一类连接子用于蛋白质标记及其在生物药中的应用

1.本发明属于生物制药及生物技术领域，主要涉及一种新型的光诱导的邻硝基苄醇类化合物，用于多肽和蛋白质中的赖氨酸游离氨基的选择性标记，及其应用于将亲和标记物、荧光物质及活性药物等特异性偶联到多肽、蛋白质中，以开发靶向示踪诊断试剂、肿瘤靶向治疗药物等用途。


背景技术：

2.蛋白质是一类重要的生物大分子，是生命的物质基础。蛋白质其特定的空间结构决定了蛋白质的功能。在维持蛋白质的完整性与功能的基础上，通过官能团的化学反应对蛋白质进行化学选择性标记修饰从而获得新的生物缀合物，使其在化学生物学和生物医学研究领域中尤为重要。在越来越多的研究报道中,不仅有利用一系列酶对翻译后的蛋白质进行修饰的方法,还有利用小分子物质缀合的标记方法,而利用蛋白质中天然氨基酸残基进行选择性标记是非常经济有效的策略。化学修饰方法直接转换蛋白质中特定残基的化学结构，由于蛋白中存在各种反应性基团，可以使缀合发生在该特定位点，特别是天然氨基酸半胱氨酸和赖氨酸都含有亲核官能团。赖氨酸的游离氨基也是蛋白质分子中亲核反应活性很高的基团，氨基的化学修饰在蛋白质序列分析中占了极其重要的地位，而受到广泛关注。赖氨酸游离氨基用作结合位点，通常采用活化的羧基官能团，特别是n-羟基琥珀酰亚胺酯，但这些方法具有选择性不够专一、偶联效率低等问题，在生物应用中仍需发展新的蛋白质赖氨酸残基选择性标记修饰的方法。
3.抗体-药物偶联物(adc)是一种新兴的生物疗法，利用多种组织特异性抗体与一系列接头设计相结合，能够在肿瘤附近运输和选择性释放细胞毒性药物。adc由抗体(antibody)、连接子(linker)和细胞毒素(toxin)三部分组成，是化学上复杂的偶联物。adc药物设计是抗体选择，结合策略，连接子设计和有效载荷效能的复杂融合。抗体的选择受靶抗原的控制，连接子则根据所采用的结合类型和有效载荷的所需作用机理进行选择。目前已有4个adc药物被fda批准上市，分别为：adcetris(2011年)，kadcyla(2013年)，mylotarg(2017年)和besponsa(2017年)，另有60多个adc药物正在进行临床研究。临床研究中的adc药物常用的抗体修饰位点主要有赖氨酸残基和半胱氨酸残基两种。当选用半胱氨酸残基作为偶联位点时，尽管抗体只有4对链间二硫键，通过还原链间二硫键产生的半胱氨酸残基形成的adc药物的dar值理论上较均一，但此种偶联方式，但由于现有还原剂(dtt、tcep)对链间二硫键的选择性较差，因此最终产物均一性也较差，同时破坏了抗体的二硫键，影响了抗体的稳定性。当选用赖氨酸残基作为偶联位点时，由于一个抗体大约含有40个以上的赖氨酸残基，化学选择性极差，药物的结合位点及结合数目较复杂的同时获得了非常广泛的载药量分布。尽管如此，目前市场上四个adc中的三个已经成功采用了赖氨酸偶联策略。
4.因此，研发新的蛋白质赖氨酸残基选择性标记修饰的方法，不仅对蛋白质本身的研究有非常积极的作用，同时将该方法用于adc药物的定位合成时也有着独特的优势。到目前为止在蛋白质赖氨酸残基选择性标记修饰中引入具有光诱导活性的化学反应官能团并
没有被开发出来。光诱导的化学反应官能团在不光照时是惰性的反应官能团，一旦在特定波长的光照射下，该类反应官能团产生高活性的中间体，与其靶向的蛋白质上的作用位点形成不可逆共价键结合的化学反应。光交联反应具有速度快、条件简单、适合于原位反应等优点。因此，开发新的高效、可靠、选择性好的方法选择性标记蛋白质赖氨酸残基是非常有必要的。


技术实现要素：

5.本发明的发明人通过设计一类结构简单以及容易合成的具有光诱导活性的反应官能团，该类光诱导活性官能团主要含有邻硝基苄醇的结构。该类反应官能团在光诱导条件下，主要和胺基反应，在蛋白质复合物中主要和蛋白质中的赖氨酸的侧链胺基反应，形成吲唑酮(indazolone)，进而形成结构稳定的共价连接。该反应与多肽或蛋白质的反应如下：
[0006][0007]
该邻硝基苄醇连接子与蛋白上赖氨酸反应可以在非常温和的条件下实现，反应速度非常快，反应效率高(chem.,2019,5,2955-2968.rsc adv.,2019,9,13249-13253)。因此，本发明开发的光诱导的邻硝基苄醇连接子能够对相应的蛋白质的赖氨酸进行特异性标记，再将亲和标记物、荧光物质及活性药物等特异性偶联到多肽和蛋白质中，从而为新型adc药物，生物诊断试剂，成像探针等设计与开发提供了直接途径。
[0008]
本发明的一个目的是提供通式(i)所示的化合物、其互变异构体、对映异构体、对映体、非对映体、消旋体、同位素化合物、及各种形式的盐或其水合物。
[0009]
本发明的另一个目的是提供该类化合物在选择性标记多肽和蛋白中的赖氨酸的方法。
[0010]
本发明的另一个目的是提供该类化合物制备抗体-荧光示踪物质偶联物以及抗体-药物偶联物中的应用。
[0011]
本发明的另一个目的是提供该类化合物开发抗体-药物偶联物的新方法。
[0012]
本发明提供如下通式(i)所示的化合物，或其互变异构体、对映异构体、对映体、非对映体、消旋体、同位素化合物、各种形式的盐或水合物。
[0013][0014]
其中y选自：-co-、-nh-co-、-nh-ch
2-、-o-co-ch
2-、-nh-coo-ch
