一种高分辨率的显色平皿及其应用

1.本发明属于微生物学研究领域，尤其涉及一种高分辨率的显色平皿及其应用。


背景技术：

2.在微生物学研究领域，通过琼脂平皿进行抑菌圈、清空圈或显色圈(下文统一以显色圈指代)对微生物、酶、药物等进行效力评估，是一种常见的检测手段。这种检测手段具有操作简便，成本低廉的优势。尤其是作为一种初筛手段得到广泛的应用。但该方法也具有一些难以忽略的缺陷，包括：(1)例如量度与效力不符，甚至存在级数上的差异；(2)边缘不规则，无法精确测定；(3)越靠近扩散外缘与背景差别越小，难以确定真实边界。以上缺陷阻碍了高分辨率的检测。由于初筛结果决定了后续是否开展精确的抑制力、酶活、效价的检测，一旦判断失误，将会造成后续大量的人力、耗材和时间的浪费。
3.传统的平皿显色圈方法的显色圈其增大过程不与扩散半径呈正比关系，是一个非线性过程，因此无法直观判断总效价的大小。尤其是随着显色圈的外扩，其边缘越来越不清晰，此时测定显色圈半径会导致极大的误差。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高分辨率的显色平皿及其应用；所述高分辨率的显色平皿通过在平皿内部设置二次函数平方根倒数曲线或二次函数立方根倒数曲线扩散路径阻隔，实现扩散梯度的均匀化和扩散路径的倍增，有利于实现更加精确的检测；立方根化扩散路径阻隔的设置能够实现低效价的检测，降低了平皿检测的检测限，提高了平皿检测的灵敏度。
5.本发明提供了一种高分辨率的显色平皿，以所述显色平皿内部底面的圆心为基点，在平皿内部底面上设置若干组镜面对称的扩散路径的阻隔；
6.所述阻隔为垂直于底面、并与所述扩散路径重叠的曲面阻隔；
7.所述扩散路径为二次函数的平方根的倒数曲线或二次函数的立方根的倒数曲线；所述二次函数以扩散距离为自变量x，路径宽度为应变量d。
8.优选的，所述二次函数的平方根的倒数曲线为其中a、b、c为常数，且a≠0。
9.优选的，所述二次函数的立方根的倒数曲线为其中a、b、c为常数，且a≠0。
10.优选的，所述阻隔的数量为6～24组。
11.优选的，所述阻隔的数量为12～18组。
12.优选的，所述显色平皿的底面内部或底面外部设置有刻度条，所述刻度条沿半径自圆周向圆心设置。
13.优选的，所述刻度条设置于每组阻隔的内部区域。
14.优选的，所述显色平皿配置独立的刻度尺。
15.优选的，所述阻隔与所述显色平皿的底面一体成型。
16.本发明还提供了所述的显色平皿在微生物代谢产物检测中的应用。
17.优选的，所述微生物点样位置为所述每组阻隔内部区域靠近圆周的一端。
18.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
19.本发明提供的高分辨率的显色平皿通过在平皿内部设置二次函数的平方根的倒数曲线或二次函数的立方根的倒数曲线扩散路径阻隔，实现扩散梯度的均匀化和扩散路径的倍增，有利于实现更加精确的检测；二次函数的立方根的倒数曲线扩散路径阻隔的设置能够实现低效价的检测，降低了平皿检测的检测限，提高了平皿检测的灵敏度。
20.常规的显色圈是在琼脂平皿之上点种或移液，而后任由活性物质向周围自由扩散，这导致随着扩散的进行，单位距离通过界面活性物质的总量越来越稀释，其稀释程度与扩散距离成正方反比关系。根据菲克扩散方程可知，扩散通量与界面的活性物质浓度差成正比，因此其扩散速度会降低。扩散速度低不利于显色圈的形成，在活性物质浓度较低时尤其严重，甚至不能将显色圈和菌落有效分开。本发明鉴于扩散效应，优化了扩散路径，将路径宽度设计成二次函数的平方根倒数曲线的形式，使扩散梯度降至扩散距离的一次方的数量级。此时，扩散路径由过去的向四周扩散变成了沿直线扩散，且扩散长度大幅提高，有利于实现更加精确的测量。此时的扩增距离与总效价成线性化、正比例关系，可以用于直观评估总效价。由于线性化的扩散非常便于精确测定，使用本发明的平皿可使最终的评估结果的精确度提高一个数量级。
21.本发明将扩散路径设计为二次函数的立方根的倒数曲线，使得扩散距离的增长程度高于效价的增加，可以显著的比较低效价的情况，能够实现更低浓度的检测。
附图说明
