elispot、胱天蛋白酶活性测定或lamp-1易位流式细胞术测定。为了特异性地监测靶细胞的杀伤，羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(cfse)可用于容易快速地标记目标细胞群以进行体外或体内研究，以监测表位特异性csfe
标记的靶细胞的杀伤(durward m等人，j vis exp 45pii 2250(2010))。
[0433]
对mhc i类呈递的体内反应，可以通过施用mhc i类/抗原促进剂(例如肽、蛋白质或灭活/减毒病毒疫苗)，然后用活性剂(例如病毒)攻击并监测对于该试剂的反应来追踪，通常与未接种疫苗的对照相比。可以使用与前面描述的方法类似的方法(例如ctl细胞毒性测定和细胞因子释放的定量)监测离体样品的ctl活性。
[0434]
hla-a、hla-b和/或hla-c分子在裂解后使用免疫亲和性(例如抗mhc抗体“沉降”纯化)来分离，和缔合肽(即由分离的mhc分子呈递的肽)从纯化的复合物中回收。通过测序质谱分析回收的肽。质谱数据与由外源(非自身)肽(t细胞表位x)序列和人类国际蛋白质指数(代表“自身”或非免疫原性肽)组成的蛋白质数据库文库进行比较。根据概率数据库按重要性对肽进行排序。列出了所有检测到的抗原(非自身)肽序列。通过搜索乱码诱饵数据库来验证数据以减少错误命中(参见例如ma b，johnson r，mol cell proteomics 11：o111.014902(2012))。结果将证明来自t细胞表位x的肽呈递在中毒靶细胞表面的mhc复合物中。
[0435]
由于所表达的抗原特异性hla分子，呈递的肽-抗原-mhc复合物组可能在细胞之间有所不同。然后，t细胞可以使用具有不同抗原特异性的不同tcr分子识别细胞表面上展示的特定肽-抗原-mhc复合物。
[0436]
因为多个t细胞表位可以通过结合分子递送，例如通过在单个蛋白酶体递送效应多肽中嵌入两个或更多个不同的t细胞表位，所以单个结合分子可以是具有不同的mhc类变体的相同物种的有效脊索动物，例如在具有不同hla等位基因的人类中。这可能允许基于mhc复合物蛋白质多样性和多态性在不同的受试者亚群中组合具有不同有效性的不同t细胞表位的单个分子。例如，人类mhc复合物蛋白、hla蛋白在人类之间因遗传血统而异，例如：非洲人(撒哈拉沙漠以南)、美洲印第安人、高加索人、蒙古人、新几内亚人和澳大利亚人或太平洋岛民。
[0437]
涉及递送多肽和分子的t细胞表位的应用非常广泛。哺乳动物有机体中的每个有核细胞都可能能够在与mhc i类分子复合的细胞外表面上以mhc i类途径呈递免疫原性t细胞表位肽。此外，t细胞表位识别的敏感性非常高，只需呈递少数mhc-i肽复合物即可引起免疫应答，例如，即使是单一复合物的呈递也足以被效应t细胞识别(sykulev y等人，immunity 4：565-71(1996))。
[0438]
t细胞反应的激活是某些抗癌、抗肿瘤的(anti-neoplastic)、抗肿瘤和/或抗微生物生物药物的理想特征，以刺激患者自身对靶细胞的免疫系统。激活强大而强烈的t细胞应答也是许多疫苗的理想特征。生物体内靶细胞对t细胞表位的呈递可导致对靶细胞和/或其在生物体内的一般位置的强烈免疫应答的激活。因此，用于呈递的t细胞表位的靶向递送可用作在治疗方案期间激活t细胞应答的机制。
[0439]
mhc i类系统呈递的t细胞免疫原性表位-肽靶向呈递细胞以通过ctl介导的裂解进行杀伤，并在局部微环境中触发免疫刺激。通过在靶细胞内化治疗分子的志贺菌毒素效应多肽组分内改造免疫原性表位序列，可以实现免疫刺激性抗原的靶向递送和呈递。免疫刺激性非自身抗原的呈递，例如已知具有高免疫原性的病毒抗原，通过靶细胞向其他免疫细胞发出信号以破坏靶细胞以及向该区域募集更多的免疫细胞。
[0440]
mhc i类复合物呈递免疫原性t细胞表位-肽靶向呈递细胞以通过ctl介导的细胞
溶解进行杀伤。免疫刺激性非自身抗原的靶细胞呈递，例如已知的具有高免疫原性的病毒表位-肽，可以向其他免疫细胞发出信号以破坏靶细胞并将更多免疫细胞募集到脊索动物内的靶细胞位点。
[0441]
因此，已经有细胞毒性分子，例如包含志贺菌毒素效应多肽的治疗性或潜在治疗性分子可使用本文所述的方法改造为更具细胞毒性的分子和/或具有通过递送t细胞表位、呈递和刺激效应t-细胞而起作用的另外的细胞毒性机制。这些多种细胞毒性机制可以相互补充(例如通过提供直接靶细胞杀伤和间接(ctl介导的)细胞杀伤，相互冗余备份(例如通过在不存在另一个的情况下提供一种细胞杀伤机制)，和/或防止产生治疗抗性(通过限制对恶性或感染细胞进化以同时阻断两种不同的细胞杀伤机制的不太可能的情况的抗性)。
[0442]
此外，本领域技术人员可使用常规方法将包含志贺菌毒素效应多肽区的细胞毒性分子改造为酶失活的变体，所述细胞毒性分子表现出基于催化的细胞毒性。例如，细胞毒性分子的细胞毒性志贺菌毒素效应多肽组分可以通过引入一个或多个突变和/或截短而被赋予降低的活性和/或使其失活，使得所得分子仍然可以通过其递送t细胞表位至靶细胞的mhc i类系统，随后呈递至靶细胞表面的能力而具有细胞毒性。在另一个实施例中，t细胞表位可以插入或嵌入志贺菌毒素效应多肽中，使得志贺菌毒素效应多肽被添加的表位灭活(参见例如wo2015/113005：实施例1-f)。这种方法去除了一种细胞毒性机制，同时保留或添加了另一种，并且还可以提供分子，所述分子通过递送的t细胞表位呈递或“抗原播种”而能够对生物体内靶细胞局部区域表现出免疫刺激。此外，包含嵌入或插入的异源t细胞表位的结合分子的非细胞毒性变体可用于涉及脊索动物内的免疫刺激和/或用mhc i类分子展示的表位标记脊索动物内的靶细胞的应用。
[0443]
递送某些志贺菌毒素效应多肽和结合分子的t细胞表位的能力可以在不同的条件下和在非靶向旁观者细胞靶细胞，例如离体操作的靶细胞、体外培养的靶细胞，体外培养的组织样品中的靶细胞，或如在多细胞生物体内的体内环境中的靶细胞的存在下实现。
[0444]
c.通过靶向细胞毒性和/或细胞毒性t细胞的参与进行细胞杀伤
[0445]
在一些实施方案中，结合分子可以提供1)用于靶细胞mhc i类呈递的t细胞表位的递送和/或2)有效的细胞毒性。在结合分子的一些实施方案中，在接触与由细胞靶向结合区结合的细胞外pd-l1物理偶联的细胞时，结合分子能够引起细胞死亡。细胞杀伤的机制可能是直接的，例如通过毒素效应多肽区域的酶活性，或间接通过ctl介导的细胞溶解。
[0446]
1.通过t细胞表位递送和mhc i类呈递的间接细胞杀伤
[0447]
结合分子的某些实施方案是细胞毒性的，因为它们包含能够被递送至靶细胞的mhc i类呈递途径并呈递在靶细胞的细胞表面上的cd8 t细胞表位。例如，t细胞表位递送、cd8 t细胞超免疫、志贺菌毒素效应多肽，有或没有内源性表位去免疫，可用作结合分子的组分，用于涉及间接细胞杀伤的应用。
[0448]
在结合分子的某些实施方案中，在接触与由细胞靶向结合区结合的细胞外pd-l1物理偶联的细胞时，结合分子能够间接引起细胞死亡，例如通过靶细胞呈递一种或多种t细胞表位以及随后募集杀死靶细胞的ctl。在一些实施方案中，募集涉及对结合分子的抗原货物特异的内源性ctl。
[0449]
细胞呈递与mhc i类分子复合的抗原肽通过诱导细胞凋亡、裂解和/或坏死使呈递细胞对细胞毒性t细胞(ctl)的靶向杀伤敏感。此外，识别靶细胞的ctl可以释放免疫刺激性
细胞因子，例如干扰素γ(ifn-γ)、肿瘤坏死因子α(tnf)、巨噬细胞炎症蛋白-1β(mip
‑‑
1β)、和白细胞介素，例如il-17、il-4和il-22。此外，通过识别呈递表位而激活的ctl可以不加选择地杀死邻近呈递细胞的其他细胞，而不管这些近端细胞呈递的肽-mhc i类复合物库如何(wiedemann a等人，proc natl acad sci usa103：10985-90(2006))。
[0450]
由于不同物种内的mhc等位基因多样性，仅包含单个表位的结合分子可能对同一物种的不同患者或受试者表现出不同的有效性。然而，结合分子的某些实施方案可各自包含多个能够同时递送至靶细胞的mhc i类系统的t细胞表位。因此，在结合分子的一些实施方案中，结合分子用于治疗在其mhc分子的表位-肽结合亲和力方面具有显著差异(即，它们的mhc等位基因和/或mhc基因型有显著差异)的不同受试者。此外，结合分子的某些实施方案通过同时使用多种细胞杀伤机制(例如同时通过多个不同的t细胞表位的直接杀伤和间接杀伤)来减少或防止靶细胞适应而逃避杀伤(例如靶标癌细胞突变以逃避治疗效果或“突变体逃逸”)。
[0451]
在一些实施方案中，结合分子通过至少两种不同的作用机制诱导靶细胞杀伤，所述两种不同机制为志贺菌毒素a亚基效应子活性和抗原肽递送以促进免疫激活，其可以协同作用以在存在某些mhc i类表位特异性限制性cd8 t细胞的情况下诱导更多靶细胞死亡。在通过两种不同的作用机制诱导靶细胞杀伤的结合分子的一些实施方案中，两者不同的作用机制为志贺菌毒素a亚基效应子活性和抗原肽递送以促进免疫激活，与单独的任一种杀伤机制相比，所产生的靶细胞杀伤是累加的或协同的。
[0452]
2.通过细胞靶向的志贺菌毒素细胞毒性的直接的细胞杀死
[0453]
结合分子的某些实施方案是细胞毒性的，因为它们包含催化活性毒素组分并且与分子中是否存在免疫原性cd8 t细胞表位无关。例如，cd8 t细胞超免疫的志贺菌毒素效应多肽或白喉毒素效应多肽，有或没有内源性表位去免疫，可用作结合分子的组分，用于涉及直接细胞杀伤的应用，例如，例如通过志贺毒素效应多肽的酶活性或核糖体结合和由于非催化机制而干扰核糖体功能(参见例如wo 2015/113005)。某些结合分子可以使靶细胞内的核糖体永久失活。
[0454]
在cd8 t细胞超免疫结合分子的一些实施方案中，在接触与由细胞靶向结合区结合的细胞外pd-l1物理偶联的细胞时，结合分子能够直接引起细胞死亡，例如，不涉及非靶向的细胞毒性t细胞(参见章节v-d，如上所述)。
[0455]
在一些实施方案中，结合分子能够在接触pd-l1阳性外周血单核细胞后，例如在体内引起pd-l1阳性外周血单核细胞的死亡。
[0456]
c.细胞类型之间的选择性细胞毒性
[0457]
某些结合分子可用于在存在未靶向的旁观者细胞的情况下选择性杀死特定的靶细胞。通过通过细胞靶向结合区将毒素组分靶向递送至特定细胞，结合分子可以表现出细胞类型特异性、受限的细胞杀伤活性，从而导致在非靶向细胞存在的情况下排他或优先杀伤选定的细胞类型。类似地，通过将免疫原性t细胞表位的靶向递送至靶细胞的mhc i类途径，随后由结合分子诱导的t细胞表位的呈递和ctl介导的靶细胞细胞溶解可以被限制为在存在非靶向细胞的情况下，排他或优先杀死选定的细胞类型。此外，细胞毒性毒素组分和免疫原性t细胞表位的细胞靶向递送都可以通过单个结合分子来完成，使得两种潜在的细胞毒性组分的递送在存在非靶向细胞的情况下，都被排他地或优先地限制在靶细胞中。
[0458]
在一些实施方案中，结合分子在某些浓度下是细胞毒性的。在一些实施方案中，在将结合分子施用至细胞类型的混合物后，与未与任何细胞外pd-l1物理偶联的细胞类型相比，细胞毒性结合分子能够选择性地杀死与由结合区结合的细胞外pd-l1物理偶联的那些细胞。在一些实施方案中，细胞毒性结合分子能够选择性地或优先地引起两种或更多种不同细胞类型的混合物中的特定细胞类型死亡。与不表达靶生物分子的“旁观者”细胞类型相比，这能够以高优先级(例如3倍的细胞毒性效应)将细胞毒活性靶向特定细胞类型。或者，如果靶生物分子以足够低的量表达和/或以低量与不被靶向的细胞类型物理偶联，则结合区的靶生物分子的表达可以是对一种细胞类型非排他性的。与不表达大量靶生物分子或未与大量靶生物分子物理偶联的“旁观者”细胞类型相比，这能够以高优先级(例如3倍的细胞毒性效应)靶向杀死特定细胞类型。
[0459]
对于一些实施方案，在将细胞毒性结合分子施用至两种不同的细胞类型群体后，细胞毒性结合分子能够以至少比相同细胞毒结合分子对其成员不表达细胞毒结合分子的结合区的细胞外靶生物分子的细胞群的cd
50
剂量低3倍的剂量引起对靶细胞群(其成员表达细胞毒结合分子结合区的细胞外靶生物分子)的半数最大细胞毒性浓度(cd
50
)定义的细胞死亡。
[0460]
在一些实施方案中，结合分子对与由结合区结合的细胞外pd-l1物理偶联的细胞类型群体的细胞毒活性比对未与由结合区结合的任何细胞外pd-l1物理偶联的细胞类型群体的细胞毒活性高至少3倍。如本文所述，选择性细胞毒性可以根据(a)对与由结合区结合的细胞外pd-l1物理偶联的特定细胞类型的细胞群的细胞毒性与(b)对未与由结合区结合的任何细胞外pd-l1物理偶联的细胞类型的细胞群的细胞毒性的比值(a/b)来定量。在一些实施方案中，细胞毒性比值指示选择性细胞毒性，对于与结合区的靶生物分子物理偶联的细胞群或细胞类型群体，与不与结合区的靶生物分子物理偶联的细胞群或细胞类型群体相比，其高至少3-倍、5-倍、10-倍、15-倍、20-倍、25-倍、30-倍、40-倍、50-倍、75-倍、100-倍、250-倍、500-倍、750-倍或1000倍。
[0461]
在一些实施方案中，结合分子的优先细胞杀伤功能或选择性细胞毒性是由于志贺菌毒素效应多肽中存在的另外的外源物质(例如细胞毒性物质)和/或异源t细胞表位，不一定是志贺菌毒素效应多肽区的催化活性的结果。
[0462]
这种优先的细胞杀伤功能允许靶向标细胞在不同条件下和存在非靶向旁观细胞的情况下被某些细胞毒性结合分子杀死，所述非靶向旁观者细胞例如离体操作的细胞类型混合物、具有细胞类型的混合物的体外培养的组织，或在体内存在多种细胞类型(例如在多细胞生物体内的原位或天然位置)。
[0463]
尽管可以选择性地靶向表达pd-l1的细胞，但某些结合分子可以在表达pd-l1的外周血单核细胞类型存在的情况下选择性地杀死表达pd-l1的肿瘤细胞。
[0464]
d.pd-l1/pd-1信号传导干扰
[0465]
除了细胞毒性、细胞抑制和免疫刺激应用之外，结合分子任选地可用于抑制pd-1信号传导，例如在涉及免疫检查点抑制和抗癌免疫治疗的应用中。在一些实施方案中，当外源性施用至细胞时，pd-l1结合分子可以阻断pd-1/pd-l1相互作用。尽管结合分子的一些实施方案表现出对pd-l1信号传导抑制的半数最大抑制浓度(ec
50
)，但其效力比它们的细胞毒性cd
50
(例如0.1至50nm)低得多(例如大于500nm或1μm)，但对于给定的靶细胞类型，情况并
非总是如此。结合分子的一些实施方案可以表现出与其cd
50
值等同的ec
50
值，表明pd-1信号传导抑制和细胞毒性的有效水平可以同时发生。在一些实施方案中，结合分子表现出大于其细胞毒性cd
50
值(例如大于1,000或10,000nm)的ec
50
值(例如1至200nm)，例如包含灭活毒素的结合分子如pd-l1结合分子包括无活性或活性降低的志贺菌毒素效应多肽，例如116296(seq id no：127))。某些表现出ec
50
值大于其细胞毒性cd
50
值的结合分子可以在某些浓度下用于在不存在任何显著细胞毒性活性的情况下实现pd-1信号转导抑制。
[0466]
e.将另外的外源物质递送到靶细胞内部
[0467]
除了细胞毒性、细胞抑制、免疫刺激和抗癌免疫治疗应用之外，结合分子任选地可用于靶向细胞内递送功能，例如在涉及信息收集和诊断功能的应用中。
[0468]
因为结合分子，包括其降低的细胞毒性和/或其无毒形式，能够进入与结合分子的结合区识别的细胞外pd-l1分子物理偶联的细胞，所以结合分子的某些实施方案可以用于递送另外的外源物质进入靶向细胞类型的内部。例如，细胞毒性结合分子的无毒变体，或任选的细胞毒性变体，可用于将另外的外源物质递送至和/或标记细胞内部，所述细胞与结合分子的结合区结合的细胞外pd-l1物理偶联。将靶标生物分子表达至至少一个细胞表面的各种类型的细胞和/或细胞群可以被结合分子靶向，用于接收外源物质。功能组分是模块化的，因为各种毒素组分、另外的外源物质和结合区可以相互缔合，以提供适用于涉及货物递送的多种应用的结合分子，例如非侵入性的体内肿瘤细胞成像。
[0469]
某些结合分子的外源物质功能的这种递送可以在不同的条件下并且在存在非靶向旁观细胞的情况下完成，例如离体操作的靶细胞、体外培养的靶细胞、体外培养的组织样本内的靶细胞，或如多细胞生物体内环境中的靶细胞。此外，通过某些结合分子将外源物质选择性递送至某些细胞可以在不同的条件下和在存在非靶向旁观者细胞的情况下完成，例如离体操作的细胞类型混合物、具有细胞类型混合物的体外培养的组织、或在存在多种细胞类型的体内(例如，在多细胞生物体内的原位或天然位置)。
[0470]
毒素效应多肽和结合分子在某些浓度范围内不能杀死靶细胞和/或递送嵌入或插入的表位以供靶细胞的mhc分子的细胞表面呈递，但它们仍可用于将外源物质递送到细胞中，例如检测促进剂。
[0471]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应子表现出低至零的细胞毒性，因此在本文中被称为“无细胞毒性和/或降低的细胞毒性”。在一些实施方案中，结合分子表现出低至零的细胞毒性并且可以被称为“非细胞毒性”和/或“降低的细胞毒性变体”。例如，一些分子不表现出显著水平的基于志贺菌毒素的细胞毒性，其中在小于1000nm、500nm、100nm、75nm、50nm的剂量下，与适当的参考分子相比，没有显著量的细胞死亡，例如通过本领域技术人员已知的和/或本文所述的测定法测量的。在一些实施方案中，分子在每kg哺乳动物受体1-100μg的剂量下不表现出任何毒性。降低细胞毒性的变体在某些浓度或剂量下可能仍然具有细胞毒性，但表现出降低的细胞毒性，例如在某些情况下不能表现出显著水平的志贺菌毒素细胞毒性。
[0472]
包含其的某些结合分子可以被赋予非细胞毒性，例如通过添加一个或多个技术人员已知的用于使毒素效应多肽失活的氨基酸置换，包括本文所述的示例性置换。结合分子的非细胞毒性变体和细胞毒性降低变体在某些情况下可能比更具有细胞毒性的变体更适合递送另外的外源物质。
[0473]
诊断功能
[0474]
某些结合分子在体外和/或体内检测特定细胞、细胞类型和/或细胞群，以及任何上述的特定亚细胞区室中具有用途。与检测促进剂缀合的细胞毒性降低和/或无毒形式的细胞毒性结合分子任选地可用于诊断功能，例如用于与包含该细胞毒性结合分子或相关结合区的治疗方案结合使用的伴随诊断，例如，与相同标生物分子、重叠表位和/或相同表位具有高亲和力结合的结合区。
[0475]
在一些实施方案中，本文所述的结合分子用于诊断和治疗，或单独用于诊断。当相同的细胞毒结合分子用于诊断和治疗两者时，在一些实施方案中，掺入用于诊断的检测促进剂的结合分子变体可通过其志贺毒素效应多肽区通过一个或多个氨基酸置换(包括本文所述的示例性置换)的催化失活而具有其降低的细胞毒性或使其无毒，例如，结合分子的某些无毒变体在施用小于1mg/kg的剂量后表现出小于5％、4％、3％、2％或1％的靶细胞死亡。降低的细胞毒性的变体在某些浓度或剂量下仍可能具有细胞毒性，但表现出降低的细胞毒性，例如不能表现出如本文所述的显著水平的志贺菌毒素细胞毒性。
[0476]
将本领域已知的检测促进剂与各种结合分子缀合的能力提供了用于检测某些细胞例如癌症、肿瘤、免疫和/或感染细胞的有用组合物。结合分子的这些诊断实施方案可用于通过本领域已知的各种成像技术和测定法收集信息。例如，结合分子的诊断实施方案可用于通过对患者或活组织检查样品中的各个癌细胞、免疫细胞和/或感染细胞的细胞内细胞器(例如细胞内吞(endocytotic)、高尔基体、内质网和细胞溶质区室)的成像进行信息收集。
[0477]
可以使用结合分子的诊断实施方案收集各种类型的信息，无论是用于诊断用途还是其他用途。该信息可能用于，例如，诊断肿瘤细胞类型、确定患者疾病的治疗敏感性、测定抗肿瘤治疗随时间的进展、测定免疫调节治疗随时间的进展、测定抗微生物治疗随时间的进展、评估移植材料中是否存在感染细胞、评估移植材料中是否存在不需要的细胞类型，和/或评估手术切除肿瘤块后残留肿瘤细胞的存在。
[0478]
例如，可以使用使用结合分子的诊断变体收集的信息来确定患者的亚群，然后可以基于使用那些诊断实施方案揭示的其独特特征将个体患者进一步分类为亚群。例如，特定药物或疗法的有效性可能是用于定义患者亚群的标准。例如，特定细胞毒性结合分子的无毒诊断变体可用于区分哪些患者属于预测对该结合分子的细胞毒性变体有积极反应的患者类别或亚群。因此，本文还提供了使用结合分子(包括细胞毒性结合分子的无毒变体)进行患者鉴定、患者分层和诊断的相关方法。
[0479]
为了通过结合分子靶向细胞，例如直接细胞杀伤、间接细胞杀伤、外源物质如t细胞表位的递送，和/或信息收集，细胞对靶生物分子的表达不需要是天然的。靶生物分子的细胞表面表达可能是感染、病原体存在和/或细胞内微生物病原体存在的结果。靶生物分子的表达可以是人工的，例如通过在用病毒表达载体感染后强制或诱导表达，参见例如腺病毒、腺伴随病毒和逆转录病毒系统。pd-l1的表达可以通过将细胞暴露于电离辐射来诱导(wattenberg m等人，br j cancer 110：1472-80(2014))。
[0480]
靶向免疫抑制性免疫细胞
[0481]
在一些实施方案中，本文所述的pd-l1结合分子能够特异性结合细胞例如免疫抑制性免疫细胞(iic)表面上的pd-l1。在与细胞上的pd-l1结合后，结合分子可能被内化，志
贺菌毒素a亚基效应多肽的活性有效且特异性地杀死细胞。在一些实施方案中，这种直接的细胞杀伤活性会消耗免疫抑制性免疫细胞，例如肿瘤微环境(tme)中的treg。一旦tme中的免疫抑制被解除，非抑制性免疫细胞(例如，细胞毒性t细胞)就可以攻击肿瘤。
[0482]
在一些实施方案中，本文所述的结合分子与iic和肿瘤细胞上的pd-l1结合。因此，在一些实施方案中，除了消耗tme中的免疫抑制性免疫细胞之外，结合分子还结合并直接杀死肿瘤细胞。这种双重作用机制可以增强所公开的结合分子在癌症治疗中的有效性。
[0483]
在一些实施方案中，本文所述的结合分子引起一种或多种类型的细胞例如免疫细胞的扩增。例如，在一些实施方案中，pd-l1结合分子引起b细胞、t细胞或嗜酸性粒细胞的扩增。
[0484]
在一些实施方案中，本文所述的结合分子包含抗原表位，例如cd8 t细胞表位。在一些实施方案中，在结合分子与pd-l1结合并内化到细胞中后，抗原表位被递送至细胞的mhc i类系统，靶向细胞以进行免疫介导的破坏。因此，除了消耗tme中的免疫抑制性免疫细胞，并且在一些实施方案中直接杀死肿瘤细胞外，结合分子还增强了免疫系统对肿瘤的识别。
[0485]
在一些实施方案中，结合分子调节结合分子的结合区所结合的pd-l1的表达。在一些实施方案中，结合分子降低或下调pd-l1的表达。在一些实施方案中，结合分子降低pd-l1的细胞表面密度。在一些实施方案中，pd-l1表达的调节降低了免疫抑制。在一些实施方案中，pd-l1表达的调节导致细胞死亡。
[0486]
因此，所公开的结合分子可用于(1)选择性杀死在其他细胞中表达pd-1的一种或多种细胞类型，和(2)作为治疗性分子用于治疗多种疾病、紊乱和病症，包括癌症。图35进一步说明了说明性结合分子可以在受试者中诱导抗肿瘤作用的作用机制。
[0487]
本文所述的结合分子包含能够特异性结合细胞(例如pd-l1阳性细胞)表面上的pd-l1的结合区。在一些实施方案中，pd-l1阳性细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，pd-l1阳性细胞是免疫抑制性免疫细胞，例如免疫抑制性t细胞、免疫抑制性b细胞、免疫抑制性浆细胞或免疫抑制性骨髓细胞。在一些实施方案中，免疫抑制性免疫细胞是treg、mdsc或tam。在一些实施方案中，免疫抑制性免疫细胞是tan或caf。在一些实施方案中，结合区不特异性结合驻留记忆t细胞、排除肿瘤的树突细胞和/或cd14 单核细胞。
[0488]
如本文所用，术语“不直接杀死”或“间接杀死”是指其中包含志贺菌毒素a亚基效应多肽和结合区的结合分子与靶细胞(例如icc)结合的过程，其导致下游杀死第二个细胞(例如癌细胞)。例如，结合分子可以通过结合并杀死肿瘤微环境(tme)中的免疫抑制性免疫细胞来间接杀死肿瘤细胞。一旦在tme中解除免疫抑制，癌细胞就会被非抑制性免疫细胞(例如，细胞毒性t细胞等)杀死。
[0489]
在一些实施方案中，用于在需要其的受试者中降低免疫细胞的免疫抑制活性的方法包括向受试者施用有效量的(i)结合分子，(ii)编码结合分子的核酸(例如，表达载体)，或(iii)包含结合分子或编码该结合分子的核酸的组合物。
[0490]
在一些实施方案中，结合分子与存在于受试者的免疫抑制性免疫细胞表面上但不存在于受试者癌细胞表面上的pd-l1结合。在一些实施方案中，结合分子直接杀死免疫抑制性免疫细胞，但不直接杀死受试者的癌细胞。
[0491]
在一些实施方案中，结合分子与受试者的免疫抑制细胞和受试者的癌细胞表面上
存在的pd-l1结合。在一些实施方案中，结合分子直接杀死免疫抑制性免疫细胞和受试者的癌细胞。
[0492]
在一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，癌症的特征在于例如在肿瘤微环境中存在至少一种免疫抑制细胞。在一些实施方案中，癌症的特征在于高突变负荷(tmb)和/或高频率的插入缺失(indel)。突变负荷可以通过各种方法进行分析，包括基于杂交的下一代测序，并报告为每个分析的肿瘤基因组区域的序列变体或突变总数(例如，每百万碱基的突变)。如果癌症具有大于或等于每个百万碱基20个突变，则可以将癌症归类为具有“高”突变负荷。高突变负荷是由于暴露于强致癌物(如烟草烟雾和多环芳烃)(例如肺癌和膀胱癌)以及暴露于诱变剂(例如黑色素瘤中的紫外线)而导致的癌症的典型特征。插入缺失(插入和缺失)是癌细胞中常见的一种突变类型。产生移码突变的插入缺失可以产生高度免疫原性的肿瘤新抗原。因此，高频率的插入缺失可以导致对本文所述的治疗方法的更好反应。如果癌症具有大于或等于0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个插入缺失/百万碱基，则将癌症分类为具有“高”插入缺失频率。在一些实施方案中，如果癌症具有每百万碱基0.1-1、1-10、10-50、50-100或大于100个插入缺失，则将癌症分类为具有高频率插入缺失。
[0493]
v、志贺毒素效应多肽和结合分子的生产、制备和纯化
[0494]
志贺毒素效应多肽和某些结合分子可以使用本领域技术人员熟知的技术产生。例如，志贺菌毒素效应多肽和结合分子可以通过标准合成方法、通过使用重组表达系统或通过任何其他合适的方法来制备。因此，志贺菌毒素效应多肽和结合分子可以多种方式合成，包括，例如，方法包括：(1)使用标准固相或液相方法，逐步或通过片段组装合成结合分子的多肽或多肽组分，并分离和纯化最终的多肽化合物产物；(2)在宿主细胞中表达编码结合分子的蛋白质或蛋白质组分的多核苷酸，并从宿主细胞或宿主细胞培养物中回收表达产物；(3)编码结合分子的多肽或多肽组分的多核苷酸的无细胞体外表达，并回收表达产物；或通过(1)、(2)或(3)的方法的任何组合获得蛋白质组分的片段，随后结合(例如连接)肽或多肽片段以获得多肽组分，并回收多肽组分。
[0495]
优选通过固相或液相肽合成来合成结合分子或结合分子的蛋白质组分。多肽和结合分子可以通过标准合成方法适当地制备。因此，肽可以通过例如包括通过标准固相或液相方法，逐步或通过片段组装合成肽以及分离和纯化最终肽产物的方法合成。在这种情况下，可以参考wo 1998/011125，或者尤其是fields g等人，principles and practice of solid-phase peptide synthesis(synthetic peptides，grant g，ed.，oxford university press，u.k.，2nd ed.，2002)和其中的合成实施例。
[0496]
志贺菌毒素效应多肽和结合分子可以使用本领域熟知的重组技术来制备(产生和纯化)。通常，通过培养用包含编码多核苷酸的载体转化或转染的宿主细胞并从细胞培养物中纯化或回收蛋白质来制备蛋白质的方法描述于例如sambrook j等人，molecular cloning：alaboratory manual(cold spring harbor laboratory press，ny，u.s.，1989)；dieffenbach c等人，pcr primer：a laboratory manual(cold spring harbor laboratory press，n.y.，u.s.，1995)。任何合适的宿主细胞都可用于产生多肽和/或细胞靶向蛋白。宿主细胞可以是用一种或多种驱动多肽表达的表达载体稳定或瞬时转染、转化、转导或感染的细胞。此外，志贺菌毒素效应多肽和/或结合分子可以通过修饰编码多肽或细胞靶向蛋白的多核苷酸来产生，这导致改变一个或多个氨基酸或缺失或插入一个或多个氨
基酸以实现所需的特性，例如改变的细胞毒性、改变的细胞抑制作用和/或改变的血清半衰期。
[0497]
可以选择多种表达系统来产生如本文所述的多肽或细胞靶向的蛋白质。例如，用于表达细胞靶向蛋白的宿主生物包括原核生物，如大肠杆菌(e.coli)和枯草芽孢杆菌(b.subtilis)，真核细胞，如酵母和丝状真菌(如酿酒酵母(s.cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)、泡盛曲霉(a.awamori)和乳酸克鲁维酵母(k.lactis))、藻类(如莱茵衣藻(c.reinhardtii))、昆虫细胞系、哺乳动物细胞(如cho细胞)、植物细胞系和真核生物如转基因植物(如拟南芥(a.thaliana)和本氏烟草(n.benthamiana))。
[0498]
因此，还提供了用于根据上述方法和使用编码细胞靶向蛋白的部分或全部多肽或蛋白质组分的多核苷酸，包括当被引入宿主细胞时能够编码多肽或细胞靶向蛋白的部分或全部的至少一种多核苷酸的表达载体，和/或包含多核苷酸或表达载体的宿主细胞来产生志贺毒素效应多肽和/或结合分子的方法。
[0499]
当使用重组技术在宿主细胞或无细胞系统中表达蛋白质时，将所需蛋白质与其他组分(例如宿主细胞因子)分离(或纯化)是有利的，以获得高纯度或基本均质的制剂。纯化可以通过本领域熟知的方法来完成，例如离心技术、提取技术、色谱和分级分离技术(例如通过凝胶过滤进行尺寸分离、通过离子交换柱进行电荷分离、疏水相互作用色谱、反相色谱、二氧化硅色谱或阳离子交换树脂(例如deae等)、色谱聚焦和蛋白a琼脂糖色谱以去除污染物)和沉淀技术(例如乙醇沉淀或硫酸铵沉淀)。可以使用任何数量的生化纯化技术来增加多肽和/或结合分子的纯度。在一些实施方案中，多肽和结合分子可以任选地以同多聚体形式纯化(例如，包含两个或更多个多肽或结合分子的分子复合物)。
[0500]
可以使用重组方法和组合物产生抗体(参见例如美国专利4,816,567)。在一些实施方案中，提供了编码本文所述的抗体或抗体片段的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体的vl的氨基酸序列和/或包含vh的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。制备如本文所述的抗体的方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上所提供的，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。对于抗体的重组生产，编码抗体的核酸，例如如上所述，被分离并插入一种或多种载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。使用技术人员已知的常规方法可以容易地分离和测序此类核酸。
[0501]
用于克隆或表达抗体编码载体的合适宿主细胞包括本文所述和/或技术人员已知的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和/或fc效应子功能时(参见例如u.s.5,648,237、u.s.5,789,199和u.s.5,840,523)。表达后，抗体可从可溶级分中的细菌细胞糊中分离，并可进一步纯化。
[0502]
除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已“人源化”的真菌和酵母菌株，从而产生具有部分或完全人的糖基化模式的抗体(参见例如gerngross t，nat biotech 22：1409-14(2004)；li h等人，natbiotech 24：210-15(2006))。
[0503]
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。植物细胞可用作宿主(参见例如美国专利5,959,177、美国专利6,040,498、美国专利6,420,548、美国专利7,125,978和美国专利6,417,429)。已经鉴定了许多杆状病毒株，它们可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于草地贪
夜蛾(spodoptera frugiperda)细胞的转染。脊椎动物细胞可用作宿主。例如，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。其他有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由sv40(cos-7)转化的猴肾cv1细胞系；人胚肾系293细胞；小仓鼠肾细胞(bhk)；小鼠滋养细胞(例如tm4细胞)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(vero-76)；人宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck；水牛大鼠肝细胞(brl 3a)；人肺细胞(w138)；人肝细胞(hep g2)；小鼠乳腺肿瘤(mmt 060562)；tri细胞；mrc 5细胞；和fs4细胞(graham f等人，j genvirol 36：59-74(1977)；mather j等人，biolreprod 23：243-52(1980)；mather j等人，ann nyacadsci 383：44-68(1992))。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞(包括dhfr-cho)和骨髓瘤细胞系，例如y0、ns0和sp2/0细胞(参见例如urlaub g等人，proc natl acad sci u.s.a.77：4216-20(1980))。有关适用于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见yazaki和wu，methods in molecular biology，第248卷(b.k.c.lo，编辑，humana press，托托瓦，n.j.)，pp.255-268(2003)。
