NKG2D融合蛋白及其用途的制作方法

nkg2d融合蛋白及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.此申请根据35 u.s.c.
§
119(e)要求以下美国临时专利申请中的利益：(1)2019年9月18日提交的us 62/902,071和(2)2019年9月18日提交的us 62/902,080。这些临时申请的公开内容通过引用整体并入本文。


背景技术：

3.需要用于预防和治疗广泛范围的癌症类型的新颖且有效的疗法。本文提供了本领域中这些和其他问题的解决方案。


技术实现要素：

4.本文提供了包括两个单体的二聚体蛋白，其中每个单体包括(1)第一nkg2d肽或其变体；(2)第二nkg2d肽或其变体；(3)连接所述第一nkg2d肽或其变体和所述第二nkg2d肽或其变体的第一肽接头；以及(4)免疫球蛋白(ig)的可结晶区(fc区)。
5.在一些实施例中，第一nkg2d肽或其变体和第二nkg2d肽或其变体具有相同的氨基酸序列。
6.在一些实施例中，第一nkg2d肽或其变体和第二nkg2d肽或其变体具有不同的氨基酸序列。
7.在一些实施例中，第一nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:1、2、3或4具有至少85％同一性的氨基酸序列。
8.在一些实施例中，第一nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:1、2、3或4的氨基酸序列。
9.在一些实施例中，第二nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:1、2、3或4具有至少85％同一性的氨基酸序列。
10.在一些实施例中，第二nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:1、2、3或4的氨基酸序列。
11.在一些实施例中，第一肽接头是甘氨酸-丝氨酸肽接头。
12.在一些实施例中，所述肽接头由式(gggs)n(seq id no:9)表示，其中n为1、2、3、4或5。
13.在一些实施例中，肽接头是gggsgggs(seq id no:10)。
14.在一些实施例中，所述fc区包含人免疫球蛋白g(igg)的fc区。
15.在一些实施例中，所述fc区包含人igg1的fc区。
16.在一些实施例中，所述fc区包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:5、6、63、64、65或68具有至少85％同一性的氨基酸序列。
17.在一些实施例中，所述fc区包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:5、6、63、64、65或68的氨基酸序列。
18.在一些实施例中，所述单体从n末端到c末端包括所述第一nkg2d肽或其变体、所述
第一肽接头、所述第二nkg2d肽或其变体和所述fc区。在一些实施例中，所述第二nkg2d肽或其变体在没有肽接头情况下直接与所述fc区融合。在一些实施例中，所述第二nkg2d肽或其变体通过第二肽接头与所述fc区连接。
19.在一些实施例中，所述单体从n末端到c末端包括所述fc区、所述第一nkg2d肽或其变体、所述第一肽接头和所述第二nkg2d肽或变体区。在一些实施例中，所述fc区与所述第一nkg2d肽或其变体在没有肽接头情况下直接融合。在一些实施例中，所述fc区通过第二肽接头与所述第一nkg2d肽或其变体连接。
20.在一些实施例中，所述单体还包含另外的一个或两个nkg2d肽或其变体。
21.在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61和69中的任一个具有至少85％同一性的氨基酸序列。
22.在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61和69中的任一个的氨基酸序列。
23.在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62和70中的任一个具有至少85％同一性的核酸序列。
24.在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：seq id no:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62和70中的任一个。
25.在一些实施例中，所述两个单体是共价连接的。
26.在一些实施例中，所述单体通过cys-cys桥连接。
27.在一些实施例中，所述二聚体蛋白还包含药物部分。
28.本文还提供了包含核酸序列的分离的多核苷酸，所述核酸序列包含以下或由以下组成：seq id no:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62和70中的任一个。
29.本文还提供了包含本文所述的分离的多核苷酸的载体。
30.本文还提供了包含本文所述的二聚体蛋白、本文所述的分离的多核苷酸或本文所述的载体的组合物。
31.在一些实施例中，所述组合物还包含药学上可接受的载剂。
32.本文还提供包含本文所述的二聚体蛋白、本文所述的分离的多核苷酸、本文所述的载体或本文所述的组合物的细胞。
33.在一些实施例中，所述细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
34.在一些实施例中，所述细胞是经修饰的cho细胞。
35.在一些实施例中，所述经修饰的cho细胞包含灭活的蛋白裂解酶基因或蛋白裂解酶基因的敲除(缺失)。
36.本文提供由本文所述的细胞产生的二聚体蛋白。
37.本文提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的二聚体蛋白或本文所述的组合物。
38.在一些实施例中，所述疾病是表达nkg2d配体的疾病。
39.在一些实施例中，所述疾病是癌症、自身免疫性疾病、肝病、神经损伤、遗传性运动和感觉神经病、衰老或病毒感染。
40.在一些实施例中，所述疾病是癌症或自身免疫性疾病。
41.在一些实施例中，所述癌症是表达nkg2d配体的癌症。
42.在一些实施例中，所述受试者具有表达nkg2d配体的癌症。