22.图1为实施例1和2中的高分辨率显色平皿的结构示意图，其中，1：塑料平皿；2：间隔区；3：平方(立方)根倒数扩散路径区域；4：点样处；5：阻隔板；6：刻度；7：外侧测量基准点；8：内侧测量基准点；箭头所指方向为微生物代谢产物的扩散方向；
23.图2为传统透明圈和平方根化路径透明圈测定结果对比图；
24.图3为扩散截面随扩散距离的变化(传统透明圈法)；
25.图4为点浓度与扩散距离(传统透明圈法)，其中虚线表示扩散系数小，实线表示扩散系数大；
26.图5为点浓度随扩散时间变化(传统透明圈法)，其中虚线表示扩散系数小，实线表示扩散系数大；
27.图6为点效价随扩散距离的变化(传统透明圈法)，其中虚线表示扩散系数小，实线表示扩散系数大；
28.图7为累计效价随扩散距离变化(传统透明圈法)，其中浅色线表示扩散系数小，深色线表示扩散系数大；
29.图8为平方根化扩散路径的曲线；
30.图9为立方根化扩散路径的曲线；
31.图10为乳杆菌在普通平皿(l)和平方根倒数路径平皿(r)的碳酸钙mrs培养基上培养的透明圈情况，其中a～d为被测菌株，b为不接种的空白对照；
32.图11为铜绿假单胞菌在普通平皿(l)和平方根倒数路径平皿(r)中的纤维素钠-刚果红培养基上培养的透明圈情况，其中a～d为被测菌株，b为不接种的空白对照。
具体实施方式
33.本发明提供了一种高分辨率的显色平皿，以所述显色平皿内部底面的圆心为基点，在平皿内部底面上设置若干组镜面对称的扩散路径的阻隔；
34.所述阻隔为垂直于底面、并与所述扩散路径重叠的曲面阻隔；
35.所述扩散路径为二次函数的平方根的倒数曲线或二次函数的立方根的倒数曲线；所述二次函数以扩散距离为自变量x，路径宽度为应变量d。
36.在本发明中，所述二次函数的平方根的倒数的曲线优选为其中a、b、c为常数，且a≠0，具体可选为
37.在本发明中，所述二次函数的立方根的倒数的曲线为其中a、b、c为常数，且a≠0；具体可选为
38.本发明中，所述扩散路径能够设置为通用扩散路径，对所有待检测物质都能够实现高分辨率的检测；进一步的，所述扩散路径也能够根据具体的检测物质设置特异性的扩散路径，调整常数a、b、c的值即可。
39.在本发明中，所述阻隔的数量优选为6～24组，进一步优选为12～18组。
40.在本发明中，所述显色平皿的底面内部或底面外部优选的设置有刻度条，所述刻度条沿半径自圆周向圆心设置；所述刻度条优选的设置于每组阻隔的内部区域；本发明所述刻度条的数量优选的至少为1，进一步优选的与所述阻隔的数量一致。在本发明的另一个具体实施方式中，所述显色平皿配置独立的刻度尺，本发明中，独立的刻度尺的数量优选为1～2个，本发明中独立的刻度尺，方便移动测量。
41.本发明对所述显色平皿的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的平皿的制备方法即可。在本发明中，所述阻隔与所述显色平皿的底面优选的一体成型。在本发明中，所述显色平皿优选的还包括盖子，本发明对所述盖子没有特殊限定，参考本领域常规平皿盖子设置即可。
42.本发明还提供了所述的显色平皿在微生物代谢产物检测中的应用。
43.在本发明中，所述微生物点样位置为所述每组阻隔内部区域靠近圆周的一端。本发明对所述微生物代谢产物没有特殊限定，任意能够用平皿显色检测的微生物代谢产物均可；在本发明中，所述显色包括显透明化或显其他颜色。本发明对所述平皿内的显色培养基的种类没有特殊限定，任意种类能够实现显色检测的培养基均可。
44.本发明对所述显色平皿的其他应用没有特殊限定，所述显色平皿也可以用于常规
的微生物培养，所述显色平皿用于常规的微生物培养时，能够实现在同一平皿内分区域培养。
45.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
46.实施例1
47.二次函数的平方根的倒数曲线扩散路径的设计
48.使用绘图工具绘制二次函数的平方根曲线(曲线如图8所示)。将曲线进行镜像化处理，形成漏斗状，即得到二次函数的平方根倒数曲线
49.根据上述获得的二次函数的平方根的倒数曲线，以d＝0时的点为基点，设置于圆心处，在9cm直径平皿底面内部设置12组扩散路径的阻隔；具体结构示意图参见图1。