[0504]
本文提供的抗体可以通过本领域已知的各种测定来鉴定、筛选或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
[0505]
免疫缀合的方法包括但不限于反应性硫醇、醛标记、分选酶介导的缀合、mtg酶介导的缀合、转谷氨酰胺酶缀合、双键和使用间隔区或多功能接头(参见例如wo 2009/052249，wo 2012/097333，wo2013/173391，wo 2014/140317，wo 2014/159835，wo 2015/155753，wo 2015/191883，wo 2016/102632，wo 2018/185526)。
[0506]
抗体-毒素缀合物或免疫缀合物可以通过若干途径使用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂来制备，包括抗体的亲核基团与二价连接试剂反应以在接头和抗体之间形成共价键，然后与毒素组分反应；以及毒素组分的亲核基团与二价连接试剂反应，以在接头和毒素之间形成共价键，然后与抗体的亲核基团反应。
[0507]
抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)氨基末端胺基，(ii)侧链胺基，例如赖氨酸残基的侧链胺基，(iii)侧链硫醇基团，例如半胱氨酸残基的侧链硫醇基团，和(iv)当抗体被糖基化时碳水化合物部分的糖羟基或胺基。胺、羟基和硫醇基团是亲核的，能够与接头部分和连接试剂上的亲电子基团反应形成共价键，连接试剂包括：(i)活性酯，例如nhs酯、hobt酯、卤甲酸酯和酰基卤；(ii)卤代烷和苄基卤化物，例如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫化物，例如半胱氨酸二硫键。通过用还原剂如二硫苏糖醇(dtt)或三羰基乙基膦(tcep)处理，可使抗体与连接试剂缀合反应，从而使抗体完全或部分还原(参见例如wo 2013/173391，wo 2013/173392，wo 2013/173393，wo 2013/190272，wo 2014/064424，wo 2014/114207，wo 2015/155753，wo 2018/185526)。可以通过修饰赖氨酸残基将另外的亲核基团引入抗体，例如，通过使赖氨酸残基与2-亚氨基硫烷(2-iminothiolane)(traut试剂)反应，从而将胺转化为硫醇。还可以通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变体抗体)将反应性硫醇基团引入抗体。
[0508]
抗体-毒素缀合物或免疫连接物也可以通过抗体上的亲电子基团(例如醛或酮羰基)与连接试剂或毒素组分上的亲核基团之间的反应来产生。连接试剂上有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、氨硫脲、羧酸肼和芳酰肼。在一个实施方案中，抗体被修饰以引入能够与连接试剂或毒素组分上的亲核取代基反应的亲电子部分。在另一个实施方案
中，糖基化抗体的糖可以被氧化，例如与高碘酸盐氧化剂形成醛基或酮基，这些基团可与连接试剂或毒素组分的胺基反应。所得亚胺席夫碱基团可以形成稳定的键，或可以被还原，例如通过硼氢化物试剂形成稳定的胺键。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠反应可在抗体中产生羰基(醛和酮)基团，其可与毒素组分上的适当基团反应。在另一个实施方案中，含有氨基末端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体可以与偏高碘酸钠反应，导致产生代替第一个氨基酸的醛(参见例如u.s.5,362,852)。这种醛可以与毒素组分或连接亲核试剂反应。
[0509]
抗体fc区上的碳水化合物是连接化合物的天然位点。通常，碳水化合物通过高碘酸盐氧化改性以产生反应性醛，然后可用于通过席夫碱形成连接反应性含胺化合物。由于醛类可以与胺基反应，因此反应在低ph值下进行，从而抗体或抗原结合结构域中的赖氨酸残基被质子化且不反应。酰肼基最适合与生成的醛连接，因为它们在低ph值下具有反应性以形成腙键。然后可以通过用氰基硼氢化钠还原以形成肼键进一步稳定该键。
[0510]
毒素组分上的示例性亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、氨硫脲、羧酸肼和能够与接头部分和连接试剂上的亲电子基团反应形成共价键的芳酰肼基团，连接试剂包括：(i)活性酯，例如nhs酯、hobt酯、卤甲酸酯和酰基卤；(ii)卤代烷和苄基卤化物，例如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。
[0511]
缀合物负载可以表示为每个抗体的缀合物部分的平均数量(x)。每个抗体的缀合物负载范围可以是1到20个缀合物部分。来自缀合反应的抗体-毒素缀合物或免疫连接物的制备中每个抗体缀合物部分的平均数量可以通过常规方法例如质谱、elisa测定和高效液相色谱(hplc)来表征。还可以确定免疫连接物以x表示的定量分布，例如，通过分离、纯化和表征同质免疫连接物，其中p是来自免疫连接物的某个值，其他缀合物负载可以通过诸如反相hplc或电泳的方式实现。
[0512]
在以下实施例中，描述了用于产生示例性结合分子的方法的非限制性实例，以及产生方法的具体但非限制性方面。
[0513]
vi.包含结合分子的药物和诊断组合物
[0514]
还提供志贺菌毒素效应多肽和结合分子，其单独或与一种或多种另外的治疗剂组合用于药物组合物中，用于治疗或预防下文进一步详细描述的病症、疾病、紊乱或症状(例如癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、生长异常、免疫紊乱和微生物感染)。本文还提供了药物组合物，其包含结合分子或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或运载体。在一些实施方案中，药物组合物可以包含同多聚体和/或异多聚体形式的结合分子。药物组合物可用于治疗、改善或预防下文进一步详细描述的疾病、病症、紊乱或症状的方法。每种此类疾病、病症、紊乱或症状被设想为关于如本文所述的药物组合物的用途的单独实施方案。还提供了用于至少一种治疗方法的药物组合物，如下文更详细描述的。
[0515]
如本文所用，术语“患者”和“受试者”可互换使用以指任何生物体，通常指脊椎动物，例如人和动物，其表现出至少一种疾病、紊乱或病症的症状、体征和/或指征。这些术语包括哺乳动物，例如灵长类动物、家畜动物(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、伴侣动物(例如猫、狗等)和实验室动物(例如小鼠、兔子、大鼠等)的非限制性实例。
[0516]
如本文所用，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”及其语法
变体是指用于获得有益或期望的临床结果的方法。这些术语可指减慢病症、紊乱或疾病的发作或发展速度，减少或减轻与其相关的症状、产生病症的完全或部分消退，或上述任何一种的一些组合。在一些实施方案中，有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的减少或减轻、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定(例如不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓解以及缓和(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”也可能意味着相对于如果不接受治疗的预期生存时间延长生存。需要治疗的受试者(例如人)因此可以是已经患有所讨论的疾病或紊乱的受试者。术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括抑制或减少相对于没有治疗的病理状态或症状的严重程度的增加，并且不一定意味着相关疾病、紊乱或病症的完全停止。对于肿瘤和/或癌症，治疗包括减少总体肿瘤负荷和/或个体肿瘤大小。
[0517]
如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”及其语法变体是指用于预防病症、疾病或紊乱的发展或改变病症、疾病或紊乱的病理学的方法。因此，“预防”可以指预防性的或预防措施。在一些实施方案中，有益的或期望的临床结果包括但不限于预防或减缓疾病的症状、进展或发展，无论是可检测的还是不可检测的。需要预防的受试者(例如人)因此可以是尚未患有所讨论的疾病或紊乱的受试者。术语“预防”包括相对于不存在治疗减缓疾病的发作，并不一定意味着对相关疾病、紊乱或病症的永久预防。因此，“预防(preventing)”或“预防(prevention)”病症在某些情况下可以指降低发展该病症的风险或预防或延迟与该病症相关的症状的发展。
[0518]
如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”是组合物(例如治疗组合物、化合物或药剂)的量或剂量，其在受试者中产生至少一种所需的治疗效果，例如预防或治疗靶病症或有益地减轻与该病症相关的症状。最理想的治疗有效量是产生本领域技术人员为需要其的给定受试者选择的特定治疗的理想疗效的量。该量将取决于技术人员理解的多种因素而变化，包括但不限于治疗组合物的特征(包括活性、药代动力学、药效学和生物利用度)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型、疾病阶段、一般身体状况、对给定剂量的反应性和药物类型)、制剂中药学上可接受的一种或多种载体的性质以及施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定治疗有效量，即通过监测受试者对组合物施用的反应并相应地调整剂量(参见例如remington：the science and practice of pharmacy(gennaro a，编辑，mack publishing co.，伊斯顿，pa，u.s.，第19版，1995))。
[0519]
药剂(例如结合分子的药物制剂)的有效量，是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需治疗或预防结果的量。治疗癌症的药物的有效量可以减少癌细胞的数量；减小肿瘤大小；抑制(例如在一定程度上减缓并优选停止)癌细胞浸润到外周器官；抑制(例如在一定程度上减缓并优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。就药物可以防止生长和/或杀死现有癌细胞而言，它可能是细胞抑制和/或细胞毒性的。有效量可以延长无进展生存期(例如，通过实体瘤反应评估标准、recist或ca-125变化测量)，导致目标反应(包括部分反应，pr或完全反应，cr)，增加总生存时间，和/或改善癌症的一种或多种症状(例如通过fosi评估)。
[0520]
诊断组合物包含结合分子和一种或多种检测促进剂。当生产或制备诊断组合物时，结合分子可以直接或间接地连接至一种或多种检测促进剂。有许多技术人员已知的标
准技术，用于将各种检测促进剂掺入、固定和/或缀合至分子的蛋白质或蛋白质组分，尤其是免疫球蛋白和免疫球蛋白衍生的结构域。
[0521]
有许多技术人员已知的检测促进剂，例如同位素、染料、比色剂、对比增强剂、荧光剂、生物发光剂和磁性剂，它们可以可操作地连接到多肽或结合分子，用于信息收集方法，例如用于对生物体的疾病、紊乱或病症的诊断和/或预后应用(参见例如cai w等人，j nucl med48：304-10(2007)；nayak t，brechbiel m，bioconjug chem 20：825-41(2009)；paudyal p等人，oncol rep 22：115-9(2009)；qiao j等人，plos one 6：e18103(2011)；sano k等人，breast cancer res 14：r61(2012))。这些试剂可以在任何合适的位置与多肽或结合分子结合、连接和/或掺入。例如，检测促进剂的连接或掺入可以通过分子的氨基酸残基或通过本领域已知的某种类型的连接，包括通过接头和/或螯合剂。试剂的掺入是这样的方式，使得能够在筛选、测定、诊断程序和/或成像技术中检测诊断组合物的存在。
[0522]
类似地，技术人员已知许多成像方法，例如医学领域中常用的非侵入性体内成像技术，例如：计算机断层扫描成像(ct扫描)、光学成像(包括直接、荧光和生物发光成像)、磁共振成像(mri)、正电子发射断层扫描(pet)、单光子发射计算机断层扫描(spect)、超声和x射线计算机断层扫描成像。
[0523]
vii.包含结合分子的药物和/或诊断组合物的生产或制备
[0524]
本文还提供了任何志贺菌毒素效应多肽和结合分子的药学上可接受的盐或溶剂化物。
[0525]
术语“溶剂化物”是指在溶质(在所定情况下(in casu)，蛋白质化合物或其药学上可接受的盐)和溶剂之间形成的确定化学计量的复合物。在这方面的溶剂例如可以是水、乙醇或另一种药学上可接受的，通常是小分子有机物质，例如但不限于乙酸或乳酸。当所讨论的溶剂是水时，这种溶剂化物通常称为水合物。
[0526]
多肽和蛋白质或其盐可配制成制备用于储存或施用的药物组合物，其通常包含在药学上可接受的载体中的治疗有效量的分子或其盐。术语“药学上可接受的载体”包括任何标准的药学载体。用于治疗分子用途的药学上可接受的载体在制药领域是众所周知的，并且描述于例如remington’s pharmaceutical sciences(mack publishing co.(a.gennaro，编辑，1985)。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理上可接受的，即相容的溶剂、分散介质、涂层、抗微生物剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体或稀释剂包括适合口服、直肠、鼻的或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内和透皮)施用的制剂中使用的那些。示例性的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。可用于药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油如橄榄油、和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。例如，可以通过使用包衣材料如卵磷脂、在分散体的情况下通过保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。在一些实施方案中，载体适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据所选择的施用途径，蛋白质或其他药物组分可以包覆在一种材料中，以保护化合物免受低ph和其他天然灭活条件的影响，当通过特定施用途径施用至患者时活性蛋白可能遇到低ph和其他天然灭活条件。
[0527]
药物组合物的制剂可以方便地以单位剂型存在并且可以通过药学领域中众所周
知的任何方法制备。在这种形式中，组合物被分成含有适量活性成分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，该包装包含离散量的制剂，例如包装的片剂、胶囊和小瓶或安瓿中的粉末。单位剂型也可以是胶囊、扁囊剂或片剂本身，或者它可以是适当数量的任何这些包装形式。它可以以单剂量可注射形式提供，例如以笔(pen)的形式。可以针对任何合适的施用途径和方式配制组合物。皮下或透皮施用方式可能特别适用于本文所述的治疗性蛋白质。
[0528]
药物组合物还可以包含佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌程序和通过加入各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯丁醇、苯酚山梨酸等来确保防止微生物的存在。组合物中的等渗剂，例如糖、氯化钠等，也可能是需要的。此外，可通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
[0529]
药物组合物还任选地包括药学上可接受的抗氧化剂。示例性的药学上可接受的抗氧化剂是水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(bha)、丁基羟基甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
[0530]
本文还提供了药物组合物，其包含一种或多种不同的结合分子，或任何前述物质的酯、盐或酰胺，以及至少一种药学上可接受的载体。
[0531]
治疗组合物通常是无菌的并且在制备和储存条件下是稳定的。该组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、醇例如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)或任何合适的混合物。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持所需的粒度以及通过使用根据本领域公知的制剂化学的表面活性剂来保持适当的流动性。在一些实施方案中，组合物中可能需要等渗剂，例如糖和多元醇，例如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来延长可注射组合物的吸收。
[0532]
用于皮内或皮下应用的溶液或悬浮液通常包括以下一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如l二胺四乙酸；缓冲剂，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和张力调节剂，例如氯化钠或葡萄糖。ph可以用酸或碱调节，例如盐酸或氢氧化钠，或用缓冲剂例如柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐调节。此类制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
[0533]
无菌可注射溶液可以通过将所需量的多肽或结合分子掺入适当的溶剂中来制备，该溶剂具有上述成分中的一种或上述成分的组合，根据需要，然后进行灭菌微孔过滤。分散体可以通过将活性化合物掺入无菌运载体中来制备，所述运载体含有分散介质和其他成分，例如上述那些。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从无菌过滤溶液中产生除任何其他所需成分外的活性成分粉末。
[0534]
当治疗有效量的多肽和/或结合分子被设计为通过例如静脉内、皮肤或皮下注射时，粘合剂将呈无热原、肠胃外可接受的水溶液形式。考虑到适当的ph、等渗性、稳定性等来制备肠胃外可接受的蛋白质溶液的方法在本领域技术范围内。用于静脉内、皮肤或皮下注射的优选药物组合物除了粘合剂外，还含有等渗运载体，例如氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸林格注射液或如本领域已知的其他运载体。药
appl math 2：482-9(1981)的算法。还包括能够在严格条件下与编码细胞靶向蛋白的序列的互补序列杂交的多核苷酸(参见例如ausubel f等人，current protocols in molecular biology(john wiley&sons，new york，ny，u.s.，1993))及以下。严格条件是本领域技术人员已知的并且可以在例如current protocols in molecular biology(john wiley&sons，ny，u.s.，ch.sec.6.3.1-6.3.6(1989))中找到。
[0542]
本文还提供了包含本文所述多核苷酸的表达载体。可以使用本领域熟知的材料和方法将能够编码志贺菌毒素效应多肽组分和/或结合分子的多核苷酸插入已知载体，包括细菌质粒、病毒载体和噬菌体载体，以产生表达载体。此类表达载体将包括支持在选择的任何宿主细胞或无细胞表达系统(例如ptxb1和pivex2.3)内产生预期的志贺毒素效应多肽和/或结合分子所必需的多核苷酸。包含特定多核苷酸的用于特定类型宿主细胞或无细胞表达系统的表达载体为本领域普通技术人员所熟知，可以使用常规实验确定，和/或可以购买。
[0543]
如本文所用，术语“表达载体”是指包含一个或多个表达单元的线性或环状多核苷酸。术语“表达单元”表示编码目标多肽并且能够在宿主细胞中提供核酸片段的表达的多核苷酸区段(segment)。表达单元通常包含转录启动子、编码目标多肽的开放阅读框和转录终止子，所有这些都处于可操作构型。表达载体包含一个或多个表达单元。因此，在一些实施方案中，编码志贺菌毒素效应多肽和/或包含单条多肽链的结合分子的表达载体至少包括单条多肽链的表达单元，而蛋白质(包括，例如两条或更多条多肽链(例如一条链包含v
l
结构域和第二条链包含与毒素效应多肽连接的vh结构域))包括至少两个表达单元，一个用于蛋白质的两条多肽链中的每一条。对于多链细胞靶向蛋白的表达，每个多肽链的表达单元也可以分别包含在不同的表达载体上(例如，表达可以用已经引入每个多肽链的表达载体的单个宿主细胞来实现)。
[0544]
能够指导多肽和蛋白质瞬时或稳定表达的表达载体在本领域中是众所周知的。表达载体通常包括但不限于以下一种或多种：异源信号序列或肽、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，它们中的每一个都是本领域公知的。可以使用的任选调节控制序列、整合序列和有用的标记是本领域已知的。
[0545]
术语“宿主细胞”是指能够支持表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌或真核细胞(例如酵母、昆虫、两栖动物、鸟类或哺乳动物细胞)。包含多核苷酸或能够产生多肽和/或结合分子的宿主细胞系的产生和分离可以使用本领域已知的标准技术来完成。
[0546]
本文所述志贺菌毒素效应多肽和/或蛋白质可以是本文所述多肽和分子的变体或衍生物，其通过改变一个或多个氨基酸或缺失或插入一个或多个氨基酸，通过修饰编码结合分子的多肽和/或蛋白质组分的多核苷酸而产生，使其更适合实现所需特性，例如宿主细胞的更优化表达。
[0547]
ix.固定在固体基质上的pd-l1结合分子
[0548]
在一些实施方案中，本文所述的分子(例如结合分子、融合蛋白或多核苷酸)或其任何效应片段被固定在固体基质上。本文考虑的固体基质包括但不限于微珠、纳米颗粒、聚合物、基质材料、微阵列、微量滴定板或本领域已知的任何固体表面(参见例如us 7,771,955)。根据这些实施方案，可以使用技术人员已知的技术将分子共价或非共价连接至固体
2015/113005，wo 2015/113007，wo 2015/191764，us20150259428，wo 2016/196344，wo 2017/019623，wo 2018/106895和wo 2018/140427中所述的各种方法。
[0556]
本文提供杀死细胞的方法，包括使细胞在体外或体内与本文所述的志贺菌毒素效应多肽、结合分子或药物组合物接触的步骤。本文所述的志贺菌毒素效应多肽、结合分子和药物组合物可用于在一个或多个细胞与要求保护的物质组合物之一接触时杀死特定的细胞类型。在一些实施方案中，结合分子或药物组合物可用于杀死不同细胞类型的混合物中的特定细胞类型，例如包含癌细胞、感染细胞和/或血液细胞的混合物。在一些实施方案中，结合分子或药物组合物可用于杀死不同细胞类型混合物中的癌细胞。在一些实施方案中，细胞毒性志贺结合分子或药物组合物可用于杀死不同细胞类型的混合物中的特定细胞类型，例如移植前组织。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽、结合分子或药物组合物可用于杀死细胞类型混合物中的特定细胞类型，例如用于治疗目的的施用前组织材料。在一些实施方案中，结合分子或药物组合物可用于选择性地杀死被病毒或微生物感染的细胞，或者选择性地杀死表达特定细胞外靶生物分子例如细胞表面生物分子的细胞。志贺菌毒素效应多肽、结合分子和药物组合物具有多种应用，包括例如用于在体外或体内从组织中清除不需要的细胞类型，用于调节免疫应答以治疗移植物抗宿主反应，用作抗病毒剂，用作抗寄生虫剂，并用于清除移植组织中不需要的细胞类型。
[0557]
在一些实施方案中，某些志贺菌毒素效应多肽、结合分子和药物组合物，单独或与其他化合物或药物组合物组合，当在体外或体内施用至受试者，例如需要治疗的患者中的细胞群时，可显示出有效的细胞杀伤活性。通过使用高亲和力结合区将酶活性志贺菌毒素a亚基效应多肽和/或t细胞表位靶向递送至特定细胞类型，可以将细胞杀伤活性限制为特异性和选择性地杀死生物体内的某些细胞类型，例如某些癌细胞、肿瘤细胞、恶性细胞、非恶性肿瘤细胞和/或感染细胞。
[0558]
在一些实施方案中，杀死需要其的患者的细胞的方法包括向患者施用至少一种结合分子或其药物组合物的步骤。
[0559]
在一些实施方案中，结合分子或其药物组合物可用于通过靶向发现与癌症或肿瘤细胞物理偶联的细胞外pd-l1来杀死患者中的癌细胞。术语“癌细胞”或“癌性细胞”是指以异常加速和/或不受调节的方式生长和分裂的各种肿瘤细胞，并且对于技术人员来说是清楚的。术语“肿瘤细胞”包括恶性和非恶性细胞。通常，癌症和/或肿瘤可以定义为可治疗和/或预防的疾病、紊乱或病症。由可受益于方法和组合物的癌细胞和/或肿瘤细胞组成的癌症和肿瘤(恶性或非恶性)对于技术人员来说是清楚的。肿瘤细胞通常与以下一项或多项相关：不受调节的生长、缺乏分化、局部组织侵袭、血管生成和转移。可受益于本文所述的用于靶向某些癌细胞和/或肿瘤细胞的方法和组合物的由癌症和/或肿瘤(恶性或非恶性)引起的疾病、紊乱和病症对于技术人员来说将是清楚的。
[0560]
在一些实施方案中，本文所述的结合分子和组合物可用于杀死癌症干细胞、肿瘤干细胞、恶性癌前起始细胞和肿瘤起始细胞，这些细胞通常分裂缓慢并且对癌症疗法如化学疗法和辐射具有抗性。例如，可以通过杀死aml干细胞和/或休眠的aml祖细胞来治疗急性髓性白血病(aml)(参见例如shlush l等人，blood 120：603-12(2012))。
[0561]
由于基于志贺菌毒素a亚基的作用机制，本文所述的物质组合物可以更有效地用于涉及它们与其他疗法组合或与其他疗法互补方式的方法中，所述其他疗法例如化学疗
法、免疫疗法、放射、干细胞移植和免疫检查点抑制剂，和/或对化学抗性/抗辐射性和/或静息肿瘤细胞/肿瘤起始细胞/干细胞有效。类似地，物质组合物可以更有效地用于涉及与针对相同疾病紊乱或病症的非重叠或不同靶上的相同表位以外的其他细胞靶向疗法组合的方法中。
[0562]
结合分子或其药物组合物的某些实施方案可用于通过靶向发现与免疫细胞物理偶联的细胞外pd-l1来杀死患者中的免疫细胞(无论是健康的还是恶性的)。
[0563]
使用结合分子或其药物组合物用于清除患者的恶性、赘生性或其他不需要的t细胞和/或b细胞的细胞群(例如骨髓)，然后将t细胞和/或b细胞消耗的材料重新注入患者体内的目的在本公开的范围内(参见例如van heeckeren w等人，br j haematol 132：42-55(2006)；(参见例如alpdogan o，van den brink m，semin oncol 39：629-42(2012))。
[0564]
使用结合分子或其药物组合物用于从从患者体内去除的分离细胞群中离体消耗t细胞和/或b细胞的目的在本公开的范围内。在一个非限制性实例中，结合分子可用于预防器官和/或组织移植排斥的方法中，其中供体器官或组织在移植前用细胞毒性结合分子或其药物组合物灌注，以便清除器官的供体t细胞和/或b细胞(参见例如alpdogan o，van den brink m，semin oncol 39：629-42(2012))。
[0565]
利用结合分子或其药物组合物从供体细胞群中消耗t细胞和/或b细胞以预防移植物抗宿主反应和/或在进行骨髓和/或干细胞移植的患者中，诱导耐受性也在本公开的范围内(参见例如van heeckeren w等人，br j haematol 132：42-55(2006)；(参见例如alpdogan o，van den brink m，semin oncol 39：629-42(2012))。
[0566]
在志贺菌毒素效应多肽或结合分子或其药物组合物的一些实施方案中，可用于通过靶向发现与受感染细胞物理偶联的细胞外pd-l1来杀死患者中的受感染细胞。
[0567]
在结合分子或其药物组合物的一些实施方案中，可以使用非自身的t细胞表位-肽呈递细胞在脊索动物内“接种”基因座，以激活免疫系统以增强对基因座的监控。在这种“接种”方法的一些实施方案中，该基因座是肿瘤块或受感染的组织部位。在该“接种”方法的优选实施方案中，非自身t细胞表位-肽选自由以下组成的组中：结合分子的靶细胞尚未呈递的肽，靶细胞表达的任何蛋白质中不存在的肽，靶细胞的蛋白质组或转录组中不存在的肽，待接种位点的细胞外微环境中不存在的肽，以及待靶向的肿瘤块或感染组织部位中不存在的肽。
[0568]
这种“接种”方法的作用是用一种或多种mhc i类呈递的t细胞表位标记脊索动物内的一个或多个靶细胞，以供效应t细胞识别并激活下游免疫应答。通过利用结合分子的细胞内化、细胞内按路线发送和t细胞表位递送功能，展示所递送的t细胞表位的靶细胞被用来诱导宿主t细胞识别呈递的靶细胞并诱导进一步的免疫应答，包括通过ctl杀死靶细胞。这种使用结合分子的“接种”方法可以通过诱导适应性免疫应答来攻击接种的微环境例如肿瘤块或受感染的组织部位中的细胞，来提供临时的疫苗接种效果，无论是否呈递结合分子递送的t细胞表位。这种“接种”方法还可以诱导对脊索动物内的靶细胞群、肿瘤块和/或感染组织部位的免疫耐受性的破坏。
[0569]
在一些实施方案中，涉及用一种或多种抗原性和/或免疫原性表位在脊索动物内接种基因座的方法可以与免疫佐剂的施用组合，无论是局部施用还是全身施用，以刺激对某些抗原的免疫应答，例如，本文所述的组合物与一种或多种免疫佐剂如细胞因子、细菌产
物或植物皂甙的共同施用。可能适用于本文所述方法的免疫佐剂的其他实例包括铝盐和油，例如明矾、氢氧化铝、矿物油、角鲨烯、石蜡油、花生油和硫柳汞。
[0570]
此外，本文提供了治疗患者的疾病、紊乱或病症的方法，包括向需要其的患者施用有效量的至少一种结合分子或其药物组合物的步骤。在一些实施方案中，疾病、紊乱或病症涉及表达pd-l1的细胞。可以使用该方法治疗的预期疾病、紊乱和病症包括癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、生长异常、免疫紊乱和微生物感染。本文所述组合物的“治疗有效剂量”的施用可导致疾病症状的严重性降低、疾病无症状期的频率和持续时间增加，或预防由于疾病折磨引起的损伤或残疾。
[0571]
组合物的治疗有效量将取决于施用途径、被治疗生物体的类型以及所考虑的特定患者的身体特征。这些因素及其与确定该量的关系对于医学领域的熟练从业者来说是众所周知的。可以调整该量和施用方法以实现最佳功效，并且可以取决于医学领域技术人员熟知的因素，例如体重、饮食、同时用药和其他因素。最适合人类使用的剂量大小和给药方案可以由本文获得的结果指导，并且可以在适当设计的临床试验中得到证实。可以通过常规方法确定有效剂量和治疗方案，从实验动物中的低剂量开始，然后在监测效果的同时增加剂量，并系统地改变给药方案。在确定给定受试者的最佳剂量时，临床医生可以考虑许多因素。这样的考虑是技术人员已知的。
[0572]
可接受的施用途径可以是指本领域已知的任何施用途径，包括但不限于气雾剂、肠内、鼻、眼部、口服、肠胃外、直肠、阴道或透皮(例如乳膏、凝胶或软膏的局部施用，或通过透皮贴剂)。“肠胃外给药”通常与在预期作用部位处或与预期作用部位相联系的注射有关，包括眶下、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管施用。
[0573]
对于药物组合物的施用，剂量范围通常为每千克受试者体重约0.001至10毫克(mg/kg)，并且更多，通常为0.001至0.5mg/kg。示例性剂量可以是0.01mg/kg体重、0.03mg/kg体重、0.07mg/kg体重、0.09mg/kg体重或0.1mg/kg体重或在0.01至0.1mg/kg的范围内。示例性的治疗方案是每天一次或两次施用，或每周一次或两次施用，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每月一次，每两或三个月一次或每三至六个月一次。熟练的医疗保健专业人员可以根据需要选择和重新调整剂量，以最大化特定患者的治疗益处。
[0574]
药物组合物通常将多次施用于同一患者。单次剂量之间的间隔可以是例如两到五天、每周、每月、每两或三个月、每六个月或每年。基于调节受试者或患者的血液水平或其他标志物，施用之间的间隔也可以是不规则的。组合物的给药方案包括，例如，静脉内施用0.01mg/kg体重或0.03mg/kg体重的组合物，每2-4周施用6剂，然后每三个月0.03mg/kg体重或0.01mg/kg体重。
[0575]
药物组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种，通过一种或多种施用途径施用。如技术人员将理解的，施用途径和/或方式将根据所需结果而变化。结合分子和药物组合物的施用途径包括，例如静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。对于其他实施方案，结合分子或药物组合物可以通过非胃肠外途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部。
