一种高强度丝蛋白纳米纤维水凝胶的制备方法

1.本发明属于高强度生物材料技术领域，尤其涉及一种高强度丝蛋白纳米纤维水凝胶的制备方法。


背景技术：

2.高强度材料由于其优异的性能和广泛的应用一直是材料领域研究的热点。自然界存在的高强度材料主要通过微米-纳米尺寸的多级组装和非共价作用实现性能的优化。考虑到天然生物材料的优异生物相容性，壳聚糖、纤维素等高强度天然材料被溶解重构以满足不同领域的应用需求，然而，绝大多数重构的材料会丧失其良好的力学性能，极大限制其应用。如何在重构过程中实现材料在微纳尺度的多级组装成为改善其力学性能的关键。
3.凝胶材料由于同人体组织环境的相似性，已成为再生医学的研究热点，然而同其它形态材料相比，天然生物材料制备的凝胶力学性能更低，难以满足应用需求，高强度水凝胶一直是生物材料研究的难点。蚕丝作为一种典型的天然高强度材料，已被制备成纤维、膜、水凝胶、支架和微球等不同形式，广泛应用于组织工程、柔性电子器件和药物递送等领域。然而，同其它天然材料面临的问题相似，丝蛋白水凝胶的力学性能太低，无法满足多个应用的要求，特别是软骨等具有支撑作用组织修复的需求。
4.近年来，研究者通过改变浓度、化学交联、添加其它成分等方法来提高丝蛋白凝胶的力学性能，然而其制备工艺相对复杂、力学性能提升有限，亟需新的思路和方法来突破现有技术瓶颈。发明人在前期研究中，已开发出具有丰富beta-sheet结构的丝蛋白纳米纤维，并成功用于多孔海绵以及凝胶的制备。然而，由于上述丝蛋白纳米纤维表面富含负电荷，电荷斥力导致纤维之间难以进一步组装和作用，所获得凝胶力学性能极差。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高强度丝蛋白纳米纤维水凝胶的制备方法，本发明提供的方法制备的纳米纤维水凝胶具有优异的压缩模量和断裂强度。
6.本发明提供了一种高强度丝蛋白纳米纤维水凝胶的制备方法，包括：
7.将丝蛋白纳米纤维甲酸溶液中的甲酸和水溶液进行置换，得到高强度丝蛋白纳米纤维水凝胶。
8.优选的，所述置换的时间为2～72小时。
9.优选的，所述丝蛋白纳米纤维甲酸溶液的质量浓度为5～30％。
10.优选的，所述置换的方法包括：
11.将丝蛋白纳米纤维甲酸溶液放入透析袋或者半透膜中，将透析袋或者半透膜放入水溶液中，进行甲酸和水溶液的置换；
12.所述透析袋或者半透膜丝蛋白无法透过，甲酸和水溶液能够透过。
13.优选的，所述置换后还包括：
14.将置换后的产物在水溶液中浸泡，重复换水溶液，直至换后水溶液的ph值为6～8。
15.优选的，所述置换过程中水溶液和甲酸的体积比在3：1以上。
16.优选的，所述丝蛋白纳米纤维甲酸溶液的制备方法包括：
17.将丝蛋白纳米纤维冻干粉溶解于甲酸中，得到丝蛋白纳米纤维甲酸溶液；
18.所述溶解的温度为4～80℃；所述溶解的时间为0.1～24小时。
19.优选的，所述水溶液包括：
20.纯水或含有离子的水溶液，
21.所述离子为镁离子、钙离子和/或铜离子。
22.优选的，所述丝蛋白纳米纤维冻干粉的制备方法包括：
23.将高晶丝蛋白纳米纤维水溶液冻干，得到丝蛋白纳米纤维冻干粉；
24.所述高晶丝蛋白纳米纤维水溶液的质量浓度为0.01～4％。
25.优选的，所述高晶丝蛋白纳米纤维水溶液的制备方法包括：
26.将丝蛋白水溶液依次进行一次浓缩、二次浓缩后稀释，密封孵育，得到高晶丝蛋白纳米纤维水溶液。
