一种检测鸡金银羽位点基因型的引物对、试剂盒及检测方法

1.本发明涉及动物遗传育种和生物技术领域，尤其涉及一种检测鸡金银羽位点基因型的引物对，包含该引物对的试剂盒，以及利用该试剂盒检测鸡金银羽位点基因型的方法。


背景技术：

2.初生雏鸡的雌雄鉴别在养鸡生产中有着重要的意义。在肉鸡生产中雏鸡出壳时鉴别雌雄有利于公母分养，便于根据公母不同的生长发育速度、营养需求给予不同的饲料和饲养管理条件，避免公雏发育快而抢食，影响母雏发育；在商品蛋鸡生产中雏鸡出壳时即淘汰公雏可节省饲养公雏的空间和成本，提高母鸡的成活率和整齐度；对于种鸡可通过鉴别雌雄、只出售不同品系单一性别的雏鸡以保护育种成果。
3.雏鸡的性别鉴定方法大体分为两类：一类根据雌雄雏鸡的生殖器官的差异，通过对生殖突起或性腺的直接观察来鉴定，包括器械鉴别法、翻肛鉴别法等；另一类利用鸡性连锁基因的伴性交叉遗传现象，使用带有特定伴性基因基因型的品种或品系进行杂交生产自别雌雄配套系，通过杂交后代雏鸡绒羽的颜色、浅色斑块的大小或不同的羽毛生长速度来鉴别雏鸡性别。自别雌雄方法相对直接观察法(如翻肛法，器械鉴别法)具有鉴别速度快，准确率高，不需要对鉴别人员进行专门的技术培训，对雏鸡损伤小，交叉感染疾病的可能性小的优点。目前在自别雌雄配套系生产中应用的伴性基因有快慢羽基因、金银羽基因和横斑基因。在利用这些基因的自别雌雄方法中，利用金银羽基因自别雌雄可直接通过雏鸡绒羽颜色区分雌雄，更为简单直观，没有时间的限制，而且准确率更高，具有更好的利用价值。利用金银羽基因进行自别雌雄时，使用金羽公鸡与银羽母鸡交配，所生后代公雏绒羽为白色，母雏绒羽为红色。目前金银羽自别雌雄配套系已广泛应用于源自洛岛红、洛岛白遗传背景的蛋鸡配套系中(包括海兰褐、伊莎褐、大午金凤等)。但在应用金银羽表型进行性别鉴定的配套系的建立过程中银羽亲本需要有银羽纯合公鸡和银羽纯合母鸡来保持，而对于银羽公鸡而言可能存在两种基因型，即银羽纯合(ss)和银羽杂合(ss)，只有淘汰掉银羽杂合公鸡才能形成稳定的配套系亲本，对于一些遗传背景不够清晰的家鸡遗传资源，若应用金银羽表型建立自别雌雄的配套系，从白羽鸡群体中筛选出携带银羽基因的个体，并建立起银羽基因位点纯合的银羽品系是建立应用金银羽自别雌雄的配套系的前提和基础。


技术实现要素：

4.针对以上技术问题，本发明提供了一种检测鸡金银羽位点基因型的引物对，包含该引物对的试剂盒，以及利用该试剂盒检测鸡金银羽位点基因型的方法。利用本发明提供的引物对、试剂盒以及检测方法，能够快速鉴定出鸡只的金银羽位点基因型，操作简单，成本低，周期短，并大大提高了该位点基因型判定的准确性。
5.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
6.一种检测鸡金银羽位点基因型的引物对，包括由seq id no.1所示的上游引物和seq id no.2所示的下游引物；其中，seq id no.1的序列为：5
′‑
cttaagtcactcttgaagactcttttaagc-3
′
；seq id no.2的序列为：5
′‑
ccgtgaagaagagcatgttggtca-3
′
。
7.已有的研究表明银羽纯合子个体(公鸡)或半合子(母鸡)的银羽表型是slc45a2基因(genbank号：nc_006127.5，序列如seq id no.3所示)的第9423位的碱基c突变为a，导致其编码的蛋白发生了一个有意突变(leu34 7met)所致。但若根据突变后的基因序列直接设计引物，则没有合适的酶切位点可用于pcr-rflp分析。针对基因突变这一特征以及应用于pcr-rflp分析的需求，本发明对突变序列分析后进行了引物的人工设计，设计得到了上述引物，其中在下游引物3
′
端倒数第三个碱基引入了一个错配碱基，结合基因本身的突变能够形成bsphi酶切位点。利用上述引物能够建立以pcr-rflp法来鉴别金银羽位点基因型的分子鉴定方法，从而可以快速鉴定出鸡只的金银羽位点基因型。