[0576]
治疗性结合分子或药物组合物可以与本领域已知的多种医疗装置中的一种或多种一起施用。例如，在一个实施方案中，可以用无针皮下注射装置施用药物组合物。可用的
众所周知的植入物和模块的示例在本领域中是已知的，包括例如用于受控速率输送的可植入微输注泵；通过皮肤给药的装置；用于以精确的输注速率递送的输注泵；用于连续药物递送的可变流量植入式输注装置；和渗透药物递送系统。这些和其他这样的植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
[0577]
结合分子或药物组合物可以单独施用或与一种或多种其他治疗剂或诊断剂组合施用。组合疗法可以包括结合分子或其药物组合物，与至少一种基于待治疗的特定患者、疾病或病症选择的其他治疗剂组合。其他此类药剂的实例尤其包括细胞毒剂、抗癌剂或化疗剂、抗炎剂或抗增殖剂、抗微生物剂或抗病毒剂、生长因子、细胞因子、镇痛剂、治疗活性小分子或多肽、单链抗体、经典抗体或其片段，或调节一种或多种信号传导途径的核酸分子，和类似的调节治疗分子，其可以补充或以其他方式有益于治疗或预防治疗方案。
[0578]
在一些实施方案中，用结合分子或药物组合物治疗患者可导致靶细胞的细胞死亡和/或靶细胞生长的抑制。因此，细胞毒性结合分子和包含它们的药物组合物将可用于治疗多种病理紊乱的方法，其中杀死或消耗靶细胞可能是有益的，例如尤其癌症、肿瘤、其他生长异常、免疫紊乱和感染的细胞。本文还提供了用于抑制细胞增殖和治疗细胞紊乱的方法，包括瘤形成、过度活跃的b细胞和过度活跃的t细胞。
[0579]
在一些实施方案中，本文所述的结合分子和药物组合物可用于治疗或预防癌症、肿瘤(恶性和非恶性)、生长异常、免疫紊乱和微生物感染。在一些实施方案中，上述离体方法可以与上述体内方法组合以提供治疗或预防骨髓移植受体排斥和实现免疫耐受的方法。
[0580]
在一些实施方案中，用于治疗哺乳动物受试者例如人的恶性肿瘤或肿瘤和其他血细胞相关癌症的方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的细胞毒性结合分子或药物组合物的步骤。
[0581]
结合分子和药物组合物具有多种应用，包括例如用于去除不需要的t细胞、用于调节免疫应答以治疗移植物抗宿主反应、用作抗病毒剂、用作抗微生物剂以及用于清除移植组织不需要的细胞类型。本文所述的结合分子和药物组合物通常是抗肿瘤剂——意味着它们能够通过抑制癌细胞或肿瘤细胞的生长和/或引起癌细胞或肿瘤细胞的死亡来治疗和/或预防肿瘤或恶性细胞的发展、成熟或扩散。
[0582]
在一些实施方案中，结合分子或药物组合物用于治疗b细胞、浆细胞或抗体介导的疾病或紊乱，例如白血病、淋巴瘤(例如，原发性纵隔b细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、或非霍奇金淋巴瘤)、骨髓瘤、风湿性疾病、脊椎炎、人类免疫缺陷病毒相关疾病、淀粉样变性、溶血性尿毒症综合征、多动脉炎、感染性休克、克罗恩病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、溃疡性结肠炎、银屑病、哮喘、肖格伦氏综合征、移植物抗宿主病、移植物排斥、糖尿病、血管炎、硬皮病和系统性红斑狼疮。
[0583]
在一些实施方案中，本文所述的结合分子和药物组合物的某些实施方案是抗微生物剂——意味着它们能够治疗和/或预防微生物病原体感染的获得、发展或后果，所述微生物病原体感染例如由病毒、细菌、真菌、朊病毒或原生动物引起。
[0584]
通过向患者施用本文所述的结合分子或其药物组合物以杀死患者体内的t细胞或b细胞为目的来提供对由t细胞或b细胞介导的疾病或病症的预防或治疗在本公开的范围内。这种用法与准备或调理患者进行骨髓移植、干细胞移植、组织移植或器官移植兼容，无论移植材料的来源如何，例如人类或非人类来源。
[0585]
通过使用本文所述的细胞毒性结合分子或药物组合物的宿主t细胞的靶向细胞杀死来提供用于预防或治疗骨髓受体的宿主抗移植物疾病也在本公开的范围内。
[0586]
在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括向需要其的受试者施用有效量的pdl-1结合分子或包含该分子的药物组合物。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括向需要其的受试者施用有效量的编码pd-l1结合分子的核酸(例如，表达载体)。在一些实施方案中，癌症是以下任意一种：膀胱癌(例如，尿路上皮癌)、乳腺癌(例如，her2阳性乳腺癌、三阴性乳腺癌)、结肠癌(例如，结肠直肠癌，例如转移性微卫星不稳定性-高或错配修复缺陷型结直肠癌)、子宫内膜癌、食道癌、输卵管癌、胃肠道癌(如胃癌、胆道肿瘤、胃食管连接部癌)、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(如头颈的鳞状细胞癌)，肾癌(如肾细胞癌)、肝癌(如肝细胞癌)、肺癌(如非小细胞肺癌、小细胞肺癌)、淋巴瘤(如弥漫性大b细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤)、梅克尔细胞癌、间皮瘤(如胸膜间皮瘤)、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)、鼻咽肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜肿瘤、前列腺癌，皮肤癌(例如，皮肤鳞状细胞癌、黑色素瘤、移行细胞癌或尿路上皮癌。
[0587]
结合分子和药物组合物的一些实施方案可用于治疗癌症的方法，包括向需要其的患者施用治疗有效量的结合分子和/或药物组合物。在一些实施方案中，正在治疗的癌症选自由以下组成的组：骨癌(如多发性骨髓瘤或尤文氏肉瘤)、乳腺癌(如her2阳性乳腺癌或三阴性乳腺癌)、中枢/外周神经系统癌(如脑癌、神经纤维瘤病或成胶质细胞瘤)、胃肠道癌(例如胃癌或结肠直肠癌)、生殖细胞癌(例如卵巢癌和睾丸癌、腺癌(如胰腺癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、唾液腺癌或甲状腺癌)、头颈癌(如鼻咽癌、口腔癌或咽癌)、血液学癌症(例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、肾泌尿道癌(例如肾癌和膀胱癌)、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌/胸膜癌(如间皮瘤、小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(如血管肉瘤、纤维肉瘤、卡波西肉瘤或滑膜肉瘤)、皮肤癌(例如基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑色素瘤)、尿路上皮癌、胃癌、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌、梅克尔细胞癌、子宫内膜癌和子宫癌。
[0588]
在本文所述的治疗癌症的方法的一些实施方案中，受试者在施用结合分子之前接受了至少一种先前治疗的线(line)或方案。在一些实施方案中，受试者患有癌症，并且该癌症对至少一种先前的治疗如检查点抑制剂治疗复发或难治。在一些实施方案中，癌症对伊匹单抗、纳武利尤单抗、派姆单抗、阿特珠单抗(atexolizumab)、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗、曲美木单抗(tremelimumab)或西米普利单抗(cemiplimab)是复发的或难治的。在一些实施方案中，癌症是下表6中列出的癌症之一，并且对至少一种在表中标有“x”的先前治疗是复发或难治的。
[0589]
表6：可用本公开的结合分子治疗的癌症，其对先前的治疗是可复发的或难治的
m，science 340：968-71(2013)，以及创建神经退行性疾病的模型系统，例如帕金森氏症和阿尔茨海默氏症(参见例如hamlin a等人，plos one e53472(2013))。
[0595]
在一些实施方案中，提供了使用如本文所述的志贺菌毒素效应多肽、结合分子、药物组合物和/或诊断组合物来标记或检测肿瘤细胞和/或免疫细胞类型的内部的方法。该方法可能基于某些结合分子进入特定细胞类型和在细胞内通过逆行细胞内运输运送(route)到特定细胞类型的内部区室的能力，特定细胞类型的内部区室被标记用于检测。这可以在患者体内的原位细胞或从生物体中取出的细胞和组织上进行，例如，活检材料。
[0596]
在一些实施方案中，提供了使用志贺菌毒素效应多肽、结合分子、药物组合物和/或诊断组合物来检测细胞类型的存在，以用于收集关于疾病、病症和/或紊乱的信息的目的的方法。该方法包括使细胞与诊断有效量的结合分子接触，以便通过测定或诊断技术检测该分子。短语“诊断有效量”是指通过所使用的特定测定或诊断技术为信息收集目的提供充分检测和准确测量的量。通常，用于体内诊断用途的整个生物体的诊断有效量将是每kg受试者每受试者0.001至10毫克检测促进剂连接的结合分子的非累积剂量。通常，在这些信息收集方法中使用的志贺菌毒素效应多肽或结合分子的量将尽可能低，只要它仍然是诊断有效量。例如，对于生物体中的体内检测，施用至受试者的志贺菌毒素效应多肽、结合分子或药物组合物的量将尽可能低。
[0597]
结合分子与检测促进剂组合的细胞类型特异性靶向提供了检测和成像细胞的方法，所述细胞与由分子的结合区结合的细胞外pd-l1物理偶联。可以通过本领域已知的任何合适技术在体外或体内进行使用结合分子的细胞成像。可以使用本领域已知的各种方法收集诊断信息，包括生物体的全身成像或使用取自生物体的离体样品。本文使用的术语“样品”是指任何数量的事物，但不限于，流体例如血液、尿液、血清、淋巴液、唾液、肛门分泌物、阴道分泌物和精液，以及通过活检程序获得的组织。例如，各种检测促进剂可用于通过诸如磁共振成像(mri)、光学方法(如直接、荧光和生物发光成像)、正电子发射断层扫描(pet)、单光子发射计算机断层扫描(spect)、超声、x射线计算机断层扫描以及上述的组合进行非侵入性体内肿瘤成像(参见kaur s等人，cancer lett 315：97-111(2012)，供审阅)。
[0598]
还提供了在诊断组合物中使用志贺菌毒素效应多肽、结合分子或药物组合物来标记或检测血液细胞、癌细胞、肿瘤细胞、感染细胞和/或免疫细胞内部的方法(参见例如，koyama y等人，clin cancer res 13：2936-45(2007)；ogawa m等人，cancer res 69：1268-72(2009)；yang l等人，small 5：235-43(2009))。基于某些结合分子进入特定细胞类型和通过逆行细胞内运输在细胞内运送(route)的能力，特定细胞类型的内部区室被标记用于检测。这可以在患者体内的原位细胞或从生物体中取出的细胞和组织上进行，例如，活检材料。
[0599]
诊断组合物可用于通过相关药物组合物将疾病、紊乱或病症表征为潜在可治疗的。本文所述的一些物质组合物可用于确定患者是否属于对使用本文所述的化合物、组合物或相关方法的治疗策略有反应的组，或者是否非常适合使用本文所述的递送装置。
[0600]
诊断组合物可以在疾病例如癌症被检测之后使用，以更好地表征它，例如监测远处转移、异质性和癌症进展的阶段。疾病或感染的表型评估有助于在做治疗决策期间进行预后和预测。在疾病复发时，可以使用某些方法来确定是局部问题还是全身问题。
[0601]
诊断组合物可用于评估对治疗的反应，而不管治疗类型的类型如何，例如小分子
药物、生物药物或基于细胞的疗法。例如，诊断的某些实施方案可用于测量肿瘤大小的变化、抗原阳性细胞群的变化，包括数量和分布，或监测与已经施用至患者的治疗所靶向的抗原不同的标志物(参见smith-jones p等人，nat.biotechnol 22：701-6(2004)；evans m等人，proc.natl.acad.sci.usa 108：9578-82(2011))。
[0602]
在用于检测细胞类型的存在的方法的一些实施方案中，可用于收集关于疾病、紊乱和病症的信息，例如骨癌(如多发性骨髓瘤或尤文氏肉瘤)、乳腺癌、中枢/外周神经系统癌(如脑癌、神经纤维瘤病或成胶质细胞瘤)、胃肠道癌(如胃癌或结直肠癌)、生殖细胞癌(例如卵巢癌和睾丸癌)、腺癌(如胰腺癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、唾液腺癌或甲状腺癌)、头颈癌(如鼻咽癌、口腔癌或咽癌)、血液学癌症(如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、肾泌尿道癌(如肾癌和膀胱癌)、肝癌、肺癌/胸膜癌(如间皮瘤、小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(如血管肉瘤、纤维肉瘤、卡波西肉瘤或滑膜肉瘤)、皮肤癌(如基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑色素瘤)、子宫癌、艾滋病、风湿病、脊柱炎、淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、孤独症、风湿性心脏病(cardiorheumatic disease)、克罗恩病、糖尿病、全身性红斑狼疮、胃炎、移植物排斥、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒症综合征、艾滋病毒相关疾病、红斑狼疮、淋巴组织增生性疾病(包括移植后淋巴组织增生性疾病)、多发性硬化症、重症肌无力、神经炎症、多动脉炎、银屑病、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、感染性休克、肖格伦氏综合征、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、血管炎、细胞增殖、炎症、白细胞活化、白细胞粘附、白细胞趋化性、白细胞成熟、白细胞迁移、神经元分化、急性淋巴细胞白血病(all)、t急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤(all)、急性髓细胞白血病、急性髓细胞白血病(aml)、b细胞慢性淋巴细胞白血病(b-cll)、b细胞幼淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(bl)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml-bp)、慢性粒细胞白血病(cml)、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病(hcl)、霍奇金淋巴瘤(hl)、血管内大b细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、淋巴浆细胞淋巴瘤、malt淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤(mm)、自然杀伤细胞白血病、结边缘b细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、浆细胞白血病、浆细胞瘤、原发性渗出性淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病、早幼粒细胞白血病、小淋巴细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、t细胞淋巴瘤(tcl)、重链疾病、单克隆丙种球蛋白病、单克隆免疫球蛋白沉积病、骨髓增生异常综合征(mds)、郁积多发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
[0603]
在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽和结合分子或其药物组合物用于诊断和治疗两者，或单独用于诊断。在某些情况下，需要在选择志贺菌毒素效应多肽或结合分子用于治疗之前，确定或验证受试者和/或来自受试者(例如需要治疗的患者)的患病组织中表达的hla变体和/或hla等位基因。
[0604]
结合分子的任何实施方案(例如，简述中的实施方案组#1-13中任一项实施方案)可以与本文所述方法的每个单独实施方案一起使用。
[0605]
本发明通过以下编号的实施方案以及能够特异性靶向pd-l1并包含一种或多种蛋白质毒素组分的结合分子的非限制性实例进一步说明。
[0606]
编号的实施方案
[0607]
下文参考编号为#1-3的实施方案组描述了pd-l1结合分子的不同实施方案。
[0608]
实施方案组#1-pd-l1结合分子包含去免疫的志贺菌毒素效应多肽，所述去免疫的
志贺菌毒素效应多肽包含嵌入或插入的异源t细胞表位和非重叠去免疫亚区
[0609]
本文提供了结合分子，其包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子(pd-l1)的结合区和(ii)去免疫的志贺菌毒素效应多肽。例如，在实施方案组#1的一些实施方案中，结合分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区和(ii)去免疫志贺菌毒素效应多肽，所述去免疫志贺菌毒素效应多肽包含至少一个插入或嵌入的异源表位(a)和至少一个被破坏的、内源性b细胞和/或cd4 t细胞表位区(b)，其中异源表位不与嵌入或插入的异源t细胞表位重叠。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽能够表现出至少一种志贺菌毒素效应子功能，例如，指导细胞内按路线发送至存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶，抑制核糖体功能，使核糖体酶失活，引起白细胞郁滞，和/或引起细胞毒性。在一些实施方案中，异源t细胞表位是cd8 t细胞表位，例如关于人免疫系统的cd8 t细胞表位。在一些实施方案中，异源t细胞表位能够由细胞的mhc i类分子呈递。在一些实施方案中，结合分子能够具有以下一项或多项：进入细胞，抑制核糖体功能，引起白细胞郁滞，引起细胞死亡，和/或将嵌入或插入的异源t细胞表位递送至mhc i类分子以呈递在细胞表面上。在一些实施方案中，当引入细胞时，结合分子能够表现出与参考分子相当或更好的细胞毒性，所述参考分子例如由结合分子组成的第二结合分子，除了其所有志贺菌毒素效应多肽组分每个都包含野生型志贺菌毒素a1片段。
[0610]
在实施方案组#1的一些实施方案中，结合分子包含位于志贺菌毒素a1片段区的羧基末端的羧基末端的分子部分。
[0611]
在实施方案组#1的一些实施方案中，在被引入脊索动物时，与参考分子相比，结合分子能够表现出改善的体内耐受性和/或稳定性，所述参考分子例如由结合分子组成的第二结合分子，除了其所有志贺毒素效应多肽组分每个均包含野生型志贺菌毒素a1片段和/或在其a1片段区的羧基末端包含野生型志贺菌毒素弗林蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽不是细胞毒性的并且分子部分是细胞毒性的。
[0612]
在实施方案#1的一些实施方案中，结合区和志贺毒素效应多肽直接或间接连接在一起。
[0613]
在实施方案组#1的一些实施方案中，结合区包含多肽，所述多肽包含免疫球蛋白型结合区。在一些实施方案中，结合区包含选自由以下组成组的多肽：自主vh结构域、单域抗体片段(sdab)、纳米抗体、源自骆驼科动物的重链抗体结构域(vhh或vh结构域片段)、源自软骨鱼的重链抗体结构域(vhh或vh结构域片段)、免疫球蛋白新抗原受体(ignar)、v
nar
片段、单链可变片段(scfv)、抗体可变片段(fv)、互补决定区3片段(cdr3)、受限的fr3-cdr3-fr4多肽(fr3-cdr3-fr4)、fd片段、小模块化免疫药物(smip)结构域、抗原结合片段(fab)、犰狳重复多肽(armrp)、纤连蛋白衍生的第10个纤连蛋白iii型结构域(10fn3)、生腱蛋白iii型结构域(tnfn3)、锚蛋白重复基序结构域、低密度脂蛋白受体衍生的a结构域(ldlr-a)、脂质运载蛋白(anticalin)、kunitz结构域、蛋白质a衍生的z结构域、γ-b晶状体蛋白衍生结构域、泛素衍生结构域、sac7d衍生多肽(affitin(亲和素))、fyn衍生的sh2结构域、小蛋白、c型凝集素样结构域支架、工程化抗体模拟物以及任何上述保留结合功能的任何基因操作的对应物。
[0614]
在实施方案组#1的一些实施方案中，结合分子能够表现出(i)与野生型志贺菌毒素a1片段或野生型志贺菌毒素效应多肽相当的催化活性水平，(ii)具有半数最大抑制浓度
(ic
50
)值为10,000皮摩尔或更低的核糖体抑制活性，和/或(iii)显著水平的志贺菌毒素催化活性。
[0615]
在实施方案组#1的一些实施方案中，结合分子和/或其志贺菌毒素效应多肽能够表现出与参考结合分子相当的亚细胞按路线发送效率和/或能够表现出从细胞的内体起始位置到内质网和/或胞质溶胶的显著水平的细胞内按路线发送活性，所述参考结合分子包含野生型志贺菌毒素a1片段或野生型志贺菌毒素效应多肽。
[0616]
在实施方案组#1的一些实施方案中，由此将结合分子施用于与结合分子的结合区的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞，结合分子能够引起细胞死亡。在一些实施方案中，将结合分子施用于在细胞外靶生物分子的存在或水平方面不同的两种不同细胞类型群体，结合分子能够对与细胞毒性结合分子的结合区的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型引起细胞死亡，其cd
50
至少三倍或小于对未与结合分子的结合区的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型的cd
50
。在一些实施方案中，由此将结合分子施用至第一细胞群和第二细胞群，所述第一细胞群的成员与结合分子结合区的细胞外靶生物分子物理偶联，所述第二细胞群的成员未与结合区的任何细胞外靶生物分子物理偶联，相对于所述第二细胞群的成员，结合分子对所述第一细胞群的成员的细胞毒性作用至少大3倍。在一些实施方案中，由此将结合分子施用至第一细胞群和第二细胞群，所述第一细胞群的成员与显著量的结合分子结合区的细胞外靶生物分子物理偶联，所述第二细胞群的成员未与显著量的结合区的任何细胞外靶生物分子物理偶联，相对于所述第二细胞群的成员，结合分子对所述第一细胞群的成员的细胞毒性作用至少大3倍。在一些实施方案中，由此将结合分子施用至靶生物分子阳性细胞的第一群和第二细胞群，所述第二细胞群的成员在细胞表面不表达显著量的结合分子的结合区的靶生物分子，相对于第二细胞群的成员，结合分子对第一细胞群的成员的细胞毒性作用至少大3倍。
[0617]
在实施方案组#1的一些实施方案中，在被引入细胞时，结合分子能够表现出半数最大抑制浓度(cd
50
)值为300nm或更小的细胞毒性和/或能够表现出显著水平的志贺菌毒素的细胞毒性。
[0618]
在实施方案组#1的一些实施方案中，结合分子能够将嵌入或插入的异源cd8 t细胞表位递送至细胞的mhc i类呈递途径，用于由mhc i类分子结合的表位的细胞表面呈递。
[0619]
在实施方案组#1的一些实施方案中，结合分子包含与志贺菌毒素效应多肽的羧基末端相缔合的分子部分。在一些实施方案中，分子部分包含结合区或由结合区组成。在一些实施方案中，分子部分包含至少一个氨基酸并且志贺菌毒素效应多肽与分子部分的至少一个氨基酸残基连接。在一些实施方案中，分子部分和志贺菌毒素效应多肽融合形成连续多肽。
[0620]
在实施方案组#1的一些实施方案中，结合分子进一步包含与志贺菌毒素效应多肽的羧基末端相缔合的细胞毒性分子部分。在一些实施方案中，细胞毒性分子部分是细胞毒性剂，例如技术人员已知的和/或在本文中描述的小分子化疗剂、抗肿瘤剂、细胞毒性抗生素、烷化剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。对于一些实施方案，细胞毒性分子部分在小于10,000、5,000、1,000、500或200pm的浓度下具有细胞毒性。
[0621]
在实施方案组#1的一些实施方案中，结合区通过至少一个不是二硫键的共价键直接或间接连接至志贺菌毒素效应多肽。在一些实施方案中，结合区直接或间接融合至志贺
菌毒素效应多肽的羧基末端，以形成单个连续的多肽。在一些实施方案中，结合区是免疫球蛋白型结合区。
[0622]
在实施方案组#1的一些实施方案中，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小的弗林蛋白酶切割位点中相对于野生型志贺菌毒素a亚基的一个或多个突变。在一些实施方案中，被破坏的弗林蛋白酶切割基序不是与最小弗林蛋白酶切割位点的至少一个氨基酸残基的部分或全部重叠的序列的氨基末端截短。在一些实施方案中，最小的弗林蛋白酶切割位点中的突变是r/y-x-x-r弗林蛋白酶切割基序中至少一个氨基酸残基的氨基酸缺失、插入和/或置换。在一些实施方案中，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺菌毒素a亚基的至少一个突变，该突变改变天然定位于1)志贺样毒素1(seq id no：1)或志贺菌毒素(seq id no：2)的a亚基的248-251或2)在志贺样毒素2(seq id no：3)的a亚基的247-250处或任何志贺菌毒素a亚基中的等效氨基酸序列位置的区域中的至少一个氨基酸残基。在一些实施方案中，突变是精氨酸残基被非带正电荷的氨基酸残基置换的氨基酸残基置换。
[0623]
在实施方案组#1的一些实施方案中，结合分子在被引入细胞时，能够表现出与参考分子的细胞毒性相当的细胞毒性，所述参考分子例如由结合分子组成的第二结合分子，除了其志贺毒素效应多肽组分的每一个都包含野生型志贺菌毒素a1片段。
[0624]
在一些实施方案中，结合区包含或基本上由包含seq id no：85-107和156-157中任一项的氨基酸序列的多肽组成。
[0625]
在一些实施方案中，结合区包含与seq id no：85-107和156-157中的任一项具有至少85％、90％、95％、97％、98％、98.5％或99％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述多肽包含：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，每个cdr包含或基本上由seq id no：19、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：25和seq id no：26中任一项所示的氨基酸序列组成；和(b)重链可变区(hvr-h)，所述重链可变区(hvr-h)包含三个cdr，每个cdr包含或基本上由seq id no：22-24和27-32中任一项所示的氨基酸序列组成。
[0626]
在实施方案组#1的一些实施方案中，结合分子包含或基本上由seq id no：108-155中任一项所示的多肽组成。
[0627]
在实施方案组#1的一些实施方案中，结合区空间上覆盖a1片段区的羧基末端。
[0628]
在实施方案组#1的一些实施方案中，分子部分空间上覆盖a1片段区的羧基末端。在一些实施方案中，分子部分包含结合区。
[0629]
在实施方案组#1的一些实施方案中，结合分子包含位于志贺菌毒素a1片段区的羧基末端的羧基末端的结合区和/或分子部分。在一些实施方案中，结合区和/或分子部分的质量为至少4.5kda、6kda、9kda、12kda、15kda、20kda、25kda、28kda、30kda、41kda、50kda、100kda或更大。
[0630]
在实施方案组#1的一些实施方案中，结合分子包含质量为至少4.5kda、6kda、9kda、12kda、15kda、20kda、25kda、28kda、30kda、41kda、50kda、100kda或更大的结合区，只要结合分子保持本文所述的志贺菌毒素生物学活性的适当水平(例如，细胞毒性和/或细胞内按路线发送)。
[0631]
在实施方案组#1的一些实施方案中，结合区包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包括例如质量为至少4.5kda、6kda、9kda、12kda、15kda、20kda、25kda、28kda、30kda、
41kda、50kda、100kda或更大的分子部分，只要结合分子保持本文所述志贺菌毒素生物学活性的适当水平。
[0632]
在实施方案组#1的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽的氨基末端在结合分子的多肽组分的氨基末端处和/或邻近结合分子的多肽组分的氨基末端。在一些实施方案中，相对于志贺菌毒素效应多肽，结合区不靠近结合分子的氨基末端。在一些实施方案中，结合区和志贺菌毒素效应多肽在结合分子内物理排列或定向，使得结合区不位于志贺菌毒素效应多肽的氨基末端附近。在一些实施方案中，结合区位于结合分子内，与志贺菌毒素效应多肽的氨基末端相比更接近志贺菌毒素效应多肽的羧基末端。对于一些实施方案，当引入细胞时，结合分子能够表现出大于第三结合分子的细胞毒性，所述第三结合分子具有氨基末端并包含结合区和志贺毒素效应多肽，所述志贺毒素效应多肽不位于或靠近第三结合分子的氨基末端。对于一些实施方案，与第三结合分子的细胞毒性相比，结合分子表现出具有更好优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如4倍、5倍、6倍、9倍或更大的细胞毒性。对于一些实施方案，结合分子对靶阳性细胞群的细胞毒性是第三结合分子对第二靶阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大，如通过cd
50
值测定的。在一些实施方案中，第三结合分子不包含kdel家族的任何羧基末端内质网保留/回收信号基序(参见seq id no：205-252)。
[0633]
在实施方案组#1的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽的氨基末端在结合分子的多肽组分的氨基末端处和/或邻近结合分子的多肽组分的氨基末端。在一些实施方案中，相对于志贺菌毒素效应多肽，结合区不靠近结合分子的氨基末端。在一些实施方案中，结合区和志贺菌毒素效应多肽在结合分子内物理排列或定向，使得结合区不位于志贺菌毒素效应多肽的氨基末端附近。在一些实施方案中，结合区位于结合分子内，与志贺菌毒素效应多肽的氨基末端相比更接近志贺菌毒素效应多肽的羧基末端。对于一些实施方案，结合分子没有细胞毒性，并且当被引入细胞时，与第三结合分子的细胞毒性相比，能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更大的亚细胞按路线发送效率，所述第三结合分子具有氨基末端并包含结合区和志贺菌毒素效应多肽，所述志贺菌毒素效应多肽不位于或靠近第三结合分子的氨基末端。在一些实施方案中，第三结合分子不包含kdel家族的任何羧基末端内质网保留/回收信号基序(参见seq id no：205-252)。
[0634]
在实施方案组#1的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽的氨基末端在结合分子的多肽组分的氨基末端处和/或邻近结合分子的多肽组分的氨基末端。在一些实施方案中，相对于志贺菌毒素效应多肽，结合区不靠近结合分子的氨基末端。在一些实施方案中，结合区和志贺菌毒素效应多肽在结合分子内物理排列或定向，使得结合区不位于志贺菌毒素效应多肽的氨基末端附近。在一些实施方案中，结合区位于结合分子内，与志贺菌毒素效应多肽的氨基末端相比更接近志贺菌毒素效应多肽的羧基末端。在一些实施方案中，结合分子表现出低细胞毒性效力(即，当被引入某些阳性靶细胞类型时，在结合分子浓度为1000nm、500nm、100nm、75nm、50nm时，不能表现出大于细胞群1％的细胞死亡的细胞毒性)，并且当被引入细胞时，与第三结合分子的细胞毒性相比，能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更大的亚细胞按路线发送效率，所述第三结合分子具有氨基末端并包含结合区和志贺菌毒素效应多肽，所述志贺菌毒素效应多肽不位于或靠近第三结合分子的氨基末端。在一些实施方案中，第三结合分子不包含kdel家族的任何羧基末端内质网保
留/回收信号基序(参见seq id no：205-252)。
[0635]