50.实施例2
51.二次函数的立方根的倒数曲线扩散路径的设计
52.使用绘图工具绘制二次函数的立方根曲线(曲线如图9所示)。将曲线进行镜像化处理，形成漏斗状，即得到二次函数的立方根倒数曲线
53.根据上述获得的二次函数的立方根倒数曲线，以d＝0时的点为基点，设置于圆心处，在9cm直径平皿底面内部设置12组扩散路径的阻隔；具体结构参见图1。
54.实施例3
55.二次函数的平方根的倒数曲线扩散路径平皿的制备和应用
56.实施例1设计的平方根倒数曲线扩散路径平皿制备完成后，采用伽玛射线灭菌后备用。
57.配制碳酸钙mrs固体培养基并进行高压灭菌。所述碳酸钙mrs固体培养基包括以下质量百分含量的组分：葡萄糖2％，蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母抽提物0.5％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸三铵0.2％，七水硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，吐温-800.1％，琼脂2％，碳酸钙1％和余量的水；ph 6.5，115℃灭菌30分钟。
58.在无菌操作台内，使用移液器分别取1ml尚未凝固的培养基加入扩散路径阻隔区域内，等待凝固后备用。
59.取相同的新鲜培养的嗜酸乳杆菌溶液各20微升，分别接种于传统的碳酸钙显色(透明圈)平皿和上述制备的二次函数的平方根倒数曲线扩散路径平皿的碳酸钙显色(透明圈)平皿。置于30℃恒温厌氧培养24h。观察透明圈(透明条)情况，并记录，结果如表1所示。
60.表1传统平皿和平方根倒数曲线扩散路径平皿透明圈的测量结果
[0061][0062]
由表1可知，使用本实施例提供的平方根倒数曲线扩散路径平皿观察效果好，易测量，重复性好，精度高。
[0063]
实施例4
[0064]
立方根的倒数的曲线扩散路径平皿的制备和应用
[0065]
实施例2设计的立方根倒数曲线扩散路径平皿制备完成后，采用伽玛射线灭菌后备用。
[0066]
配置0.2％纤维素钠-刚果红固体培养基并进行高压灭菌。0.2％纤维素钠-刚果红固体培养基由以下质量百分含量的组分组成：醋酸纤维素钠0.2％，硫酸铵0.2％，氯化钠0.05％，磷酸氢二钾0.1％，七水硫酸镁0.05％，刚果红0.04％，琼脂2％和余量的水，ph 7.0。115℃灭菌30分钟。
[0067]
在无菌操作台内，使用移液器分别取1ml尚未凝固的培养基加入扩散路径区域内，等待凝固后备用。
[0068]
取相同的新鲜培养的铜绿假单胞菌溶液各20微升，分别接种于传统的纤维素纳-刚果红显色(透明圈)平皿和立方根倒数曲线扩散路径的碳酸钙显色(透明圈)平皿。置于37℃恒温培养24h。观察透明圈(透明条)情况，并记录，结果如表2。
[0069]
表2传统平皿和立方根倒数曲线扩散路径平皿透明圈的测量结果
[0070] 传统平皿(x
±
sd)立方根的倒数曲线扩散路径平皿测量1(cm)无法观测0.57
±
0.05测量2(cm)0.4
±
0.11.26
±
0.05测量3(cm)无法观测0.19
±
0.05测量4(cm)0.4
±
0.11.36
±
0.05
[0071]
由于待测菌株的纤维素降解水平较低，即效价过低，无法有效地在显色平皿上形成稳定的、可测量的透明圈，因而失去测量意义。使用立方根倒数曲线扩散路径平皿，扩散路径被延长到便于测定的长度，且测量值具有很好的稳定性。此时，测量值可以用于比较不同菌落的效价大小，但不能作为定量依据。
[0072]
由上述实施例可知，所述高分辨率的显色平皿通过在平皿内部设置二次函数平方根倒数曲线或二次函数立方根倒数曲线扩散路径阻隔，实现扩散梯度的均匀化和扩散路径的倍增，有利于实现更加精确的检测；立方根化扩散路径阻隔的设置能够实现低效价的检测，降低了平皿检测的检测限，提高了平皿检测的灵敏度。
[0073]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。