一种聚苯乙烯高效降解菌菌株及其应用

1.本发明涉及微生物领域，具体涉及一种聚苯乙烯高效降解菌及其应用。


背景技术：

2.塑料是以来源于石油、煤炭和天然气等有机物单体为原料，通过加聚或缩聚反应聚合而成的高分子化合物。塑料的应用推动了近代人类社会的发展，但随着塑料数量的急速增多，塑料污染已经成为全世界都在面临的环境问题。聚苯乙烯（polystyrene，ps）塑料制品中产量和用量最高的聚合物之一，由于其分子质量较大、疏水性强、化学键能高、生物可及性低导致其在自然环境中很难被微生物降解。塑料可以通过热、光氧化等多种机制降解，但其降解速度极为缓慢，增加其降解速度的条件过于苛刻，且容易产生危害性较强的二次污染物。微生物降解塑料是解决废弃塑料极具潜力的方法，该方法绿色环保，不会产生二次污染，成本较低，能将塑料降解为二氧化碳和水。因此，找到高效降解聚苯乙烯的微生物，对于解决白色污染、节约面临枯竭的石油资源、减少二氧化碳排放量、生态环境保护等具有重要意义。现如今针对聚苯乙烯等塑料废弃物生物治理的方法研究较少，有效菌种资源不多，治理效率低，限制了其进一步的扩展应用。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种聚苯乙烯高效降解菌菌株及其应用，该菌株可以有效降解聚苯乙烯塑料，包括聚苯乙烯薄膜、聚苯乙烯颗粒、聚苯乙烯粉末。
4.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种聚苯乙烯高效降解菌菌株，该菌株为肠杆菌enterobacter sp. eet0601，于2021年6月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2021792。
5.本发明还提供所述菌株在聚苯乙烯塑料生物降解中的应用，具体包括在各生态体系中生物降解各种状态聚苯乙烯塑料。
6.进一步地，所述应用包括所述菌株在固体或液体培养基中对聚苯乙烯薄膜、颗粒、粉末的降解。
7.进一步地，所述应用包括采用所述菌株制备降解聚苯乙烯塑料的产品。
8.本发明还提供一种降解聚苯乙烯塑料的产品，所述产品中包含采用所述菌株制成的菌液。
9.本发明还提供一种降解聚苯乙烯塑料的方法，包括：采用所述的菌株制备成菌液；将所述菌液加入含有聚苯乙烯塑料的液体或固体培养基中培养。
10.本发明的优点：本发明提供的菌株，对聚苯乙烯塑料具有很好的降解效果。利用本发明的菌株对聚苯乙烯薄膜进行降解，40天后聚苯乙烯薄膜表面有明显的凹坑，亲水性明显增加，表面破损严重。本发明提供的菌株及利用该菌株降解聚苯乙烯塑料的方法，绿色环保，成本低廉，操作方便，为环境中聚苯乙烯废弃物的处理提供了新资源和思路，应用前景
广阔。
附图说明
11.图1为本发明提供的聚苯乙烯降解菌的菌落形态图；图2为本发明提供的聚苯乙烯降解菌的生长曲线图；图3为本发明提供的聚苯乙烯降解菌的系统发育树；图4为本发明提供的聚苯乙烯降解菌降解40天后聚苯乙烯薄膜的扫描电镜图；图5为本发明提供的聚苯乙烯降解菌降解前后聚苯乙烯薄膜表面官能团的变化；图6为本发明提供的聚苯乙烯降解菌降解前后聚苯乙烯薄膜的水接触角变化。
具体实施方式
12.为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
13.本发明实施例中用到的原料和试剂如无特殊说明，均为市售商品。采用的实验方法、仪器设备均为实验室常规技术。
14.实施例1聚苯乙烯降解菌菌株的分离筛选与鉴定（1）eet0601菌株的分离筛选黄粉虫可以啮食降解聚苯乙烯，将其完全降解矿化为二氧化碳，并利用同化为虫体脂肪，同时已被证明是其肠道微生物起主导作用。故本发明首先喂食黄粉虫聚苯乙烯泡沫，在其肠道中富集可以降解聚苯乙烯的菌株，60天后解剖得到其肠道，以黄粉虫肠道作为待分离样品进行分离筛选，将其转接至液态无碳基础培养基中，加入聚苯乙烯粉末，25℃、150 rpm振荡培养60 d，吸取菌液于营养琼脂平板上，用稀释涂布平板法分离菌株，并多次划线纯化分离得到菌株。将分离到的菌株保存后，在无碳基础琼脂培养基上验证其对聚苯乙烯的降解能力。
15.其中，分离筛选的培养基为液态无碳基础培养基（lcfbm）：0.7 g kh2po4、0.7 g k2hpo4、0.7 g mgso4·
7h2o、1.0 g nh4no3、0.005 g nacl、0.002 g feso4·
7h2o、0.002 g znso4·