在实施方案组#1的一些实施方案中，结合分子或其多肽组分包含kdel家族成员的羧基末端内质网保留/回收信号基序。对于一些实施方案，羧基末端内质网保留/回收信号基序选自由以下组成的组：kdel(seq id no：205)，hdef(seq id no：206)，hdel(seq id no：207)，rdef(seq id no：208)，rdel(seq id no：209)，wdel(seq id no：210)，ydel(seq id no：211)，heef(seq id no：212)，heel(seq id no：213)，keel(seq id no：214)，reel(seq id no：215)，kael(seq id no：216)，kcel(seq id no：217)，kfel(seq id no：218)，kgel(seq id no：219)，khel(seq id no：220)，klel(seq id no：221)，knel(seq id no：222)，kqel(seq id no：223)，krel(seq id no：224)，ksel(seq id no：225)，kvel(seq id no：226)，kwel(seq id no：227)，kyel(seq id no：228)，kedl(seq id no：229)，kiel(seq id no：230)，dkel(seq id no：231)，fdel(seq id no：232)，kdef(seq id no：233)，kkel(seq id no：234)，hadl(seq id no：235)，hael(seq id no：236)，hiel(seq id no：237)，hnel(seq id no：238)，htel(seq id no：239)，ktel(seq id no：240)，hvel(seq id no：241)，ndel(seq id n0：242)，qdel(seq id no：243)，redl(seq id no：244)，rnel(seq id no：245)，rtdl(seq id no：246)，rtel(seq id no：247)，sdel(seq id no：248)，tdel(seq id no：249)，skel(seq id no：250)，stel(seq id no：251)和edel(seq id no：252)。在一些实施方案中，当引入细胞时，结合分子能够表现出大于第四结合分子的细胞毒性，所述第四结合分子由结合分子组成，除了它不包含kdel家族的任何羧基末端内质网保留/回收信号基序(参见seq id no：205-252)。在一些实施方案中，与参考分子(例如第四结合分子)相比，结合分子能够表现出具有更好优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如4倍、5倍、6倍、9倍或更高的细胞毒性。在一些实施方案中，结合分子对靶阳性细胞群的细胞毒性是第四结合分子对第二靶阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大，如通过cd
50
值测定。
[0636]
实施例组#2-包含志贺菌毒素效应多肽的结合分子，所述志贺菌毒素效应多肽包含(i)嵌入的或插入的异源t细胞表位和(ii)被破坏的弗林蛋白酶切割基序
[0637]
本文还提供了结合分子，所述结合分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子(pd-l1)的结合区；(ii)志贺菌毒素效应多肽，所述志贺菌毒素效应多肽包含插入或嵌入的异源表位；和(iii)被破坏的弗林蛋白酶切割基序。在一些实施方案中，细胞结合分子包含(i)能够特异性结合细胞外靶生物分子的结合区；(ii)志贺菌毒素效应多肽，所述志贺菌毒素效应多肽包含(a)插入或嵌入的异源表位；(b)具有羧基末端的志贺菌毒素a1片段衍生的区域；和(c)a1片段区的羧基末端的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。对于一些实施方案，志贺菌毒素效应多肽能够表现出至少一种志贺菌毒素效应子功能，例如，指导细胞内按路线发送至存在多肽的细胞的内质网和/或胞质溶胶，抑制核糖体功能，使核糖体酶失活，引起白细胞郁滞，和/或引起细胞毒性。在一些实施方案中，异源t细胞表位是cd8 t细胞表位，例如关于人免疫系统的cd8 t细胞表位。对于一些实施方案，异源t细胞表位能够由细胞的mhc i类分子呈递。在一些实施方案中，细胞结合分子能够具有以下一项或多项：进入细胞，抑制核糖体功能，引起白细胞郁滞，引起细胞死亡，和/或将嵌入或插入的异源t细胞表位递送至mhc i类分子以呈递在细胞表面上。对于一些实施方案，当引入细胞时，结合分子能够表现出与参考分子相当或更好的细胞毒性，所述参考分子例如由结合分子组成的第
二结合分子，除了其所有志贺菌毒素效应多肽组分在其al片段区的羧基末端包含野生型志贺菌毒素弗林蛋白酶切割位点。
[0638]
在实施方案组#2的一些实施方案中，嵌入或插入的异源t细胞表位破坏选自由以下组成的组的天然定位的志贺菌毒素a亚基区的内源b细胞和/或t细胞表位区：(i) seq id no：1或seq id no：2的1-15；seq id no：3的3-14；seq id no：3的26-37；seq id no：1或seq id no：2的27-37；seq id no：1或seq id no：2的39-48；seq id no：3的42-48；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的53-66，或志贺菌毒素a亚基或其衍生物中的等效区域；(ii)seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的94-115；seq id no：1或seq id no：2的141-153；seq id no：3的40-156；seq id no：1或seq id no：2的179-190；seq id no：3的179-191；seq id no：3的204；seq id no：1或seq id no：2的205；seq id no：3的210-218；和(iii)seq id no：3的240-260；seq id no：1或seq id no：2的243-257；seq id no：1或seq id no：2的254-268；seq id no：3的262-278；seq id no：3的281-297；seq id no：1或seq id no：2的285-293，或志贺菌毒素a亚基或其衍生物中的等效区域。
[0639]
在实施方案组#2的一些实施方案中，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺菌毒素a亚基的至少一个突变，所述突变改变天然定位于志贺样毒素1(seq id no：1)或志贺菌毒素(seq id no：2)的a亚基的248-251，或在志贺样毒素2(seq id no：3)的a亚基的247-250处的区域；或志贺毒素a亚基或其衍生物中的等效区域中的至少一个氨基酸残基。在一些实施方案中，相对于野生型志贺菌毒素a亚基，被破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点中包含一个或多个突变。在一些实施方案中，最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列r/y-x-x-r和/或r-x-x-r表示。
[0640]
在实施方案组#2的一些实施方案中，结合分子包含位于志贺菌毒素a1片段区的羧基末端的羧基末端的分子部分。
[0641]
在实施方案组#2的一些实施方案中，结合区空间上覆盖a1片段区的羧基末端。
[0642]
在实施方案组#2的一些实施方案中，分子部分空间上覆盖a1片段区的羧基末端。在一些实施方案中，分子部分包含结合区。
[0643]
在实施方案组#2的一些实施方案中，结合分子包含位于志贺菌毒素a1片段区的羧基末端的羧基末端的结合区和/或分子部分。在一些实施方案中，结合区和/或分子部分的质量为至少4.5kda、6kda、9kda、12kda、15kda、20kda、25kda、28kda、30kda、41kda、50kda、100kda或更大。
[0644]
在实施方案组#2的一些实施方案中，结合分子包含质量为至少4.5kda、6kda、9kda、12kda、15kda、20kda、25kda、28kda、30kda、41kda、50kda、100kda或更大的结合区，只要结合分子保持本文所述的志贺菌毒素生物学活性的适当水平(例如，细胞毒性和/或细胞内按路线发送)。
[0645]
在实施方案组#2的一些实施方案中，结合区包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包括例如质量为至少4.5kda、6kda、9kda、12kda、15kda、20kda、25kda、28kda、30kda、41kda、50kda、100kda或更大的分子部分，只要结合分子保持本文所述志贺菌毒素生物学活性的适当水平。
[0646]
在实施方案组#2的一些实施方案中，相对于野生型志贺菌毒素a亚基，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基置换。在一些实施方案中，
37；seq id no：1或seq id no：2的27-37；seq id no：1或seq id no：2的39-48；seq id no：3的42-48；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的53-66；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的94-115；seq id no：1或seq id no：2的141-153；seq id no：3的140-156；seq id no：1或seq id no：2的179-190；seq id no：3的179-191；seq id no：3的204；seq id no：1或seq id no：2的205，和seq id no：3的210-218；seq id no：3的240-260；seq id no：1或seq id no：2的243-257；seq id no：1或seq id no：2的254-268；seq id no：3的262-278；seq id no：3的281-297；seq id no：1或seq id no：2的285-293；seq id no：1或seq id no：2的4-33；seq id no：1或seq id no：2的34-78；seq id no：1或seq id no：2的77-103；seq id no：1或seq id no：2的128-168；seq id no：1或seq id no：2的160-183；seq id no：1或seq id no：2的236-258；seq id no：1或seq id no：2的274-293；或志贺菌毒素a亚基或其衍生物中的等效区域。在一些实施方案中，没有破坏是与至少一个被破坏的内源性b细胞和/或t细胞表位和/或表位区的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基末端截短。
[0654]
在实施方案组#3的一些实施方案中，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺菌毒素a亚基的至少一个突变，所述突变改变天然定位于志贺样毒素1(seq id no：1)或志贺菌毒素(seq id no：2)的a亚基的248-251，或在志贺样毒素2(seq id no：3)的a亚基的247-250处；或志贺毒素a亚基或其衍生物中的等效区域中的至少一个氨基酸残基。在一些实施方案中，相对于野生型志贺菌毒素a亚基，被破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点中包含一个或多个突变。在一些实施方案中，最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列r/y-x-x-r和/或r-x-x-r表示。
[0655]
在实施方案组#3的一些实施方案中，结合分子包含位于志贺菌毒素a1片段区的羧基末端的羧基末端的分子部分。
[0656]
在实施方案组#3的一些实施方案中，结合区空间上覆盖a1片段区的羧基末端。
[0657]
在实施方案组#3的一些实施方案中，分子部分空间上覆盖a1片段区的羧基末端。在一些实施方案中，分子部分包含结合区。
[0658]
在实施方案组#3的一些实施方案中，结合分子包含位于志贺菌毒素a1片段区的羧基末端的羧基末端的结合区和/或分子部分。在一些实施方案中，结合区和/或分子部分的质量为至少4.5kda、6kda、9kda、12kda、15kda、20kda、25kda、28kda、30kda、41kda、50kda、100kda或更大。
[0659]
在实施方案组#3的一些实施方案中，结合分子包含质量为至少4.5kda、6kda、9kda、12kda、15kda、20kda、25kda、28kda、30kda、41kda、50kda、100kda或更大的结合区，只要结合分子保持本文所述的志贺菌毒素生物学活性的适当水平(例如，细胞毒性和/或细胞内按路线发送)。
[0660]
在实施方案组#3的一些实施方案中，结合区包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包括例如质量为至少4.5kda、6kda、9kda、12kda、15kda、20kda、25kda、28kda、30kda、41kda、50kda、100kda或更大的分子部分，只要结合分子保持本文所述志贺菌毒素生物学活性的适当水平。
[0661]
在实施方案组#3的一些实施方案中，相对于野生型志贺菌毒素a亚基，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基置换。在一些实施方案中，
id no：245)，rtdl(seq id no：246)，rtel(seq id no：247)，sdel(seq id no：248)，tdel(seq id no：249)，skel(seq id no：250)，stel(seq id no：251)和edel(seq id no：252)。在一些实施方案中，当引入细胞时，结合分子能够表现出大于参考分子的细胞毒性，所述参考分子例如由结合分子组成的第六结合分子，除了它不包含kdel家族的任何羧基末端内质网保留/回收信号基序(参见seq id no：205-252)。在一些实施方案中，与参考分子相比，结合分子能够表现出具有更好优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如4倍、5倍、6倍、9倍或更高的细胞毒性，所述参考分子例如第六结合分子。在一些实施方案中，结合分子对靶阳性细胞群的细胞毒性是第六结合分子对第二靶阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大，如通过cd
s0
值测定的。
[0670]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽还包含至少一个插入或嵌入的异源表位。
[0671]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽还包含至少一个、两个或三个被破坏的内源性b细胞和/或cd4 t细胞表位区。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含至少一个、两个或三个内源性b细胞和/或t细胞表位和/或表位区的破坏。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽进一步包含至少一个被破坏的内源性b细胞和/或cd4 t细胞表位区，其不与至少一个插入或嵌入的异源表位重叠。
[0672]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽的氨基末端在结合分子的多肽组分的氨基末端处和/或邻近结合分子的多肽组分的氨基末端。在一些实施方案中，相对于志贺菌毒素效应多肽，结合区不靠近结合分子的氨基末端。在一些实施方案中，结合区和志贺菌毒素效应多肽在结合分子内物理排列或定向，使得结合区不位于志贺菌毒素效应多肽的氨基末端附近。在一些实施方案中，结合区位于结合分子内，与志贺菌毒素效应多肽的氨基末端相比更接近志贺菌毒素效应多肽的羧基末端。对于一些实施方案，结合分子没有细胞毒性，并且当被引入细胞时，与参考分子的细胞毒性相比，能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更大的亚细胞按路线发送效率，所述参考分子例如第七结合分子，所述第七结合分子具有氨基末端并包含结合区和志贺菌毒素效应多肽，所述志贺菌毒素效应多肽不位于或靠近氨基末端。对于一些实施方案，与第七结合分子的细胞毒性相比，结合分子表现出具有更好优化的细胞毒性效力的细胞毒性，例如4倍、5倍、6倍、9倍或更大的细胞毒性。对于一些实施方案，结合分子对靶阳性细胞群的细胞毒性是第七结合分子对第二靶阳性细胞群的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大，如通过cd
50
值测定的。在一些实施方案中，第七细胞结合分子不包含kdel家族的任何羧基末端内质网保留/回收信号基序(参见seq id no：205-252)。
[0673]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽进一步包含选自由以下组成的组的天然定位的志贺毒素a亚基区的b细胞和/或t细胞表位区的破坏：seq id no：1或seq id no：2的1-15；seq id no：3的3-14；seq id no：3的26-37；seq id no：1或seq id no：2的27-37；seq id no：1或seq id no：2的39-48；seq id no：3的42-48；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的53-66；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的94-115；seq id no：1或seq id no：2的141-153；seq id no：3的140-156；seq id no：1或seq id no：2的179-190；seq id no：3的179-191；seq id no：3的204；seq id no：1或seq id no：2的205，和seq id no：3的210-218；seq id no：3的240-260；seq id no：1或seq id no：
2的243-257；seq id no：1或seq id no：2的254-268；seq id no：3的262-278；seq id no：3的281-297；seq id no：1或seq id no：2的285-293；seq id no：1或seq id no：2的4-33；seq id no：1或seq id no：2的34-78；seq id no：1或seq id no：2的77-103；seq id no：1或seq id no：2的128-168；seq id no：1或seq id no：2的160-183；seq id no：1或seq id no：2的236-258；seq id no：1或seq id no：2的274-293；或志贺菌毒素a亚基或其衍生物中的等效区域。在一些实施方案中，没有破坏是与至少一个被破坏的内源性b细胞和/或t细胞表位和/或表位区的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基末端截短。
[0674]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，相对于野生型志贺毒素a亚基，志贺毒素效应多肽在选自天然定位的组的志贺菌毒素a亚基氨基酸残基的b细胞免疫原性氨基酸残基中进一步包含突变：l49、d197、d198、r204和r205。
[0675]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，嵌入或插入的异源t细胞表位破坏选自由以下组成的组的天然定位的志贺菌毒素a亚基区的内源b细胞和/或t细胞表位区：(i)seq id no：1或seq id no：2的1-15；seq id no：3的3-14；seq id no：3的26-37；seq id no：1或seq id no：2的27-37；seq id no：1或seq id no：2的39-48；seq id no：3的42-48；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的53-66；或志贺菌毒素a亚基或其衍生物中的等效区域，其中不存在其是与至少一个被破坏的表位区的部分或全部重叠的序列的氨基末端截短的破坏；(ii)seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的94-115；seq id no：1或seq id no：2的141-153；seq id no：3的140-156；seq id no：1或seq id no：2的179-190；seq id no：3的179-191；seq id no：3的204；seq id no：1或seq id no：2的205；seq id no：3的210-218；和(iii)seq id no：3的240-260；seq id no：1或seq id no：2的243-257；seq id no：1或seq id no：2的254-268；seq id no：3的262-278；seq id no：3的281-297；seq id no：1或seq id no：2的285-293；或志贺菌毒素a亚基或其衍生物中的等效区域。
[0676]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽在选自以下组的天然定位的志贺菌毒素a亚基区的b细胞和/或t细胞表位区中包含相对于野生型志贺毒素a亚基的突变：(i)seq id no：1或seq id no：2的1-15；seq id no：3的3-14；seq id no：3的26-37；seq id no：1或seq id no：2的27-37；seq id no：1或seq id no：2的39-48；seq id no：3的42-48；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的53-66；或志贺菌毒素a亚基或其衍生物中的等效区域，其中不存在其是与至少一个被破坏的表位区的部分或全部重叠的序列的氨基末端截短的破坏；(ii)seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的94-115；seq id no：1或seq id no：2的141-153；seq id no：3的140-156；seq id no：1或seq id no：2的179-190；seq id no：3的179-191；seq id no：3的204；seq id no：1或seq id no：2的205；seq id no：3的210-218；和(iii)seq id no：3的240-260；seq id no：1或seq id no：2的243-257；seq id no：1或seq id no：2的254-268；seq id no：3的262-278；seq id no：3的281-297；和seq id no：1或seq id no：2的285-293；或志贺菌毒素a亚基或其衍生物中的等效区域，其中不存在其是与至少一个被破坏的表位区的部分或全部重叠的序列的氨基末端截短的破坏。
[0677]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含至少一个内源性表位区的破坏，所述至少一个内源性表位区选自由以下天然定位的志贺菌毒素a亚基组成的组：seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的94-115；seq id no：1或seq id no：2
的141-153；seq id no：3的140-156；seq id no：1或seq id no：2的179-190；seq id no：3的179-191；seq id no：3的204；seq id no：1或seq id no：2的205；或seq id no：3的210-218。
[0678]
在实施方案#1至#3的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含至少四个、五个、六个、七个、八个或更多个内源性b细胞和/或t细胞表位区的破坏。
[0679]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，一个或多个破坏包括相对于野生型志贺菌毒素a亚基的氨基酸残基置换。
[0680]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，一个或多个内源性b细胞和/或t细胞表位区，相对于野生型志贺毒素a亚基，包含多个氨基酸残基置换。
[0681]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，至少一个、两个、三个或四个破坏相对于野生型志贺菌毒素a亚基，包含在内源、b细胞和/或t细胞表位区中的多个氨基酸残基置换。
[0682]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，至少一个破坏相对于野生型志贺菌毒素a亚基，包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个氨基酸残基置换，并且任选地其中至少一个置换发生在选自由以下组成的组的天然定位的志贺菌毒素a亚基氨基酸残基：seq id no：1或seq id no：2的1；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的4；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的6；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的8；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的9；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的11；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的12；seq id no：1或seq id no：2的33；seq id no：1或seq id no：2的43；seq id no：1或seq id no：2的44；seq id no：1或seq id no：2的45；seq id no：1、seq id no：2或seq iid no：3的46；seq id no：1或seq id no：2的47；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的48；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的49；seq id no：1或seq id no：2的50；seq id no：1或seq id no：2的51；seq id no：1或seq id no：2的53；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的54；seq id no：1或seq id no：2的55；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的56；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的57；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的58；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的59；seq id no：1或seq id no：2的60；seq id no：1或seq id no：2的61；seq id no：1或seq id no：2的62；seq id no：1或seq id no：2的84；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的88；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的94；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的96；seq id no：1或seq id no：2的104；seq id no：1或seq id no：2的105；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的107；seq id no：1或seq id no：2的108；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的109；seq id no：1或seq id no：2的110；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的111；seq id no：1、seq id no：2或seq id n0：3的112；seq id no：1、seq id n0：2或seq id n0：3的141；seq id n0：1、seq id n0：2或seq id no：3的47；seq id n0：1或seq id n0：2的154；seq id n0：1、seq id n0：2或seq id n0：3的179；seq id n0：1或seq id n0：2的180；seq id no：1或seq id no：2的181；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的183；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的184；seq id no：1或seq id no：2的185；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的186；seq id no：1或seq id no：2的187；seq id no：1或seq id no：2的188；seq id no：1或seq id no：2的189；seq id no：3的197；seq id no：1或seq id no：2的198；seq id no：3
的204；seq id no：1或seq id no：2的205；seq id no：1或seq id no：2的247；seq id no：3的247；seq id no：1或seq id no：2的248；seq id no：3的250；seq id no：1或seq id no：2的251；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的264；seq id no：1或seq id no：2的265；和seq id no：1或seq id no：2的286；或志贺菌毒素a亚基或其衍生物中的等效氨基酸残基。在一些实施方案中，至少两个破坏各自包含相对于野生型志贺菌毒素a亚基的选自由以下组成的组的至少一个氨基酸残基置换：seq id no：1或seq id n0：2的1；seq id n0：1、seq id no：2或seq id no：3的4；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的8；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的9；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的11；seq id no：1或seq id no：2的33；seq id no：1或seq id no：2的43；seq id no：1或seq id n0：2的45；seq id no：1或seq id no：2的47；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的48；seq id no：1或seq id no：2的49；seq id no：1或seq id no：2的53；seq id no：1或seq id no：2的55；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的58；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的59；seq id no：1或seq id no：2的60；seq id no：1或seq id no：2的61；seq id no：1或seq id no：2的62；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的94；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的96；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的109；seq id no：1或seq id no：2的110；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的112；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的147；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的179；seq id no：1或seq id no：2的180；seq id no：1或seq id no：2的181；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的183；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的184；seq id no：1或seq id no：2的185；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的186；seq id no：1或seq id no：2的187；seq id no：1或seq id no：2的188；seq id no：1或seq id no：2的189；seq id no：3的204；seq id no：1或seq id no：2的205；seq id n0：1或seq id no：2的247；seq id no：3的247；seq id no：3的250；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的264；seq id no：1或seq id no：2的265；和seq id no：1或seq id no：2的286；或志贺毒素a亚基或其衍生物中的等效氨基酸残基。
