辣椒秸秆降解-原位还田变化的制作方法

1.本发明属于微生物领域，具体涉及辣椒秸秆降解-原位还田变化。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.目前，利用微生物的广泛适应性和多功能性来转化秸秆已日益受到国内外科学研究者重视，因为微生物在秸秆转化中有用途多、营养价值高、周期短、可再生等优点。作为利用秸秆资源的新途径，有着广阔的应有前景，将在农业生产中发挥越来越重要的作用。目前，研制开发理想的作物秸秆快速腐熟剂已成为微生物制剂的一个热点。此类产品在我国农业上的应用处于起步阶段，虽然有些品种已应用了好几年，也有效果好的产品，但多数产品仍存在许多要改进的地方，应用效果也还需要多点试验的验证，特别是在产品质量的技术指标、菌种组合和提高农产品质量方面。
4.辣椒种植面积居我国蔬菜作物之首，其秸秆已成为主要的蔬菜废弃物之一。对辣椒秸秆进行无害化处理和资源化利用有利于减少农业面源污染，保护自然生态环境。
5.但发明人研究发现：现有的用于辣椒秸秆降解的菌剂，在降解效率上仍有待提高。


技术实现要素：

6.为了克服上述问题，本发明提供了一种辣椒秸秆降解-原位还田变化的方法。有效地提高了辣椒秸秆降解效率。
7.为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明的第一个方面，提供了一种辣椒秸秆降解-原位还田变化的方法，包括：
9.将辣椒秸秆风干后，脱去木质素，调节ph至中性，干燥，切片，备用；
10.以上述切片后的辣椒秸秆作为碳源，配制含辣椒秸秆的培养基，灭菌；
11.将长期辣椒秸秆还田的土壤分为多组样品，分别在密封条件下，于所述培养基中进行一次静置培养；然后，摇匀，取混合液，置于含辣椒秸秆的培养基中，震荡培养；
12.对多组样品进行筛选，保留分解能力强的样品，再次于含辣椒秸秆的培养基中进行二次静置培养，多次重复筛选、二次静置培养的过程，直至降解能力和微生物组保持稳定，即得。
13.本发明的第二个方面，提供了任一上述的辣椒秸秆降解-原位还田变化的方法筛选出的含秸秆降解微生物的菌剂。
14.本发明的第三个方面，提供了一种用于筛选含秸秆降解微生物的菌剂的培养基，由如下质量份的原料组成：蛋白胨4～6份、酵母膏1.2～2.0份、caco
3 1.8～2.4份、nacl 4～6份、mgso4·
7h2o 0.3～0.5份、k2hpo
4 0.7～0.9份、辣椒秸秆8～10份、水950～1050份。
15.本发明的第四个方面，提供了一种具有降解辣椒秸秆能力的细菌菌群的筛选、富集培养方法，包括：
16.将辣椒秸秆风干后，脱去木质素，调节ph至中性，干燥，切片，备用；
17.以上述切片后的辣椒秸秆作为碳源，配制含辣椒秸秆的培养基，灭菌；
18.将长期辣椒秸秆还田的土壤分为多组样品，分别在密封条件下，于所述培养基中进行一次静置培养；然后，摇匀，取混合液，置于含辣椒秸秆的培养基中，震荡培养；
19.对多组样品进行筛选，保留分解能力强的样品，再次于含辣椒秸秆的培养基中进行二次静置培养，多次重复筛选、二次静置培养的过程，直至降解能力和微生物组保持稳定，即得。
20.本发明的第五个方面，提供了一种用于辣椒秸秆降解-原位还田的菌剂，包括如下菌种：otu11、otu208、otu225、otu254、otu255、otu257、otu262。
21.本发明的方法可以用于具有降解辣椒秸秆能力的细菌菌群的工业化培养，获得的菌种可用于制作的菌剂、细胞固定化菌源、或生物添加至农田，以提高辣椒秸秆的还田速率。
22.本发明的有益效果在于：
23.(1)采用本发明筛选出的菌剂处理后原位还田辣椒秸秆在田间土壤中的实际质量显著降低。
24.(2)采用本发明的方法可以快速地对具有降解辣椒秸秆能力的细菌菌群进行筛选、富集和培养，使其总细菌中占有数量优势，进而使获得的菌液用于原位还田时，可以有效地提高辣椒秸秆的降解速率。
25.(3)本发明的方法培养出具有较优降解辣椒秸秆能力的协同降解细菌菌群，有多种不同类型的细菌组成，具有生物多样性，较纯种细菌更具优势。
26.(4)本技术的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。
附图说明
27.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
28.图1为本发明实施例1中辣椒秸秆降解率图。
29.图2为本发明实施例1中辣椒秸秆降解实物图。
具体实施方式
30.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
31.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
32.一种辣椒秸秆降解-原位还田变化的方法，包括：