27.本发明提供的方法采用的高晶丝蛋白纳米纤维具有beta-sheet的结晶结构及良好的稳定性，溶解在甲酸中仍能保持其原有二级结构和纳米纤维形貌，通过甲酸体系中丝蛋白浓度调控优化纳米纤维之间的相互作用，然后利用特定透析袋或半透膜将甲酸和水相互置换，在保留丝蛋白纳米纤维相互作用的基础上，获得高强度的丝蛋白纳米纤维水凝胶。本发明首先利用甲酸溶剂体系实现丝蛋白纳米纤维的相互作用，随后通过半透膜或透析袋将甲酸置换成水，以保留纤维之间的相互作用，获得高强度的丝蛋白纳米纤维水凝胶，其压缩模量和断裂强度分别达到5.88mpa和1.55mpa，并且在常温常压下进行，制备方法简单易行。
28.利用甲酸作为溶剂溶解丝蛋白纳米纤维，以降低电荷斥力，促进纳米纤维之间的再组装，获得力学性能优异的丝蛋白薄膜，然而，如何将在甲酸体系中已经相互作用的丝蛋白纳米纤维体系转移到水相体系，制备高强度水凝胶缺乏可行方法，本发明在不破坏丝蛋白纳米纤维相互作用的基础上，实现甲酸体系中丝蛋白纳米纤维向水相环境的转移，获得高强度的丝蛋白纳米纤维水凝胶。
附图说明
29.图1为本发明实施例1制备的丝蛋白纳米纤维分别溶解在水中(a图)和甲酸中(b图)的原子力显微镜图片；
30.图2为本发明实施例1制备的丝蛋白纳米纤维水凝胶(a图)及其在压缩(b图)、弯曲(c图)、拉伸(d图)、压缩前(e图)、压缩60％后(f图)等不同状态下的数码照片；
31.图3为本发明实施例1制备的丝蛋白纳米纤维水凝胶的微观结构图(采用冷场发射扫描电子显微镜观察)；
32.图4为本发明实施例1制备的丝蛋白纳米纤维水凝胶压缩和拉伸的应力应变曲线图；
33.图5为本发明实施例1制备的丝蛋白纳米纤维水凝胶红外光谱图。
具体实施方式
34.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.本发明提供了一种高强度丝蛋白纳米纤维水凝胶的制备方法，包括：
36.将丝蛋白纳米纤维甲酸溶液中的甲酸和水溶液进行置换，得到高强度丝蛋白纳米纤维水凝胶。
37.在本发明中，所述丝蛋白纳米纤维甲酸溶液的质量浓度优选为5～30％，更优选为10～25％，最优选为15～20％，最最优选为5％、10％、15％或20％。
38.在本发明中，所述丝蛋白纳米纤维甲酸溶液的制备方法优选包括：
39.将丝蛋白纳米纤维冻干粉溶解于甲酸中，得到丝蛋白纳米纤维甲酸溶液(snf-fa)。
40.在本发明中，所述丝蛋白纳米纤维冻干粉的制备方法优选包括：
41.将高晶丝蛋白纳米纤维水溶液冻干，得到丝蛋白纳米纤维冻干粉。
42.在本发明中，所述高晶丝蛋白纳米纤维水溶液的质量浓度优选为0.01～4％，更优选为0.05～3％，更优选为0.1～2％，更优选为0.5～1.5％，最优选为1％或2％。
43.在本发明中，所述高晶丝蛋白纳米纤维水溶液中的高晶丝蛋白纳米纤维的结晶度优选≥40％，直径优选为10～30nm，更优选为15～25nm，最优选为20nm；长度优选为200～2000nm，更优选为500～1500nm，更优选为800～1200nm，最优选为1000nm。
44.在本发明中，所述高晶丝蛋白纳米纤维水溶液的制备方法优选包括：
45.将丝蛋白水溶液依次进行一次浓缩、二次浓缩后稀释，密封孵育，得到高晶丝蛋白纳米纤维水溶液。
46.在本发明中，所述丝蛋白水溶液的制备方法优选包括：