[0683]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含至少三个选自由以下组成的组的内源性b细胞和/或t细胞表位区的破坏：(i)seq id no：1或seq id no：2的1-15；seq id no：3的3-14；seq id no：3的26-37；seq id no：1或seq id no：2的27-37；seq id no：1或seq id no：2的39-48；seq id no：3的42-48；seq ii)no：1、seq id no：2或seq id no：3的53-66；或志贺菌毒素a亚基或其衍生物中的等效区域，其中不存在其是与至少一个被破坏的内源性b细胞和/或t细胞表位区的部分或全部重叠的氨基酸残基的氨基末端截短的破坏；(ii)seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的94-115；seq id no：1或seq id no：2的141-153；seq id no：3的140-156；seq id no：1或seq id no：2的179-190；seq id no：3的179-191；seq id no：3的204；seq id no：1或seq id no：2的205；seq id no：3的210-218；和(iii)seq id no：3的240-260；seq id n0：1或seq id no：2的243-257；seq id no：1或seq id no：2的254-268；seq id no：3的262-278；seq id no：3的281-297；和seq id no：1或seq id no：2的285-293；或志贺菌毒素a亚基或其衍生物中的等效区域，其中不存在其是与至少一个被破坏的b细胞和/或t细胞表位区的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基末端截短的破坏。
[0684]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，志贺毒素效应多肽包含至少两个内源性b细胞和/或t细胞表位区的破坏，其中每个破坏包含一个或多个氨基酸残基置换，并且其中内源性、b-细胞和/或t-细胞表位区选自由以下组成的组的天然定位的志贺菌毒素a亚基区：seq id no：3的3-14；seq id no：3的26-37；seq id no：1或seq id no：2的27-37；seq id no：1或seq id no：2的39-48；seq id no：3的42-48；seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的53-66；或志贺菌毒素a亚基或其衍生物中的等效区域。
[0685]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，嵌入或插入的异源t细胞表位不破坏本文所述的任何内源性b细胞和/或cd4 t细胞表位区。
[0686]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，至少一个破坏包括相对于野生型志贺毒素a亚基的选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸残基置换：d到a、d到g、d到v、d到l、d到i、d到f、d到s、d到q、d到m、d到r、e到a、e到g、e到v、e到l、e到i、e到f、e到s、e到q、e到n、e到d、e到m、e到r、f到a、f到g、f到v、f到l、f到i、g到a、g到p、h到a、h到g、h到v、h到l、h到i、h到f、h到m、i到a、i到v、i到g、i到c、k到a、k到g、k到v、k到l、k到i、k到m、k到h、l到a、l到v、l到g、l到c、n到a、n到g、n到v、n到l、n到i、n到f、p到a、p到g、p到f、r到a、r到g、r到v、r到l、r到i、r到f、r到m、r到q、r到s、r到k、r到h、s到a、s到g、s到v、s到l、s到i、s到f、s到m、t到a、t到g、t到v、t到l、t到i、t到f、t到m、t到s、v到a、v到g、y到a、y到g、y到v、y到l、y到i、y到f、y到m和y到t。在一些实施方案中，相对于野生型志贺菌毒素a亚基的一个或多个氨基酸残基置换选自由以下组成的组：d到a、d到g、d到v、d到l、d到i、d到f、d到s、d到q、e到a、e到g、e到v、e到l、e到i、e到f、e到s、e到q、e到n、e到d、e到m、e到r、g到a、h到a、h到g、h到v、h到l、h到i、h到f、h到m、k到a、k到g、k到v、k到l、k到i、k到m、k到h、l到a、l到g、n到a、n到g、n到v、n到l、n到i、n到f、p到a、p到g、p到f、r到a、r到g、r到v、r到l、r到i、r到f、r到m、r到q、r到s、r到k，r到h、s到a、s到g、s到v、s到l、s到i、s到f、s到m、t到a、t到g、t到v、t到l、t到i、t到f、t到m、t到s、y到a、y到g、y到v、y到l、y到i、y到f和y到m。
[0687]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，至少一个破坏包括相对于野生型志贺菌毒素a亚基的选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸残基置换：k1到a、g、v、l、i、f、m和h；t4到a、g、v、l、i、f、m和s；d6到a、g、v、l、i、f、s、q和r；s8到a、g、v、i、l、f和m；t9到a、g、v、i、l、f、m和s；s9到a、g、v、l、i、f和m；k11到a、g、v、l、i、f、m和h；t12到a、g、v、i、l、f、m、s和k；s12到a、g、v、i、l、f和m；s33到a、g、v、l、i、f、m和c；s43到a、g、v、l、i、f和m；g44到a或l；s45到a、g、v、l、i、f和m；t45到a、g、v、l、i、f和m；g46到a和p；d47到a、g、v、l、i、f、s、m和q；n48到a、g、v、l、m和f；l49到a、v、c和g；y49到a、g、v、l、i、f、m和t；f50到a、g、v、l、i和t；a51；d53到a、g、v、l、i、f、s和q；v54到a、g、i和l；r55到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；g56到a和p；i57到a、g、v和m；l57到a、v、c、g、m和f；d58到a、g、v、l、i、f、s和q；p59到a、g和f；e60到a、g、v、l、i、f、s、q、n、d、m、t和r；e61到a、g、v、l、i、f、s、q、n、d、m和r；g62到a；r84到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；v88到a和g；i88到a、v、c和g；d94到a、g、v、l、i、f、s和q；s96到a、g、v、i、l、f和m；t104到a、g、v、l、i、f、m；和n；a105到l；t107到a、g、v、l、i、f、m和p；s107到a、g、v、l、i、f、m和p；l108到a、v、c和g；s109到a、g、v、i、l、f和m；t109到a、g、v、i、l、f、m和s；g110到a；s112到a、g、v、l、i、f和m；d111到a、g、v、l、i、f、s、q和t；s112到a、g、v、l、i、f和m；d141到a、g、v、l、i、f、s和q；g147到a；v154到a和g；r179到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；t180到a、g、v、l、i、f、m和s；t181到a、g、v、l、i、f、m和s；d183到a、g、v、l、i、f、s和q；d184到a、g、v、l、i、f、s和q；l185到a、g、v和c；s186到a、g、
v、i、l、f和m；g187到a；r188到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；s189到a、g、v、i、l、f和m；d197到a、g、v、l、i、f、s和q；d198到a、g、v、l、i、f、s和q；r204到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；r205到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；s247到a、g、v、i、l、f和m；y247到a、g、v、l、i、f和m；r248到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；r250到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；r251到a、g、v、l、i、f、m、q、s、k和h；d264到a、g、v、l、i、f、s和q；g264到a；和t286到a、g、v、l、i、f、m和s。
[0688]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，在被引入脊索动物时，与参考分子相比，结合分子能够表现出改善的体内耐受性和/或稳定性，所述参考分子例如由结合分子组成的第二十四结合分子，除了其所有志贺毒素效应多肽组分每个均包含野生型志贺菌毒素a1片段和/或在其a1片段区的羧基末端包含野生型志贺菌毒素弗林蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽不是细胞毒性的并且分子部分是细胞毒性的。
[0689]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，结合区和志贺毒素效应多肽直接或间接连接在一起。
[0690]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，结合区包含至少一种肽和/或多肽。在一些实施方案中，结合区是或包含免疫球蛋白型结合区。在一些实施方案中，结合区包含选自由以下组成组的多肽：自主vh结构域、单域抗体片段(sdab)、纳米抗体、源自骆驼科动物的重链抗体结构域(vhh或vh结构域片段)、源自软骨鱼的重链抗体结构域(vhh或vh结构域片段)、免疫球蛋白新抗原受体(ignar)、v
nar
片段、单链可变片段(scfv)、抗体可变片段(fv)、互补决定区3片段(cdr3)、受限的fr3-cdr3-fr4多肽(fr3-cdr3-fr4)、fd片段、小模块化免疫药物(smip)结构域、抗原结合片段(fab)、犰狳重复多肽(armrp)、纤连蛋白衍生的第10个纤连蛋白iii型结构域(10fn3)、生腱蛋白iii型结构域(tnfn3)、锚蛋白重复基序序域、低密度脂蛋白受体衍生的a结构域(ldlr-a)、脂质运载蛋白(anticalin)、kunitz结构域、蛋白质a衍生的z结构域、γ-b晶状体蛋白衍生结构域、泛素衍生结构域、sac7d衍生多肽(affitin(亲和素))、fyn衍生的sh2结构域、小蛋白、c型凝集素样结构域支架、工程化抗体模拟物以及任何上述任何保留结合功能的任何基因操作的对应物。
[0691]
在实施方案组#1到#3的一些实施方案中，结合分子能够表现出(i)与野生型志贺菌毒素a1片段或野生型志贺菌毒素效应多肽相当的催化活性水平，(ii)具有半数最大抑制浓度(ic
50
)值为10,000皮摩尔或更低的核糖体抑制活性，和/或(iii)显著水平的志贺菌毒素催化活性。
[0692]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，结合分子和/或其志贺菌毒素效应多肽能够表现出与参考结合分子相当的亚细胞按路线发送效率和/或能够表现出从细胞的内体起始位置到内质网和/或胞质溶胶的显著水平的细胞内按路线发送活性，所述参考结合分子包含野生型志贺菌毒素a1片段或野生型志贺菌毒素效应多肽。
[0693]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，由此将结合分子施用于与结合分子的结合区的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞，结合分子能够引起细胞死亡。在一些实施方案中，将结合分子施用于在细胞外靶生物分子的存在或水平方面不同的两种不同细胞类型群体，结合分子能够对与细胞毒性结合分子的结合区的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型引起细胞死亡，其cd
50
至少三倍或小于对未与结合分子的结合区的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞类型的cd
50
。在一些实施方案中，由此将结合分子施用至第一细胞群和第二细胞群，所述第一细胞群的成员与结合分子结合区的细胞外靶生物分子物理偶联，所述第二
细胞群的成员未与结合区的任何细胞外靶生物分子物理偶联，相对于所述第二细胞群的成员，结合分子对所述第一细胞群的成员的细胞毒性作用至少大3倍。在一些实施方案中，由此将结合分子施用至第一细胞群和第二细胞群，所述第一细胞群的成员与显著量的结合分子结合区的细胞外靶生物分子物理偶联，所述第二细胞群的成员未与显著量的结合区的任何细胞外靶生物分子物理偶联，相对于所述第二细胞群的成员，结合分子对所述第一细胞群的成员的细胞毒性作用至少大3倍。在一些实施方案中，由此将结合分子施用至靶生物分子阳性细胞的第一群和第二细胞群，所述第二细胞群的成员在细胞表面不表达显著量的结合分子的结合区的靶生物分子，相对于第二细胞群的成员，结合分子对第一细胞群的成员的细胞毒性作用至少大3倍。
[0694]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，在被引入细胞时，结合分子能够表现出半数最大抑制浓度(cd
50
)值为300nm或更小的细胞毒性和/或能够表现出显著水平的志贺菌毒素的细胞毒性。
[0695]
在实施方案组#2至#11的一些实施方案中，结合分子能够将嵌入或插入的异源cd8 t细胞表位递送至细胞的mhc i类呈递途径，用于由mhc i类分子结合的表位的细胞表面呈递。
[0696]
在实施方案组#2至至至#11的一些实施方案中，结合分子包含与志贺菌毒素效应多肽的羧基末端相缔合的分子部分。在一些实施方案中，分子部分包含结合区或由结合区组成。在一些实施方案中，分子部分包含至少一个氨基酸并且志贺菌毒素效应多肽与分子部分的至少一个氨基酸残基连接。在一些实施方案中，分子部分和志贺菌毒素效应多肽融合形成连续的多肽。
[0697]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，结合分子进一步包含与志贺菌毒素效应多肽的羧基末端相缔合的细胞毒性分子部分。在一些实施方案中，细胞毒性分子部分是细胞毒性剂，例如技术人员已知的和/或在本文中描述的小分子化疗剂、抗肿瘤剂、细胞毒性抗生素、烷化剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。对于一些实施方案，细胞毒性分子部分在小于10,000、5,000、1,000、500或200pm的浓度下具有细胞毒性。
[0698]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，结合区通过至少一个不是二硫键的共价键直接或间接连接至志贺菌毒素效应多肽。在一些实施方案中，结合区直接或间接融合至志贺菌毒素效应多肽的羧基末端，以形成单个连续多肽。在一些实施方案中，结合区是免疫球蛋白型结合区。
[0699]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小的弗林蛋白酶切割位点中相对于野生型志贺菌毒素a亚基的一个或多个突变。在一些实施方案中，被破坏的弗林蛋白酶切割基序不是与最小弗林蛋白酶切割位点的至少一个氨基酸残基的部分或全部重叠的序列的氨基末端截短。在一些实施方案中，最小的弗林蛋白酶切割位点中的突变是r/y-x-x-r弗林蛋白酶切割基序中至少一个氨基酸残基的氨基酸缺失、插入和/或置换。在一些实施方案中，被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺菌毒素a亚基的至少一个突变，该突变改变天然定位于1)志贺样毒素1(seq id no：1)或志贺菌毒素(seq id no：2)的a亚基的248-251，或2)在志贺样毒素2(seq id no：3)的a亚基的247-250处或任何志贺毒素a亚基中的等效氨基酸序列位置的区域中的至少一个氨基酸残基。在一些实施方案中，突变是精氨酸残基被非带正电荷的氨基酸残基置换的氨基酸
残基置换。
[0700]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，结合分子在被引入细胞时，能够表现出与参考分子的细胞毒性相当的细胞毒性，所述参考分子例如由结合分子组成的第八结合分子，除了其志贺毒素效应多肽组分的每一个都包含野生型志贺菌毒素a1片段。
[0701]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，结合区包含或基本上由seq id no：85-107和156-157中任一项表示的多肽组成。
[0702]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，结合区空间上覆盖a1片段区的羧基末端。
[0703]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，分子部分空间上覆盖a1片段区的羧基末端。在一些实施方案中，分子部分包含结合区。
[0704]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，结合分子包含位于志贺菌毒素a1片段区的羧基末端的羧基末端的结合区和/或分子部分。在一些实施方案中，结合区和/或分子部分的质量为至少4.5kda、6kda、9kda、12kda、15kda、20kda、25kda、28kda、30kda、41kda、50kda、100kda或更大。
[0705]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，结合分子包含质量为至少4.5kda、6kda、9kda、12kda、15kda、20kda、25kda、28kda、30kda、41kda、50kda、100kda或更大的结合区，只要结合分子保持本文所述的志贺菌毒素生物学活性的适当水平(例如，细胞毒性和/或细胞内按路线发送)。
[0706]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，结合区包含在相对大的分子部分内，所述分子部分包括例如质量为至少4.5kda、6kda、9kda、12kda、15kda、20kda、25kda、28kda、30kda、41kda、50kda、100kda或更大的分子部分，只要结合分子保持本文所述志贺菌毒素生物学活性的适当水平。
[0707]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，结合分子表现出低细胞毒性效力(即，当被引入某些阳性靶细胞类型时，在结合分子浓度为1000nm、500nm、100nm、75nm、50nm时，不能表现出大于细胞群1％的细胞死亡的细胞毒性)，并且当被引入细胞时，与参考分子的细胞毒性相比，能够表现出从细胞外空间到内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的更大的亚细胞按路线发送效率，所述参考分子例如第九结合分子，所述第九结合分子具有氨基末端并包含结合区和志贺菌毒素效应多肽，所述志贺菌毒素效应多肽不位于或靠近氨基末端。在一些实施方案中，第九细胞结合分子不包含kdel家族的任何羧基末端内质网保留/回收信号基序(参见seq id no：205-252)。
[0708]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，在一些实施方案中，分子部分包含衍生自天然存在的志贺菌毒素的志贺菌毒素a2片段的肽和/或多肽。
[0709]
本文所述的实施方案不旨在涵盖任何天然存在的志贺菌全毒素或志贺菌毒素a亚基。在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，结合分子不包含天然存在的志贺菌毒素b亚基。在一些实施方案中，结合分子不包含任何多肽，所述多肽包含或基本上由天然志贺菌毒素b亚基的功能性结合结构域组成。相反，在结合分子的一些实施方案中，志贺菌毒素a亚基衍生区域在功能上与异源结合区域缔合以实现细胞靶向。
[0710]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含至少两个嵌入或插入的异源表位。
[0711]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽不包含相对于野生型志贺菌毒素a亚基选自以下组的氨基酸残基置换组：(1)r248h和r251h；(2)r248g和r251g；(3)a246g、s247a、a253g和s254a；(4)a246g、s247a、r248g、r251g、a253g和s254a。
[0712]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽不包含天然位于野生型志贺菌毒素a亚基中247-252的区域的缺失。在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽不包含天然位于野生型志贺菌毒素a亚基中245-247和253-255的区域中的缺失。
[0713]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽包含相对于志贺菌毒素家族成员的天然存在的a亚基的一个或多个突变，其改变志贺菌毒素效应多肽的酶活性，所述突变选自至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换。在一些实施方案中，相对于天然存在的a亚基的突变减少或消除志贺菌毒素效应多肽的细胞毒活性，但志贺菌毒素效应多肽保留至少一种其他志贺菌毒素效应子功能，例如促进细胞内化和/或将细胞内按路线发送引导至某个亚细胞区室。在一些实施方案中，相对于天然存在的a亚基的突变选自至少一个氨基酸残基置换，例如seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3中的a231e、r75a、y77s、y114s、e167d、r170a、r176k和/或w203a。
[0714]
在实施方案组#1至#3的一些实施方案中，志贺菌毒素效应多肽能够：(i)按路线发送至存在志贺菌毒素效应多肽的细胞的亚细胞区室，其选自以下：胞质溶胶、内质网和溶酶体；(ii)将表位从早期内体区室细胞内递送至存在志贺菌毒素效应多肽的细胞的蛋白酶体；和/或(iii)将表位从存在志贺菌毒素效应多肽的细胞的早期内体区室细胞内递送至mhc i类分子。在一些实施方案中，志贺毒素效应多肽能够细胞内递送cd 8 t细胞表位，以通过mhc i类分子呈递到存在志贺菌毒素效应多肽的细胞表面上。
[0715]
实施方案#4-包含抗体-毒素缀合物的结合分子
[0716]
本文提供了pd-l1结合分子的各种实施方案，其中每个pd-l1结合分子包含(1)至少一种毒素组分和(2)至少一个能够特异性结合pd-l1分子的细胞外部分的pd-l1结合区。在一些实施方案中，pd-l1结合分子包含药学活性毒素。在一些实施方案中，pd-l1结合分子与药学活性毒素缀合以形成“抗体药物缀合物”(adc)。
[0717]
在一些实施方案中，pd-l1结合分子包含(1)毒素和(2)包含抗pd-l1抗体的pd-l1结合区。在一些实施方案中，毒素是药学活性细胞毒素。在一些实施方案中，pd-l1结合分子是“抗体药物缀合物”(adc)，其中抗体和毒素组分如本文所述连接。如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白蛋白，即免疫球蛋白家族的多肽，或其抗原结合片段，其含有免疫特异性结合特定抗原的抗原结合位点，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、骆驼科抗体、人源化抗体或抗原结合抗体片段(例如fab、fv、scfv、sdab片段)。如本文所用，术语“缀合物”被广泛使用并且意指任何毒素剂与抗体的共价或非共价缔合，无论缔合方法如何。adc的毒素剂成分包括但不限于天然毒素、生物毒素、蛋白质毒素、毒液、细胞毒素、小分子毒素和衍生自上述任何物质的合成毒物。adc可用于治疗和诊断目的。
[0718]
在一些实施方案中，pd-l1结合区包含重链可变区(hvr-h)，所述重链可变区(hvr-h)包含三个cdr，每个与seq id no：22-24和27-32中的任一项具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id no：22-24和27-32中任一项所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，结合区进一步包括：(a)轻链可
变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，每个与seq id no：19、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：25和seq id no：26中的任一项具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id no：19、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：25和seq id no：26中任一项所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，结合区进一步包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，与seq id no：19、seq id no：20和seq id no：21具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id no：19、seq id no：20和seq id no：21中任一项所示的氨基酸序列组成。在某些其他进一步的实施方案中，结合区进一步包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，与seq id no：25、seq id no：20和seq id no：21具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id no：25、seq id no：20和seq id no：21中任一项所示的氨基酸序列组成。在某些其他进一步的实施方案中，结合区进一步包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，与seq id no：19、seq id no：20和seq id no：26具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；或基本上由seq id no：19、seq id no：20和seq id no：26中任一项所示的氨基酸序列组成。
[0719]
在一些实施方案中，结合区包括：(a)轻链可变区(hvr-l)，所述轻链可变区(hvr-l)包含三个cdr，每个cdr包含或基本上由seq id no：19、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：25和seq id no：26中任一项所示的氨基酸序列组成；和(b)重链可变区(hvr-h)，所述重链可变区(hvr-h)包含三个cdr，每个cdr包含或基本上由seq id no：22-24和27-32中任一项所示的氨基酸序列组成。
[0720]
在一些实施方案中，结合区包括：(a)轻链区，所述轻链区与seq id no：33、35-36和38中的任一项具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或基本上由seq id no：33、35-36和38中任一项的氨基酸序列组成；和/或(b)重链区，所述重链区与seq id no：34、37和39中的任一项具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或基本上由seq id no：34、37和39中任一项的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，结合区包含多肽，所述多肽与seq id no：85-107和156-157中的任一项具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或基本上由seq id no：85-107和156-157中任一项所示的多肽组成。在一些实施方案中，结合区是单链可变片段，例如由、包含或基本上由seq id no：85-107和156-157中任一项的多肽组成。
[0721]
在pd-l1结合分子的一些实施方案中，在向表达pd-l1的细胞施用pd-l1结合分子后，导致(i)pd-l1结合分子的毒素组分被细胞内化和(ii)细胞的死亡。对于一些实施方案，在向表达pd-l1的细胞施用pd-l1结合分子后，导致(i)pd-l1结合分子被细胞内化和(ii)由于催化活性的毒素组分，细胞死亡。在一些实施方案中，实施方案组#4的pd-l1结合分子在被引入细胞时，能够表现出具有500nm、100nm、50nm、10nm、1nm或更小的半数最大抑制浓度(cd
50
)值的细胞毒性。
[0722]
在pd-l1结合分子的一些实施方案中，pd-l1结合区是全长抗体、双特异性抗体、双可变结构域抗体、多链或单链抗体和/或特异性结合人pd-l1的抗体片段的形式，包括但不
限于fab、fab
′
、(fab
′
)2、fv、scfv(单链fv)、单域抗体(例如来源于骆驼科或软骨鱼的重链抗体结构域片段)、替代抗体(surrobody)(包括替代的轻链构建体)、骆驼科抗体、人源化抗体等。pd-l1结合区可以是或衍生自任何抗体同种型，包括例如iga(例如iga1、iga2或siga)、igd、ige、igg(例如igg1、igg2、igg3或igg4)，或igm。pd-l1结合区可以是或衍生自任何物种的任何抗体，包括但不限于哺乳动物来源的物种(例如，猿、啮齿动物、山羊和兔)。pd-l1结合区可包含改变抗体和/或抗原结合片段性质的修饰和/或突变，例如增加半衰期、增加或减少adcc、cdc、pd-l1拮抗作用、pd-l1激动剂活性等，如本领域已知的。
[0723]
在一些实施方案中，结合分子进一步包含另外的外源物质，其可以存在以递送至靶细胞。在一些实施方案中，另外的外源物质直接或间接地与结合分子缔合、连接和/或偶联。
[0724]
在一些实施方案中，结合分子进一步包含检测促进剂。在一些实施方案中，检测促进剂直接或间接地与结合分子缔合、连接和/或偶联。
[0725]
在一些实施方案中，结合区不是多特异性或双特异性的，即pd-l1结合区是单特异性的。在一些实施方案中，pd-l1结合分子能够特异性结合pd-l1分子的细胞外部分，但缺乏与任何其他细胞表面靶标的高亲和力和特异性结合，即pd-l1结合分子能够表现出与pd-l1和/或pd-l1分子细胞外部分内的单个表位单特异性结合。在一些实施方案中，pd-l1结合分子仅包含一个免疫球蛋白型结合区，该结合区能够表现出与存在于细胞的细胞表面上的pd-l1的特异性和高亲和力结合，即每个分子单个抗原结合位点提供单特异性结合特征。在实施方案组#1至#4的一些实施方案中，pd-l1结合分子仅包含一种免疫球蛋白型结合区，其能够表现出与存在于细胞的细胞表面上的pd-l1的特异性和高亲和力结合，即单个抗原结合位点的两个或更多个相同拷贝，例如其中pd-l1结合分子表现出多价pd-l1结合特征但在结合pd-l1时仅具有单特异性。
[0726]
本文还提供了药物组合物，其包含上述结合分子的任一种和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
[0727]
本文还提供了诊断组合物，其包含上述结合分子的任一种和检测促进剂的。一些实施方案是结合分子，其中检测促进剂是异源表位并且结合分子包含异源表位。
[0728]
除了结合分子及其组合物，本文还提供了能够编码结合分子的多核苷酸，以及包含多核苷酸的表达载体和包含任何多核苷酸和/或表达载体的宿主细胞。包含表达载体的宿主细胞可用于例如通过重组表达产生本文所述分子或其多肽组分或片段的方法中。
[0729]
本文还提供了杀死细胞(例如表达pd-l1的细胞)的方法，该方法包括使细胞与本文所述的任何上述结合分子或上述药物组合物接触的步骤。在一些实施方案中，接触细胞的步骤在体外发生。在某些其他实施方案中，接触细胞的步骤在体内发生。在细胞杀死方法的一些实施方案中，当接触在结合分子的结合区的细胞外靶生物分子的细胞外存在和/或表达水平方面不同的细胞混合物时，该方法能够选择性地杀死细胞和/或细胞类型，优先于其他细胞和/或细胞类型。
[0730]
本文还提供了抑制pd-l1/pd1相互作用和/或下游信号传导的方法，该方法包括使表达pd-l1的细胞与本文所述的任何上述结合分子或上述药物组合物接触的步骤。在一些实施方案中，接触细胞的步骤在体外发生。在某些其他实施方案中，接触细胞的步骤在体内发生。