43.在一些实施例中，表达配体的癌症是肺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肝细胞癌(hcc)、肾癌、鼻咽癌(npc)、前列腺癌、黑素瘤、浆细胞癌、白血病、淋巴瘤、神经胶质瘤或神经母细胞瘤。
44.在一些实施例中，所述白血病是急性髓性白血病(aml)、慢性髓性白血病(cml)或慢性淋巴细胞性白血病(cll)。
45.在一些实施例中，所述方法进一步包括用另外的抗癌疗法或抗癌剂治疗受试者。
46.在一些实施例中，另外的抗癌疗法是手术、放射疗法、化学疗法、基因疗法、dna疗法、病毒疗法、rna疗法、辅助疗法或免疫疗法。
47.在一些实施例中，所述另外的癌症疗法是损伤dna的化学疗法。
48.在一些实施例中，所述nkg2d配体是mica、micb、ulbp1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5或ulbp6。
49.在一些实施例中，自身免疫性疾病是类风湿性关节炎、结肠炎、乳糜泻、多发性硬化症、斑秃、1型糖尿病、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化或与2型糖尿病相关的代谢综合征。
50.在一些实施例中，所述肝病是肝纤维化、门静脉高压症、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、脂肪肝病和肝硬化。
51.在一些实施例中，神经损伤是对外周或颅神经、脊髓或脑、颅神经的创伤或中毒、创伤性脑损伤、中风、脑动脉瘤、脊髓损伤或与潜在遗传疾病有关的损伤。
52.在一些实施例中，遗传性运动和感觉神经病是杜斯氏症(charcot-marie-tooth)(例如1a型、2型、3型(具有锥体特征)、或6型)或雷夫叙姆病(refsum disease)。
53.在一些实施例中，所述病毒感染是肝炎、爱泼斯坦-巴尔(epstein-barr)或巨细胞病毒。
54.本文还提供了用于诊断表达nkg2d配体的疾病的方法，所述方法包括：(1)从患有表达nkg2d配体的疾病的受试者中获得生物样品；(2)使所述生物样品与包含本文所述的二聚体蛋白或本文所述的组合物的结合试剂接触；(3)检测所述nkg2d配体与所述结合剂的结合；其中nkg2d配体与所述结合试剂的结合指示对受试者中表达nkg2d配体的疾病的诊断。
55.在一些实施例中，所述nkg2d配体是mica、micb、ulbp1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5或ulbp6。
56.本文提供了本文所述的二聚体蛋白、本文所述的多核苷酸、本文所述的载体或本文所述的组合物，作为药物使用。
57.本文提供了本文所述的二聚体蛋白、本文所述的多核苷酸、本文所述的载体或本文所述的组合物，用于治疗疾病。
58.本文提供本文所述的二聚体蛋白、本文所述的多核苷酸、本文所述的载体或本文所述的组合物，用于治疗疾病，其中所述疾病是表达nkg2d配体的疾病。
59.本文提供本文所述的二聚体蛋白、本文所述的多核苷酸、本文所述的载体或本文所述的组合物，用于治疗疾病，其中所述疾病是癌症或自身免疫性疾病。
附图说明
60.图1a-1b提供了nkg2d-fc结构的示意图。图1a提供了nkg2d(绿色)-fc(蓝色)的图。图1b提供了基于pdb 1hyr的nkg2d-fc与mica(橙色)相互作用的模型。
61.图2a-2b展示基于报道基因测定法，在诱导针对nkg2d-l靶细胞的adcc信号传导中，n’nkg2d(即一个或多个nkg2d肽位于fc片段的n末端)和两个nkg2d同二聚体的优越性。在图2a中，nkg2d-fc构建体诱导了jnl报道基因荧光，表明在与nkg2d-l 靶细胞共培养中，与jnl细胞上的fc受体的交联。图2b提供了该实验中使用的nkg2d-fc变体的图，其中具有n’nkg2d(h1/h2)或c’nkg2d(h3/h4)(即一个或多个nkg2d肽位于fc片段的c末端)和一个nkg2d同二聚体(h1/h3)或两个nkg2d同二聚体(h2/h4)。
62.图3a-3b展示了小鼠nkg2d-fc替代构建体结合表达小鼠nkg2d配体的细胞(在最佳接头长度为0个氨基酸情况下)。y轴是平均r-pe荧光。图3a描绘了构建体与过表达小鼠rae-1α的细胞的结合。图3b描绘了构建体与表达小鼠rae-1ε的细胞的结合。
63.图4a-4d展示了两个nkg2d同二聚体是最佳价，基于nkg2d价和方向优化，超过两个同二聚体的另外的价没有提供显著的杀伤活性优势。图4a描绘了在图4b中使用的构建体的图。图4b描绘了针对表达人mica*008的靶细胞的adcc报道基因基因测定的结果。图4c描绘了在图4d中使用的构建体的图。图4d描述了针对表达人mica*008的靶细胞的adcc报道基因基因测定的结果。
64.图5a-5d提供了关于示例性nkg2d-fc变体的信息。图5a提供了nkg2d-fc的两个变体hh8和hh2的图。hh8与hh2的区别在于两个flnslf序列的缺失。图5b提供了nkg2d-fc结构的图。图5c提供了hh2/hh8的完整序列。红色的序列从hh8中缺失。图5d提供了hh2、hh7和hh8的生产特征，所述生产特征描绘了hh2、hh7和hh8的结合的biacore传感图(右图)和定量总结(左表)。
65.图6提供了hh8的序列。nkg2d以黑色显示，铰链区为绿色，ch2为蓝色，ch3为紫色，n-糖基化位点为红色，异构化位点为橙色，并且接头序列为浅绿色(seq id no:29)。
66.图7提供了hh10的序列。nkg2d以黑色显示，铰链区为绿色，ch2为蓝色，ch3为紫色，n-糖基化位点为红色，异构化位点为橙色，并且接头序列为浅绿色(seq id no:31)。
67.图8提供了hh8-afuco的序列。nkg2d以黑色显示，铰链区为绿色，ch2为蓝色，ch3为紫色，n-糖基化位点为红色，异构化位点为橙色，并且接头序列为浅绿色(seq id no:29)。
68.图9a-9e展示了cho产生改善nkg2d-fc adcc活性。通过与ct26.wt-humica*008(图9a)、ct26.wt-humica*001(图9b)、ct26.wt.humicb*001(图9c)和ct26.wt-cymicb*05(图9d)共培养中报道基因活性来测量nkg2d-fc adcc活性。图9e描绘了与衍生自hek的nkg2d-fc相比，衍生自cho的nkg2d-fc的ec50改善的总结。
69.图10描绘了cho mako细胞系中产生的hh2蛋白的第二nkg2d片段中的裁剪位点的通过lc-ms的鉴定。