47.将蚕丝脱胶后干燥，然后在溴化锂溶液中溶解、透析，得到丝蛋白水溶液。
48.在本发明中，所述脱胶优选采用na2co3水溶液；所述蚕丝、水和na2co3的用量比例优选为(4～6)g：(1～3)l：(4～5)g，更优选为(4.5～5.5)g：(1.5～2.5)l：(4.2～4.5)g，最优选为5g：2l：4.24g。
49.在本发明中，所述干燥优选为烘干。
50.在本发明中，所述溴化锂溶液的浓度优选为9～10mol/l，更优选为9.1～9.5mol/l，最优选为9.2～9.3mol/l。
51.在本发明中，所述干燥后的产物和溴化锂溶液的用量比例优选为(2.5～3.5)g：(8～12)ml，更优选为(2.6～2.8)g：(9～11)ml，最优选为2.7g：10ml。
52.在本发明中，所述透析的时间优选为2～4天，更优选为3天。
53.在本发明中，所述一次浓缩优选将丝蛋白水溶液的质量浓度浓缩至8～12％，更优选为9～11％，最优选为10％；所述第二浓缩优选将一次浓缩后的丝蛋白水溶液质量浓度浓缩至16～24％，更优选为18～22％，最优选为20％；所述稀释优选为加水稀释，优选将二次浓缩后的丝蛋白水溶液的质量浓度加水稀释至0.01～4％，更优选为0.05～3％，更优选为0.1～2％，更优选为0.5～1.5％，最优选为1％。
54.在本发明中，所述溶解的温度优选为4～80℃，更优选为10～70℃，更优选为20～60℃，更优选为30～50℃，最优选为40℃，最最优选为4℃、10℃、20℃、40℃或60℃；所述溶解的时间优选为0.1～24小时，更优选为0.5～20小时，更优选为1～15小时，更优选为5～12小时，最优选为8～10小时，最最优选为0.5小时、1小时、4小时、12小时或24小时。
55.在本发明中，所述水溶液优选包括：纯水或含有离子的水溶液；所述纯水优选为去离子水；所述离子优选选自镁离子、钙离子和/或铜离子。
56.在本发明中，所述置换过程中为保证甲酸能够快速析出，水溶液进入快速固化丝蛋白形成凝胶，所述水溶液和甲酸的体积比优选大于3：1，更优选为(3～8)：1，更优选为(4～6)：1，最优选为5：1。
57.在本发明中，所述置换过程中为保证甲酸充分析出，置换的时间优选为2～72小时，更优选为4～70小时，更优选为10～60小时，更优选为20～50小时，更优选为30～40小，最优选为2小时、8小时、24小时或48小时。
58.在本发明中，所述置换的方法优选包括：
59.将丝蛋白纳米纤维甲酸溶液放入透析袋或者半透膜中，将透析袋或者半透膜放入水溶液中，进行甲酸和水溶液的置换。
60.在本发明中，所述透析袋或者半透膜丝蛋白无法透过，甲酸和水溶液能够透过；所述透析袋或半透膜的截留分子量优选为3000～10000，更优选为5000～8000，最优选为6000。
61.在本发明中，通过透析袋或半透膜将内部的甲酸同水溶液进行置换，使甲酸从透析袋或半透膜析出，水进入，得到丝蛋白纳米纤维水凝胶。
62.在本发明中，为保证甲酸充分析出，置换过程中的水溶液优选用新鲜溶液多次替换，即一次置换后替换新鲜的水溶液再次进行置换，所述替换水溶液的次数优选为2次以上，更优选为2～8次，更优选为4～6次，最优选为5次；所述替换水溶液的时间间隔优选为5～15小时，更优选为8～12小时，最优选为10小时。
63.在本发明中，所述置换完成后优选还包括：