2-、-nh-co-nh-ch
2-、-cooch
2-、-co-nh-、-o-ch
2-、-ch
2-、-coo-、-oco-、-o-、-s-、-so
2-、-c≡c-、-c＝c-、-so2nh-、-nhconh-、-nhcsnh-、-nh-、-conh-ch
2-或者不存在，其中y一端可与邻硝基苄醇结构
中苯环的3、4、5或6位相连；
[0015]
其中r1为邻硝基苄醇结构中3、4、5或6位上除y取代位置外的任意位置的一个或多个取代，多取代时r1可相同也可不相同，r1各自独立地选自氢、氘、氨基、卤素、硝基、氰基、c
1-6
烷基、c
3-10
环烷基、c
1-5
烷氧基、c
1-6
烷胺基或氨基烷基、c
1-c6烷基羰基、c
2-c6烷氧基羰基、c
2-c6烷胺基羰基、c
5-8
杂环基、c
6-10
芳基、c
5-6
杂芳基、其中n0和n1为1、2、3、4或5，其中所述的烷基、环烷基、烷氧基、烷胺基或氨基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、烷胺基羰基、杂环基、芳基、杂芳基任选进一步被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、c
1-c6烷氧基、氰基、硝基的取代基所取代；特别地，r1各自独立地为氢；
[0016]
r选自氢、氘、卤素、硝基、氰基、羟基，烷基羟基，芳香基羟基，烷基胺基，芳香基胺基，巯基，烷基巯基，芳香基巯基，羧酸，烷基羧酸，芳香基羧酸，炔基，烷基炔基，芳香基炔基，叠氮，烷基叠氮，芳香基叠氮，羰基，烷基羰基，芳香基羰基，醛基，烷基醛基，芳香基醛基，烷基、环烷基、烷氧基、杂环基、芳基、杂芳基或其中任意组合，其中上述的基团任选进一步被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、c
1-c6烷氧基、氰基、硝基的取代基所取代。
[0017]
优选地，通式(ⅰ)所示的化合物中，
[0018]
y选自：-co-、-nh-co-、-nh-ch
2-、-o-co-ch
2-、-nh-coo-ch
2-、-nh-co-nh-ch
2-、-cooch
2-、-co-nh-、-o-ch
2-、-ch
2-、-coo-、-oco-、-o-、-s-、-so
2-、-c≡c-、-c＝c-、-so2nh-、-nhconh-、-nhcsnh-、-nh-、-conh-ch
2-或者不存在，其中y一端可与邻硝基苄醇结构中苯环的3、4、5或6位相连；
[0019]
其中r1为邻硝基苄醇结构中3、4、5或6位上除y取代位置外的任意位置的一个或多个取代，多取代时r1可相同也可不相同，r1各自独立地选自氢、氘、氨基、卤素、硝基、氰基、c
1-6
烷基、c
3-10
环烷基、c
1-5
烷氧基、c
1-6
烷胺基或氨基烷基、c
1-c6烷基羰基、c
2-c6烷氧基羰基、c
2-c6烷胺基羰基、c
5-8
杂环基、c
6-10
芳基、c
5-6
杂芳基、其中n0和n1为1、2、3、4或5，其中所述的烷基、环烷基、烷氧基、烷胺基或氨基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、烷胺基羰基、杂环基、芳基、杂芳基任选进一步被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、c
1-c6烷氧基、氰基、硝基的取代基所取代；特别地，r1各自独立地为氢；
[0020]
r选自氢、氘、卤素、硝基、氰基、羟基，烷基羟基，芳香基羟基，烷基胺基，芳香基胺基，巯基，烷基巯基，芳香基巯基，羧酸，烷基羧酸，芳香基羧酸，炔基，烷基炔基，芳香基炔基，叠氮，烷基叠氮，芳香基叠氮，羰基，烷基羰基，芳香基羰基，醛基，烷基醛基，芳香基醛基，烷基、环烷基、烷氧基、杂环基、芳基、杂芳基或其中任意组合，其中上述的基团任选进一步被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、c
1-c6烷氧基、氰基、硝基的取代基所取代。
[0021]
更优选地，通式(ⅰ)所示的化合物中
[0022]
其中y选自：-co-、-nh-co-、-nh-ch
2-、-o-co-ch
2-、-nh-coo-ch
2-、-nh-co-nh-ch
2-、-cooch
2-、-co-nh-、-o-ch
2-、-ch
2-、-coo-、-oco-、-o-、-s-、-so
2-、-c≡c-、-c＝c-、-so2nh-、-nhconh-、-nhcsnh-、-nh-、-conh-ch
2-或者不存在，其中y一端可与邻硝基苄醇结构中苯环的3、4、5或6位相连；
[0023]
其中r选自氢、氘、卤素、硝基、氰基、羟基，烷基羟基，芳香基羟基，烷基胺基，芳香基胺基，巯基，烷基巯基，芳香基巯基，羧酸，烷基羧酸，芳香基羧酸，炔基，烷基炔基，芳香基
炔基，叠氮，烷基叠氮，芳香基叠氮，羰基，烷基羰基，芳香基羰基，醛基，烷基醛基，芳香基醛基，烷基、环烷基、烷氧基、杂环基、芳基、杂芳基或其中任意组合，其中上述的基团任选进一步被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、c
1-c6烷氧基、氰基、硝基的取代基所取代；
[0024]