70.图11a-11b展示了nkg2d-fc特异性地与全部八个nkg2d-l以一位数字的nm ec50结合。图11a提供了实验图。图11b描绘了hh8与过表达人nkg2d-l的细胞结合。
71.图12a-12b展示了hh8结合所有经测试的食蟹猴nkg2d-l。图12a提供了实验图。图12b描绘了hh8与过表达食蟹猴nkg2d-l的细胞的结合。
72.图13a-13b展示了nkg2d-fc与来自许多不同适应症的癌细胞系而不是正常的hupbmc结合。图13a描绘了nkg2d-fc与人肿瘤细胞系的结合。图13b描绘了nkg2d-fc与正常人pbmc的结合。
73.图14a-14b展示了nkg2d-fc在体外保留nkg2d表达。图14a提供了实验图。图14b展示了通过添加nkg2d-fc恢复了与nkg2d-l 靶细胞共培养的nk细胞上的nkg2d表达。
74.图15展示了增强的adcc变体具有改善的体外功能，描绘了在报道基因测定中各种氨基酸变体对adcc活性的影响。
75.图16a-16d展示了hh8、hh10和hh8-afuco促进针对nkg2d-l 靶细胞系的adcc。在nk3.3杀伤测定中，hh10和hh8-afuco具有改善的活性。图16a-16d描绘了nkg2d-l 靶细胞系的特异性杀伤。
76.图17a-17e展示了nkg2d-fc直接结合肿瘤细胞并募集免疫细胞以通过adcc/adcp(启动癌症免疫周期)杀伤肿瘤。图17a展示了nkg2d-fc，hh8促进原代人nk细胞杀伤hct-116细胞。图17b-17c展示了nkg2d-fc促进原代人nk细胞杀伤ovcar-3细胞。图17d-17e展示了如通过cd69表达、nkg2d表达、大小和粒度测量，nkg2d-fc，hh8在与hct-116细胞共培养96小时之中促进原代人nk细胞的延长激活。
77.图18展示了在与原代小鼠巨噬细胞和表达nkg2d-l的小鼠肿瘤细胞共培养之中，nkg2d-fc，hh8通过adcp以亚nm ec50促进杀伤nkg2d-l 肿瘤。
78.图19a-19f展示了hh8和hh10促进针对所有测试的nkg2d-l(包括humica*008(图19a)、humicb*001(图19b)、huulbp1(图19c)、huulbp2(图19d)、cymica*08(图19e)和(图19f)cymicb*05(图19f))的体外adcc。
79.图20a-20b描绘了nkg2d-fc在小鼠中的药代动力学，展示了生产细胞系和fc形式对体内谱的影响。图20a描绘了在hek或cho中产生的或具有fc变异的nkg2d-fc变体的体内药代动力学。图20b描绘了在cho中产生的nkg2d-fc变体的体内药代动力学。
80.图21a-21b描述了hh8在食蟹猴中的药代动力学，展示了体内循环后抗体样pk谱和结合靶的能力的保持。图21a描绘了在给药后指示的小时数下的hh8浓度，量化为总量或能够离体结合mica的量(靶)。图21b描绘了在给药后指定的小时数下的hh8血清浓度以及典型的igg模拟。
81.图22a-22b展示了过表达nkg2d-l的小鼠肿瘤具有差的cd8/nk浸润，表型复制了人nkg2d-l 肿瘤。nkg2d-fc恢复小鼠cd8 和nk细胞肿瘤的存在。图22a提供了研究设计图。图22b描绘了nk细胞和cd8 t细胞浸润到肿瘤中的定量。
82.图23a-23b展示了肿瘤浸润性小鼠cd8 和来自nkg2d-l 肿瘤的nk细胞脱敏。nkg2d-fc恢复肿瘤浸润性nk和cd8 t细胞的激活。图23a提供了小鼠研究图，表明在肿瘤植入后的第2天用20mg/kg的同种型或nkg2d-fc对小鼠的治疗。图23b描绘了给药后5天nkg2d-fc的药效学作用，展示了nkg2d表达的恢复和激活(如通过cd69测量)。
83.图24a-24b展示了hh8和hh10在小鼠模型中是有效的。图24a描绘了在第2天和第9天用5mg/kg的人igg1同种型、hh8或hh10治疗的c57bl/6小鼠中el4-humica*001肿瘤的生长。图24b描绘了a中的小鼠的卡普兰-梅尔(kaplan-meier)曲线。
具体实施方式
84.定义
85.尽管本文示出并描述了本发明的各种实施例和方面，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施例和方面仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，多种变型、改变和替换将是本领域技术人员容易想到的。应当理解，在实践本发明时可以采用本文所述的本发明实施例的各种替代方案。
86.除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有由本发明所属领域技术人员通常所理解的意义。以下参考文献为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：singleton等人,dictionary of microbiology and molecular biology[微生物学和分子生物学词典](第2版1994)；the cambridge dictionary of science and technology[剑桥科学技术词典](walker编辑,1988)；the glossary of genetics[遗传学词汇],第5版,r.rieger等人(编辑.),springer verlag[施普林格出版公司](1991)；和hale&marham,the harper collins dictionary of biology[哈珀柯林斯生物学词典](1991)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有所赋予的含义。
[0087]
在本公开和所附权利要求书中使用单数不定冠词或定冠词(例如，“一个”，“一种”，“该/所述”等)遵循专利中含义为“至少一个/种”的传统方法，除非该术语从上下文中可以明显看出，其在所述特定情况中旨在专门表示一个且仅一个。同样地，术语“包含”是开放式的，不排除其他的项目、特征、组分等。除非另外指出，否则本文中所标识的参考文献通过引用将其全文明确地整体并入本文。
[0088]
术语“包含”、“包括”和“具有”及其派生词在本文中可作为综合性开放式术语互换使用。例如，“包含”、“包括”或“具有”的使用意味着，包含、具有或包括的任何要素不是包含该动词的语句的主语所包含的唯一要素。
[0089]