8.以及，本发明实施例还提供一种检测鸡金银羽位点基因型的试剂盒，所述试剂盒包括上述由seq id no.1所示的上游引物和seq id no.2所示的下游引物组成的引物对。
9.优选地，所述试剂盒还包括easy taq dna聚合酶、easy taq dna聚合酶反应缓冲液、dntps、bsphi限制性内切酶及其反应缓冲液。以上缓冲液、taq dna聚合酶、bsphi限制性内切酶均可选择用于pcr-rflp分析的市售试剂。
10.以及，本发明实施例还提供了一种检测鸡金银羽位点基因型的方法，用上述的引物对通过pcr-rflp法对鸡金银羽位点基因型进行检测。用该方法能够准确检测出待测鸡的金银羽位点基因型，从而能够用于获得以金银羽表型鉴别雌雄的稳定的银羽品系。
11.优选地，该方法具体包括以下步骤：
12.s1、以所述引物对进行pcr扩增,得到扩增片段；
13.s2、对扩增片段进行bsphi酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果判定鸡金银羽位点的基因型。
14.本发明建立的方法与pcr产物直接测序、pcr-sscp等方法相比，操作简单、成本低、周期短，大大提高了该位点基因型判定的准确性，不需要特殊的仪器，易推广普及，为应用于以金银羽表型鉴别雌雄的稳定的银羽品系的建立提供了快捷有效的方法。
15.优选地，所述pcr扩增的反应体系为：
[0016][0017][0018]
扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸15s，35
个循环；72℃延伸7min；4℃保存。
[0019]
优选地，所述bsphi酶切的反应体系为：s1所得的所述扩增产物10μl，10
×
bsphi限制性内切酶反应缓冲液1.5μl，10u/μl bsphi限制性内切酶0.3μl，灭菌纯水3.2μl。
[0020]
优选地，所述bsphi酶切的反应条件为：37℃，酶切过夜。
[0021]
优选地，s2中所述琼脂糖凝胶的质量浓度为3％。
[0022]
优选地，s2中所述琼脂糖凝胶电泳的电泳缓冲液为1
×
tae，电泳的电压为120v，电泳时间为40min。
[0023]
优选地，s2中判定鸡金羽位点的基因型的方法为：电泳只出现90bp、21bp条带，个体羽色为白羽，该位点基因型公鸡为ss型，母鸡为s-半合子；电泳同时出现111bp、90bp和21bp条带，个体羽色为白羽，性别为公鸡，该位点基因型为ss型；电泳只出现111bp条带，个体羽色为有色羽或白羽，该位点基因型公鸡为ss型，母鸡为s-半合子。
[0024]
本发明的有益效果在于：
[0025]
本发明引物对是针对发生了碱基突变的序列进行设计的，其中，在下游引物3
′
端针对突变等位基因引入一个限制性内切酶bsphi的识别序列(见图1)。引入bsphi酶切位点后，发生突变的等位基因pcr扩增产物能够被bsphi切为90bp和21bp的片段；未发生突变的等位基因在扩增产物中不存在bsphi这一酶切位点，因此其pcr产物酶切后片段仍为111bp。通过对待判定基因型的鸡进行翅静脉采血，提取基因组dna，以提取的基因组dna为模板用该引物对进行pcr扩增；然后对pcr产物进行bsphi 37℃酶切过夜，电泳检测酶切产物；最后根据电泳结果判定鸡金银羽位点的基因型。
[0026]
本发明采用琼脂糖凝胶电泳法检测pcr产物酶切结果，来判定待检测鸡只该位点的基因型。与pcr-sscp和pcr产物直接测序的方法相比，本发明建立的分析方法操作简单、成本低、检测周期短，大大提高了该位点基因型判定的准确性，不需要特殊的仪器，易推广普及。试验表明本方法能有效地判定金银羽位点的基因型，可以用于鸡的金银羽位点的分子标记辅助选择，进而建立纯合银羽鸡品系。
附图说明
[0027]
图1为本发明实施例1中用于检测突变位点的pcr引物设计和扩增产物中突变位点的位置示意图；
[0028]
图2为本发明实施例3的技术流程示意图；
[0029]
