Stk11基因敲除细胞系及其构建方法和用途

stk11基因敲除细胞系及其构建方法和用途
技术领域
1.本发明涉及一种stk11 (serine/threonine kinase 11)基因敲除细胞系的构建方法和用途，属于现代农业和医学研究领域的应用技术。


背景技术：

2.stk11（又叫lkb1）在哺乳动物多种组织中广泛表达，在骨骼肌组织中表达量较高。stk11基因突变与多种肿瘤的发生相关，因此被认为是抑癌基因。stk11基因编码的蛋白质是重要的蛋白激酶，在体内发挥多种生理功能，参与调控肌肉发育、脂肪生成、细胞生长、能量代谢和肿瘤发生发展等。
3.stk11基因可能与肌内脂肪沉积、肌细胞分化和融合及肌纤维形成相关，但目前关于stk11基因调控肌纤维发育和肌内脂质代谢的机制鲜见报道，也未有stk11基因敲除的相关细胞系。比如通过敲除动物模型研究，体外细胞实验每次需要分离原代肌卫星细胞，繁琐周期长、不易操作，成功率低。
4.因此，构建stk11基因敲除的成肌（myoblast）细胞系并研究其在调控肌细胞的增殖、分化和融合及肌内脂肪沉积等过程中的功能具有重要的意义。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种stk11基因敲除细胞系及其构建方法和用途。
6.一种stk11基因敲除细胞系的构建方法，包括以下步骤：1）根据小鼠stk11基因全长序列和plent-u6-gfp-puro载体的信息设计并合成含有mlu i及bamh i酶切位点的靶向stk11的引物序列；正义寡核苷酸序列如seq id no. 1所示；反义寡核苷酸序列如seq id no. 2所示；2）stk11干扰质粒（简称plent-u6-shstk11）的构建及其慢病毒制取：将1）stk11的shrna引物退火反应形成互补双链，然后将退火产物用mlu i和bamh i双酶切，再与双酶切后的plent-u6质粒连接，构建stk11干扰质粒（plent-u6-shstk11），转化大肠杆菌，并挑选单克隆菌pcr和测序鉴定；将阳性克隆菌质粒提取后，采用脂质体转染法将12μg plent-u6-shstk11和9
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g pspax.2及3.5
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g pmd2.g共转染到293t细胞中，48h后获得plent-u6-shstk11慢病毒载体；3）stk11基因敲除的c2c12细胞系构建：用制取的plent-u6-shstk11慢病毒载体转染小c2c12成肌细胞，通过嘌呤霉素筛选获得稳定敲除stk11基因的c2c12细胞系。
7.步骤2）所得的plent-u6-shstk11慢病毒载体进行鉴定：转染密度为70%~80%的293t细胞，48 h后用收集细胞，提取总蛋白并用western blot 法检测目的蛋白stk11和内参gapdh蛋白表达情况。
8.一种根据所述的构建方法得到的stk11基因敲除细胞系。
9.一种根据所述的stk11基因敲除的细胞系的用途，用于研究敲除stk11对成肌细胞融合、分化、肌纤维发育及相关基因表达与调控机制，用于药物筛选和制备。
10.所述的用途，stk11基因敲除下调细胞中肌细胞融合基因。
11.所述的用途，stk11基因敲除下调细胞中myhc的表达量。
12.本发明的有益效果：本发明提供了一种潜在调控肌肉发育和预防肌肉萎缩的关键靶点stk11，借助于构建的stk11基因敲除的c2c12细胞系，证实了成肌细胞敲除了stk11后显著抑制肌细胞的分化和融合过程，最终导致肌纤维形成缺陷，这可能作为临床上治疗肌肉萎缩和预防肌肉性疾病提供依据。
13.本发明建立得到的stk11基因敲除的c2c12细胞系稳定敲除stk11，细胞可多次传代且能保持优良的特性，是研究stk11基因功能的一种强有力的细胞模型，可用于体外探究stk11在调控成肌细胞融合、分化等方面的研究，开拓了目前研究小鼠stk11功能及其在成肌细胞中研究的新方法；其次，该细胞系可以用于研究stk11对肌纤维发育方面的调控功能研究，可以抑制肌细胞融合等；而且，stk11与糖脂代谢密切相关，可用于探究stk11对肌细胞糖脂代谢和肌细胞内脂肪沉积的影响及作用机制。可用于开展stk11对线粒体功能和肌内脂肪沉积、能量代谢和自噬等多方面的研究，适合于开展更多和stk11基因功能相关的实验，可用于药物筛选和制备，应用前景广泛。
附图说明
14.下面结合附图对本发明的具体实施方式和用途作进一步详细说明。
15.图1 是所用载体的图谱。
16.图2 是不同梯度的stk11基因shrna载体转染细胞，48小时后观察荧光强度图；用于确定慢病毒最佳moi（multiplicity of infection，感染复数），6个梯度（1-10-6
μl，分别编号为1-6）。