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后期经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢结合的α碳、羧基、氨基和r基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)的化合物。此类类似物具有经修饰的r基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有如下结构的化合物，该结构与氨基酸的一般化学结构不同但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用。术语“非天然存在的氨基酸”和“非天然氨基酸”是指在自然界中不存在的氨基酸类似物、合成的氨基酸和氨基酸模拟物。
[0090]
氨基酸在本文中可以用它们众所周知的三字母符号或iupac-iub生化命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样，核苷酸可以用它们通常被接受的单字母代码来指代。
[0091]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物，其中在实施例中，所述聚合物可以缀合至不由氨基酸组成的部分。该术语适用于其中的一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。“融合蛋白”是指编码两个或更多个分开的蛋白序列的嵌合蛋白，所述两个或更多个分开的蛋白序列重组表达为单个部分。
[0092]
如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸寡聚物”、“寡核苷酸”、“核酸序列”、“核酸片段”和“多核苷酸”可互换使用，并且意在包括但不限于共价连接在一起的可以具有各种长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物、衍生物或修饰)聚合形式。不同的多核苷酸可以具有不同的三维结构，并且可以执行各种已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、基因间dna(包括但不限于异染色质dna)、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、分离的dna序列、分离的rna序列、核酸探针和引物。可用于本发明方法的多核苷酸可包含天然核酸序列及其变体、人工核酸序列或这些序列的组合。
[0093]
多核苷酸通常由四个核苷酸碱基的特定序列构成：腺嘌呤(a)；胞嘧啶(c)；鸟嘌呤(g)；胸腺嘧啶(t)(当多核苷酸为rna时，尿嘧啶(u)代替胸腺嘧啶(t))。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示；或者，该术语可以应用于多核苷酸分子本身。所述字母表示形式可以输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如功能基因组学和同源性搜索。多核苷酸可任选地包括一种或多种非标准核苷酸、一种或多种核苷酸类似物和/或经修饰的核苷酸。
[0094]“经保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列，“经保守修饰的变体”是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸。由于遗传密码的简并性，许多核酸序列将编码任何给定的蛋白。例如，密码子gca、gcc、gcg和gcu均编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，该密码子可以改变为任何所述的相应密码子而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其是经保守修饰变异中的一种。本文编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员应认识到，核酸中的每个密码子(除了通常是甲硫氨酸的唯一密码子的aug和通常是色氨酸的唯一密码子的tgg)均可以经修饰以产生功能上相同的分子。因此，在每个所述序列中均隐含了编码多肽的核酸的每种沉默变异。
[0095]
对于氨基酸序列，熟练的技术人员应当认识到，对一种核酸、肽、多肽或蛋白序列进行的单个取代、删除或添加(这在经编码的序列中改变、增加或删去一个单一氨基酸或小百分数的氨基酸)是一种“经保守修饰的变体”，其中该改变导致一种氨基酸被一种化学上相似的氨基酸取代。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表是本领域中熟知的。此类保守修饰的变体是对本发明的多态变体、种间同源物和等位基因的补充，并且不排除所述多态变体、种间同源物和等位基因。
[0096]
以下八组含有互为保守取代的氨基酸：
[0097]
1)丙氨酸(a)、甘氨酸(g)；
[0098]
2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；
[0099]
3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；
[0100]
4)精氨酸(r)、赖氨酸(k)；
[0101]
5)异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、缬氨酸(v)；
[0102]
6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；
[0103]
7)丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；和
[0104]
8)半胱氨酸(c)、甲硫氨酸(m)
[0105]
(参见creighton,proteins[蛋白质](1984))。
[0106]
通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定“序列一致性的百分比”，其中比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包含与参考序列(其不包含添加或缺失)相比的添加或缺失(即，缺口)以使两个序列最佳比对。可以通过以下方法计算所述百分比：测定在这两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置数，将所述匹配位置数除以所述比较窗口中的位置总数，并且将结果乘以100，从而得到序列同一性百分比。