其中r1为邻硝基苄醇结构中3、4、5或6位上除y取代位置外的任意位置的一个或多个取代，多取代时r1可相同也可不相同，r1各自独立地选自氢、氘、氨基、卤素、c
1-3
烷氧基、硝基、其中n0和n1为1、2、3、4、5，特别地，r1各自独立地为氢。
[0025]
进一步优选地，如通式(ⅰ)所示的化合物选自如下通式：
[0026][0027]
其中r和r1的定义与上述定义相同。
[0028]
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
[0029]
术语“烃基”是指只含有碳原子和氢原子的取代基，非限制性地包括甲基、乙基、异丙基、丙基、环己基、苯基等。
[0030]
术语“c1-c6”烷基是指链上具有1至6个碳原子的直链或支链饱和烷基，非限制性地包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等。
[0031]
术语“环烷基”是指由碳原子组成的饱和环状烷基，非限制性地包括环丁基、环戊基、环己基等。
[0032]
术语“c3-c10环烷基”是指含3至10个碳原子的饱和单-或多-环烷基，非限制性地包括环丙基，环丁基，环戊基，或环己基。
[0033]
术语“c6-c10芳基”是指包含6-10个环原子但环原子中不含杂原子的芳香族环基，如苯基、萘基。
[0034]
术语“5-8元杂环基”是指含有一个或多个饱和和/或部分饱和环，其包括5至8个环原子，其中一个或多个环原子选自氮、氧或硫的杂原子，其余环原子为碳；例如，环氧丙烷、四氢呋喃基、吡咯烷基、四氢吡喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基。
[0035]
术语“5-6元杂芳基”是指包含5-6个环原子且在环原子中含有1-4个杂原子作为环成员的单价芳香环基团。杂原子可以选自氮、氧或硫。
[0036]
术语“互变异构体”是指容易通过互为异构体的化学反应互变的结构异构体，该反应一般导致伴随单键和相邻双键转变的氢原子或质子的形式移动。
[0037]
术语“对映体”是指互为镜像而不可重叠的立体异构体。
[0038]“非对映体”是指具有两个或者两个以上的手性中性，并且不成镜像的立体异构体。
[0039]“消旋体”是指两个互为镜像的立体异构体，旋光性相反，互相抵消了旋光性。
[0040]
盐是指分子与对应的有机酸、无机酸或者有机碱、无机碱形成相应的盐的，例如化合物的盐酸、甲酸、三氟乙酸、琥珀酸、甲磺酸盐等。
[0041]“水合物”是指含有水的化合物。
[0042]
本发明另一方面提供了上述根据本发明的通式(ⅰ)所示的化合物、其互变异构体、对映异构体、对映体、非对映体、消旋体、同位素化合物、及各种形式的盐或其水合物用于制备选择性标记多肽或蛋白质侧链赖氨酸游离氨基的标记物的用途。根据本发明的通式(ⅰ)所示的邻硝基苄醇化合物在光诱导条件下，可以选择性标记主要是多肽和蛋白中的赖氨酸侧链游离氨基。
[0043]
本发明的通式(ⅰ)所示的化合物，或其互变异构体、对映异构体、对映体、非对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、各种形式的盐或水合物可以通过多肽及蛋白质的赖氨酸侧链的氨基形成连接结构，用于制备抗体-药物偶联物、抗体-亲和标记物和抗体-荧光物质。
[0044]
因此，本发明再一方面提供本发明的通式(ⅰ)所示的化合物、其互变异构体、对映异构体、对映体、非对映体、消旋体、同位素化合物、及各种形式的盐或其水合物用于制备抗体-药物偶联物、抗体-亲和标记物和抗体-荧光物质的用途。
[0045]
所述偶联物的特征结构式(ⅱ)为：
[0046][0047]
其中，y，r1的定义与上述通式(ⅰ)中的定义相同，
[0048]
a是多肽或蛋白质；
[0049]
z为l-x，x包括亲和标记物、示踪荧光物质以及活性药物或者它们的衍生物中的一种或者不存在；特别地，亲和标记物如生物素和叶酸，所述的示踪荧光物质包括但不局限于罗丹明类，荧光素类，色素类，香豆素类。其中活性药物包括但不局限于美登素类(maytansinoids)，耳抑素肽类(auristatins)，卡其霉素类(calicheamicins)，阿霉素类(doxorubicins)，吡咯并苯二氮卓二聚体类(pbds)，雷公藤甲素类(triptolide)，秋水仙碱类(colchicine)，康普瑞汀类(combretastatin)，高三尖杉酯碱类(homoharringtonine)，
喜树碱类(camptothecin)，紫杉醇类(paclitaxel)，还包括所有可用于抗体药物偶联物的药物；
[0050]
l可为：c1-c9烷基、c2-c9烯基、c2-c9炔基、芳基、杂芳基、c3-c9环烷基、c3-c9杂环基、-nr1-、-o-、-s-、-s-s-、-co-、-oco-、-coo-、-nhco-、-conr1-、-c＝nr1-、-c＝s-o-、-c＝s-nr1-、-cs2-、-nr1co-、-nr1csnr2-、-oconr1-、-oso-、val-val-pab、val-cit-pab、val-ala-pab、val-lys(ac)-pab、phe-lys-pab、phe-lys(ac)-pab、d-val-leu-lys、gly-gly-arg、ala-ala-asn-pab、ala-pab、pab及其任意组合或为空，其中，r1，r2各自独立地选自h、c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、芳基、杂芳基、c3-c9环烷基、c3-c9杂环基，n3为0～23；或l不存在。