64.将置换后的产物在水溶液中浸泡，重复换水溶液，直至换后水溶液的ph值为6～8。
65.在本发明中，优选将置换后的固态丝蛋白水凝胶从透析袋或半透膜中取出，在水溶液中浸泡，去除残留的甲酸；所述浸泡过程中优选重复换水溶液，直至换后水溶液(浸泡后的水溶液)的ph值达到6～8，获得最终的高强度丝蛋白纳米纤维水凝胶。
66.在本发明中，所述重复换水溶液的次数优选为2次以上，更优选为2～8次，更优选为3～6次，最优选为4～5次。
67.在本发明中，所述重复换水溶液优选使换后的水溶液(浸泡后的水溶液)的ph值为6.8～7.2，更优选为7。
68.本发明提供了一种上述技术方案所述的方法制备得到的高强度丝蛋白纳米纤维水凝胶，所述高强度丝蛋白纳米纤维水凝胶可通过模具或加工方法制备成不同形状的产品，如长条状或星状。
69.本发明通过甲酸体系中丝蛋白浓度调控优化纳米纤维之间的相互作用，然后利用特定透析袋或半透膜将甲酸和水相互置换，在保留丝蛋白纳米纤维相互作用的基础上，获得高强度的丝蛋白纳米纤维水凝胶。本发明首先利用甲酸溶剂体系实现丝蛋白纳米纤维的
相互作用，随后通过半透膜或透析袋将甲酸置换成水，以保留纤维之间的相互作用，获得高强度的丝蛋白纳米纤维水凝胶，其压缩模量和断裂强度分别达到5.88mpa和1.55mpa，并且在常温常压下进行，制备方法简单易行。
70.实施例1
71.将质量浓度为1％丝蛋白纳米纤维水溶液冻干，得到丝蛋白纳米纤维冻干粉；所述1％丝蛋白纳米纤维水溶液的制备方法为：
72.将蚕丝用na2co3水溶液脱胶(5g蚕丝：2l水：4.24g na2co3)后烘干，以(2.7g:10ml)的浴比于9.3mol/l的溴化锂溶液中溶解，取出透析3天，获得丝蛋白水溶液，然后将丝蛋白水溶液依次进行一次浓缩、二次浓缩后至质量浓度为20％，用去离子水稀释至质量浓度为1％，密封孵育；
73.将丝蛋白纳米纤维冻干粉于60℃在甲酸中溶解0.5h，获得质量浓度为20％的丝蛋白纳米纤维甲酸溶液；
74.将质量浓度为20％的丝蛋白纳米纤维甲酸溶液放置于截留分子量为3500的透析袋(源叶公司，型号sp132594)中，随后放入体积为甲酸体积5倍的去离子水中，进行溶剂置换，每8小时用新鲜去离子替换外部含有析出甲酸的水溶液，共置换3次，在透析袋内部形成固态丝蛋白纳米纤维水凝胶；
75.将上述固态丝蛋白水凝胶取出，放置于去离子水中浸泡，去除残留的甲酸，每小时换水1次，换水3次后，测量水的ph值为6.8，获得最终水凝胶。
76.图1为本发明实施例1制备的丝蛋白纳米纤维分别溶解在水(a)中和甲酸(b)中的原子力显微镜图片；从图1可以看出：在水溶液中甲酸溶液中丝素蛋白都呈现出纳米纤维的形貌；水溶液中纳米纤维长度分布在200～1000nm，而甲酸中纳米纤维长度减小到50～200nm，更短的纤维长度为纤维间相互作用提供了更多的机会。
77.图2为本发明实施例1制备的丝蛋白纳米纤维水凝胶(a)及其在压缩、弯曲、拉伸等不同状态下的数码照片(b～f)，可以看到水凝胶可以加工成不同形状，在压缩、弯曲以及拉伸状态下均保持完整形态，表明其具有良好的可加工性和力学性能。
78.图3为本发明实施例1制备的丝蛋白纳米纤维水凝胶的微观结构图；从图3可以看出，凝胶保持均匀的多孔结构，纳米纤维形态已不明显，表明纤维发生再组装，且结合紧密。
79.对实施例1制备的高强度丝蛋白纳米纤维水凝胶的压缩模量和断裂强度进行测试：