[0107]
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指两个或更多个序列或子序列，所述两个或更多个序列或子序列是相同的或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当针对在比较窗口或指定区域上的最大对应进行比较并对齐时，在指定区域上约60％同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)，如使用具有以下所述默认参数的blast或blast 2.0序列比较算法测量或通过手动对齐和目视检查(例如，参见ncbi网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/或者类似等)测量。这样的序列被称为“基本上相同”。该定义也可以指或可以用于对测试序列的补充。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。如下所述，所述优选算法可以考虑缺口等。优选地，同一性存在于长度至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选地存在于长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。
[0108]
氨基酸或核苷酸碱基的“位置”由数字表示，该数字根据其相对于n末端(或5'末端)的位置顺序鉴定参考序列中的每个氨基酸(或核苷酸碱基)。因为在确定最佳比对时必须考虑缺失、插入、截短、融合等，通常通过从n末端开始简单地计数而确定的测试序列中的氨基酸残基数目不一定与参考序列中其对应位置的编号相同。例如，在变体相对于比对的参考序列具有缺失的情况下，变体中与参考序列中缺失位点相对应的位置将不存在氨基酸。在比对的参考序列中有插入的情况下，该插入将不对应于参考序列中的编号的氨基酸位置。在截短或融合的情况下，参考序列或比对序列中可能存在与相应序列中任何氨基酸不对应的氨基酸区段。
[0109]
当在给定氨基酸或多核苷酸序列编号的上下文中使用时，术语“参考......进行编号”或“对应于”是指当给定氨基酸或多核苷酸序列与参考序列进行比较时，对特定参考序列的残基进行编号。
[0110]
如本文所用，术语“探针”或“引物”被定义为可以检测与样品的特异性杂交的一个或多个核酸片段。探针或引物可以具有任何长度，这取决于其将针对使用的特定技术。例如，pcr引物的长度通常在10至40个核苷酸之间，而用于例如蛋白质印迹的核酸探针的长度可以超过一百个核苷酸。探针可以是未经标记的或如下所述经标记的，以便可以检测其与靶或样品的结合。探针可以从染色体的一个或多个特定(预选)部分的核酸来源产生，例如一个或多个克隆、分离的完整染色体或染色体片段或聚合酶链反应(pcr)扩增产物的集合。固定在靶元件上的核酸的长度和复杂性对本发明不是关键的。技术人员可以调整这些因素，为给定的杂交程序提供最佳的杂交和信号产生，并在不同的基因或基因组位置中提供所需的分辨率。
[0111]
所述探针也可以是以阵列固定在固体表面(例如，硝酸纤维素、玻璃、石英、熔融二氧化硅载玻片)上的分离的核酸。在一些实施例中，探针可以是例如在wo 96/17958中所述
的核酸阵列的成员。能够产生高密度阵列的技术也可以用于该目的(参见，例如，fodor(1991)science[科学]767-773；johnston(1998)curr.biol.[当前生物学]8:r171-r174；schummer(1997)biotechniques[生物技术]23:1087-1092；kern(1997)biotechniques[生物技术]23:120-124；美国专利号5,143,854)。
[0112]
短语“选择性地(或特异性地)杂交”是指分子仅与特定核苷酸序列以相比于其他核苷酸序列(例如总细胞或文库的dna或rna)以更高亲和力(例如在更严格条件下)进行结合、双链化或杂交。
[0113]
短语“严格杂交条件”是指通常在核酸的复杂混合物中核酸与其靶序列杂交但不与其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下会有所不同。更长的序列在更高温度下特异性杂交。广泛的核酸杂交指南发现于tijssen,techniques in biochemistry and molecular biology
‑‑
hybridization with nucleic probes[生物化学和分子生物学技术—用核酸探针杂交],“overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays[杂交原理概述和核酸测定策略概述]”(1993)。通常，严格杂交条件应选择为比特定序列在定义的离子强度ph下的热熔点(tm)低约5℃-10℃。tm是温度(在确定的离子强度、ph和核酸浓度下)，在所述温度下与靶互补的50％的探针在平衡时与靶序列杂交(因为靶序列过量存在，在tm处，50％的探针在平衡时被占用)。严格杂交条件也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景杂交的两倍，优选是背景杂交的十倍。示例性严格杂交条件可以如下：50％甲酰胺，5xssc和1％sds，在42℃下孵育，或者5xssc，1％sds，在65℃孵育，在0.2xssc和0.1％sds在65℃洗涤。示例性的“中等严格杂交条件”包括在40％甲酰胺、1m nacl、1％sds的缓冲液中在37℃下杂交，并在1xssc在45℃下洗涤。阳性杂交是背景的至少两倍。普通技术人员将容易认识到，可以利用替代的杂交和洗涤条件来提供相似严格性的条件。用于确定杂交参数的其他指南在许多参考文献中提供，例如，current protocols in molecular biology[分子生物学的当前方案],编辑ausubel,等人,john wiley&sons[约翰
·
威利父子公司]。
[0114]