图3为本发明实施例3中大午金凤商品代鸡pcr产物酶切电泳结果；其中，1-10为大午金凤商品代母鸡(金羽等位基因半合子，s-)；11-20大午金凤商品代公鸡(金银羽等位基因杂合子，ss)；c1为银羽等位基因纯合子公鸡对照(ss)；c2为银羽等位基因和金羽等位基因杂合子公鸡对照(ss)；c3为金羽等位基因纯合子公鸡对照(ss)；m:100bp ladder dna分子量标准；
[0030]
图4为本发明实施例3中海兰褐商品代鸡pcr产物酶切电泳结果；其中，1-10为海兰褐商品代母鸡(金羽等位基因半合子，s-)；11-20海兰褐商品代公鸡(金银羽等基因杂合子，ss)；c1为银羽等位基因纯合子公鸡对照(ss)；c2为银羽等位基因和金羽等位基因杂合子公鸡对照(ss)；c3为金羽等位基因纯合子公鸡对照(ss)；m:100bp ladder dna分子量标准；
[0031]
图5为本发明实施例3中伊莎褐商品代鸡pcr产物酶切电泳结果；其中，1-10为伊莎
褐商品代母鸡(金羽等位基因半合子，s-)；11-20伊莎褐商品代公鸡(金银羽等位基因杂合子，ss)c1为银羽等位基因纯合子公鸡对照(ss)；c2为银羽等位基因和金羽等位基因杂合子公鸡对照(ss)；c3为金羽基因纯合子公鸡对照(ss)；m:100bp ladder dna分子量标准；
[0032]
图6为本发明实施例3中部分太行鸡公母鸡pcr产物酶切电泳结果；其中，1-10为太行鸡母鸡(960只太行鸡母鸡只检出三只携带银羽等位基因的个体，s-)；11-20太行鸡公鸡(260只太行鸡公鸡未检出携带银羽基因的个体)；m:100bp ladder dna分子量标准。
具体实施方式
[0033]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0034]
以下实施例中的easy taq dna聚合酶、10
×
easy taq dna聚合酶反应缓冲液和dntp购自全式金生物科技有限公司、bsphi限制性内切酶及其缓冲液购自北京百奥莱博生物科技有限公司，引物有由华大基因合成。
[0035]
100bp ladder dna分子量标准及其他试剂均购自天根生物科技有限公司。
[0036]
实施例1
[0037]
本发明实施例提供了一种检测鸡金银羽位点基因型的引物对，该引物对中包括由seq id no.1所示的上游引物和seq id no.2所示的下游引物。
[0038]
上游引物的序列(seq id no.1)为：
[0039]5′‑
cttaagtcactcttgaagactcttttaagc-3
′
；
[0040]
下游引物的序列(seq id no.2)为：
[0041]5′‑
ccgtgaagaagagcatgttggtca-3
′
。
[0042]
以上引物对是以slc45a2基因序列(genbank accession no：nc_006127.5，序列如seq id no.3所示)为模板，通过人工设计得到。如图1所示，图1中两条引物之间的序列表示的是slc45a2基因部分序列，反向引物是上述下游引物的反向互补序列。本发明实施例在下游引物3
′
端引入限制性内切酶bsphi的识别序列，图中方框中表示突变位点，带下划线为内切酶识别序列，小写“a”是引入的错配碱基，目的为实现后续的酶切判型。
[0043]
实施例2
[0044]
本发明实施例提供了一种检测鸡金银羽位点基因型的试剂盒，具体包括：
[0045]
(1)由seq id no.1所示的上游引物和seq id no.2所示的下游引物组成的引物对；
[0046]
(2)10
×
easytaq dna聚合酶反应缓冲液、dntps(每种2.5mm)、easy taq dna聚合酶(5u/μl)、bsphi限制性内切酶(10u/μl)及其对应的反应缓冲液，灭菌纯水，和100bp ladder dna分子量标准。
[0047]
实施例3
[0048]
本发明实施例提供了一种检测鸡金银羽位点基因型的方法，用实施例2所提供的试剂盒对鸡金银羽位点基因型进行检测。
[0049]
本实施例的技术流程示意图如图2所示，主要包括以下步骤：
[0050]
(1)试样的制备与保存
[0051]
大午金凤商代公母鸡各10只，采自大午种禽科技有限公司；