80.在25
±
0.5℃，60
±
5％的相对湿度下，使用万能试验机(instron 5967，样品高度：10mm；压缩速度：5mm/min)进行压缩测试；使用万能试验机(instron3365，样品长度：10mm；拉伸速度：10mm/min)进行拉伸测试。
81.检测结果如图4，图4为本发明实施例1制备的丝蛋白纳米纤维水凝胶压缩和拉伸的应力应变曲线图，从图4可以看出，本发明实施例1制备的丝蛋白纳米纤维水凝胶力学性能优异，其压缩模量和断裂强度分别达到5.88mpa和1.55mpa。
82.图5为本发明实施例1制备的丝蛋白纳米纤维水凝胶(snf20)的红外光谱图，对照分别为相同浓度甲酸溶液中丝蛋白纤维(snf-fa，将丝蛋白纳米纤维冻干粉溶解于甲酸中获得)的红外光谱图以及传统丝蛋白纳米纤维水凝胶(snf2，丝蛋白水溶液依次进行一次浓缩、二次浓缩后，用去离子水稀释至2wt％，密封孵育获得)的红外光谱图；从图5可以看出，
传统高晶丝蛋白纳米纤维水凝胶中1168cm-1
和1064cm-1
两处的吸收峰为1064cm-1
强1168cm-1
弱，而甲酸溶液和本发明制备的丝蛋白纳米纤维水凝胶中1168cm-1
和1064cm-1
两处的吸收峰则均为1064cm-1
弱1168cm-1
强，表明在甲酸溶液中纳米纤维之间形成了良好的相互作用，且此相互作用在本发明实施例制备的水凝胶中完好保留。
83.实施例2
84.将质量浓度为2％丝蛋白纳米纤维水溶液(制备方法同实施例1，与实施例1的区别在于，用去离子水稀释至质量浓度为2％)冻干，得到丝蛋白纳米纤维冻干粉；
85.将丝蛋白纳米纤维冻干粉于20℃在甲酸中溶解4h，获得质量浓度为10％的丝蛋白纳米纤维甲酸溶液；
86.将质量浓度为10％的丝蛋白纳米纤维甲酸溶液放置于截留分子量为5000的半透膜(源叶公司，型号sp131192)中，随后放入体积为甲酸体积3倍的去离子水中，进行溶剂置换，每4小时用新鲜去离子水替换外部含有析出甲酸的水溶液，共置换4次，在透析袋内部形成固态丝蛋白纳米纤维水凝胶；
87.将上述固态丝蛋白水凝胶取出，放置于去离子水中浸泡，去除残留的甲酸，每2小时换水1次，换水4次后，测量水的ph值为7.2，获得最终水凝胶。
88.按照实施例1的方法，对本发明实施例2制备的水凝胶进行力学性能检测，检测结果为，实施例2制备的丝蛋白纳米纤维水凝胶压缩模量和断裂强度分别达到1.71mpa和0.9mpa。
89.实施例3
90.将质量浓度为1％丝蛋白纳米纤维水溶液(制备方法同实施例1)冻干，得到丝蛋白纳米纤维冻干粉；
91.将丝蛋白纳米纤维冻干粉于4℃在甲酸中溶解24h，获得质量浓度为15％的丝蛋白纳米纤维甲酸溶液；
92.将质量浓度为15％的丝蛋白纳米纤维甲酸溶液放置于截留分子量为10000的透析袋(源叶公司，型号sp131270)中，随后放入体积为甲酸体积8倍的含有镁离子的水(镁离子浓度为100mmol/l)中，进行溶剂置换，每12小时用新鲜含镁离子的水替换外部含有析出甲酸的水溶液，共置换4次，在透析袋内部形成固态丝蛋白纳米纤维水凝胶；
93.将上述固态丝蛋白水凝胶取出，放置于去离子水中浸泡，去除残留的甲酸，每4小时换水1次，换水6次后，测量水ph值为7，获得最终水凝胶。