如本文所用，术语“缀合物”是指原子或分子之间的缔合。所述缔合可以是直接或间接的。例如，本文提供的第一部分(例如核酸部分)和第二部分(肽部分)之间的缀合物可以是直接的，例如通过共价键，或间接的，例如通过非共价键(例如静电相互作用)(例如离子键、氢键、卤素键)，范德华相互作用(例如偶极-偶极、偶极诱导的偶极、伦敦分散)，环堆积(π效应)，疏水相互作用等)。在一些实施例中，使用缀合物化学形成缀合物，所述缀合物化学包括但不限于亲核取代(例如，胺和醇与酰基卤、活性酯的反应)，亲电子取代(例如，烯胺反应)以及向碳-碳和碳-杂原子多重键的加成(例如迈克尔反应、狄尔斯-阿尔德(diels-alder)加成)。这些和其他有用的反应讨论于例如march,advanced organic chemistry[高级有机化学],第3版,约翰
·
威利父子公司,纽约,1985；hermanson,bioconjugate techniques[生物缀合技术],academic press[学术出版社],圣地亚哥,1996；和feeney等人,modification of proteins[蛋白质的修饰]；advances in chemistry series[化学进展系列],第198卷,american chemical society[美国化学学会],华盛顿特区,1982。
[0115]
对于本文所述的特定蛋白(例如nkg2d、mica、micb、ulbp1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5、ulbp6)，命名的蛋白包括所述蛋白的任何天然存在形式或保持所述蛋白预期活性的
变体(例如，与天然蛋白相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些实施例中，与天然存在形式相比，变体跨整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在其他实施例中，所述蛋白是通过其ncbi序列参考鉴定的蛋白。在其他实施例中，所述蛋白是通过其ncbi序列参考或其功能片段鉴定的蛋白。
[0116]
因此，nkg2d(也称为klrkl；杀伤细胞凝集素样受体亚家族k，成员1；cd314；klr；nkg2-d；flj17759；flj75772或d12s2489e)，一种跨膜蛋白，属于c型凝集素样受体的cd94/nkg2家族。在人中，它由nk细胞、γδt细胞和cd8 αβt细胞表达。nkg2d识别来自mic和raet1/ulbp家族的自体诱导蛋白，这些蛋白出现在应激的、恶变的和感染细胞的表面。本文所述的nkg2d包括任何nkg2d天然存在形式或保持其蛋白活性(例如，与天然nkg2d相比在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)的变体。在一些实施例中，与天然存在的nkg2d相比，nkg2d变体或同源物跨整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在其他实施例中，nkg2d是由其ncbi序列参考np_031386鉴定的蛋白。在其他实施例中，nkg2d与通过ncbi序列参考(np_031386)鉴定的蛋白或其功能片段基本相同(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)。下文提供了可用于本文所述的二聚体蛋白中的不同类型的nkg2d变体的更详细描述。
[0117]
术语“mica”，也称为mhc i类多肽相关序列a、mic-a、perb11.1，包括任何mica天然存在形式或保持其蛋白活性(例如，与天然mica相比在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)的变体。在一些实施例中，与天然存在的mica相比，mica变体或同源物跨整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在其他实施例中，mica是通过其ncbi序列参考np_000238、np_001170990、np_001276081、np_001276082或np_001276083鉴定的蛋白。在其他实施例中，mica与通过ncbi序列参考(np_000238、np_001170990、np_001276081、np_001276082或np_001276083)鉴定的蛋白或其功能片段基本相同(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)。
[0118]
术语“micb”，也称为mhc i类多肽相关序列b、mic-b、perb11.2，包括任何micb天然存在形式或保持其蛋白活性(例如，与天然micb相比在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)的变体。在一些实施例中，与天然存在的micb相比，micb变体或同源物跨整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在其他实施例中，micb是由其ncbi序列参考np_001276089、np_001276090或np_005922鉴定的蛋白。在其他实施例中，micb与通过ncbi序列参考(np_001276089、np_001276090或np_005922)鉴定的蛋白或其功能片段基本相同(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)。
[0119]
术语“ulbp1”，也称为ul16结合蛋白1、raet1i、n2dl-1、nkg2dl1，包括任何ulbp1天然存在形式或保持其蛋白活性(例如，与天然ulbp1相比在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)的变体。在一些实施例中，与天然存在的ulbp1相比，ulbp1变体或同源物跨整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在其他实施例中，ulbp1是由其ncbi序列参考np_001304018或np_079494鉴定的蛋白。在其他实施例中，ulbp1与通过ncbi序列参考(np_001304018或np_079494)鉴定的蛋白或其功能片段基本相同(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)。
[0120]