17.图3 是stk11基因shrna载体转染c2c12成肌细胞48h后用嘌呤霉素筛选3天得到的稳转细胞图；其中，左边gfp
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plent-u6 转染，右边sh-stk11
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plent-u6-shstk11转染。
18.图4 是稳定敲除stk11的c2c12成肌细胞系，然后体外用2%马血清成肌诱导3天stk11基因表达的qpcr检测结果；其中，左边gfp
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plent-u6 转染，右边sh-stk11
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plent-u6-shstk11转染。
19.图5 是稳定敲除stk11的c2c12成肌细胞系，然后体外用2%马血清成肌诱导3天，目的蛋白stk11和分化标志蛋白myhc表达的western blot检测结果图。
20.图6 是稳定敲除stk11的c2c12成肌细胞系，然后体外用2%马血清成肌诱导3天，鉴定敲除stk11调控肌细胞分化指标的统计分析结果图；其中，左边gfp
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plent-u6 转染，右边sh-stk11
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plent-u6-shstk11转染。
21.图7是稳定敲除stk11的c2c12成肌细胞系，然后体外用2%马血清成肌诱导3天，肌细胞分化标志基因表达的qpcr检测结果。
22.图8是稳定敲除stk11的c2c12成肌细胞系，然后体外用2%马血清成肌诱导3天，鉴定敲除stk11调控肌细胞融合指标的统计分析结果图；
其中，左边gfp
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plent-u6 转染，右边sh-stk11
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plent-u6-shstk11转染。
23.图9是稳定敲除stk11的c2c12成肌细胞系，然后体外用2%马血清成肌诱导3天，肌细胞融合关键基因表达的qpcr检测结果。
24.图10是稳定敲除stk11的c2c12成肌细胞系，然后体外用2%马血清成肌诱导5天，鉴定肌纤维形成的免疫荧光染色的检测结果图；其中，左边gfp
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plent-u6 转染，右边sh-stk11
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plent-u6-shstk11转染。
具体实施方式
25.下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
26.（一）、小鼠stk11基因敲除载体构建与鉴定1、小鼠stk11基因全长引物设计与合成根据genbank小鼠stk11基因序列，利用primer 5.0设计特异性针对stk11基因的shrna序列。质粒载体选用plent-u6-gfp-puro（简称plent-u6，图1），为了便于与plent-u6载体克隆，在引物两端加上mlu i及bamh i的酶切位点，模板链后面连接rna polyiii聚合酶转录终止位点。设计好的引物序列由上海生工生物工程公司合成，引物序列如下：正义寡核苷酸：5
’‑
gatccgcagaagatgtatatggtgatttcaagagaatcaccatatacatcttctgctttttta-3’；反义寡核苷酸：5
’‑
cgcgttaaaaaagcagaagatgtatatggtgatttcaagagaatcaccatatacatcttctgc-3’。
27.2、模板合成正义寡核苷酸链：按以下体系配制退火反应体系：正义寡核苷酸
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5μl反义寡核苷酸
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5μlnacl
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100 mmtris-cl ph7.4
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50mm加水补足
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50 μl。