[0731]
本文还提供了同时抑制pd-l1/pd1相互作用和诱导表达pd-l1的细胞死亡的方法，该方法包括使表达pd-l1的细胞与任何上述结合分子或上述药物组合物接触的步骤。在一些实施方案中，接触细胞的步骤在体外发生。在某些其他实施方案中，接触细胞的步骤在体内发生。
[0732]
在一些实施方案中，治疗疾病、紊乱或病症的方法包括向需要其的受试者施用有效量的pdl-1结合分子或包含该分子的药物组合物。在一些实施方案中，癌症是以下任一种：膀胱癌(例如，尿路上皮癌)、乳腺癌(例如，her2阳性乳腺癌、三阴性乳腺癌)、结肠癌(例如，结肠直肠癌，例如转移性微卫星不稳定性-高或错配修复缺陷型结直肠癌)、子宫内膜癌、食道癌、输卵管癌、胃肠道癌(如胃癌、胆道肿瘤、胃食管结合部癌)、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(如头颈部鳞状细胞癌癌)、肾癌(例如肾细胞癌)、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌)、淋巴瘤(例如，弥漫性大b细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤)、梅克尔细胞癌、间皮瘤(如胸膜间皮瘤)、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)、鼻咽癌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜肿瘤、前列腺癌、皮肤癌(例如，皮肤鳞状细胞癌、黑色素瘤、移行细胞癌或尿路上皮癌。
[0733]
在一些实施方案中，治疗患者的疾病、紊乱和/或病症的方法包括向需要其的患者施用治疗有效量的结合分子和/或药物组合物的步骤。在一些实施方案中，待使用方法治疗的疾病、紊乱或病症选自：癌症、肿瘤、生长异常、免疫紊乱或微生物感染。在这些方法的一些实施方案中，待治疗的癌症选自由以下组成的组：肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤和乳腺癌。在这些方法的一些实施方案中，待治疗的免疫紊乱是与选自由以下组成的组的疾病相关的免疫紊乱：风湿病、脊柱炎、淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、桥本氏甲状腺炎、溶血性尿毒症综合征、hiv相关疾病、红斑狼疮、多发性硬化症、结节性多动脉炎、多发性关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、感染性休克、肖格伦氏综合征、溃疡性结肠炎和血管炎。
[0734]
结合分子的某些实施方案可用于将另外的外源物质递送到与结合分子的细胞外靶生物分子物理偶联的细胞中。此外，本公开提供了用于将外源物质递送至细胞内部的方法，包括使细胞在体外或体内与结合分子、药物组合物和/或诊断组合物接触。还提供了用于将外源物质递送至患者的细胞内部的方法，该方法包括向患者施用结合分子(具有或不具有细胞毒活性)的步骤，其中靶细胞与结合分子的细胞外靶生物分子物理偶联。
[0735]
本文还提供了将能够由细胞的mhc i类分子呈递的t细胞表位递送到细胞中的方法，该方法包括使细胞与结合分子接触的步骤，所述结合分子与异源结合的t细胞表位和/或其组合物(例如，如本文所述的药物或诊断组合物)缔合。
[0736]
在一些实施方案中，制备本文所述的pd-l1结合分子的方法包括表达pd-l1结合分子和回收pd-l1结合分子。在一些实施方案中，表达pd-l1结合分子包括在表达pd-l1结合分子的条件下培养包含编码pd-l1结合分子的核酸(例如，表达载体)的宿主细胞。
[0737]
在一些实施方案中，用于从包含pd-l1结合分子和至少一种其他生物分子的表达系统组合物中纯化本文所述的pd-l1结合分子的方法包括，(i)使表达系统组合物与细菌蛋白l接触以产生pd-l1结合分子-蛋白l复合物，和(ii)回收pd-l1结合分子-蛋白l复合物。在一些实施方案中，表达系统组合物是细胞溶解产物。在一些实施方案中，蛋白l分离或衍生自大芬戈尔德菌(f.magna)。在一些实施方案中，蛋白l缀合至树脂。
[0738]
在一些实施方案中，产生本文所述分子的方法包括使用细菌细胞壁蛋白结构域相互作用，例如来自大消化链球菌(p.magnus)的蛋白l或其衍生物和其结合结构域片段，或来自金黄色葡萄球菌(s.areus)的蛋白a或其衍生物和其结合结构域片段，纯化分子或其多肽组分的步骤。在一些实施方案中，该方法的纯化步骤涉及志贺菌毒素效应多肽，所述志贺菌毒素效应多肽包含或基本上由seq id no：1-18和40-68中所示的多肽中的任一项组成。在一些实施方案中，该方法的纯化步骤涉及结合分子，该结合分子包含或基本上由seq id no：108-155中所示的多肽中的任一项组成。
[0739]
在实施方案中，制备pd-l1结合分子的方法包括在表达pd-l1结合分子的条件下培养宿主细胞并回收蛋白质。在一些实施方案中，结合分子包含允许它们使用亲和层析纯化的表位。在一些实施方案中，结合分子包含ig结合结构域，例如细菌ig结合结构域，或其片段或功能变体。
[0740]
在一些实施方案中，本文所述的纯化方法中使用的ig结合结构域是蛋白l，或其衍生物或结合结构域片段。蛋白l最初是从大芬戈尔德菌(finegoldia magna)(以前称为大消化链球菌(peptostreptococcus magnus))中分离出来的，是一种免疫球蛋白结合蛋白，它具有独特的通过κ轻链相互作用结合的能力，而不会干扰抗体、scfv、fab片段或其他结合蛋白的抗原结合位点。蛋白l结合天然κ轻链亚型i、iii和iv。蛋白l不与天然κ轻链亚型ii或天然λ轻链结合。蛋白l与人igg、iga、igm、ige和igd结合。在一些实施方案中，蛋白l分离或衍生自大芬戈尔德菌(f.magna)。蛋白l可以在例如大肠杆菌中重组产生。在一些实施方案中，蛋白l包含seq id no：279的序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。
[0741]
在一些实施方案中，ig结合结构域是来自c组和g组链球菌细菌的蛋白g，或来自金黄色葡萄球菌(s.aureus)的蛋白a，或任何前述物质的衍生物和结合结构域片段。
[0742]
在一些实施方案中，纯化方法包括使包含ig结合结构域表位的结合分子与ig结合结构域(例如蛋白l或其片段或衍生物)接触。
[0743]
在一些实施方案中，该方法包括三个步骤：结合步骤、洗涤步骤和洗脱步骤。在结合步骤中，包含嵌合免疫球蛋白结合结构域的蛋白质与固定在基质上的蛋白l接触。基质可以是任何固体支持物，例如珠、树脂等。在一些实施方案中，基质可以填充到柱中或柱体中。
[0744]
在洗涤步骤中，洗涤基质以去除杂质。可以重复洗涤步骤，例如至少2次、至少3次、至少4次或至少5次，直到基本上所有杂质被去除。在一些实施方案中，重复洗涤步骤直到至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％杂质被去除。
[0745]
在洗脱步骤中，包含嵌合免疫球蛋白结合结构域的蛋白质从蛋白l-基质中洗脱。可以使用例如高盐洗涤溶液(例如，1m nacl)或改变ph值来洗脱蛋白质。洗脱后，可以根据标准方法收集蛋白质，适当的话，进一步纯化和/或脱盐。
[0746]
在一些实施方案中，用于从包含pd-l1结合分子和至少一种其他生物分子的表达系统组合物中纯化pd-l1结合分子的方法包括，(i)使表达系统组合物与细菌蛋白l接触以产生pd-l1结合分子-蛋白l复合物，和(ii)回收pd-l1结合分子-蛋白l复合物。在一些实施方案中，表达系统组合物是细胞溶解产物。在一些实施方案中，蛋白l分离或衍生自大芬戈尔德菌(f.magna)。在一些实施方案中，蛋白l缀合至树脂。
[0747]
在一些实施方案中，制备结合分子的方法包括在表达结合分子的条件下培养宿主细胞并回收蛋白质。在一些实施方案中，纯化结合分子的方法包括使结合分子与细菌蛋白l接触。在一些实施方案中，蛋白l分离或衍生自大芬戈尔德菌(f.magna)。在一些实施方案中，蛋白l缀合至树脂。
[0748]
本文还提供了包含如本文所述的物质组合物的试剂盒，以及任选的使用说明、另外的试剂和/或药物递送装置。该试剂盒还可包含用于检测样品或受试者中的细胞类型(例如肿瘤细胞)的试剂和其他工具。
[0749]
另外的编号的实施方案
[0750]
1.pd-l1结合分子，其包含志贺菌毒素a亚基效应多肽和能够特异性结合pd-l1细胞外部分的结合区；其中所述结合区包括：(a)重链可变区(vh)，其包含：(i)cdr1，其包含氨基酸序列eytmh(seq id no：27)，(ii)cdr2，其包含氨基酸序列ginpnnggtwynqkfkg(seq id no：29)，和(iii)cdr3，其包含氨基酸序列pyyygsredyfdy(seq id no：32)；和(b)轻链可变区(vl)，其包含：(i)cdr1，其包含氨基酸序列sasssvsymy(seq id no：19)，(ii)cdr2，其包含氨基酸序列ltsnlas(seq id no：20)，和(iii)cdr3，其包含氨基酸序列qqwssnppt(seq id no：26)。
[0751]
2.根据实施方案1所述的pd-l1结合分子，其中志贺菌毒素a亚基效应多肽包含seq id no：41的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。
[0752]
3.根据实施方案1-2中任一项所述的pd-l1结合分子，其中vh包含seq id no：34的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。
[0753]
4.根据实施方案1-3中任一项所述的pd-l1结合分子，其中vl包含seq id no：35的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。
[0754]
5.根据实施方案1-2中任一项所述的pd-l1结合分子，其中vh包含seq id no：34的序列，vl包含seq id no：35的序列。
[0755]
6.根据实施方案1-5中任一项所述的pd-l1结合分子，其中所述结合区包含scfv接头，其连接vh和vl。
[0756]
7.根据实施方案6所述的pd-l1结合分子，其中所述scfv接头的长度为约3至约12个氨基酸。
[0757]
8.根据实施方案6-7中任一项所述的pd-l1结合分子，其中所述scfv接头是柔性接头。
[0758]
9.根据实施方案6所述的pd-l1结合分子，其中scfv接头包含seq id no：72的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。
[0759]
10.根据实施方案1-9中任一项所述的pd-l1结合分子，其中所述结合区是单链可变片段(scfv)。
[0760]
11.根据实施方案1-9中任一项所述的pd-l1结合分子，其中所述结合区包含seq id no：106的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。
[0761]
12.根据实施方案1-11中任一项所述的pd-l1结合分子，其中pd-l1结合分子包含结合结构域接头，其连接志贺菌毒素a亚基效应多肽和结合区。
[0762]
13.根据实施方案12所述的pd-l1结合分子，其中所述结合结构域接头包含seq id no：73的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。
[0763]
14.根据实施方案12-13中任一项所述的pd-l1结合分子，其中所述结合分子从n末端到c末端包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头和结合区。
[0764]
15.根据实施方案12-13中任一项所述的pd-l1结合分子，其中所述结合分子从n末端到c末端包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头、vh和vl。
[0765]
16.根据实施方案12-13中任一项所述的pd-l1结合分子，其中所述结合分子从n末端到c末端包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头、vh、scfv接头和vl。
[0766]
17.根据实施方案1-16中任一项所述的pd-l1结合分子，其中pd-l1结合分子包含cd8 t细胞表位，其与志贺菌毒素a亚基是异源的。
[0767]
18.根据实施方案17所述的pd-l1结合分子，其中cd8 t细胞表位包含序列nlvpmvatv(seq id no：78)，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。
[0768]
19.根据实施方案17-18中任一项所述的pd-l1结合分子，其中cd8 t细胞表位通过可切割的间隔区连接至结合区。
[0769]
20.根据实施方案19所述的pd-l1结合分子，其中所述可切割的间隔区具有序列hhaa(seq id no：265)。
[0770]
21.根据实施方案17-20中任一项所述的pd-l1结合分子，其中所述结合分子从n末端到c末端包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头、结合区和cd8 t细胞表位。
[0771]
22.根据实施方案17-20中任一项所述的pd-l1结合分子，其中所述结合分子从n末端到c末端包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头、vh、scfv接头、vl和cd8 t细胞表位。
[0772]
23.根据实施方案19-20中任一项所述的pd-l1结合分子，其中所述结合分子从n末端到c末端包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头、结合区、可切割的间隔区和cd8 t细胞表位。
[0773]
24.根据实施方案1-23中任一项所述的pd-l1结合分子，其中pd-l1结合分子包含seq id no：128的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。
[0774]
25.根据实施方案1-24中任一项所述的pd-l1结合分子，其中pd-l1结合分子是单个连续的多肽。
[0775]
26.根据实施方案1-24中任一项所述的pd-l1结合分子，其中pd-l1结合分子包含两个多肽。
[0776]
27.根据实施方案26所述的pd-l1结合分子，其中两个多肽中的每一个都包含seq id no：128的序列。
[0777]
28.根据实施方案26-27中任一项所述的pd-l1结合分子，其中两个多肽彼此非共价连接。
[0778]
29.根据实施方案26-27中任一项所述的pd-l1结合分子，其中两个多肽通过结合区彼此非共价连接。
[0779]
30.根据实施方案1-29中任一项所述的pd-l1结合分子，其中结合分子是细胞毒性的。
[0780]
31.根据实施方案1-29中任一项所述的pd-l1结合分子，其中结合分子是非细胞毒性的。
[0781]
32.药物组合物，其包含根据实施方案1-31中任一项所述的pd-l1结合分子，以及
至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
[0782]
33.多核苷酸，其编码根据实施方案1-31中任一项所述的pd-l1结合分子，或其互补物。
[0783]
34.表达载体，其包含根据实施方案33的多核苷酸。
[0784]
35.宿主细胞，其包含根据实施方案33的多核苷酸或根据实施方案34的载体。
[0785]
36.制备根据实施方案1-31中任一项所述的pd-l1结合分子的方法，所述方法包括(a)表达根据实施方案1-31中任一项所述的pd-l1结合分子，和(b)回收所述pd-l1结合分子。
[0786]
37.根据实施方案36所述的方法，其中表达pd-l1结合分子包括在表达pd-l1结合分子的条件下培养根据实施方案35所述的宿主细胞。
[0787]
38.用于从包含pd-l1结合分子和至少一种其他生物分子的表达系统组合物中纯化根据实施方案1-31中任一项所述的pd-l1结合分子的方法包括：(i)使表达系统组合物与细菌蛋白l接触以产生pd-l1结合分子-蛋白l复合物，和(ii)回收pd-l1结合分子-蛋白l复合物。
[0788]
39.根据实施方案38所述的方法，其中所述表达系统组合物是细胞溶解产物。
[0789]
40.根据实施方案38-39中任一项所述的方法，其中所述蛋白l分离或衍生自大芬戈尔德菌(f.magna)。
[0790]
41.根据实施方案38-40中任一项所述的方法，其中所述蛋白l缀合至树脂。
[0791]
42.杀死表达pd-l1的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与根据实施方案1-31中任一项的pd-l1结合分子或根据实施方案32的药物组合物接触的步骤。
[0792]
43.治疗受试者的疾病、紊乱或病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-31中任一项的pd-l1结合分子或根据实施方案32的药物组合物。
[0793]
44.根据实施方案43所述的方法，其中所述疾病、紊乱或病症是免疫紊乱或微生物感染。
[0794]
45.治疗癌症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-31中任一项的pd-l1结合分子或根据实施方案32的药物组合物。
[0795]
46.根据实施方案45所述的方法，其中所述癌症的特征在于高突变负荷和/或高频率的插入缺失。
[0796]
47.根据实施方案45-46中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
[0797]
48.根据实施方案45-47中任一项的方法，其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、输卵管癌、胃肠道癌、神经胶质瘤、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、骨髓瘤、鼻咽肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜肿瘤、前列腺癌、皮肤癌、移行细胞癌或尿路上皮癌。
[0798]
49.根据实施方案45-47中任一项所述的方法，其中，所述癌症是膀胱癌，所述膀胱癌是尿路上皮癌。
[0799]
50.根据实施方案45-47中任一项所述的方法，其中，所述癌症是乳腺癌，所述乳腺癌是her2阳性乳腺癌或三阴性乳腺癌。
[0800]
51.根据实施方案45-47中任一项所述的方法，其中，所述癌症是结肠癌，所述结肠
癌是结肠直肠癌。
[0801]
52.根据实施方案45-47中任一项所述的方法，其中，所述癌症是胃肠道癌，所述胃肠道癌是胃癌、胆道肿瘤或胃食管结合部癌。
[0802]
53.根据实施方案45-47中任一项所述的方法，其中，所述癌症是胶质瘤，所述胶质瘤是成胶质细胞瘤。
[0803]
54.根据实施方案45-47中任一项所述的方法，其中所述癌症是头颈癌，所述头颈癌是头颈部鳞状细胞癌。
[0804]
55.根据实施方案45-47中任一项所述的方法，其中，所述癌症是肾癌，所述肾癌为肾细胞癌。
[0805]
56.根据实施方案45-47中任一项所述的方法，其中，所述癌症是肝癌，所述肝癌是肝细胞癌。
[0806]
57.根据实施方案45-47中任一项所述的方法，其中，所述癌症是肺癌，所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。
[0807]
58.根据实施方案45-47中任一项所述的方法，其中，所述癌症是淋巴瘤，所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤或弥漫性大b细胞淋巴瘤。
[0808]
59.根据实施方案45-47中任一项所述的方法，其中，所述癌症是间皮瘤，所述间皮癌是胸膜间皮瘤。
[0809]
60.根据实施方案45-47中任一项所述的方法，其中所述癌症是骨髓瘤，所述骨髓瘤是多发性骨髓瘤。
[0810]
61.根据实施方案45-47中任一项所述的方法，其中，所述癌症是皮肤癌，所述皮肤癌是皮肤鳞状细胞癌或黑色素瘤。
[0811]
62.根据实施方案45-61中任一项所述的方法，其中癌症对涉及伊匹单抗、纳武利尤单抗、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维单抗(avelumab)、曲美木单抗(tremelimumab)和西米普利单抗(cemiplimab)中的至少一种的治疗是复发或难治的。
[0812]
63.根据实施方案45-62中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性的。
[0813]
64.细胞毒性pd-l1结合分子，其包含：包含与seq id no：41具有至少98％同一性的氨基酸序列的志贺菌毒素a亚基效应多肽；能够特异性结合pd-l1细胞外部分的单链可变片段(scfv)；和人cd8 t细胞表位，其中所述scfv包括：(a)重链可变区(vh)，其包含：(i)cdr1，其包含氨基酸序列eytmh(seq id no：27)，(ii)cdr2，其包含氨基酸序列ginpnnggtwynqkfkg(seq id no：29)，和(iii)cdr3，其包含氨基酸序列pyyygsredyfdy(seq id no：32)；和(b)轻链可变区(vl)，其包含：(i)cdr1，其包含氨基酸序列sasssvsymy(seq id no：19)，(ii)cdr2，其包含氨基酸序列ltsnlas(seq id no：20)，和(iii)cdr3，其包含氨基酸序列qqwssnppt(seq id no：26)；以及scfv接头，其位于vh和vl之间，长度为3至12个氨基酸。
[0814]
65.根据实施方案64所述的pd-l1结合分子，其中vh包含seq id no：34的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。
[0815]
66.根据实施方案64或65所述的pd-l1结合分子，其中vl包含seq id no：35的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。
[0816]
67.根据实施方案64所述的pd-l1结合分子，其中vh包含seq id no：34的序列，vl包含seq id no：35的序列。
[0817]
68.根据实施方案64-67中任一项所述的pd-l1结合分子，其中scfv接头包含seq id no：72的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。
[0818]
69.根据实施方案64-68中任一项所述的pd-l1结合分子，其中scfv包含seq id no：106的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。
[0819]
70.根据实施方案64-69中任一项所述的pd-l1结合分子，其中pd-l1结合分子包含结合结构域接头，其连接志贺菌毒素a亚基效应多肽和scfv。
[0820]
71.根据实施方案70所述的pd-l1结合分子，其中所述结合结构域接头包含seq id no：73的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。
[0821]
72.根据实施方案64-71中任一项所述的pd-l1结合分子，其中cd8 t细胞表位包含序列nlvpmvatv(seq id no：78)。
[0822]
73.根据实施方案64-72中任一项所述的pd-l1结合分子，其中cd8 t细胞表位通过间隔区连接至scfv。
[0823]
74.根据实施方案73所述的pd-l1结合分子，其中所述间隔区具有序列hhaa(seq id no：265)。
[0824]
75.根据实施方案64-74中任一项所述的pd-l1结合分子，其中pd-l1结合分子包含seq id no：128的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。
[0825]
76.根据实施方案64-75中任一项所述的pd-l1结合分子，其中pd-l1结合分子是单个连续的多肽。
[0826]
77.根据实施方案76所述的pd-l1结合分子，其中所述pd-l1结合分子是单个连续的多肽，其按从n末端至c末端的顺序包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、scfv和cd8 t细胞表位。
[0827]
78.根据实施方案76所述的pd-l1结合分子，其中所述pd-l1结合分子是单个连续的多肽，其按从n末端至c末端的顺序包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头、scfv和cd8 t细胞表位。
[0828]
79.根据实施方案76所述的pd-l1结合分子，其中所述结合分子是单个连续的多肽，其按从n末端至c末端的顺序包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头、vh、scfv接头、vl和cd8 t细胞表位。
[0829]
80.根据实施方案76所述的pd-l1结合分子，其中所述结合分子是单个连续的多肽，其按从n末端至c末端的顺序包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头、scfv、间隔区和cd8 t细胞表位。
[0830]
81.根据实施方案64-75中任一项所述的pd-l1结合分子，其中pd-l1结合分子包含两个多肽。
[0831]
82.根据实施方案81所述的pd-l1结合分子，其中两个多肽彼此非共价连接。
[0832]
83.根据实施方案81或82所述的pd-l1结合分子，其中两个多肽通过结合区彼此非共价连接。
[0833]
84.根据实施方案81-83中任一项所述的pd-l1结合分子，其中两个多肽中的每一个按从n末端到c末端的顺序包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、scfv和cd8 t细胞表位。
[0834]
85.根据实施方案81-83中任一项所述的pd-l1结合分子，其中两个多肽中的每一个从n末端到c末端包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头、scfv和cd8 t细胞表位。
[0835]
86.根据实施方案81-83中任一项所述的pd-l1结合分子，其中两个多肽中的每一个按从n末端到c末端的顺序包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头、vh、scfv接头、vl和cd8 t细胞表位。
[0836]
87.根据实施方案81-83中任一项所述的pd-l1结合分子，其中两个多肽中的每一个从n末端到c末端包含志贺菌毒素a亚基效应多肽、结合结构域接头、scfv、间隔区和cd8 t细胞表位。
[0837]
88.根据实施方案81-87中任一项所述的pd-l1结合分子，其中两个多肽中的每一个都包含seq id no：128的序列。
[0838]
89.蛋白质，其包含seq id no：128的序列。
[0839]
90.蛋白质，其由seq id no：128的序列组成。
实施例
[0840]
以下实施例说明了本发明的某些实施方案。然而，应当理解，这些实施例仅用于说明目的，并不意在也不应被解释为完全确定本发明的条件和范围。除非另有说明，否则以下实施例中的实验是使用标准技术进行的，这些技术对于本领域技术人员来说是公知的和常规的。
[0841]
以下实施例描述了几种示例性的pd-l1结合分子。以下每个示例性pd-l1结合分子包含至少一种直接或间接连接至细胞靶向pd-l1结合区的毒素(参见，例如，图1)。下文描述的示例性细胞毒性结合分子与由靶向肿瘤细胞类型表达的细胞表面pd-l1分子结合并进入那些靶细胞。实施例中所示的一些内化的pd-l1结合分子具有毒素组分，其有效地按路线发送至靶细胞的胞质溶胶的区室，在该处毒素使核糖体失活并随后引起靶细胞的凋亡。一些示例性结合分子能够有效地将免疫原性t细胞表位-肽递送至肿瘤靶细胞的细胞内mhc i类途径，导致细胞表面呈递、细胞间t细胞接合和包括细胞因子分泌和/或靶细胞杀伤的免疫应答。
[0842]
实施例中示例性pd-l1结合分子中使用的蛋白质毒素效应多肽被去免疫化，同时保留催化和/或细胞毒活性，除非在本文中指示为“失活的”。一些示例性的pd-l1结合分子包含至少一个志贺菌毒素效应多肽组分，其(1)是去免疫的；(2)位于结合分子的多肽组分的氨基末端上或附近；(3)如本文所述具有弗林蛋白酶切割抗性；和/或(4)包含嵌入或插入的cd8 t细胞表位。
[0843]
实施例1 pd-l1结合结构域发现
[0844]
pd-l1结合结构域由abeome corporation(bogart，乔治亚州，u.s.a.)鉴定或衍生自由abeome corporation鉴定的pd-l1结合蛋白(参见例如pct/us2019/022971)。pd-l1结合蛋白使用文献中描述的方法鉴定，该方法涉及abeome corporation的筛选表达亲和力成熟单克隆抗pd-l1抗体的转基因鼠b细胞的pd-l1结合亲和力的方法。某些抗pd-l1抗体候选者可选地使用重组方法进行人源化以制备鼠/人嵌合序列，并筛选所得嵌合抗pd-l1单克隆抗体的pd-l1结合亲和力和pd-l1/pd-1结合的抑制。对于某些分子，被识别为推定的翻译后
修饰位点和/或可能对制造不利的氨基酸残基，例如非规范或未配对的半胱氨酸残基和n-糖基化位点，被改变或去除。如果需要更高的pd-l1结合亲和力，则使用abeome corporation的有所有权的方法进行互补决定区(cdr)的诱变。
[0845]
表达抗pd-l1抗体的转基因鼠b细胞是从使用重组pd-l1细胞外结构域(包含人pd-l1的前239个氨基酸)作为免疫原按初始/增强方案皮下免疫的转基因abeomice
tm
获得的。收集并汇集淋巴组织样样品和骨髓，针对与人pd-l1的结合，对在细胞表面表达单克隆抗体(mab)的b细胞进行分类和筛选。来自某些b细胞克隆的单克隆抗体的可变区被鉴定并克隆为嵌合mab。候选mab的特征在于pd-l1结合和破坏pd-1/pd-l1相互作用和/或pd-1信号传导轴的能力。
[0846]
实施例2包含志贺菌毒素a亚基组分的pd-l1结合分子
[0847]
i、pd-l1靶向免疫毒素的构建与检测
[0848]
如先前在wo 2016/196344和wo 2018/140427中所述，设计、表达和纯化包含实施例1的志贺菌毒素组分和候选mab免疫球蛋白结构域的pd-l1结合分子。在这些实施例中描述的靶向pd-l1的免疫毒素的毒素组分中使用了志贺菌毒素a1片段的各种突变。例如，实施例2的示例性靶向pd-l1的免疫毒素中使用的所有志贺菌毒素a1片段都被去免疫(在本文中称为“di-slt-a1”)。示例性的靶向pd-l1的免疫毒素构建为融合蛋白，每个包含示例性的源自实施例1中鉴定的可变区pd-l1结合结构域的抗pd-l1 scfv和“di-slt-a1”的一个或多个变体”。这些靶向pd-l1的免疫毒素在本文中称为“di-slt-a1融合蛋白”。116297的蛋白质制剂包含单体(即，包含seq id no：128的蛋白质的单体)、同型二聚体(即，两种蛋白质的二聚体，每一个都包含seq id no：128的序列)和大小大于二聚体的同源多聚体(即三种或更多种蛋白质的多聚体，每一种蛋白质都包含seq id no：128的序列)的混合物，其中同型二聚体占绝大多数。115749的制剂主要包含单体(即，包含seq id no：113的蛋白质的单体)。
[0849]
以酶联免疫测定(elisa)形式测试了包含示例性抗pd-l1 scfv的靶向pd-l1的免疫毒素(di-slt-a1融合蛋白)与pd-l1重组蛋白的结合。简而言之，用重组人或食蟹猴pd-l1细胞外结构域(ecd)蛋白包被nunc板，用pbs洗涤，并封闭以减少非特异性背景噪音。di-slt-a1融合蛋白与pd-l1 ecd蛋白一起孵育，洗涤样品，然后使用与辣根过氧化物酶(hr)缀合的抗di-slt-a1 mab检测di-slt-a1融合蛋白水平。在与tmb-ultra(3
′
，5，5
′‑
四甲基联苯胺)孵育并随后用盐酸中和后检测elisa信号。使用读板器读取450纳米(nm)处的吸光度值(abs)，并减去来自仅缓冲液对照的背景elisa信号。使用非线性曲线回归分析(prism(graphpad prism，圣地亚哥，ca，美国，prism软件函数sigmoidal 4pl)将平均荧光强度(mfi)值绘制为对数转换的di-slt-a1融合蛋白浓度的函数，以确定bmax和kd。这些结合实验的一些结果显示在表7和图2、3、15和34中。表7显示了以纳克/毫升(ng/ml)为单位测量的解离常数(kd)和以mfi为单位测量的bmax。
[0850]
测试了di-slt-a1融合蛋白115749(seq id no：113)和115750(seq id no：114)与来自不同物种的pd-l1的结合，并确定其与人和食蟹猴pd-l1结合，但不与小鼠pd-l1结合，如图2所示。将靶向pd-l1的对照di-slt-a1融合蛋白(114964)用作阳性对照，该蛋白包含存在于阿特珠单抗中的已知与来自人、猕猴和小鼠的pd-l1结合的免疫球蛋白结合结构域。
[0851]
pd-l1结合分子115749(seq id no：113)和115750(seq id no：114)在该测定中，均与人pd-l1和食蟹猴pd-l1结合，但不与鼠pd-l1结合(图2；表7)。
[0852]