33.将辣椒秸秆风干后，脱去木质素，调节ph至中性，干燥，切片，备用；
34.以上述切片后的辣椒秸秆作为碳源，配制含辣椒秸秆的培养基，灭菌；
35.将长期辣椒秸秆还田的土壤分为多组样品，分别在密封条件下，于所述培养基中
进行一次静置培养；然后，摇匀，取混合液，置于含辣椒秸秆的培养基中，震荡培养；
36.对多组样品进行筛选，保留分解能力强的样品，再次于含辣椒秸秆的培养基中进行二次静置培养，多次重复筛选、二次静置培养的过程，直至降解能力和微生物组保持稳定，即得。
37.在一些实施例中，所述长期辣椒秸秆还田的土壤为辣椒秸秆还田时间在两年以上的土壤。
38.在一些实施例中，所述脱去木质素的具体方法为：将辣椒秸秆在碱溶液中浸泡24～32h。
39.在一些实施例中，所述培养基包括：蛋白胨、酵母膏、caco3、nacl、mgso4·
7h2o、k2hpo4；
40.在一些实施例中，所述一次静止培养的条件为：黑暗和29～31℃，3～4天。
41.在一些实施例中，所述含辣椒秸秆的培养基中，辣椒秸秆的含量为0.8～1.5％w/v，优选的，为1％w/v。
42.在一些实施例中，所述振荡培养的条件为：黑暗和28～30℃，6～8天；
43.在一些实施例中，所述二次静止培养的条件为：黑暗和28～30℃，6～8天。
44.在一些实施例中，重复次数为15～20次。
45.下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
46.实施例1：
47.1原料
48.(1)含秸秆降解微生物样品的采集
49.长期(两年以上)辣椒秸秆还田的土壤200g。
50.(2)培养基碳源
51.将辣椒秸秆风干后，用1％naoh溶液浸泡24h脱去木质素，清水冲洗数次至冲洗液ph中性(7.0)，80℃烘干，切成2cm长片段备用。
52.(3)培养基
53.5.5g蛋白胨(peptone)、1.6g酵母膏(yeast extract)、2.1g caco3、4.5g nacl、0.4g mgso4·
7h2o、0.8g k2hpo4、1％(w/v，1000ml加入10g)辣椒秸秆(2cm片段)、1,000ml去离子水，ph＝7.2。培养基配好后，务必保证121℃灭菌20min。
54.2协同降解辣椒秸秆的复合微生物菌系筛选
55.(1)将20g长期辣椒秸秆还田的土壤放入500-ml锥形瓶，加入350ml灭菌的培养基，用锡箔纸或通气封口膜密封，在黑暗和室温(大约30℃)条件下静置培养3天，同时设置几十组平行样，置于重复瓶，以便于后续筛选。
56.(2)培养3天后，充分摇匀，吸取20ml摇匀后的混合液放入新的500-ml锥形瓶中，加入380ml灭菌的培养基[含1％(w/v)辣椒秸秆]，在黑暗和室温(28-30℃)条件下震荡(210rpm)培养6天。
[0057]
(3)培养6天后，根据秸秆降解情况，淘汰无分解和分解较弱的重复，保留分解能力强的重复。充分摇匀分解能力强的重复瓶，吸取20ml摇匀后的混合液放入新的500-ml锥形瓶中，加入380ml灭菌的培养基[含1％(w/v)辣椒秸秆]，在黑暗和室温(28-30℃)条件下静
置培养6天。
[0058]
(4)重复步骤(3)15-20次，直至降解能力和微生物组保持稳定，即得到菌剂。
[0059]
实施例2：
[0060]
对实施例1的菌剂对辣椒秸秆的降解性能进行测试，降解性能测试的具体方法为：将辣椒秸秆粉碎，与菌剂按照质量比1:100的比例混合均匀，置于网袋中，然后，将网袋埋于地下，定期取出，测试辣椒秸秆的质量，计算降解率，具体测试结果如表1、表2、图1、图2所示。
[0061]
表1为辣椒秸秆降解率表
[0062][0063]
[0064]
表2菌剂处理后原位还田辣椒秸秆在田间土壤中的实际质量
[0065][0066]
由此可知，采用本发明的方法可以快速地对具有降解辣椒秸秆能力的细菌菌群进行筛选、富集和培养，使其总细菌中占有数量优势，获得的菌液用于原位还田时，有效地提高了辣椒秸秆的降解速率。
[0067]
实施例3：
[0068]
为了更好地探究辣椒秸秆的降解规律及后期的商业化应用，本技术还对实施例1获得的菌剂中的菌株进行测序(测试方法为商业化的高通量测序技术)；菌群序列如下：
[0069]
otu11
[0070]
chryseobacteriumtaichungense strain cc-twgs1-8 16s ribosomal rna,partial sequence
[0071]
organism chryseobacteriumtaichungense
[0072]
bacteria；bacteroidetes；flavobacteriia；flavobacteriales；
[0073]
weeksellaceae；chryseobacterium group；chryseobacterium.