[0052]
海兰褐商品代公母鸡各10只，采自华丰乐源农牧有限公司；
[0053]
伊莎褐商品代公母鸡各10只，采自鹿泉区会元养殖场。
[0054]
白羽太行鸡母鸡960只，公鸡260只采自赞皇天然农产品开发有限公司。
[0055]
各鸡只用医用edta抗凝管进行翅静脉采血，用硅胶膜吸附法提取血液dna,将dna样品保存于4℃冰箱备用。
[0056]
(2)pcr扩增
[0057]
以实施例2的试剂盒中的引物对为引物，建立25μl扩增体系：
[0058][0059][0060]
扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。
[0061]
(3)pcr扩增产物的酶切
[0062]
15μl的bsphi酶切体系：步骤(2)中的pcr扩增产物10μl，10
×
bsphi限制性内切酶反应缓冲液1.5μl，10u/μl bsphi限制性内切酶0.3μl，灭菌纯水3.2μl。
[0063]
酶切反应的条件：37℃,酶切过夜。
[0064]
(4)pcr扩增产物酶切后的检测与结果判定
[0065]
取15μl pcr产物的酶切产物，以3％的琼脂糖凝胶进行电泳(电泳缓冲液为1
×
tae，电泳电压：120v；电泳时间：40min)，用凝胶成像系统检测，电泳图谱详见图3～图6。
[0066]
根据电泳图谱中出现的条带的大小及组成判定待鉴定鸡只金银羽位点基因型：
[0067]
若只有90bp和21bp的片段，则公鸡为银羽等位基因纯合子(ss)，母鸡为银羽等位基因半合子(s-)，表型为白羽；
[0068]
若只有111bp的片段，则公鸡为金羽等位基因纯合子(ss)，母鸡为金羽等位基因半合子(s-)，表型为有色羽或白羽；
[0069]
若既有111bp又有90bp和21bp的片段，则为金银羽等位基因杂合子公鸡(ss)，表型为白羽。
[0070]
由图3～图5所示的电泳结果可见，应用本发明建立的分子鉴定方法得到的鉴定结果与实际情况相符合：如图3所示，大午金凤商代公鸡为金银羽等位基因杂合子(ss)，有111bp、90bp和21bp(21bp太短，电泳时与引物带重叠)的片段，大午金凤商代母鸡为金羽等
位基因半合子(s-)，只有111bp的片段；海兰褐(见图4)、伊莎褐(见图5)商品代公鸡为金银羽等位基因杂合子(白羽，ss)，也和大午金凤商品代公鸡一样都有111bp、90bp和21bp(21bp太短，电泳时与引物带重叠)的片段，而海兰竭和尹莎竭商品代母鸡也和大午金凤商品代母鸡一样为有色羽半合子(s-)，酶切产物只有一条111bp的片段。
[0071]
以上结果表明本发明建立的方法能够准确的用于金银羽位点基因型的判别，即本发明建立了一个简便、准确、低成本的金银羽基因位点基因型鉴定的有效方法，该方法具有良好的推广价值。用建立的本方法对960只白羽太行鸡母鸡和260只白羽太行鸡公鸡进行分析，只鉴定出三只携带银羽基因的母鸡(银羽半合子，s-)，未鉴定出携带银羽基因的公鸡(见图6)，这一方面说明本方法具有广适性，同时也证明在白羽太行鸡中银羽基因频率很低。
[0072]
实施例4本发明用海兰褐父母代公鸡(金羽等位基因纯合，ss，羽色红羽，购自华丰乐源农牧有限公司)与鉴定获得的三只太行鸡银羽母鸡进行了测交实验，即选择10只海兰褐父母代成年公鸡采集精液并为三只鉴定的银羽太行母鸡(通过其他实验已经证实这三只太行母鸡的白羽表型不是由显性白羽突变引起)进行输精，每隔5天输精一次，收集10天的受精蛋，共获得种蛋25枚，对收集得到的种蛋进行孵化，获得雏鸡21只，其中9只为银羽表型，12只为金羽表型，通过翻肛鉴别法鉴别雏鸡性别，其中9只银羽表型个体均为公鸡，12只金羽表型个体为母鸡，这与金银羽表型进行自别雌雄的结果一致，这进一步说明本发明建立的金银羽位点基因型鉴定方法能够有效的用于金羽和银羽纯系及应用金银羽表型进行自别雌雄的雏鸡性别鉴定配套系的建立，进一步说明了本发明的有效性。
[0073]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。