[0051]
优选地，通式(ⅱ)所示的抗体-药物偶联物中，l选自以下结构及其任意组合：
[0052][0053]
其中，n4为0～23的整数。
[0054]
特别地，上述的a是指可以结合、反应性关联或者络合受体或抗原的单元，包括但不限于嵌合抗体，人源化抗体，人抗体或者抗体片段。
[0055]
特别地，所述抗体-药物偶联物选自如下结构；
[0056]
[0057][0058]
其中，y，l，r1的定义与上述定义相同，
[0059]
表示抗体(antibody)，所述的抗体是指能够结合、反应性关联或者络合受体或抗原的单元，例如嵌合抗体，人源化抗体，人抗体或者抗体片段。
[0060]
根据本发明的通式(i)所示的化合物或者上述的抗体-药物偶联物、抗体-亲和标记物和抗体-荧光物质可以通过或者参考下面实施例的方法或者与其类似的方法制备。
附图说明
[0061]
图1显示化合物1g对多肽上-nh2的选择性反应。
[0062]
图2显示化合物1g标记的多肽产物的分子量谱图。
[0063]
图3显示化合物1f对多肽上-nh2的选择性反应。
[0064]
图4显示化合物1f标记的多肽产物的分子量谱图。
[0065]
图5显示未标记的多肽适体和1f标记的多肽适体的esi-tof谱。
[0066]
图6显示未标记的纳米抗体-抗人表皮生长因子抗体和1f标记的纳米抗体-抗人表皮生长因子抗体的esi-tof谱。
[0067]
图7显示未标记的泛素和1f标记修饰的泛素的esi-tof谱。
[0068]
图8的a是未标记的胰凝乳蛋白酶原和被1f标记的胰凝乳蛋白酶原的esi-tof谱。
[0069]
图8的b是胰凝乳蛋白酶原被化合物1f标记后酶切肽段的esi-ms/ms谱图。
[0070]
图8的c是标记蛋白与tamra-n3偶联后sds-page凝胶荧光成像图。
[0071]
图9的a是未标记的溶菌酶和被化合物1f标记的溶菌酶的esi-tof谱图。
[0072]
图9的b是溶菌酶被化合物1f标记后酶切肽段的esi-ms/ms谱图。
[0073]
图9的c是标记蛋白与tamra-n3偶联后sds-page凝胶荧光成像图。
[0074]
图10的a是未标记的肌红蛋白和被化合物1f标记的肌红蛋白的esi-tof谱图。
[0075]
图10的b是肌红蛋白被化合物1f标记后酶切肽段的esi-ms/ms谱图。
[0076]
图10的c是标记蛋白与tamra-n3偶联后sds-page凝胶荧光成像图。
[0077]
图11显示化合物1f对纳米抗体-抗人表皮生长因子受体抗体中氨基的选择性标记，以及抗体-荧光偶联物的制备。
[0078]
图12的a是未标记的纳米抗体-抗人表皮生长因子受体和被化合物1f标记抗体的esi-tof谱图。
[0079]
图12的b是纳米抗体-抗人表皮生长因子受体被化合物1f标记后酶切肽段的esi-ms/ms谱图。
[0080]
图12的c是标记抗体与tamra-n3偶联后sds-page凝胶荧光成像图。
具体实施方式
[0081]
在所有实施例中，1h nmr由bruker avance iii-300或avance iii-400型核磁共振仪记录，化学位移以δ(ppm)表示；质谱由ms质谱uplc-ms(esi)测定；其中uplc型号是waters hplc h-class，ms(esi)的型号是waters sq detector 2；无水四氢呋喃由二苯甲酮/金属钠回流干燥除氧制得，无水甲苯和无水二氯甲烷由氯化钙回流干燥制得；石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等用于柱层析流动相的溶剂均购置于国药集团化学试剂有限公司；反应检测中使用的薄层层析硅胶板(hsgf254)来自国药集团化学试剂有限公司；化合物分离选用国药集团化学试剂有限公司的200-300目硅胶。本发明中原料可以从商业途径获得，如主要试剂购买于国药集团化学试剂有限公司，或者通过本领域已知的方法制备，或者根据本发明中所述方法制备。
[0082]
实施例1：n-(3-叠氮丙基)-4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰胺
[0083][0084]
步骤1-1：将化合物s1(4-(溴甲基)-3-硝基苯甲酸)(5.00g，19.2mmol)溶于丙酮/h2o(1：1，150ml)混合溶液中，加入na2co3(7.13g，67.3mmol)回流3小时。真空除去丙酮，并将水相用et2o萃取两次。向水相中加入浓hcl直至ph 2～3，并用乙酸乙酯萃取3次。有机层用水和盐水洗涤，经硫酸镁干燥，真空浓缩，无需进一步纯化，得到化合物1a，为棕色油状物(3.78g，98％)。1h nmr(500mhz,meod)δ8.60(s,1h),8.29(d,j＝8.0hz,1h),7.97(d,j＝8.1hz,1h),5.00(s,2h).