28.将配制好的退火反应缓冲液重复混合，离心并运行以下程序： 90℃ 4min，70℃ 10min，55℃ 10min，40℃ 10min，25℃ 10min。
29.3、双酶切双酶切体系（50 μl）：10
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buffer k
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50μlmlu i
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10ubamh i
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20uplent-u6质粒或pcr产物
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2μg双蒸水补足
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50μl
反应条件：37℃ 3.5 h。
30.4、连接反应利用t4 dna ligase连接目的片段得到stk11干扰质粒（plent-u6-shstk11）反应体系：10
ꢀ×ꢀ
t4 dna ligase buffer
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1μlt4 dna ligase
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1μl双酶切后的基因pcr产物
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30ng双酶切后plent-u6质粒
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60ng反应条件：16℃过夜。
31.5、转化与鉴定将dh5α大肠杆菌感受态细胞在冰上冻融，取5μl连接体系加入到50μl dh5α大肠杆菌感受态细胞中混匀，放冰上30min，然后在42℃的水中保持90s，迅速取出后置于冰上4min，加750μl lb培养液，37℃振荡培养50min。取150 μl培养液涂板，37℃过夜培养，挑选菌落进行pcr检测，扩大培养阳性克隆，并保存菌液。并将阳性克隆扩大培养后，提取质粒并进行双酶切鉴定，对鉴定的阳性质粒送上海生工公司进行测序。
32.6、plent-u6-shstk11质粒转染293t验证：取8
×
105个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中，然后用脂质体转染plent-u6-shstk11质粒，48小时后提取蛋白，用western blot 法检测stk11和内参gapdh的表达。
33.（二）plent-u6-stk11重组慢病毒的制备1、质粒抽提本实验通过qiagen质粒提取试剂盒提取重组质粒，步骤如下：1）新鲜培养板中挑取单克隆于15ml离心管中，离心管中有3ml 含amp的lb培养基，37℃，300rpm培养8h。
34.2）按1/500-1/1000比例接种于含amp的lb培养基中，37℃，300rpm培养14-16h。
35.3）将获得的菌液4℃，6000rpm离心15min。
36.4）加入rnase a的buffer p1中，取出10ml充分重悬菌斑。
37.5）加入10ml buffer p2，轻柔颠倒4-6次混匀彻底，室温（15-25℃）孵育5min。
38.6）加入10ml buffer p3，立刻轻柔颠倒4-6次彻底混匀，冰上孵育20min。
39.7）以4℃，15000rpm离心40min，立刻取含有质粒的上清。
40.8）以4℃，15000rpm离心20min再次离心，取上清。
41.9）向qiagen-tip 500中加入10ml buffer qbt平衡柱子，通过重力使其自然流空。
42.10）将从第8）步获取的上清移入柱子，使其自然流下通过滤膜。
43.11）用2
×
30ml buffer qc冲洗柱子。
44.12）用15ml buffer qf洗脱dna。
45.13）加入10.5ml（0.7倍体积）室温异丙醇到洗脱液中沉淀dna。立刻混匀，4℃，15000g离心30min。小心弃上清。
46.14）加入5ml室温70%酒精，15000rpm离心10min。
47.15）空气中干燥沉淀5-10min，用300μl的超纯水溶解dna。
48.16）通过核酸定量仪测定质粒的浓度和纯度，浓度应在1μg/μl，od比值应在1.80以
上。
49.2、细胞转染与慢病毒制取采用脂质体转染法将慢病毒质粒，分别同各自的包装质粒和包膜质粒共转染到293t细胞中，获得重组慢病毒。具体步骤如下：1）在10 cm2细胞培养皿中铺3.0
×