7h2o、0.001 g mnso4·
h2o，将上述试剂溶解于1 l去离子水中，即为液体培养基。向其中加入1.5%的琼脂即为固体培养基。
16.通过上述的分离与筛选工作，多次分离纯化，获得一株能够利用聚苯乙烯为碳源和能源生长的菌株，将其命名为eet0601，该菌株在营养琼脂平板上菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，如图1所示。
17.（2）eet0601菌株的生理特征及分子生物学鉴定lb培养基，以37℃、220 rpm的条件培养，对培养至对数期的菌体进行革兰氏染色。
18.光学显微镜下，菌株经革兰氏染色显红色，为革兰氏阴性菌株。在lb培养基中的生长曲线如图2所示，在lb培养基中生长迅速，2小时后进入对数期，8小时后进入称稳定期。
19.采用细菌通用引物27f、1492r作为扩增引物对上述分离获得的单一菌株进行pcr扩增。
20.16s rdna序列引物27f：5'-aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3'，seq id no.2；1492r：5'-ggt tac ctt gtt acg act t-3' ，seq id no.3。
21.对扩增产物进行电泳检测，委托生工生物工程公司测序，16s rdna序列如seq id no.1所示。将所得的序列与ncbi数据库中已有的序列进行blast分析，并选取同源性相近的菌株，采用mega 11.0软件构建系统发育树。
22.在ncbi上进行16s rdna序列比对结果显示，霍氏肠杆菌enterobacter hormaechei strain bw的相似性为99％，且在进化距离上相对较近，菌株的系统发育树如图3所示，结合菌株的生理生化特征，初步将其鉴定为肠杆菌，并命名为enterobacter sp. eet0601。将该菌株送交至中国典型培养物保藏中心（武汉大学）保藏，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为cctcc no：m 2021792，保藏日期为2021年6月28日。
23.实施例2 聚苯乙烯降解菌菌株对聚苯乙烯薄膜的降解实验聚苯乙烯薄膜的制备：将ps微珠溶解在二甲苯（20 mg/ml）中，然后将溶液倒在玻璃培养皿上，每个培养皿大约15 ml，通风橱中晾干后将形成的膜从平板上取下。将塑料薄膜切成3
×
3 mm的小块，并用乙醇和去离子水冲洗，最后浸泡在乙醇中，在超净台晾干备用。
24.挑取单菌落至3 ml nb培养基中，30℃、120 rpm过夜培养，离心（6000 rpm、10 min）收集细胞，并用lcfbm培养基冲洗除去残留的nb培养基，重复3次。将收集到的细胞重悬于等体积lcfbm培养基中以获得细胞悬浮液。
25.取10 μl上述细胞悬浮液于无碳基础琼脂培养基平板上，覆盖一层聚苯乙烯薄膜，30℃下正置培养40天后分析聚苯乙烯薄膜表面的形貌变化，官能团变化以及疏水性变化。
26.聚苯乙烯膜处理方法：用2% sds溶液振荡洗涤去除表面的生物膜，将薄膜固定喷金后在扫描电子显微镜（quanta 250 feg，fei）下观察其微观形貌变化。采用傅里叶红外光谱仪（nicolet is50，thermo fisher scientific）测定薄膜表面官能团的变化，扫描波长范围600-4000 cm-1
，分辨率4 cm-1
，扫描次数32次。用接触角测量仪测定水接触角的变化，表征薄膜表面疏水性变化。
27.由图4可见，经过40 d的培养，在扫描电镜下观察到接菌处理的薄膜与对照组相比表面粗糙，表而出现明显的微生物侵蚀孔洞，并且由图6可见，经接触角测量仪结果显示，接菌处理的聚苯乙烯薄膜水接触角下降了11
°
，表明接菌处理显著降低了薄膜的疏水性，更易于被微生物附着侵蚀。同时图5的ftir结果显示，降解后ps薄膜出现了新的特征峰，在3340 cm-1
检测到了羟基峰，o-h的出现是ps发生生物降解的基本标志，表明聚苯乙烯发生了生物降解。
28.此外本发明的菌株也可以降解颗粒和粉末状态的聚苯乙烯塑料。将聚苯乙烯塑料颗粒或粉末直接添加在固体或液体培养基中，然后将本发明的菌株接种在上述培养基中进行培养，直至聚苯乙烯塑料全部降解。
29.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。