[0085]
步骤1-2：将1a(1.0eq)，hatu(1.2eq)和丙胺(1b，3.0eq)或炔丙基胺(1c，3.0eq)或3-叠氮基丙-1-胺(1d，1.0eq)溶于无水dmf中，于0℃下滴加dipea(3.0eq)，然后将混合物在室温搅拌过夜。向混合物中加入h2o，并用乙酸乙酯萃取3次。有机层用饱和nahco3、0.1m hcl、h2o、盐水洗涤，经na2so4干燥并真空浓缩,残余物通过二氧化硅色谱纯化，得到产物1e～g。化合物1e，产率：64％.1h nmr(400mhz,meod)δ8.50(d,j＝1.7hz,1h),8.14(dd,j＝8.1,1.7hz,1h),7.96(d,j＝8.2hz,1h),4.99(s,2h),3.39
–
3.33(m,2h),1.66(dq,j＝14.7,
7.4hz,2h),1.02
–
0.94(m,3h).
13
c nmr(101mhz,meod)δ167.5,148.4,142.5,135.6,132.9,129.7,124.5,61.8,42.9,23.6,11.8.hrms(esi-q-tof):m/z[m h]

calcd for c
11h15
n2o
4
:239.1026；found:239.1040.化合物1f，产率：yield:58％.1h nmr(400mhz,meod)δ8.51(d,j＝1.7hz,1h),8.15(dd,j＝8.2,1.8hz,1h),7.97(d,j＝8.2hz,1h),4.99(s,2h),4.18(d,j＝2.5hz,2h),2.64
–
2.62(m,1h).
13
c nmr(101mhz,meod)δ167.1,148.3,142.8,134.9,133.0,129.8,124.6,80.4,72.3,61.8,30.1.hrms(esi-q-tof):m/z[m-h]-calcd for c
11
h9n2o
4-:233.0568；found:233.0566.化合物1g，产率：51％.1h nmr(500mhz,meod)δ8.52(d,j＝1.8hz,1h),8.15(dd,j＝8.1,1.8hz,1h),7.98(d,j＝8.1hz,1h),4.99(s,2h),3.49(t,j＝6.9hz,2h),3.43(t,j＝6.7hz,2h),1.90(p,j＝6.8hz,2h).
13
c nmr(126mhz,meod)δ167.7,148.5,142.6,135.5,133.0,129.8,124.5,61.8,50.2,38.6,29.7.hrms(esi-q-tof):m/z[m na]

calcd for c
11h13
n5nao
4
:302.0860；found:302.0853.
[0086]
实施例2：4-(羟甲基)-3-硝基-n-(2-(5-((3as，4s，6ar)-2-氧环己烷-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊烷基)乙基)苯甲酰胺
[0087][0088]
步骤2-1：在室温下将d-生物素(3.00g，12.3mmol)，edci
·
hcl(2.82g，14.7mmol)和nhs(1.70g，14.7mmol)的dmf(100ml)溶液搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩并将残余物过滤，用etoh/acoh/h2o(95∶1∶4)洗涤并真空干燥。无需进一步纯化就获得黄色油状的产物化合物2a(3.74g，89％)。1h nmr(500mhz,dmso)δ6.45(s,1h),6.38(s,1h),4.30(dd,j＝7.5,5.2hz,1h),4.16
–
4.12(m,1h),3.13
–
3.07(m,1h),2.84(d,j＝5.1hz,1h),2.81(s,4h),2.67(t,j＝7.4hz,2h),2.58(d,j＝13.3hz,1h),1.74
–
1.57(m,6h).