术语“ulbp2”，也称为ul16结合蛋白2、n2dl2、raet1h、alcan-α、nkg2dl2、raet1l，包括任何ulbp2天然存在形式或保持其蛋白活性(例如，与天然ulbp2相比在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)的变体。在一些实施例中，与天然存在的ulbp2相比，ulbp2变体或同源物跨整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在其他实施例中，ulbp2是由其ncbi序列参考np_079493鉴定的蛋白。在其他实施例中，ulbp2与通过ncbi序列参考(np_079493)鉴定的蛋白或其功能片段基本相同(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)。
[0121]
术语“ulbp3”，也称为ul16结合蛋白3、raet1n、n2dl-3、nkg2dl3，包括任何ulbp3天然存在形式或保持其蛋白活性(例如，与天然ulbp3相比在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)的变体。在一些实施例中，与天然存在的ulbp3相比，ulbp3变体或同源物跨整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在其他实施例中，ulbp3是由其ncbi序列参考np_078794鉴定的蛋白。在其他实施例中，ulbp3与通过ncbi序列参考(np_078794)鉴定的蛋白或其功能片段基本相同(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)。
[0122]
术语“ulbp4”，也称为ul16结合蛋白4、raet1e、letal、n2dl-4、nkg2dl4、raet1e2、rl-4、ba350j20.7、视黄酸早期转录本1e，包括任何ulbp4天然存在形式或保持其蛋白活性(例如，与天然ulbp4相比在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)的变体。在一些实施例中，与天然存在的ulbp4相比，ulbp4变体或同源物跨整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在其他实施例中，ulbp4是由其ncbi序列参考np_001230254、np_001230256、np_001230257或np_631904鉴定的蛋白。在其他实施例中，ulbp4与通过ncbi序列参考(np_001230254、np_001230256、np_001230257或np_631904)鉴定的蛋白或其功能片段基本相同(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)。
[0123]
术语“ulbp5”，也称为ul16结合蛋白5或视黄酸早期转录本1g(raet1g)，包括任何
ulbp5天然存在形式或保持其蛋白活性(例如，与天然ulbp5相比在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)的变体。在一些实施例中，与天然存在的ulbp5相比，ulbp5变体或同源物跨整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在其他实施例中，ulbp5是由其ncbi序列参考np_001001788.2鉴定的蛋白。在其他实施例中，ulbp5与通过ncbi序列参考(np_001001788.2)鉴定的蛋白或其功能片段基本相同(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)。
[0124]
术语“ulbp6”，也称为ul16结合蛋白6或视黄酸早期转录本1l(raet1l)，包括任何ulbp6天然存在形式或保持其蛋白活性(例如，与天然ulbp6相比在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)的变体。在一些实施例中，与天然存在的ulbp6相比，ulbp6变体或同源物跨整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在其他实施例中，ulbp6是由其ncbi序列参考np_570970.2鉴定的蛋白。在其他实施例中，ulbp6与通过ncbi序列参考(np_570970.2)鉴定的蛋白或其功能片段基本相同(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)。
[0125]
本文所用的术语“接头”或“生物缀合物接头”是指导致生物缀合物反应性基团的原子或分子之间缔合的分子。所述缔合可以是直接或间接的。例如，本文提供的第一生物缀合物反应性基团(例如，-nh2、-cooh、-n-羟基琥珀酰亚胺或-马来酰亚胺)与第二生物缀合物反应性基团(例如，巯基、含硫氨基酸、胺、包含胺侧链的氨基酸或羧酸盐)之间的缀合可以是直接的，例如通过共价键，或间接的，例如通过非共价键(例如静电相互作用)(例如离子键、氢键、卤素键)，范德华相互作用(例如偶极-偶极、偶极诱导的偶极、伦敦分散)，环堆积(π效应)，疏水相互作用等)。在一些实施例中，使用生物缀合化学(即，两个生物缀合反应性基团的缔合)形成生物缀合接头，所述生物缀合化学包括但不限于亲核取代(例如，胺和醇与酰基卤、活性酯的反应)，亲电子取代(例如，烯胺反应)以及向碳-碳和碳-杂原子多重键的加成(例如迈克尔反应、狄尔斯-阿尔德(diels-alder)加成)。这些和其他有用的反应讨论于例如march,advanced organic chemistry[高级有机化学],第3版,约翰
·
威利父子公司,纽约,1985；hermanson,bioconjugate techniques[生物缀合技术],academic press[学术出版社],圣地亚哥,1996；和feeney等人,modification of proteins[蛋白质的修饰]；advances in chemistry series[化学进展系列],第198卷,american chemical society[美国化学学会],华盛顿特区,1982。在一些实施例中，第一生物缀合物反应性基团(例如马来酰亚胺部分)共价附接至第二生物缀合物反应性基团(例如巯基)。在一些实施例中，第一生物缀合物反应性基团(例如卤代乙酰基部分)共价附接至第二生物缀合物反应性基团(例如巯基)。在一些实施例中，第一生物缀合物反应性基团(例如啶基部分)共价附接至第二生物缀合物反应性基团(例如巯基)。在一些实施例中，第一生物缀合物反应性基团(例如，-n-羟基琥珀酰亚胺部分)共价附接至第二生物缀合物反应性基团(例如胺)。在一些实施例中，第一生物缀合物反应性基团(例如马来酰亚胺部分)共价附接至第二生物缀合物反应性基团(例如巯基)。在一些实施例中，第一生物缀合物反应性基团(例如，-磺基-n-羟