密切相关的di-slt-a1融合蛋白，仅在轻链结构域和重链结构域之间的scfv结构域间接头不同，在类似的测定中进行了测试，以表征它们与pd-l1的结合亲和力。在该实验中，测试了一系列稀释的di-slt-a1融合蛋白与人或食蟹猴pd-l1重组蛋白的结合。这些结合实验的一些结果显示在表7和图3、15和34中。
[0853]
pd-l1结合分子115749(seq id no：113)和116297(seq id no：128)均与重组人pd-l1和食蟹猴pd-l1结合(表7；图3、15和34)。
[0854]
表7示例性pd-l1结合di-slt-1a融合蛋白与来自人或食蟹猴来源的重组pd-l1蛋白的结合特性
[0855][0856]
pd-l1结合分于115749(seq id no：113)、116188(seq id no：126)和116297(seq id no：128)各自以相似结合特征结合人和食蟹猴pd-l1蛋白(图3、13、5、17a-17b和34)。表7和图3和15中显示的结果表明115749(seq id no：113)和116297(seq id no：128)以相似的亲和力和bmax值结合人和食蟹猴pd-l1。此外，图3中的结果显示116188(seq id no：126)，116297(seq id no：128)的相关变体，表现出与pd-l1相似的结合特征。在使用相同测定法的另一个实验中，115749(seq id no：113)对pd-l1重组蛋白的亲和力与115961(seq id no：123)对相同pd-l1重组蛋白的亲和力相当。
[0857]
示例性pd-l1结合分子116297(seq id no：128)以相似的亲和力与重组人和食蟹猴蛋白结合(图3、13、15、17a-17b和34)；然而，116297(seq id no：128)不结合啮齿动物pd-l1(图17a-17b)。
[0858]
通过流式细胞术测量15749(seq id no：113)与表达pd-l1的hcc1954细胞的结合。在如下进行结合测定之前，用ifn-γ(ifn-γ)处理细胞一天。将融合蛋白115749(seq id no：113)添加到细胞中，并将样品在冰上孵育一小时。洗涤细胞，并使用与fitc缀合的抗di slt-a1 mab检测di-slt-a1融合蛋白。图4显示了该测定的结果。pd-l1结合分子115749(seq id no：113)表现出与表达pd-l1的hcc1954细胞的剂量依赖性结合(图4)。
[0859]
值得注意的是，在表达pd-l1的细胞结合测定中，116297、115749、115695和116555的结合亲和力是相当的(参见，例如，图15)。在pd-l1阳性细胞杀伤测定中，116297和115765的cd50值相当(参见例如图14)。
[0860]
ii.测定毒素酶活性和免疫毒素细胞毒性
[0861]
包含示例性pd-l1结合区的di-slt-a1融合蛋臼被证明具有与单独的di slt-a1志贺菌毒素效应多肽相似的核糖体失活活性。核糖体抑制测定使用无细胞体外蛋白质翻译测定，其使用快速偶联的转录/翻译试剂盒(quick coupled transcription/translation kit)(l1170promega麦迪逊，wi，u.s.a.)。该试剂盒包括荧光素酶t7对照dna(l4821 promega麦迪逊，wi，u.s.a.)和quick master mix。根据制造商的说明准备
核糖体活性反应。在适当的缓冲液中制备一系列(通常为10倍)稀释液，并为每个稀释液产生一系列相同的tnt反应混合物组分。将蛋白质样品与每种tnt反应混合物以及荧光素酶t7对照dna结合。测试样品在30℃下孵育1.5小时。孵育后，将荧光素酶测定试剂(e1483 promega，麦迪逊，wi，u.s.a.)添加到所有测试样品中，并根据制造商说明通过发光测量荧光素酶蛋白翻译的量。翻译抑制水平通过总蛋白的对数转换浓度与相对发光单位的非线性回归分析来确定。使用统计软件(graphpad prism，圣地亚哥，ca，usa)，使用prism软件函数的log(抑制剂)与反应(三个参数)[y＝底部 ((项部-底部)/(1 10^(x-logic
50
)))]在标题剂量反应抑制下计算半数最大抑制浓度(ic
50
)值。这种核糖体抑制测定的一些结果显示在表8、图5、图13-14和图33中。
[0862]
表8通过蛋白质合成抑制测定的示例性的靶向pd-l1的di-slt-1a融合蛋白的催化活性
[0863]
di-slt-1a融合蛋白ic
50
(ng/ml)115749(seq id no：113)0.25115961(seq id no：123)0.88仅di-slt-1a0.20
[0864]
示例性pd-l1结合分子115749(seq id no：113)和115961(seq id no：123)表现出与阳性“对照”分子相当的核糖体抑制活性，所述阳性“对照”分子即单独的志贺毒素效应多肽(di-slta)，不与任何靶向剂或结合区偶联(即，包含seq id no：41的多肽)，尽管115961(seq id no：123)的效力略低(图5；表8)。115749(seq id no：113)保留了有效蛋白质合成抑制的志贺菌毒素功能，例如，在单独的di-slta水平(即，包含seq id no：41的多肽)(表8；图5)。
[0865]
图13、14和33还报告了116297(seq id no：128)的核糖体抑制测定的结果。示例性pd-l1结合分子116297(seq id no：128)表现出与115749(seq id no：113)(ic500.25ng/ml)相当的核糖体抑制活性水平(ic500.36ng/ml)(参见表8)。116297(seq id no：128)表现出与115749(seq id no：113)和阳性“对照”分子相当的核糖体抑制活性，阳性“对照”分子即单独的志贺菌毒素效应多肽(di-slta)，不与任何靶向剂或结合区偶联(即，包含seq id no：41)的多肽(图14和33)。
[0866]
测试了包含示例性scfv和其他pd-l1靶向结合结构域的di-slt-a1融合蛋白对在细胞表面表达pd-l1的细胞的特异性细胞毒性。简而言之，将细胞铺板，然后与稀释系列的di-slt-a1融合蛋白一起孵育，孵育3至5天，然后用celltiter-glo读取成活力。测量相对发光值(rlu)并将其标准化至仅细胞对照孔。将成活力绘制为对数转换浓度的函数，并在graphpad prism中使用非线性回归(对数(抑制剂)与反应(三个参数))计算cd
50
。当cd
50
值不能基于测试浓度的曲线形状计算时，最大cd
50
值被记录为超出最大测试值，例如，对于在最高测试样品浓度下没有杀死50％细胞的样品，大于20,000ng/ml(“＞20,000ng/ml”)。将转染以表达人、食蟹猴或小鼠pd-l1的cho-k1细胞系与115749(seq id no：113)或115750(seq id no：114)(以稀释系列)孵育4天，然后读取细胞成活力(cell titer glo，promega，麦迪逊，wi，usa)。该细胞毒性实验的一些结果显示在表9和图6a-6b中。
[0867]
表9通过体外细胞成活力测定法测定的示例性靶向pd-l1的di-slt-1a融合蛋白对表达人或食蟹猴pd-l1的细胞的细胞毒性
[0868][0869]
图6a显示了pd-l1结合分子115749(seq id no：113)，图6b显示了pd-l1结合分子115750(seq id no：114)杀死了表达人或食蟹猴pd-l1的细胞，但不杀死表达鼠pd-l1的细胞。表9和图6a-6b中显示的结果表明115749(seq id no：113)和115750(seq id no：114)的细胞毒性的特异性与来自人和食蟹猴的pd-l1的存在相关，但与来自小鼠的pd-l1无关。
[0870]
使用上述体外细胞成活力测定，示例性pd-l1结合分子116297(seq id no：128)杀死表达人或食蟹猴pd-l1的细胞，但不杀死表达小鼠pd-l1的细胞(图17a-17b)。
[0871]
将人类永生化癌细胞与115749(seq id no：113)或115750(seq id no：114)或di-slt-1a志贺菌毒素效应多肽(在稀释系列中)孵育5天(在此期间对所有样品更新培养基一次)，然后使用上述测定法读取细胞成活力(cell titer glo，promega，麦迪逊，wi，usa)。在单独的流式细胞术实验中，对这些细胞系进行了细胞表面pd-l1表达的分析。涉及这些细胞系的实验在1周内进行。该细胞毒性实验的一些结果显示在表10和图7中。
[0872]
表10通过体外细胞成活力测定法测定的示例性pd-l1靶向di-slt-1a融合蛋白对表达pd-l1的人肿瘤细胞的细胞毒性
[0873][0874]
*“dnt”表示未测试。
[0875]
表10和图7中显示的结果表明115749(seq id no：113)在一定浓度范围内对表达pd-l1的人类癌细胞系具有细胞毒性，而单独的非靶向di slt-1a(“仅di-slt-1a”，即包含seq id no：41的多肽)在测试浓度下表现出相对低的细胞毒性(di slt-1a仅在高浓度时具有细胞毒性，并且仅对某些细胞系具有细胞毒性)。图16显示116297(seq id no：128)可以表现出比115749(seq id no：113)更大的细胞毒性。
[0876]
基本上如上所述对相关di-slt-a1融合蛋白进行另外的细胞成活力实验。这些实验对代表性pd-l1阳性细胞系hcc-1954和mda-mb-231的一些结果显示在表11和图8中。在这些细胞毒性实验中测试的di-slt-a1融合蛋白在其免疫球蛋白型结合结构域的可变区具有相同或相似的cdr序列。
[0877]
表11通过体外细胞成活力测定法测定的示例性的靶向pd-l1的di-slt-1a融合蛋白对表达pd-l1的人肿瘤细胞的细胞毒性
[0878][0879][0880]
pd-l1结合分子115744(seq id no：108)、115745(seq id no：109)、115747(seq id no：111)、115748(seq id no：112)、115749(seq id no：113)、115750(seq id no：114)、115751(seq id no：115)、115752(seq id no：116)、115753(seq id no：117)、115754(seq id no：118)、115755(seq id no：119)、115756(seq id no：120)和115757(seq id no：121)对两种不同的表达pd-l1的细胞类型：hcc-1954和mda-mb-231细胞表现出细胞毒性(表11；图8)。
[0881]
以类似的形式对相关的di-slt-a1融合蛋白进行了另外的细胞成活力实验。在这些实验中测试的di-slt-a1融合蛋白在其免疫球蛋白型结合结构域的可变区中具有相同或相似的cdr序列。这些实验对代表性pd-l1阳性细胞系hcc-1954和mda-mb-231的一些结果显示在表12和图9中。如表12中所用，“仅di-slta-1a”是指包含seq id no：41的多肽。
[0882]
表12示例性pd-l1结合di-slt-a1融合蛋白对pd-l1阳性或阴性人肿瘤细胞的细胞毒活性
[0883][0884][0885]
pd-l1结合分子116297(seq id no：128)和116299(seq id no：129)对四种不同的表达pd-l1的细胞类型表现出细胞毒性：hcc 1954、jimt-1、hcc 827和mda-mb-231(图9；表12)。表10-12和图7-9中表征的pd-l1结合分子在不存在细胞毒性t细胞的情况下表现出约1至480ng/ml的cd
50
值。不受理论束缚，这些结果表明某些pd-l1结合分子在体内对“冷”肿瘤细胞或对特征为“非发炎”或排除在免疫监视之外的肿瘤中的肿瘤细胞具有细胞毒性，例如“免疫排除肿瘤”。例如，一些pd-l1结合分子可能在没有肿瘤浸润淋巴细胞的情况下对体内的肿瘤细胞产生细胞毒性，并且无论肿瘤微环境的免疫调节状态如何。不受理论的束缚，一些pd-l1结合分子在体内可能对肿瘤细胞具有细胞毒性，而不管肿瘤细胞的突变负荷如何。因此，靶向细胞杀伤作用机制允许在体内靶向肿瘤细胞杀伤，而不管肿瘤免疫状态如何(例如免疫排除、非发炎和/或“冷”)。
[0886]
将人永生化癌细胞与116297(seq id no：128)、115749(seq id no：113)、115765(seq id no：161)或114895(seq id no：163)一起孵育5天(在此期间对所有样品更新培养基一次)，然后使用上述测定法读取细胞成活力(cell titer glo，promega，麦迪逊，wi，usa)。该细胞毒性实验的结果显示在图43a-43b中。这些结果表明，116297(seq id no：128)在一定浓度范围内对表达pd-l1的人癌细胞系(hcc1954(图43a)和mda-mb-231(图43b))具有细胞毒性，并且显示比115749(seq id no：113)、115765(seq id no：161)和114895(seq id no：163)更大的细胞毒性。
[0887]
图18报告了多种临床相关肿瘤细胞系的116297(seq id no：128)的细胞表面pd-l1表达水平(图18a)和cd
50
值(图18b)。pd-l1在各种人肿瘤细胞的细胞表面表达，包括来自人肺癌、皮肤癌和乳腺癌细胞系的细胞。116297(seq id no：128)表现出广泛的抗肿瘤细胞毒性。116297(seq id no：128)特异性且有效地杀死表达pd-l1的靶细胞。
[0888]
图19、20a-20b和21a-21b显示来自pbmc样品的免疫细胞亚群上的pd-l1表达水平与116297(seq id no：128)治疗的细胞毒效力有关。图19证明人供体pbmc样品包括单核细胞和淋巴细胞，其中可以通过干扰素γ处理诱导单核细胞以提高其pd-l1的表达。图20a表明116297(seq id no：128)对pbmc的细胞毒性仅限于经ifn-γ处理的表达更高水平pd-l1的单核细胞。图20a-20b和图21a-21b显示116297(seq id no：128)可以对“pd-l1高表达”单核细胞表现出选择性细胞毒性，而对pd-l1阴性淋巴细胞没有细胞毒性。图21b显示了在测试条件下pd-l1表达水平与116297(seq id no：128)的cd50值的图。图21a-21b表明116297
(seq idno：128)更高的pd-l1表达与更高的细胞毒性效力(即较低的cd
50
值)之间存在一般相关性。炎性细胞因子ifn-γ增强了单核细胞上的pd-l1表达。图20a-20b显示116297(seq id no：128)对pd-l1阳性人免疫细胞表现出离体细胞毒性。116297(seq id no：128)直接杀死免疫细胞需要pd-l1表达。116297(seq id no：128)不靶向大量淋巴细胞群，这些淋巴细胞群在存在或不存在ifn-γ的情况下不表达pd-l1。116297(seq id no：128)被设计为消耗肿瘤环境中表达pd-l1的肿瘤细胞(tc)和免疫细胞(ic)。单核细胞pd-l1表达的离体ifn-γ诱导与肿瘤中ic上的适应性pd-l1表达一致(参见例如kowanetz m等人，proc natl acad sci u.s.a.115：e10119-e10126(2018))。其他pd-l1靶向药物在肿瘤细胞或免疫细胞pd-l1阳性的患者中显示出活性(kowanetz m等人，proc natlacadsci u.s.a.115：e10119-e10126(2018)；tang f，zhengp，cellbiosci 8：34(2018))。
[0889]
iii.测试cd8 t细胞表位递送和免疫应答的诱导
[0890]
对示例性分子在靶细胞表面上的抗原功能性呈递进行了测试。在本实施例中，选择了一种已知在人体中具有免疫原性的病毒cd8 t细胞表位-肽与di-slt-a1融合蛋白融合。本实施例中使用的cd8 t细胞表位-肽nlvpmvatv(seq id no：78)是基于该肽与人mhc i类分子结合并因此引发人ctl介导的免疫应答的能力而选择的。该病毒表位-肽与包含志贺菌毒素效应多肽的pd-l1靶向蛋白融合，所述志贺菌毒素效应多肽具有通过内质网逆行转运细胞内径由到胞质溶胶的内在能力(参见例如wo 2016/196344和wo 2018/140427)。
[0891]
为了测试免疫原性病毒表位肽的功能呈递，使用了共孵育测定。靶标癌细胞系mda-mb-231(nr)(mda-mb-231细胞，其表达pd-l1和hla-a02，并用nuclight红色慢病毒试剂(essen bioscience，安阿伯，mi，usa)转染，用于荧光定量)用不具有免疫原性病毒肽的示例性di-slt-a1融合蛋白或相关对照di-slt-a1融合蛋白处理，然后暴露于富含nlvpmvatv(seq id no：78)肽特异性ctl的淋巴细胞(从在标准条件下培养的hla-a02阳性、cmv血清反应阳性供体外周血单核细胞(pbmc)中富集)。富集nlvpmvatv(seq id no：78)肽特异性ctl的淋巴细胞在下文中称为cmv-ctl。
[0892]
通过上清液(elisa)中的ifn-γ水平测量cmv-ctl信号传导的刺激，通过靶细胞成活力测量由接合的cmv-ctl引导的特定靶细胞裂解(均通过s3活细胞分析系统(essen bioscience，安阿伯，mi，usa)读数和终点细胞titer-glo测定中的荧光进行动力学分析)。简而言之，pd-l1阳性细胞系mda-mb-231(nr)与单独的磷酸盐缓冲盐水(pbs)(“仅缓冲液”)或di-slt-a1融合蛋白一起孵育长达24小时。孵育后，洗涤细胞并将含有cmv-ctl的培养基与靶细胞共同孵育。根据制造商的说明，24至48小时后，收集上清液并通过细胞因子特异性ifn-γelisa试剂盒(biolegend，inc.，圣地亚哥，ca，u.s-a.)测量ifn-γ浓度。在一些实验中，在收获上清液后，洗涤贴壁的靶细胞以去除pbmc，并根据制造商的说明通过发光细胞成活力测定(g7573，promega corp.，麦迪逊，wi，usa)和在rlu中测量评估细胞成活力。
[0893]
mda-mb-231(nr)靶细胞(测定前24小时在存在ifn-γ的情况下每孔接种30,000个细胞)与匹配的di-slt-a1融合蛋白对孵育24小时，该di-slt-a1融合蛋白具有(1)异源cd8 t细胞表位货物(“抗原递送”)(例如115749(seq id no：113))或(2)缺乏病毒抗原货物(本文称为“无抗原”或“对照结合分子”)(例如115961(seq id no：123)，其与115749(seq id no：113)密切相关))中任一项。除了带有病毒抗原货物的115749(seq id no：113)和没有病
毒抗原货物的相关115961(seq id no：123)的匹配对之外，测试的另一匹配对是带有病毒抗原货物的di-slt-a1融合蛋白115750(seq id no：114)和缺乏任何病毒抗原货物的相关的di-slt-a1融合蛋白115962(seq id no：124)。结果如图10a所示。
[0894]
洗涤细胞，然后以1∶1 cmv-ctl与靶细胞的比例添加cmv-ctl。在48小时时，去除上清液以分泌ifn-γ并更换培养基。随着时间的推移监测经处理的细胞与未经处理的对照相比的成活力，并显示了80小时后的成活力。该免疫原性实验的一些结果显示在表13、图10a和10b以及图24b中。
[0895]
表13 cmv-ctl对用含有病毒抗原货物的di-slt-1a融合蛋白的靶细胞处理的功能性应答
[0896][0897]
表13和图10a和10b中显示的数据表明，携带di-slt-a1融合蛋白115749(seq id no：113)和115750(seq id no：114)的抗原货物能够刺激cmv-ctl细胞，以驱动细胞因子(ifn-γ)分泌和靶细胞杀伤，并且该特性在对照di-slt-a1融合蛋白115961(seq id no：123)和115962(seq id no：124)中不存在，所有这些都不包含任何病毒抗原货物。
[0898]
使用类似的免疫原性测定，在施用另外的di-slt-a1融合蛋白对后，测量ifn-γ分泌的诱导，所述另外的di-slt-a1融合蛋白对中的一个包含融合病毒抗原，另一个是缺乏任何病毒抗原货物的对照di-slt-a1融合蛋白。mda-mb-231(nr)靶细胞(测定前24小时在ifn-γ存在下每孔接种10,000个细胞)与匹配的di-slt-a1融合蛋白对孵育24小时，其中有和没有抗原递送能力，例如抗原递送115749(seq id no：113)与不含病毒抗原的相关di-slt-a1融合蛋白115961(seq id no：123)配对；抗原递送116297(seq id no：128)或116299(seq id no：129)与不含抗原货物的相关di-slt-a1融合蛋白116187(seq id no：125)配对。洗涤细胞，然后以1∶1 cmv-ctl与靶细胞的比例添加cmv-ctl。在40小时时，去除35％的上清液以分泌ifn-γ，并更换培养基。随时间监测经处理的的细胞与未经处理的对照相比的成活力。该免疫原性实验的一些结果显示在表14和图11中。
[0899]
表14 cmv-ctl对用包含抗原货物的di-slt-1a融合蛋白的靶细胞处理的功能性应答
[0900][0901]
表14和图11中的数据表明di-slt-a1融合蛋白115749(seq idno：113)、116297(seq id no：128)和116299(seq id no：129)能够刺激cmv-ctl细胞，以驱动细胞因子(ifn-γ)分泌，并且该功能在不含病毒抗原的对照di-slt-a1融合蛋白115961(seq id no：123)和116187(seq id no：125)中不存在。如表14中所用，术语“仅di-slt-1a”是指包含seq id no：41的多肽。
[0902]
在共培养实验中，在表达pd-l1的肿瘤细胞存在下，暴露于pd-l1结合分子的cmv血清反应阳性供体pbmc可以扩增ctl群体，如天然感染期间发生的ctl记忆扩增和/或类似于内源性记忆t细胞制备的。
[0903]
基于ctl的细胞毒性测定用于评估cd8 t细胞表位呈递的后果。该测定涉及组织培养的靶细胞和t细胞。通过在标准条件下(包括在37℃和含5％二氧化碳的气氛中)孵育细胞(通常为4小时或16小时或更长时间)，用示例性pd-l1结合分子使靶细胞中毒，以允许pd-l1靶向的中毒。孵育后，洗涤靶细胞。接下来，将ctl添加到经处理的靶细胞中并孵育，以使ctl识别和结合任何显示cd8 t细胞表位-肽/mhc i类复合物(pmhc i)的靶细胞。然后使用技术人员已知的标准方法研究pmhc i识别的某些功能性后果，包括通过ctl介导的细胞溶解杀死表位呈递靶细胞，以及通过elisa测定细胞因子，例如ifn-γ或白细胞介素的释放。
[0904]
共培养细胞杀伤测定：将pd-l1阳性细胞以每孔10,000至20,000个细胞接种在96孔板中，并与浓度为5,000ng/ml的示例性pd-l1结合分子孵育。24小时后，将pd-l1结合分子洗掉，然后将细胞与t细胞或仅与细胞培养基共培养。表达荧光标签的pd-l1阳性/hla：a2阳性mda-mb-231细胞被用作测定(essen bioscience，安阿伯，mi，u.s.a.)中的靶标。使用incucyte-s3-活细胞成像仪(essen bioscience，ann安阿伯，mi，u.s.a.)测量细胞成活力随时间的变化，每4到6小时捕获细胞样品的相位和荧光图像。通过s3软件包(essen bioscience，安阿伯，mi，u.s.a)通过荧光细胞计数测量百分比成活力。将成活力数据绘制为总荧光细胞计数并归一化至时间零。
[0905]
图22、23和24a-24b显示116297(seq id no：128)表现出至少两种靶细胞杀伤机制：直接细胞杀伤和抗原特异性ctl依赖性细胞杀伤。图22表明116297(seq id no：128)而不是116296(seq id no：127)在抗原特异性ctl(共培养物)存在下表现出更大的靶细胞
(mda-mb-231(hla：a02阳性))细胞毒性。116297(seq id no：128)在存在抗原特异性ctl的情况下的细胞毒作用大于不存在ctl的情况。116297(seq id no：128)在不存在ctl(红色，开圆)的情况下的细胞毒性作用等同于116296(seq id no：127)在存在(绿色正方形)或不存在ctl(绿色，开圆)时的细胞毒性作用。当存在病毒抗原特异性细胞毒性t细胞(cmv-ctl)时，116297(seq id no：128)对hla*a02 /pd-l1 靶细胞的细胞毒性作用增加。作为对照，缺乏任何病毒抗原货物的对照pd-l1结合分子在存在cmv-ctl的情况下没有表现出细胞毒性的增加。图24表明116297(seq id no：128)与肿瘤细胞的孵育导致在ctl存在下剂量依赖性细胞毒性和干扰素γ分泌的诱导。图22和24a-24b显示除了通过内化志贺菌毒素效应多肽的直接细胞毒性之外，抗原货物递送作为第二种细胞毒性作用机制存在。
[0906]
图23、25-27表明肿瘤靶细胞表达pd-l1和hla：a*02是抗原接种所必需的，但还不够，即在存在ctl的情况下观察到更大的116297(seq id no：128)诱导的细胞毒性。这些结果表明，在这些共培养实验中，由116297(seq id no：128)诱导的ctl活化和ctl介导的细胞毒性需要pd-l1的靶细胞表达和hla：a*02和ctl-抗原特异性。图25显示了pd-l1和hla：a*02在mda-mb-231(pd-l1阳性，hla：a*02阳性)；l1236((pd-l1阳性，hla：a*02阳性)；或mcf-7(pd-l1阴性，hla：a*02阳性)细胞上的表面分子表达。图26显示将116297(seq id no：128)施用于与抗原特异性ctl(“cmv-ctl”)共培养的hla：a*02和pd-l1 肿瘤细胞诱导干扰素γ分泌。图27显示将116297(seq id no：128)施用于与抗原特异性ctl(“cmv-ctl”)共培养的hla：a*02和pd-l1 肿瘤细胞比在无ctl样品中诱导更多的细胞毒性。图27显示116297(seq id no：128)对pd-l1阳性靶细胞的细胞毒效力在存在ctl的情况下增加。
[0907]
这些实验的结果显示示例性pd-l1结合分子116296(seq id no：127)和116297(seq id no：128)在不存在和存在人供体细胞毒性t细胞时，对pd-l1阳性/hla：a02阳性mda-mb-231细胞具有细胞毒性(参见，例如，图9、图11、图24a)。在存在供体ctl的情况下，由于先前施用116297(seq id no：128)而不是施用116296(seq id no：127)，显著更多的mda-mb-231细胞被杀死。
[0908]
iv.通过pd-l1结合分子测试pd-l1/pd-1信号传导干扰
[0909]
不受任何理论的束缚，任何示例性di-slt-a1融合蛋白杀死表达pd-l1的靶细胞的细胞毒性作用机制不需要靶向pd-l1的di-slt-a1融合蛋白阻断pd-1/pd-l1相互作用的能力，这可能需要志贺菌毒素a亚基组分的细胞内化和核糖体抑制。然而，对于某些抗体，阻断pd-1/pd-l1信号传导轴的能力被认为对其治疗益处很重要(参见ribas a，wolchok j，science 359：1350-55(2018))。
[0910]
为了测试di-slt-a1融合蛋白干扰pd-1/pd-l1相互作用的能力，根据制造商的说明使用市售的基于细胞的pd-1信号传生物测定(promega pd-1/pd-l1阻断生物测定，promega corp.，麦迪逊，wi，usa)。该测定基于通过pd-1抑制的释放而激活的jurkat nfat-luc报告系统。将表达pd-l1的靶细胞(pd-l1 aapc/cho-k1细胞)与测试蛋白(例如抗体或pd-l1结合分子)一起孵育30分钟，然后在37℃下与表达pd-l1的jurkat t细胞(pd-1效应细胞)共培养6小时，所述jurkat t细胞在tcr控制下表达nfat-luc报告基因。将bioglo试剂(荧光素)添加到板的孔中，并根据标准程序使用光度计读取板的发光情况。信号的增加(以rlu测量)表明pd-1/pd-l1相互作用被阻断。已知阻断这种相互作用的pd-l1靶向单克隆抗体抗hpd-l1-higg1(n298a)(目录号hpdl1-mab12，invivogen，圣地亚哥，ca，u.sa.)作为对
照进行了测试。这些pd-1/pd-l1相互作用实验的结果在图12中示出。
[0911]
pd-l1靶向的di-slt-a1融合蛋白115749(seq id no：113)、115750(seq id no：114)和115962(seq id no：124)在某些浓度下均表现出阻断这种相互作用的能力，但活性比抗hpd-l1-higg1对照低得多，如图12所示。在该测定中，115749(seq id no：113)、115750(seq id no：114)和115962(seq id no：124)抑制pd-1/pd-l1信号传导(ec50)的半数最大有效浓度大于200nm(见图12)。pd-l1结合分子的某些其他实施方案显示在1至50nm或更低的半数最大抑制浓度下阻断pd-i/pd-l1相互作用的能力。
[0912]
v.用于测试结合分子和诱导体内免疫应答的动物模型
[0913]
动物模型用于确定示例性细胞靶向融合蛋白对肿瘤细胞和/或免疫系统的体内影响。
[0914]
a.鼠类研究
[0915]
各种小鼠品系被用于测试细胞靶向融合蛋白施用至注射了人肿瘤细胞(其在其细胞表面上表达pd-l1)ctg-1444或ctg-0192(源自患者的非小细胞肺癌(nsclc)肿瘤细胞，并在小鼠体内传代)的小鼠后，细胞靶向融合蛋白对异种移植肿瘤的影响。本实验检测的nsclc肿瘤细胞为hla：a0201阳性。
[0916]
免疫系统受损(裸的)(nude)或免疫缺陷(nog)小鼠品系用作异种移植模型。首先给小鼠施用能够识别cd8 t细胞表位的cd8 人类细胞毒性t细胞(ctl)作为人类t细胞系统的过继转移模型。将人类肿瘤细胞施用于免疫缺陷小鼠，以产生皮下肿瘤或播散性肿瘤作为人类nsclc的患者衍生的异种移植模型。
[0917]
116297(seq id no：128)的静脉内施用在两种不同的鼠模型中显示了对人类患者衍生的非小细胞肺癌异种移植物的体内疗效(参见图28a-28c和29a-29c)。在第一个异种移植模型中，116297(seq id no：128)的施用减少了免疫系统受损nog小鼠中针对侵袭形式的nsclc异种移植物的肿瘤生长并延长了终点存活期(图28b)。116297(seq id no：128)给药方案为在研究第1天6mg/kg，在研究第3、5、8、10、12、22、24和28天2mg/kg。115749(seq id no：113)和116297(seq id no：128)施用均产生了生存益处(图28c)。116297(seq id no：128)施用导致肿瘤体积为运载体对照组的67％，并且115749(seq id no：113)施用导致肿瘤体积为运载体对照组的85％(图28c)。在使用免疫系统受损的nog小鼠的第二个异种移植模型中，116297(seq id no：128)的施用促进了肿瘤消退并增加了针对源自表达相对低水平细胞表面pd-l1的nsclc细胞的nsclc异种移植的终点存活率(图29a-29c和30)。116297(seq id no：128)给药方案为研究第1天和第15天6mg/kg，在研究第3、5、8、10、12、17、19、22和24天2mg/kg。116297(seq id no：128)施用导致了肿瘤体积为运载体对照组的21％，而115749(seq id no：113)施用没有减少肿瘤生长(图29a-c和图30)。在60天研究期间，与运载体对照相比，施用116297(seq id no：128)增加了存活率(图29a-29c和30)。
[0918]
图30显示116297(seq id no：128)在异种移植(pdx)动物模型中对人类患者来源的肿瘤表现出体内活性。116297(seq id no：128)施用导致对pd-l1阳性、非小细胞肺癌(nsclc)患者衍生的异种移植产生有效且持续的应答。用116297(seq id no：128)处理导致该nsclc pdx小鼠模型(nog小鼠)中肿瘤生长的全身性消退和延迟。
[0919]
b.非人类灵长类动物研究
[0920]
示例性地，将pd-l1结合分子116297(seq id no：128)施用于食蟹猴并观察到某些
药效学作用。因为116297(seq id no：128)靶向人和食蟹猴pd-l1两者，并杀死表达食蟹猴pd-l1的细胞(参见图13、15、17a-17b和34)，食蟹猴被认为是耐受性和药效学研究的相关模型。食蟹猴pd-l1与人pd-l1具有约93％的序列同源性。
[0921]
每周一次静脉内施用116297(seq id no：128)持续4周，导致所测试的两只动物之一中的tnf-α、ifn-γ和白细胞介素-2(il-2)(即i型细胞因子)增加(参见图31)。i型细胞因子水平的增加表明由于116297(seq id no：128)施用导致t细胞激活。
[0922]
图17a报告116297(seq id no：128)结合转基因cho-k1细胞表达的人(hu)和食蟹猴(cyno)pd-l1两者。在这些条件下，116297(seq id no：128)不与转基因cho-k1细胞表达的小鼠pd-l1结合。在结合测定中使用对照抗人pd-l1抗体(“pd-l1 mab”)阿特利珠单抗。类似地，图17b显示116297(seq id no：128)对表达人(hu)或食蟹猴(cyno)pd-l1但不表达小鼠pd-l1的转基因cho-1细胞具有细胞毒性。
[0923]