[0089]
步骤2-2：向乙二胺(3.91ml，58.6mmol)在无水dmf(20ml)中的搅拌溶液中，逐滴加入化合物2a(1.00g，2.93mmol)的无水dmf(10ml)中的溶液，并搅拌过夜。向混合物添加et2o，过滤沉淀的产物，用乙酸乙酯洗涤，并在不进一步纯化的情况下真空干燥(753mg，90％)。将来自前一步骤的产物(400mg，1.40mmol)，化合物1a(276mg，1.40mmol)和hatu(637mg，1.68mmol)溶于无水dmf(15ml)中，在0℃下滴加入dipea(0.69ml，4.19mmol)，然后将混合物在室温搅拌过夜。向混合物中加入h2o，并用乙酸乙酯萃取3次。有机层用饱和nahco3、1m hcl、h2o、盐水洗涤，经na2so4干燥并真空浓缩,通过硅胶色谱法纯化，得到黄色油状的化合物2b(331mg，51％)。1h nmr(500mhz,meod)δ8.52(d,j＝1.7hz,1h),8.15(dd,j＝8.1,1.7hz,1h),7.99(d,j＝8.2hz,1h),5.00(s,2h),4.46(dd,j＝7.9,4.9hz,1h),4.24(dd,j＝7.9,4.5hz,1h),3.53(t,j＝5.9hz,2h),3.44(t,j＝5.8hz,2h),3.14
–
3.09(m,1h),2.89(dd,j＝12.8,5.0hz,1h),2.68(d,j＝12.7hz,1h),2.21(t,j＝7.4hz,2h),1.66(m,4h),1.59
–
1.49(m,2h).
13
c nmr(126mhz,meod)δ176.7,167.8,166.1,148.5,142.6,135.5,133.0,129.9,124.6,63.3,61.8,61.6,56.9,41.1,41.0,39.9,36.8,29.7,29.4,26.8.hrms
(esi-q-tof):m/z[m h]

calcd for c
20h28
n5o6s

:466.1755；found:466.1744.
[0090]
实施例3：n-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己基)-4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰胺
[0091][0092]
步骤3-1：将化合物s2(74mg，0.25mmol)加入2：1ch2cl2和三氟乙酸(1.5ml)的溶液中，在室温下搅拌1h后，真空除去溶剂直接投下一步。
[0093]
步骤3-2：将化合物1a(54mg，0.275mmol)，hatu(104mg，0.275mmol)和所得油状物3a溶于无水dmf，将dipea(227μl，1.38mmol)添加到该溶液中。将反应在室温搅拌1小时。将混合物用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤，经na2so4干燥，真空除去溶剂后，将所得残余物通过快速色谱纯化，得到化合物3b，为黄色油状物(30mg，32％)。1hnmr(600mhz,dmso)δ8.74(t,j＝5.5hz,1h),8.49(d,j＝1.7hz,1h),8.20(dd,j＝8.1,1.7hz,1h),7.92(d,j＝8.1hz,1h),6.99(s,2h),5.65(t,j＝5.5hz,1h),4.87(d,j＝5.5hz,2h),3.39(t,j＝7.1hz,2h),3.25(dd,j＝12.8,6.9hz,2h),1.53
–
1.46(m,4h),1.34
–
1.29(m,2h),1.25
–
1.22(m,2h).
13
c nmr(126mhz,dmso)δ171.1,163.8,146.6,141.1,134.4,134.0,132.0,128.4,123.0,59.9,37.0,28.8,27.9,25.9,25.8.hrms(esi-q-tof):m/z[m h]

calcd for c
18h22
n3o
6
:376.1503；found:376.1496.
[0094]
实施例4
[0095]
化合物1g对多肽上-nh2的选择性标记实验。如图1显示化合物1g对多肽上-nh2的选择性反应。用365nm紫外光处理100mm pbs/meoh(9：1，ph＝7.4)中的化合物1g(1.25mm)和多肽(图1中acsrkydh)(0.5mm)，并在25℃摇动30分钟，收集样品，用meoh/h2o稀释并通过uplc-ms分析。图2显示化合物1g标记的多肽产物的分子量谱图，结果表明，光诱导的多肽标记非常迅速，uplc-ms对反应混合物进行分析，可以得到所需的产物。
[0096]
实施例5
[0097]
化合物1f对多肽上-nh2的选择性标记实验。如图3显示化合物1f对多肽上-nh2的选择性反应。用365nm紫外光处理100mm pbs/meoh(9：1，ph＝7.4)中的化合物1f(1.25mm)和多肽(图3中acrcymnk,0.5mm)，并在25℃摇动30分钟，收集样品，用meoh/h2o稀释并通过uplc-ms分析。图4显示化合物1f标记的多肽产物的分子量谱图，结果表明，光诱导的多肽标记非常迅速，uplc-ms对反应混合物进行分析，可以得到所需的产物。
[0098]
实施例6
[0099]
光诱导条件下，化合物1f标记affibody蛋白实验。
[0100]
化合物1f(2.5mm)在甲醇中365nm紫外光照7min后加入affibody(55μm)在pbs溶液中使邻硝基苄醇化合物1f最终浓度为125μm。混合后25℃振摇1h。收集样品，加水稀释后进行esi-tof蛋白分子量分析。图5显示未标记的affibody和1f标记的affibody的esi-tof谱，