106个293t 细胞；2）细胞的汇合度达到70%-80%左右时，在6孔板的单孔中加入3 ml预热的dmem培养基，然后分别加入plent-u6慢病毒质粒和其包装质粒，轻轻混匀后室温放置5min。慢病毒质粒12μg，9
ꢀµ
g pspax.2和3.5
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g pmd2.g。
50.3）在使用lipectamine 2000之前先轻轻混匀脂质体。而后，在另一孔中加入3ml预热的dmem培养基，按照dna与脂质体的比例为1:3，分别加入90μl和75μl的lipectamine 2000。轻轻混匀后室温放置5min。
51.4）将上述稀释好的dna与脂质体混合。混合物置于室温孵育20min。在此期间，可以用dmem培养基清洗待转染的细胞一次。（注：由于293t细胞易脱壁，故整个过程中操作须轻缓。可以先将细胞培养板倾斜，将液体沿板壁慢慢加入，再慢慢放正细胞板）。
52.5）将脂质体和dna复合物逐滴加入培养基中。上下倾斜细胞板使液体均匀覆盖在细胞表面。而后，将细胞板放回37
°
c培养箱中孵育。3h后，移去脂质体和dna复合物，在每个培养皿中重新加入15ml新鲜的培养液，将细胞放回37
°
c培养箱。
53.6） 48h后，将细胞上清液用0.45
ꢀµ
m滤器过滤，收集滤过液，并将其分装至1.5ml管子里。此时病毒可以直接用来转染，或置于-70
°
c备用。
54.（三）、stk11基因敲除的c2c12细胞系构建plent-u6
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stk11 慢病毒转染c2c12成肌细胞用（二）中制取的慢病毒，转染c2c12，转染前一天铺板，为了确定慢病毒感染的最佳moi值，设置梯度试验（图2），使其在转染时密度为70%~90%，72 h后观察细胞生长状况和荧光强度，确定慢病毒感染c2c12细胞的moi值。随后，用确定好的慢病毒moi值去感染c2c12成肌细胞，72h后用嘌呤霉素连续筛选3-5天获得目的单克隆细胞（图3），将单克隆细胞扩大培养并通过western blot法检测目的蛋白stk11、内参gapdh蛋白和肌细胞分化标志蛋白myhc的表达情况（图4、图5），获得stk11基因敲除的c2c12细胞系。
55.（四）、stk11基因敲除的c2c12细胞系用于研究肌细胞分化过程将1
×
105的对照c2c12细胞和stk11基因敲除的c2c12细胞铺12孔板后，24h后更换培养基为2%马血清 dmem 高糖培养基，之后每24小时更换一次培养基，直至第3天收集细胞，通过qpcr检测分化关键基因myod、myog、des、emhc和myh8的表达情况。
56.结果为：统计分析结果表明，与对照组（gfp）相比， stk11基因敲除的c2c12细胞肌细胞分化指标显著低于对照组（图6）；同时，qpcr检测结果表明，与对照组（gfp）相比，stk11基因敲除的c2c12细胞中肌细胞分化基因显著下调（图7）。结果提示，stk11基因敲除的c2c12细胞系可以用于研究stk11对肌细胞分化过程的影响。
57.（五）、stk11基因敲除的c2c12细胞系用于研究肌细胞融合过程将1
×
105的对照c2c12细胞和stk11基因敲除的c2c12细胞铺12孔板后，24h后更换培养基为2%马血清 dmem 高糖培养基，之后每24小时更换一次培养基，直至第3天收集细
胞，通过qpcr检测分化关键基因cav3、cdh15、myomaker和myoxier的表达情况。
58.结果为：统计分析结果表明，与对照组（gfp）相比， stk11基因敲除的c2c12细胞肌细胞融合指标显著低于对照组（图8）；同时，qpcr检测结果表明，与对照组（gfp）相比，stk11基因敲除的c2c12细胞中肌细胞融合基因显著下调（图9）。结果提示，stk11基因敲除的c2c12细胞系可以用于研究stk11对肌细胞融合过程的影响。
59.（六）、stk11基因敲除的c2c12细胞系用于研究肌纤维发育过程将1
×
105的对照c2c12细胞和stk11基因敲除的c2c12细胞铺12孔板后，24h后更换培养基为2%马血清 dmem 高糖培养基，之后每24h更换一次培养基，直至第5天收集细胞，通过western blot和免疫荧光检测肌纤维形成关键蛋白myhc的表达情况。
60.结果为：western blot检测结果表明，与对照组（gfp）相比，stk11基因敲除的c2c12细胞中肌纤维形成关键蛋白myhc的表达量显著下调；免疫荧光结果表明，stk11基因敲除的c2c12细胞肌纤维形成出现了严重缺陷（图10）。结果提示，stk11基因敲除的c2c12细胞系可以用于研究sk11对肌纤维发育的影响。
61.最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，比如用于药物筛选和制备。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。