图31显示116297(seq id no：128)施用导致非人灵长类动物血清中i型细胞因子增加。116297(seq id no：128)的每周、静脉内、重复给药在食蟹猴中以50μg/kg、150μg/kg和450μg/kg的剂量的探索性研究(每个剂量水平队列n＝2)中进行测试4周(在第1、8、15和22天给药)。该研究表明，在最高两个给药队列(150和450μg/kg)的两只食蟹猴之一中，116297(seq id no：128)施用在第15天和23天增加了血清i型细胞因子tnf-α、ifn-γ和il-2的水平。由pd-l1和pd-1靶向试剂驱动的免疫相关事件与患者获益相关(参见例如das s，johnson d，j immunother cancer 7：306(2019))。在图31中，μg是指每kg受试者体重施用的微克(μg)，而pg/ml是指皮克每毫升(pg/ml)。
[0924]
图32是显示示例性pd-l1结合分子例如116297(seq id no：128)的潜在作用机制的示意图。116297(seq id no：128)被设计为消耗pd-l1阳性肿瘤和免疫细胞。pd-l1结合分子可以包含连续多肽，所述连续多肽包含去免疫的志贺菌毒素a亚基效应多肽(di slta)、抗pd-l1单链可变片段(scfv)和cd8 t细胞表位肽货物(例如人cmv-pp65衍生肽)(参见图32)。这种潜在的作用机制是独特的，因为它包含两种不同的作用机制：有效杀死表达pd-l1的肿瘤和免疫细胞以及改变肿瘤免疫表型。简而言之，第一种作用机制涉及将有效的细胞毒性靶向表达pd-l1的靶细胞。首先，pd-l1结合分子的scfv片段区与细胞表面pd-l1结合；然后志贺菌毒素效应多肽组分诱导内化进入细胞并通过高尔基体细胞内径由至内质网，最后进入胞质溶胶；一旦进入胞质溶胶，志贺菌毒素效应多肽就通过酶促和不可逆的核糖体破坏有效地杀死靶细胞。一旦pd-l1结合分子位于内质网或胞质溶胶中，抗原肽货物就可从pd-l1结合分子的其余部分被切割，从而允许抗原肽转运至内质网腔和/或通过mhc i类分子的抗原肽的结合。这允许未负载的mhc i类分子装载抗原肽货物，例如，形成“装载表位-肽的mhc-i”。载有抗原的mhc i类分子然后可以从内质网通过高尔基体转运到细胞表面，以呈递cd* t细胞表位以供适应性免疫系统识别。一旦到达细胞表面，载有表位的mhc i类分子复合物可被cd8 t细胞识别，例如，导致细胞毒性t细胞接合并杀死抗原呈递靶细胞。由肿瘤细胞呈递递送的抗原可能导致“改变的免疫表型”，并导致如本文所述的抗原接种。内源性细胞毒性t细胞通过cd8 t细胞表位的递送和呈递重新定向至肿瘤靶细胞可能代表治疗受试者内肿瘤或特定基因座的改变的免疫表型。例如，i类cmv cd8 t细胞表位的递送和呈递可将内源性cmv特异性细胞毒性t细胞(ctl)重新导向肿瘤细胞。在图32中，“ctl”是指cmv特异性t细胞，其表达识别mhc i类展示的cmv病毒表位-肽复合物的tcr。在图32中，短语“改变的免疫表型”或“改变的肿瘤免疫表型”是指递送病毒cd8 t细胞表位(抗原)以将内源性cmv特异性t胞重新定向至肿瘤的结果——“抗原接种技术”或简称“ast”。去除了其病毒表位-肽货物的pd-l1结合分子可以在胞质溶胶中具有活性，其主要作用机制(moa)涉及抑制导致靶细胞杀伤的蛋白质合成。这种主要的作用机制与受试者的免疫功能状态无关。
[0925]
这种潜在的作用机制还可能涉及杀死表达pd-l1的免疫细胞，包括抑制性免疫细胞，通过去除肿瘤部位或在某些肿瘤微环境中的抑制性和/或无能细胞，导致抗肿瘤免疫监视的有利改善。116297(seq id no：128)被设计为消耗pd-l1阳性肿瘤和pd-l1阳性抑制性(即免疫抑制性)免疫细胞。肿瘤细胞(tc)和免疫细胞(ic)的pd-l1阳性与诊断为非小细胞肺癌(nsclc)的患者对阿特珠单抗(一种抗pd-l1抗体治疗剂)的持久临床反应独立相关(kowanetz m等人，proc natl acad sci u.s.a.115：e10119-e10126(2018))。116297(seq id no：128)的细胞毒性潜力可治疗性地用于(1)直接靶向pd-l1阳性肿瘤细胞以减少患者的肿瘤负担和(2)靶向抑制性免疫细胞以减少其对患者的肿瘤微环境的不良影响。例如，116297(seq id no：128)的细胞毒性潜力可用于直接靶向pd l1 tc以减少肿瘤负荷，以及通过消耗肿瘤处的pd l1 ic来减少抑制性细胞及其对tme的相关影响。
[0926]
图33显示了示例性pd-l1结合分子116297(seq id no：128)的核糖体抑制测定的结果。pd-l1结合分子116297(seq id no：128)表现出的核糖体抑制活性水平与阳性“对照”分子相当，阳性“对照”分子即单独的志贺菌毒素效应多肽(di-slta)，不与任何靶向剂或细胞-结合区或结构域偶联(即，包含seq id no：41的多肽)。因此，116297(seq id no：128)似乎保留了在其去免疫的志贺菌毒素效应多肽组分中存在于仅di-slta构建体中的催化结构域中的蛋白质合成抑制的有效酶活性。
[0927]
图34显示了示例性pd-l1结合分子116297(seq id no：128)的pd-l1靶结合测定的结果。图34显示pd-l1结合分子116297(seq id no：128)与重组人pd-l1和食蟹猴pd-l1结合，但在该测定中未表现出与重组小鼠pd-l1的高亲和力结合。
[0928]
图35显示了pd-l1结合分子处理如何诱导抗肿瘤作用，例如通过直接杀死表达pd-l1的肿瘤细胞和pd-l1阳性免疫细胞，导致肿瘤免疫表型的改变。116297(seq id no：128)是一种独特的药物，被设计为消耗肿瘤和抑制性免疫细胞。116297(seq id no：128)特异性和直接杀死pd-l1 靶细胞，在体外对肿瘤细胞和离体对免疫细胞进行了证明。116297(seq id no：128)可以递送病毒抗原货物，以与mhc i类分子复合呈递在hla*a02 /pd-l1 靶细胞表面，这可能导致组织部位、肿瘤、和/或肿瘤微环境的免疫表型的改变，从而允许效应t细胞进行有益的抗肿瘤监测。116297(seq id no：128)在药效学相关灵长类动物模型中以与人类癌症患者的预测效力相关的剂量被耐受。在图35中，“teff”是指效应t细胞，“病毒ctl”是指病毒抗原特异性ctl，“slta”是指pd-l1结合分子的志贺菌毒素a亚基效应多肽组分。
[0929]
实施例4 116297靶向pd-l1阳性肿瘤细胞(tc)通过不同的作用模式消耗
[0930]
在这个实施例中，测试了116297对具有不同pd-l1表达水平和不同作用机制的肿瘤细胞的细胞毒性。最初，通过免疫组织化学评估了29个具有代表性的肺、皮肤、乳腺和卵巢肿瘤细胞系(tc)的表面pd-l1表达，并对强度进行评分(tc1＝低表达，tc2＝中等表达，tc3＝高表达)。代表性结果如图37b所示。
[0931]
然后通过流式细胞术评估29种细胞系的pd-l1表达和体外对116297的细胞毒性敏感性。来自各种说明性细胞系的结果显示在图37a中，包括hcc1954(乳腺癌)、mda-mb-231
(三阴性乳腺癌)、hcc827(肺癌)、nci-h225(肺癌)、a549(肺癌)和mcf7(乳腺癌)。这些数据表明，116297在一系列pd-l1表达水平上对肿瘤细胞系具有细胞毒性。
[0932]
研究了116297的基于核糖体抑制的细胞毒性和ctl介导的细胞毒性。本实验中ctl介导的细胞毒性是基于抗原接种的pd-l1/hla*a02阳性靶细胞在细胞表面呈递递送的cmv cd8 t细胞表位肽货物。mda-mb-231细胞用pd-l1结合分子116297、“无ag”pd-l1结合分子对照(与116297相关但缺乏抗原肽结构域的分子)或携带cmv表位肽的“无活性”pd-l1结合分子对照、116555处理，然后在存在或不存在cmv-hla：a02限制性t细胞的情况下培养5天，以通过ifn-γ分泌测试细胞成活力和t细胞激活。如图37c所示，pd-l1结合分子根据各种作用机制杀死细胞：核糖体抑制(“无ag”pd-l1结合分子对照)和抗原肽递送(“无活性”pd-l1结合分子对照)。根据这两种作用机制，116297杀死了细胞。如图37d所示，116297刺激cmv特异性ctl分泌ifn-γ，以响应pd-l1/hla*a02靶细胞通过mhc i类系统呈递递送的cmv cd8 t细胞肽。
[0933]
实施例5116297控制体内pd-l1阳性肿瘤
[0934]
在该实施例中，评估了116297在植入人类肿瘤的免疫缺陷小鼠中控制pd-l1阳性肿瘤的能力。116297处理导致小鼠中的肿瘤得到显著控制，具有有限的毒性(图38a-38b)。116297施用抑制了植入pd-l1阳性人三阴性乳腺癌(tnbc，mda-mb-231细胞(图38a))或pd-l1阳性人非小细胞肺癌(nsclc)患者衍生的细胞的小鼠中的肿瘤生长(图38b)。此外，将这些小鼠异种移植模型中的116297活性与用缺乏病毒抗原(无cmv肽)或缺乏志贺菌毒素催化活性(116555，116297的催化失活变体)的相关分子的处理进行比较，以证明116927在体内的作用机制(图38c)。模型和功效终点总结在图38d中。这些数据表明，116297在相关肿瘤模型中控制体内肿瘤生长，并且活性取决于催化活性志贺菌毒素组分。
[0935]
实施例6 116297以相似的离体效力结合并靶向肿瘤细胞和免疫细胞
[0936]
在本实施例中，使用细胞(promega)测定法评估了116297对具有不同pd-l1表达的肿瘤细胞的细胞毒性，细胞代表高pd-l1表达(hcc1954)、中/高pd-l1表达(mda-mb-231)和pd-l1阴性(mcf7)。通过流式细胞术测定肿瘤细胞和免疫细胞亚群的pd-l1的细胞表面密度，以评估靶点表达、116297细胞结合和细胞毒效力之间的关系。图39b显示了每个细胞的细胞表面pd-l1分子的数量(圆圈)或每个细胞结合的116927分子的数量(正方形)相对于由cd
50
值表示的116297细胞毒性效力作图。还在分离的人cd14阳性单核细胞上测量了116297的细胞毒性(cd
50
)，这些单核细胞要么未经处理，要么用ifn-γ处理以诱导pd-l1表达。16297效力(cd
50
)与pd-l1表面表达以及与pd-l1阳性肿瘤细胞和免疫细胞的结合相关。如图39a所示，116297以pd-l1表达水平依赖性方式有效消耗人肿瘤细胞和免疫细胞亚群。
[0937]
实施例7在非人类灵长类动物中，116297靶向人类pd-l1阳性肿瘤细胞以消耗
[0938]
一项非人类灵长类动物(nhp)研究用于确定116297在体内的药代动力学(pk)，并估计对肿瘤细胞和免疫细胞亚群的最大细胞杀伤和受体占有率。每周以50μg/kg(116297)或450μg/kg(116297和116555)向nhp静脉内施用116297或结合分子-slta-催化失活对照116555(seq id no：160)，共4剂。
[0939]
在研究的第一天，在施用116297或116555后24小时内定期采集血样。计算药代动力学曲线并显示在图40a中。116297以50μg/kg给药的半衰期约为2.8小时，以450μg/kg给药
的半衰期约为3.7小时。在450μg/kg剂量给药后，观察到116555的半衰期约为5.6小时。
[0940]
然后从上述研究的nhp pk数据模拟人血清暴露，并与体外cd
50
值和pd-l1结合数据相关，以预测对tc和ic亚群的最大细胞杀伤和受体占有率。结果如图40b所示。
[0941]
实施例8 116297在非人类灵长类动物中引起不同特征的免疫相关不良事件
[0942]
一项非人类灵长类动物(nhp)研究也用于观察和测量体内免疫相关不良反应(irae)。每周以50μg/kg(116297)或450μg/kg(116297和11655)向nhp施用116297或116555(结合分子-slta-催化失活对照)，共4剂。该给药方案如图41a所示。
[0943]
通过流式细胞术评估来自循环的免疫细胞亚群，包括外周单核细胞(图41b)和外周t淋巴细胞(图41c)的水平。在第8天获得单核细胞样品，在第15天获得淋巴细胞样品。如图41b所示，116297治疗导致在两次施用该分子后nhp中cd14阳性单核细胞的消耗。116297治疗对cd14阳性单核细胞的杀伤是剂量依赖性的，并且需要催化活性志贺菌毒素组分，因为116555处理不会导致单核细胞消耗。如图41c所示，在两次施用该分子后，116297在nhp中扩增了t和b淋巴细胞。相比之下，施用116555不会导致nhp中的免疫细胞消耗。这项nhp研究表明116297对单核细胞的影响是剂量依赖性的，免疫细胞消耗的影响不是由pd-l1/pd-1相互作用的阻断引起的，而是需要志贺菌毒素a亚基组分的催化活性。
[0944]
在两项独立的nhp研究中评估了血清细胞因子反应。在图41d中，这些研究的结果显示为研究1(n＝2nhp)和研究2(n＝8nhp(116297)和n＝5(116555))的响应者百分比。数据反映了研究中第3剂后细胞因子的诱导。116297免疫细胞消耗和淋巴细胞活化与免疫检查点抑制剂炎症特征相关。值得注意的是，116297处理在nhp中引发了与t细胞激活和在临床上用免疫检查点抑制剂观察到的反应相关的细胞因子谱。116297的施用还导致与irae的发展相关的免疫激活谱，包括皮炎(皮肤剥落)和心肌炎。
[0945]
nhp研究还用于观察和测量体内免疫相关不良事件(irae)。将116297以50μg/kg或450μg/kg施用于nhp，并与以450μg/kg施用116555(催化失活对照)进行比较，全部每周给药，共4剂。在另外的研究中，将115749以150、450或750μg/kg的剂量施用于nhp；115765以25、150或450μg/kg的剂量施用于nhp；和115695以50、1 50或450μg/kg的剂量施用于nhp，每3天给药一次，持续2周。
[0946]
通过流式细胞术评估来自循环的免疫细胞亚群，包括外周单核细胞(图41b)和外周t淋巴细胞(图41c)的水平。如图41b所示，在两次施用该分子后观察到，11629消耗了nhp中的cd14 单核细胞。细胞杀伤是剂量依赖性的，需要催化活性志贺菌毒素组分，因为催化失活的变体116555未能引发这种反应。如图41c所示，116297施用导致nhp中t和b淋巴细胞群增加，如在两次施用该分子后观察到的；在将催化失活的116555对照pd-l1结合分子施用于nhp后，未观察到淋巴细胞群的这种增加。在用115749、115765或115695治疗nhp时未观察到这些反应(参见图44)。
[0947]
还通过独立的nhp研究评估了血清细胞因子反应。在图41d中，数据显示为研究1(2只动物的样本量)和研究2(用116297测试的8只动物和用116555测试的5只动物)的响应者百分比。数据反映了研究中在第3剂116297后有时会诱导细胞因子。116297免疫细胞消耗和淋巴细胞活化与免疫检查点抑制剂炎症特征相关。值得注意的是，116297处理在nhp中引发了与t细胞激活和在临床上用免疫检查点抑制剂观察到的反应相关的细胞因子谱。在任何测试剂量下，115749、115765和115695治疗均未引发nhp中与irae相关的细胞因子反应(图
44)。
[0948]
靶向患者的免疫细胞已显示出临床益处。例如，施用单一药物或联合ici(免疫检查点抑制剂)处理可导致与良好反应相关的免疫激活和免疫相关不良事件(irae)。然而，在这项nhp研究中，仅在高剂量组合ici mab处理后观察到irae反应，而在单药剂ici mab处理后未观察到。该数据表明nhp模型具有更高的反应阈值。
[0949]
如图42a所示，116297处理刺激免疫激活并导致药效学和irae谱，与批准的人类ici联合治疗(或nhp中的高剂量ici组合处理)一致，但与单剂ici nhp研究不一致。116297处理免疫相关反应是剂量依赖性的，由志贺菌毒素催化活性介导。这些反应可能不仅仅由pd-l1信号传导抑制和/或抗原递送介导，因为以测试剂量进行的116555处理不会触发体内免疫激活或pd反应。
[0950]
如图42b中显示的数据暗示的，基于116297的疗法可能代表一种独特的治疗方法，其作为单一药剂疗法在人类中具有潜在的有效反应。值得注意的是，心肌炎和皮炎是在临床环境中使用联合免疫检查点抑制剂观察到的常见免疫相关不良事件(irae)，并且与有益的治疗反应相关。116297处理也以剂量依赖性方式观察到心肌炎或皮炎形式的irae，并在停止给药后消退。与116927相关的不良事件可能受益于该分子相对较短的半衰期(数小时)(参见图40a)。116297诱导的irae与t淋巴细胞浸润到心脏组织相关，并且在没有志贺菌毒素催化活性的情况下未观察到，因为用116555处理不会引起心肌炎、皮炎或t淋巴细胞浸润到心脏组织中。此外，其他pd-l1结合分子115765(seq id no：161)或115695(seq id no：162)不会引发这些反应。包含与116297相同的ig重链和轻链可变结构域区域但不同的scfv接头的115749的施用不会引发心肌炎但确实导致皮炎(参见图44)。
[0951]
总之，这些数据表明116297在测试的pd-l1结合分子中具有独特的特性。116297对多种pd-l1阳性肿瘤细胞表现出最有效的体外细胞毒性，并且用116297处理导致nsclc pdx体内模型中的肿瘤生长延迟和存活益处(参见，例如，图29a-29c)。116297直接杀死pd-l1阳性免疫细胞。116297处理在nhp中引发免疫介导的irae谱，该曲线类似于与用免疫检查点抑制剂处理的患者的临床益处相关的irae谱。如图42a所示，用116297消耗靶向细胞可能会导致临床上使用抗体阻滞剂未观察到的独特益处，抗体阻滞剂仅通过空间阻滞介导活性。116297刺激免疫激活和药效学和irae谱，与nhp中的联合检查点抑制剂一致，但与单药检查点抑制剂不一致。
[0952]
由于irae尚未在单药剂mab检查点抑制剂的nhp模型中出现，因此116297处理诱导的irae反应表明，作为一种独特的pd-l1靶向单一疗法，可能对患者有益。116297靶向pd-l1具有多种作用机制，与政府监管部门批准的pd-l1单克隆抗体以批准剂量施用相比，这可能会提供改进的反应。
[0953]
实施例9 pd-l1结合分子活性比较
[0954]
本研究的目的是比较116297和其他pd-l1结合分子在靶细胞中诱导抗原特异性t淋巴细胞(ast)反应的能力，作为靶细胞暴露于分子的时间的函数。
[0955]
在共培养细胞成活力测定中，将包含不同结合结构域的pd-l1结合分子相互比较。简而言之，将pd-l1结合分子与pd-l1阳性和hla：a*02阳性靶细胞以高密度孵育4小时或24小时(参见表15)。然后洗掉结合分子。每个测试的pd-l1结合分子包含用于递送至靶细胞的肽抗原(nlvpmvatv，seq id no：78)。随后，限制于由结合分子递送的肽抗原的细胞毒性t淋
巴细胞(ctl)与预先处理的靶细胞共培养，效应细胞与靶细胞的比例为1∶1。共培养48小时后，收获上清液并用于检测ifn-γ作为通过elisa对ctl活化的读数。还使用incuctye s3(sartorius)系统在60-72小时测量成活力，由单层的汇合确定。比较pd-l1结合分子在急性孵育和冲洗(4小时)或与靶标持续孵育(24小时)后促进直接细胞杀伤或介导t细胞激活(即，ifn-γ分泌)的能力。
[0956]
表15：pd-l1和hla：a＊02阳性靶细胞和hla：a＊02 nlvpmvatv(seo id no：78)限制性效应细胞
[0957][0958]
结果示于图45a、45b并总结在下表16中。测试的pd-l1结合分子证明了t胞依赖性活化和细胞杀伤。与4小时“急性”pd-l1结合分子孵育实验相比，在24小时“持续”孵育实验中，通过ifn-γ分泌测量的t细胞激活效力以及在存在ctl的情况下引发的细胞杀伤反应总体增加(图45a)。
[0959]
值得注意的是，与测试的其他pd-l1结合分子相比(compated)，116297和116555(其在志贺菌毒素效应多肽组分中包含两个点突变以降低分子的酶活性)在“急性”刺激(～20pg/ml)后引起t细胞的ifn-γ分泌增加，并且在“持续”pd-l1结合分子暴露后，ifn-γ分泌进一步增加到约40-80pg/ml。这在由非相关结合结构域组成的另外两种pd-l1结合分子(115765和114895)中没有观察到，其在持续但非急性暴露后仅引发约20pg/ml的ifn-γ分泌(图45a)。
[0960]
此外，116297展示了在4小时的孵育和冲洗后，引发约40％的pd-l1表达细胞群的ctl介导的细胞杀伤的能力。使用包含不同结合结构域的测试的其他pd-l1结合分子未观察到这种40％的细胞杀伤水平。其他测试的pd-l1结合分子(115765和115749)需要24小时持续暴露以诱导至少40％的靶细胞群的ctl介导的杀伤(图45b)。
[0961]
上述数据表明，与包含不同scfv结合结构域或scfv接头的其他pd-l1合分子相比，116297显示出更快速和更有效的t细胞激活。上述关于116297、116555的催化失活变体的数据提供了支持证据，证明测试的pd-l1结合分子表现出的理想特性与116297和116555的结合结构域相关。在使用115749(其保留与116297结合结构域相同的重链和轻链可变区，但scfv接头不同，导致单体而非同型二聚体分子)的实验中缺乏这种活性表明，116297的活性和效力可能归因于其结合结构域的结构/功能与其整体同型二聚体结构的组合。
[0962]
表16：测定结果
[0963][0964][0965]
还测试了116297和其他独特的pd-l1结合分子特异性消耗免疫细胞的能力。这些研究的目的是确定116297是否表现出与非人类灵长类动物(nhp)中的单核细胞消耗和免疫相关不良事件(irae)的发展相关的活性，而这些活性在其他pd-l1结合分子中未观察到。
[0966]
pd-l1结合分子与(i)用ifn-γ(100iu/ml)处理以诱导pd-l1表达的原代人单核细胞(ic)，(ii)表达高水平pd-l1的hcc1954肿瘤细胞，或(iii)不表达pd-l1的mcf7肿瘤细胞之一孵育(参见表17)。使用剂量系列将pd-l1结合分子添加到细胞中，最终pd-l1结合分子浓度范围为0.631-20,000ng/ml(6或8倍稀释)，并在整个研究持续时间内保持在培养物中。在测定的第5天，使用标准细胞titer glo测定评估细胞的成活力，如上所述。
[0967]
表17：靶细胞
[0968][0969]
结果示于图46a、46b并总结在表18中。116297通过在来自四个个体供体的细胞中在20μg/ml降低成活力约60％和在2μg/ml降低成活力40％，引起代表性的原代单核细胞ic群体的剂量依赖性消耗。用缺乏c末端cd8 t细胞表位-肽货物的pd-l1结合分子114963(seq id no：260)、114964(seq id no：261)和115695(seq id no：162)观察到了类似的反应。值得注意的是，与116297相比，其他pd-l1结合分子对单核细胞的效力降低，包括115749，115749是116297的单体变体，包含与116297相同的结合结构域和抗原肽货物，以及其他pd-l1结合分子115765和114895，115765和114895包含不同的结合结构域并包含相同的肽抗原货物。
[0970]
缺乏c末端肽-抗原货物的114962(seq id no：259)，不能像116555一样靶向单核细胞进行细胞消耗，116555是116297的类似物，其具有点突变(y77s，e167d)，使slta-i的酶效力严重地减弱。阴性对照单独的di-slta未显示对测定中测试的单核细胞的直接活性。
[0971]
与不同pd-l1结合分子对单核细胞的不同活性相比，pd-l1结合分子对表达pd-l1靶标的tc系hcc1954显示出相似的效力，并且对pd-l1阴性对照系mcf7具有相似的活性缺乏。
[0972]
表18：靶细胞
[0973][0974]
测试的所有pd-l1结合分子均引发了tc对照系的有效细胞杀伤(最大反应＞90％)，并显示出低于10ng/ml的效力，但114962、115749和114895(＞35ng/ml)除外。116297、115695、114964和115963均对pd-l1阳性细胞表现出相当的选择性细胞毒性。与116297相比，115765、115749和114895在20μg/ml下显示出活性降低，并且在较低的2μg/ml浓度下不能消耗单核细胞(与催化失活的116555相似的反应)。
[0975]
这些数据共同表明，虽然pd-l1结合分子在体外显示对tc相似的效力范围，但对ic亚群例如单核细胞的效力仅存在于这些分子的亚组中。该分子亚组包括116297、115695、114964和115963。值得注意的是，该亚组中只有116297代表pd-l1结合分子，该分子能够通过slta酶活性递送直接细胞毒性，并通过cd8 t细胞表位-肽的递送和ctl接合递送间接细胞毒性。此外，116297的这种体外活性与观察到的116297在nhp中单核细胞的体内消耗相关，而在其他测试的分子中没有观察到，例如，在体内nhp研究中，115695、115749或115765处理不会导致ic消耗、免疫相关不良事件的产生或免疫刺激活性。
[0976]
实施例10与pd-l1结合并包含志贺菌毒素a亚基支架的pd-l1结合分子
[0977]
在该实施例中，结合pd-l1靶生物分子的细胞外部分的结合区与毒素或其片段或衍生物融合，所述结合区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含三个cdr，每个cdr包含或基本上由seq id no：27、29、30和/或32中任一项所示的氨基酸序列组成，所述轻链可变区包含三个cdr，与seq id no：19、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：25和/或seq id no：26具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，结合区融合至志贺菌毒素效应多肽(例如，seq id no：1-18和40-68中的任一项)。志贺菌毒素效应区衍生自志贺毒菌素或志贺样毒素的a亚基(例如seq id no：1-18中的任一项)，任
选地使得其包含本文所述的亚区的组合，以提供以下的两个或更多个：1)去免疫，2)蛋白酶切割抗性，和/或3)嵌入或插入的异源t细胞表位(例如描述于wo 2014/164680、wo 2014/164693、wo 2015/138435、wo 2015/138452、wo 2015/113005、wo 2015/113007、wo 2015/191764、wo 2016/196344、wo 2017/019623、wo 2018/106895和wo 2018/140427中任一项的志贺菌毒素效应多肽)。
[0978]
所得融合蛋白作为单链多肽或多聚体产生和纯化，其任选地是多价的(例如包含两个或更多个pd-l1结合区)。该实施例的示例性蛋白质任选地使用本领域已知的技术产生具有羧基末端kdel型信号基序，并且任选地连接至另外的外源物质，例如cd8 t细胞表位-肽货物和/或检测促进剂。使用表达适当pd-l1分子的细胞，如前面实施例中所述测试本实施例的示例性蛋白质。本实施例的示例性pd-l1靶向融合蛋白可用于例如杀死表达pd-l1的细胞、标记靶细胞的亚细胞区室和诊断和治疗疾病、紊乱和/或病症，例如，各种癌症和肿瘤。
[0979]
发明简述
[0980]
在测试的其他pd-l1结合分子中，基于其体外对表达pd-l1的细胞的细胞毒性效力选择了116927，并且116927在非人灵长类动物模型中还显示出意想不到的活性。当与具有不同免疫球蛋白结合结构域的其他pd-l1靶向分子(例如115765或114895)或不同scfv-接头(115749)相比时，116297施用至pd-l1表达细胞导致对两种pd-l1阳性肿瘤细胞系pd-l1高( )和中等( )最有效的志贺菌毒素a亚基催化活性介导的细胞毒性效力(参见图43a、43b)。随着pd-l1细胞表面表达水平的降低，116297对其他pd-l1靶向分子的更大相对细胞毒性效力得以维持，这表明与其他pd-l1结合分子相比，116297可能具有更大的治疗窗和/或可能能够更有效地杀死具有更中度的pd-l1表达的pd-l1表达细胞(参见图43a、43b)。此外，116297(seq id no：128)可能在没有肿瘤浸润淋巴细胞的情况下对体内的肿瘤细胞产生细胞毒性，并且无论肿瘤微环境的免疫调节状态如何，例如无论肿瘤的特征在于“热”还是“冷”、非发炎或免疫排除肿瘤。
[0981]
116297(seq id no：128)能够在人类患者衍生的异种移植小鼠模型中表现出生存益处和抗肿瘤活性。非人灵长类动物可以耐受450μg/kg的116297(seq id no：128)静脉内施用4周。116297(seq id no：128)表现出对临床相关肿瘤细胞的有效细胞毒活性，116297(seq id no：128)与pd-l1表达水平有一定关系。116297(seq id no：128)能够表现出三种不同的作用机制：#1)通过细胞内化和催化活性直接杀伤pd-l1表达细胞；#2)通过抗原递送、呈递和ctl识别间接细胞杀伤pd-l1表达细胞；和#3)阻断pd-1/pd-l1相互作用。虽然116297(seq id no：128)可能会杀死表达pd-l1的健康外周免疫细胞，但这可能仅限于具有升高的pd-l1表达的单核细胞亚组，并且如果具有升高的pd水平的这些免疫细胞正在抑制对肿瘤细胞的免疫应答，则可以在肿瘤部位提供益处。
[0982]
靶向pd-l1的单克隆抗体(mab)作为免疫检查点抑制剂，通过物理抑制pd-l1和pd-1之间的相互作用来防止免疫检查点激活并恢复t细胞对肿瘤细胞的功能。
[0983]
据报道，作为免疫检查点抑制剂(ici)的单克隆抗体，包括靶向pd-1、pd-l1和ctla-4的单克隆抗体可提供良好的临床益处。尽管大多数接受ici的患者没有经历免疫相关不良事件(irae)，但ici治疗的临床益处与免疫相关反应相关，例如irae(参见das s等人j immunother cancer7：306(2019))。在非人类灵长类动物(nhp)研究中，经批准的ici单药
治疗在任何剂量下都不会导致任何irae。然而，在nhp模型中，当以两种或更多种ici mab组合给予且剂量远高于预期临床剂量时，单药剂ici mab施用可导致irae(changhua j等人，clin cancerres 25：4735-48(2019))。如本文实施例中所述，出乎意料地观察到将116297作为单一药剂施用于nhp在相当大比例的动物中导致irae。
[0984]
如实施例中所述，116297施用于nhp可导致免疫激活和irae的呈现，irae与在用ici治疗的患者中与有益反应相关的那些irae相似(参见图42b；nakamura y，front med(洛桑)6：119(2019))。116297的活性不同于ici mab，因为116297作为单一药剂产生这些效果。此外，这些反应与单核细胞的消耗有关，单核细胞显示以pd-l1表达依赖性方式消耗，因此将116297诱导免疫激活和irae的能力与与pd-l1靶向相关的药效学作用联系起来。
[0985]
nhp的116297处理导致免疫亚群(包括t淋巴细胞、b淋巴细胞、nk细胞和嗜酸性粒细胞)的剂量依赖性外周扩增。免疫扩增与细胞因子分泌相关，包括il-6、il-10、ifn-γ、tnf-α和il-2(参见图42b)。观察到的功能性免疫活动进一步与心脏组织的免疫浸润(心肌炎)和皮炎irae的发展相关，这些皮炎irae与临床环境中ici处理后观察到的irae相似(nakamura等人，2019)。这些由pd-l1结合分子诱导的irae在剂量停止后消退，与116297的短半衰期一致。
[0986]
如实施例中所示，116297的特性取决于细胞杀伤的志贺菌毒素a亚基催化机制，因为施用具有使志贺菌毒素组分的催化活性失活的点突变的pd-l1结合分子变体116555在nhp中不显示任何免疫激活、细胞消耗或任何irae的呈现(参见图41b、41c和41d)。
[0987]
此外，116297的特性与scfv cdr、重链和轻链和/或scfv接头相关，因为尽管在nhp中以与116297相当的剂量和更高频率给药，具有不同可变结构域的分子(115765和115695)在灵长类动物模型中没有相同的效果(图44)。在nhp研究中，115765和115695没有显示出直接清除免疫亚群、免疫亚群扩增或组织浸润以促进irae发展的迹象。
[0988]
115749是一种单体和单价pd-l1结合分子，它包含与116297相同的结合结构域，但scfv接头长度不同，没有显示出免疫消耗或激活，但有一些irae发展的迹象(皮炎)，表明依赖于116297和115749之间共有的ig结构域的特异性结合特性，表明nhp中的完全免疫激活和irae发展可能是由于重链和轻链之外的116297特有的另外的结构/功能。
[0989]
尽管本发明的一些实施方案已通过说明的方式进行了描述，但很明显，在不脱离本发明的精神的情况下，本发明可以通过许多修改、变化和适应以及使用在本领域技术人员范围内的许多等效物或替代解决方案来付诸实践。
[0990]
所有的出版物、专利和专利申请都以引用的方式整体纳入本文，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地通过引用整体纳入的程度相同。国际专利申请公开wo 2014/164680、wo 2014/164693，wo 2015/138435、wo 2015/138452、wo 2015/113005、wo 2015/113007、wo 2015/191764、wo 2016/196344、wo 2017/019623、wo 2018/106895、wo 2018/140427、wo 2019/183093和wo 2020/154475各自以引用的方式整体纳入本文。美国专利申请us2015/259428、us2016/17784、us2017/143814和us62/644,832的公开内容均通过引用的方式整体纳入本文。来自genbank(美国国家生物技术信息中心)的关于本文引用的氨基酸和核苷酸序列的所有电子可用生物序列信息的完整公开内容均通过引用的方式整体纳入本文。
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