表明其共价修饰几乎是定量修饰的(图5)。未标记的蛋白质分子量为7594.61或者7725.50，标记后蛋白质的分子量为7792.74，7923.52；以及标记两个分子的分子量为7990.46，8121.74。
[0101]
affibody氨基酸序列(seq id no:1)：
[0102]
mtsvdnkfnkelsvagreivtlpnlndpqkkafifslwddpsqsanllaeakklndaqapkgshhhhhh
[0103]
实施例7
[0104]
光诱导条件下，化合物1f标记nanobody-egfr实验。
[0105]
化合物1f(2.5mm)在甲醇中365nm紫外光照7min后加入nanobody-egfr(55μm)在pbs溶液中使邻硝基苄醇化合物1f终浓度为250μm。混合后25℃振摇1h。收集样品，加水稀释后进行esi-tof蛋白分子量分析。图6显示未标记的nanobody-egfr和1f标记的nanobody-egfr的esi-tof谱，表明其共价修饰几乎是定量修饰的。标记前蛋白质的分子量为14538.30和1455.12，标记后分子量分布分别为14736.39，14753.30，14934.22，14951.20，15149.95，15132.70，15347.14。
[0106]
nanobody-egfr氨基酸序列(seq id no:2)：
[0107]
qvkleesgggsvqtggslrltcaasgrtsrsygmgwfrqapgkerefvsgiswrgdstgyadsvkgrftisrdnakntvdlqmnslkpedtaiyycaaaagsawygtlyeydywgqgtqvtvssalehhhhhh
[0108]
实施例8
[0109]
光诱导条件下，化合物1f标记ubiquitin蛋白实验
[0110]
化合物1f(2.5mm)在甲醇中365nm紫外光照7min后加入ubiquitin(55μm)在pbs溶液中使邻硝基苄醇化合物1f终浓度为250μm。混合后25℃振摇1h。收集样品，加水稀释后进行esi-tof蛋白分子量分析。图7显示未标记的ubiquitin和1f标记修饰的ubiquitin的esi-tof谱，表明其共价修饰几乎是定量修饰的。标记前分子量为10035.19，10166.39；标记后分子量分布分别为10233.29，10364.50，10431.40，10562.58，10629.27，10760.60，10827.36和10958.34。
[0111]
ubiquitin氨基酸序列(seq id no:3)：
[0112]
mtsmqifvktltgktitlevepsdtienvkakiqdkegippdqqrlifagkqledgrtlsdyniqkestlhlvlrlrglehhhhhhhh
[0113]
实施例9
[0114]
光诱导条件下，化合物1f对chymotrypsinogen a蛋白标记实验。
[0115]
将化合物1f配制成2.5mm浓度的meoh溶液，胰凝乳蛋白酶原a在pbs溶液中配制为27.5μm浓度的溶液。用365nm紫外光处理meoh中的化合物1f(2.5mm)7分钟，然后将其加入pbs中的胰凝乳蛋白酶原a(27.5μm)中，最终浓度为125μm并混合。将该混合物在25℃下摇动1小时，收集样品，用水稀释并通过esi-tof分析，实现了对chymotrypsinogen a蛋白标记。将tamra-n3制成1.25mm浓度的dmso溶液，将cuso4和thpta制成50mm浓度的h2o溶液，并以1：5的体积比预混合。将抗坏血酸钠制成100mm浓度的h2o溶液储备液。加入100微升的邻硝基苄醇化合物1f标记的蛋白(25μm或50μm)，tamra-n3(100μm)，预混合的cuso4(100μm)，thpta(500μm)和抗坏血酸钠(5mm)，将混合物在25℃下反应1h，并通过sds-page分析。图8的a是未标记的chymotrypsinogen a和被1f标记的胰凝乳蛋白酶原的esi-tof谱，表明其共价修饰几乎是定量修饰的(图8a)。标记前分子量为26655.97，标记后分子量分布为25854.10，
26052.25，26250.34，26488.34，26646.27。胰蛋白酶消化和随后对片段的esi-ms/ms分析也证实了赖氨酸(k)特异性标记(图8的b)，并且后续也可与四甲基罗丹明偶联，有很好的生物相容性(图8的c)。
[0116]
chymotrypsinogen a氨基酸序列(seq id no:4)：
[0117]
cgvpaiqpvlsglsrivngeeavpgswpwqvslqdktgfhfcggslinenwvvtaahcgvttsdvvvagefdqgsssekiqklkiakvfknskynsltinnditllklstaasfsqtvsavclpsasddfaagttcvttgwgltrytnantpdrlqqaslpllsntnckkywgtkikdamicagasgvsscmgdsggplvckkngawtlvgivswgsstcststpgvyarvtalvnwvqqtlaan
[0118]
实施例10
[0119]
光诱导条件下，化合物1f对lysozyme蛋白标记实验。
[0120]