94.按照实施例1的方法，对本发明实施例3制备的产品进行力学性能检测，检测结果为，实施例3制备的丝蛋白纳米纤维水凝胶压缩模量和断裂强度分别达到3.22mpa和1.3mpa。
95.实施例4
96.将质量浓度为2％丝蛋白纳米纤维水溶液(制备方法同实施例2)冻干，获得丝蛋白纳米纤维冻干粉；
97.将丝蛋白纳米纤维冻干粉于40℃在甲酸中溶解4h，获得质量浓度为5％的丝蛋白纳米纤维甲酸溶液；
98.将质量浓度为5％的丝蛋白纳米纤维甲酸溶液放置于截留分子量为3500的半透膜(源叶公司，型号sp132594)中，随后放入体积为甲酸体积3倍的含有钙离子的水(钙离子浓
度为100mmol/l)中，进行溶剂置换，每半小时用新鲜含钙离子的水替换外部含有析出甲酸的水溶液，共置换8次，在透析袋内部形成固态丝蛋白纳米纤维水凝胶；
99.将上述固态丝蛋白水凝胶取出，放置于去离子水中浸泡，去除残留的甲酸，每3小时换水1次，换水4次后，测量水ph值为7.2，获得最终水凝胶。
100.按照实施例1的方法，对本发明实施例4制备的水凝胶进行力学性能检测，检测结果为，实施例4制备的丝蛋白纳米纤维水凝胶压缩模量和断裂强度分别达到1.06mpa和0.7mpa。
101.实施例5
102.将质量浓度为2％丝蛋白纳米纤维水溶液(制备方法同实施例2)冻干，得到丝蛋白纳米纤维冻干粉；
103.将丝蛋白纳米纤维冻干粉于10℃在甲酸中溶解12h，获得质量浓度为15％的丝蛋白纳米纤维甲酸溶液；
104.将质量浓度为15％的丝蛋白纳米纤维甲酸溶液放置于截留分子量为5000的半透膜(源叶公司，型号sp131192)中，随后放入体积为甲酸体积8倍的含有铜离子的水(铜离子浓度为100mmol/l)中，进行溶剂置换，每3小时用新鲜含铜离子的水替换外部含有析出甲酸的水溶液，共置换8次，在透析袋内部形成固态丝蛋白纳米纤维水凝胶；
105.将上述固态丝蛋白水凝胶取出，放置于去离子水中浸泡，去除残留的甲酸，每2小时换水1次，换水6次后，测量水ph值为7，获得最终水凝胶。
106.按照实施例1的方法，对本发明实施例5制备的水凝胶进行力学性能检测，检测结果为，实施例5制备的丝蛋白纳米纤维水凝胶压缩模量和断裂强度分别达到3.86mpa和1.5mpa。
107.本发明提供的方法通过甲酸降低电荷斥力、优化非共价作用，随后通过透析袋或半透膜实现甲酸和水的置换，获得高强度水凝胶的方法为其他材料的力学调控提供实验依据，可在高强度凝胶制备领域取得广泛应用。
108.本发明通过溶解在甲酸中丝蛋白纳米纤维的浓度来调控丝蛋白纳米纤维间相互作用，随后通过透析袋或半透膜将甲酸用水进行置换，获得高强度的丝蛋白水凝胶材料。本发明提供的通过甲酸降低电荷斥力、优化纳米纤维相互作用，随后通过甲酸和水的置换，在保持纳米纤维相互作用的基础上获得水凝胶的方法可在高强度材料制备领域取得广泛应用。
109.虽然已参考本发明的特定实施例描述并说明本发明，但是这些描述和说明并不限制本发明。所属领域的技术人员可清晰地理解，在不脱离如由所附权利要求书定义的本发明的真实精神和范围的情况下，可进行各种改变，以使特定情形、材料、物质组成、物质、方法或过程适宜于本技术的目标、精神和范围。所有此类修改都意图在此所附权利要求书的范围内。虽然已参考按特定次序执行的特定操作描述本文中所公开的方法，但应理解，可在不脱离本发明的教示的情况下组合、细分或重新排序这些操作以形成等效方法。因此，除非本文中特别指示，否则操作的次序和分组并非本技术的限制。