[0074]
origin seq id no:1
[0075]
otu208
[0076]
stenotrophomonas acidaminiphila strain amx 19 16s ribosomal rna,partial sequence
[0077]
organism stenotrophomonasacidaminiphila
[0078]
bacteria；proteobacteria；gammaproteobacteria；xanthomonadales；
[0079]
xanthomonadaceae；stenotrophomonas.
[0080]
origin seq id no:2
[0081]
otu225
[0082]
lentimicrobiumsaccharophilum strain tbc1 16s ribosomal rna,partial sequence
[0083]
organism lentimicrobiumsaccharophilum
[0084]
bacteria；bacteroidetes；bacteroidia；bacteroidales；
[0085]
lentimicrobiaceae；lentimicrobium.
[0086]
origin seq id no:3
[0087]
otu254
[0088]
siccibacterturicensis strain 508/05 16s ribosomal rna,partial sequence
[0089]
organism siccibacterturicensis
[0090]
bacteria；proteobacteria；gammaproteobacteria；enterobacterales；
[0091]
enterobacteriaceae；siccibacter.
[0092]
origin seq id no:4
[0093]
otu255
[0094]
bacillus qingshengii strain g19 16s ribosomal rna,partial sequence
[0095]
organism priestiaqingshengii
[0096]
bacteria；firmicutes；bacilli；bacillales；bacillaceae；priestia.
[0097]
origin seq id no:5
[0098]
otu257
[0099]
devosiageojensis strain bd-c194 16s ribosomal rna,partial sequence
[0100]
organism devosiageojensis
[0101]
bacteria；proteobacteria；alphaproteobacteria；rhizobiales；
[0102]
hyphomicrobiaceae；devosia.
[0103]
origin seq id no:6
[0104]
otu262
[0105]
edaphocola flava strain hme-24 16s ribosomal rna,partial sequence
[0106]
organism edaphocola flava
[0107]
bacteria；bacteroidetes；chitinophagia；chitinophagales；
[0108]
chitinophagaceae；edaphocola.
[0109]
origin seq id no:7
[0110]
otu265
[0111]
niabellahibiscisoli strain thg-dn5.5 16s ribosomal rna,partial sequence
[0112]
organism niabellahibiscisoli
[0113]
bacteria；bacteroidetes；chitinophagia；chitinophagales；
[0114]
chitinophagaceae；niabella.
[0115]
origin seq id no:8
[0116]
otu266
[0117]
syntrophomonaspalmitatica strain mpa 16s ribosomal rna(rrnb),partial sequence
[0118]
organism syntrophomonaspalmitatica
[0119]
bacteria；firmicutes；clostridia；clostridiales；
[0120]
syntrophomonadaceae；syntrophomonas.
[0121]
origin seq id no:9
[0122]
otu268
[0123]
niabellayanshanensis strain ccbau 05354 16s ribosomal rna,partial sequence
[0124]
organism niabellayanshanensis
[0125]
bacteria；bacteroidetes；chitinophagia；chitinophagales；
[0126]
chitinophagaceae；niabella.
[0127]
origin seq id no:10
[0128]
同时，测序结果还表明：占比大于1％的菌株的物种信息包括：otu11、otu208、otu225、otu254、otu255、otu257、otu262中的菌株。
[0129]
实施例4：
[0130]
基于上述菌株测序的结果，本技术采集了otu11、otu208、otu225、otu254、otu255、otu257、otu262中所对应的商业化菌株，将其按照占比相同的比例进行复配，得到商业化菌剂。
[0131]
采用上述商业化菌剂按照实施例2的方法进行辣椒秸秆还田实验，结果表明：辣椒秸秆降解率在112天，可达到31.7％。
[0132]
由此可知，本发明的方法培养出具有降解辣椒秸秆能力的细菌菌群中，多种不同类型的细菌之间具有较好的协同降解辣椒秸秆的效果，属于辣椒秸秆的协同降解菌群，具有生物多样性，较纯种细菌更具优势。
[0133]
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。