将化合物1f配制成2.5mm浓度的meoh溶液，溶菌酶在pbs溶液中配制为27.5μm浓度的溶液。用365nm紫外光处理meoh中的化合物1f(2.5mm)7分钟，然后将其加入pbs中的溶菌酶(27.5μm)中，最终浓度为125μm并混合。将该混合物在25℃下摇动1小时，收集样品，用水稀释并通过esi-tof分析，实现了对lysozyme蛋白标记。将tamra-n3制成1.25mm浓度的dmso溶液，将cuso4和thpta制成50mm浓度的h2o溶液，并以1：5的体积比预混合。将抗坏血酸钠制成100mm浓度的h2o溶液储备液。加入100微升的邻硝基苄醇化合物1f标记的蛋白(25μm或50μm)，tamra-n3(100μm)，预混合的cuso4(100μm)，thpta(500μm)和抗坏血酸钠(5mm)，将混合物在25℃下反应1h，并通过sds-page分析。图9的a是未标记的lysozyme蛋白和被化合物1f标记的溶菌酶的esi-tof谱图，表明其共价修饰几乎是定量修饰的(图9的a)。标记前分子量为14304.07，标记后分子量为14502.21，14700.33，14898.26。胰蛋白酶消化和随后对片段的esi-ms/ms分析也证实了赖氨酸特异性标记(图9的b)。图9的c是标记蛋白与tamra-n3偶联后sds-page凝胶荧光成像图，表明也可与四甲基罗丹明偶联，有很好的生物相容性。
[0121]
lysozyme氨基酸序列(seq id no:7)：
[0122]
kvfgrcelaaamkrhgldnyrgyslgnwvcaakfesnfntqatnrntdgstdygilqinsrwwcndgrtpgsrnlcnipcsallssditasvncakkivsdgngmnawvawrnrckgtdvqawirgcrl
[0123]
实施例11
[0124]
光诱导条件下，化合物1f对myoglobin蛋白标记实验。
[0125]
将化合物1f配制成2.5mm浓度的meoh溶液，肌红蛋白在pbs溶液中配制为27.5μm浓度的溶液。用365nm紫外光处理meoh中的化合物1f(2.5mm)7分钟，然后将其加入pbs中的肌红蛋白(27.5μm)中，最终浓度为125μm并混合。将该混合物在25℃下摇动1小时，收集样品，用水稀释并通过esi-tof分析，实现了对myoglobin蛋白标记。将tamra-n3制成1.25mm浓度的dmso溶液，将cuso4和thpta制成50mm浓度的h2o溶液，并以1：5的体积比预混合。将抗坏血酸钠制成100mm浓度的h2o溶液储备液。加入100微升的邻硝基苄醇化合物1f标记的蛋白(25μm或50μm)，tamra-n3(100μm)，预混合的cuso4(100μm)，thpta(500μm)和抗坏血酸钠(5mm)，将混合物在25℃下反应1h，并通过sds-page分析。图10的a是未标记的myoglobin蛋白和被化合物1f标记的肌红蛋白的esi-tof谱图，表明其共价修饰几乎是定量修饰的(图10的a)。标记前分子量为16951.38，标记后分子量分布为17149.40，17347.63，17545.73，17743.63。胰蛋白酶消化和随后对片段的esi-ms/ms分析也证实了赖氨酸特异性标记(图10的b)。图10的c是标记蛋白与tamra-n3偶联后sds-page凝胶荧光成像图，表明也可与四甲基罗丹明偶
联，有很好的生物相容性(图10的c)。
[0126]
myoglobin氨基酸序列(seq id no:5)：
[0127]
glsdgewqqvlnvwgkveadiaghgqevlirlftghpetlekfdkfkhlkteaemkasedlkkhgtvvltalggilkkkghheaelkplaqshatkhkipikylefisdaiihvlhskhpgdfgadaqgamtkalelfrndiaakykelgfqg
[0128]
实施例12
[0129]
光诱导条件下，化合物1f对nanobody-her2蛋白标记实验。图11显示化合物1f对nanobody
–
her2抗体中氨基的选择性标记，以及抗体-荧光偶联物的制备。
[0130]
在meoh溶液中制备化合物1f的2.5mm溶液。用365nm紫外光处理meoh中的化合物1f(2.5mm)7min，然后将其添加到在pbs中的nanobody
–
her2(55μm，0.77mg/ml)溶液，最终浓度为125μm并混合。将混合物在25℃下孵育1h。收集样品，用h2o稀释，并用esi-tof分析。将获得的化合物1f标记的nanobody-her2蛋白。将tamra-n3制成1.25mm浓度的dmso溶液，将cuso4和thpta制成50mm浓度的h2o溶液，并以1：5的体积比预混合。将抗坏血酸钠制成100mm浓度的h2o溶液储备液。加入100微升的邻硝基苄醇化合物1f标记的蛋白(25μm或50μm)，tamra-n3(100μm)，预混合的cuso4(100μm)，thpta(500μm)和抗坏血酸钠(5mm)，将混合物在25℃下反应1h，并通过sds-page分析。图12的a是未标记的nanobody
–
her2抗体和被化合物1f标记抗体的esi-tof谱图，表明其共价修饰几乎是定量修饰的(图12的a)。标记前分子量为13694.56，标记后分子量分布为13892.63，14090.77，14288.56，14485.93。胰蛋白酶消化和随后对片段的esi-ms/ms分析也证实了赖氨酸特异性标记(图12的b)。图12的c是标记抗体与tamra-n3偶联后sds-page凝胶荧光成像图，表明也可与四甲基罗丹明偶联，可制备抗体-荧光偶联物。
[0131]
nanobody-her2-wt-his6氨基酸序列(seq id no:6)：
[0132]
mqvqlqesgggsvqaggslkltcaasgyifnscgmgwyrqspgrerelvsrisgdgdtwhkesvkgrftisqdnvkktlylqmnslkpedtavyfcavcynletywgqgtqvtvssgghhhhhh