基琥珀酰亚胺部分)共价附接至第二生物缀合物反应性基团(例如胺)。
[0126]
在一些实施例中，接头是肽接头。在一些实施例中，接头是柔性肽接头。在一些实施例中，柔性肽接头的长度为约20个或更少的氨基酸。在一些实施例中，肽接头包含约12个或更少的氨基酸残基，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。在一些实施例中，肽接头的长度为20个氨基酸。在一些实施例中，肽接头的长度为约4至约16个氨基酸。在一些实施例中，肽接头的长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些实施例中，肽接头的长度为约2至约25个氨基酸。在一些实施例中，肽接头的长度长于25个氨基酸。在一些实施例中，肽接头包含以下氨基酸中的两个或更多个：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和脯氨酸。在一些实施例中，肽接头是甘氨酸-丝氨酸接头。在一些实施例中，甘氨酸-丝氨酸接头由式(gs)n表示，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12(seq id no:7)。在一些实施例中，肽接头是由式(ggggs)n表示的g4s接头，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:8)。在一些实施例中，肽接头是由式(gggga)n表示的g4a接头，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:12)。在一些实施例中，肽接头是由式(ggggp)n表示的g4p接头，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:13)。在一些实施例中，肽接头是由式(ggga)n表示的g3a接头，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:14)。在一些实施例中，肽接头由式(gggs)n表示，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:9)。在一些实施例中，甘氨酸-丝氨酸接头由式gggsgggs(seq id no:10)表示。
[0127]
在一些实施例中，肽接头包括蛋白酶依赖性可切割位点。蛋白酶可切割的肽接头的实例包括但不限于mmp敏感接头ggplgl w agg(seq id no:15)和因子xa敏感接头iegr(seq id no:16)。本领域技术人员将认识到，多种可切割序列可用于本文提供的接头。
[0128]
在一些实施例中，连接分子或接头可以是非肽接头。如本文所用，非肽接头是生物相容性聚合物，其包括彼此连接的两个或更多个重复单元。非肽聚合物的实例包括但不限于：聚乙二醇(peg)、聚丙二醇(ppg)、共聚(乙二醇/丙二醇)、聚氧乙烯(poe)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙基醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂质聚合物、几丁质、透明质酸和肝素。对于可用于fc融合分子的非肽接头的更详细描述，参见，例如，wo/2006/107124，其通过引用并入本文。在一些实施例中，这样的接头将具有约1kda至50kda的分子量范围，这取决于特定的接头。在一些实施例中，典型的peg具有约1至5kda的分子量，并且聚乙二醇具有约5kda至50kda，并且更优选地约10kda至40kda的分子量。
[0129]
如本文所用，术语“载体”指的是能够运送与其连接的另一核酸的核酸分子。在一些实施例中，“载体”是包含能够在宿主细胞中表达的目的核酸(在适合于递送到细胞、组织和/或生物体中的较大核酸序列或结构中的目的核酸)的任何遗传元件(例如dna、rna或其混合物)，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等。例如，载体可包含插入物(例如，编码要表达的基因或该基因的开放阅读框的异源核酸)和一个或多个另外的元件，例如适合于递送或控制插入物表达的元件。一种类型的载体是“质粒”，其是指线性或环状双链dna环，其中可以连接另外的dna区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的dna区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载
体”。一般而言，在重组dna技术中有用的表达载体通常呈质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括这种其他形式的表达载体如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们具有相同的功能。另外，一些病毒载体能够特异性或非特异性地靶向特定细胞类型。无复制能力的病毒载体或复制缺陷型病毒载体是指以下病毒载体，所述病毒载体能够感染它们的靶细胞并递送它们的病毒载荷，但随后未能继续典型的导致细胞裂解和死亡的裂解途径。
[0130]
在一些实施例中，本文所述的“载体”特别是指能够携带至少一个多核苷酸片段的多核苷酸。载体像分子载剂一样起作用，将多核苷酸传递到宿主细胞中。表达载体可包含至少一个表达盒，所述表达盒包含用于正确表达并入其中的多核苷酸的调控序列。可以将要引入细胞的多核苷酸(例如编码目的多肽或可选择标志物)插入载体的一个或多个表达盒中以便从中表达。引入宿主细胞后，表达盒尤其能够指导细胞的机制将并入的编码目的多肽的多核苷酸转录为rna，然后所述rna通常被进一步加工，并且最后翻译为目的多肽。载体可以以环形或线性(化)形式存在。术语“载体”也包括允许转移外来核酸片段的人工染色体、病毒载体或类似的相应多核苷酸。
[0131]
本文所述的组合物可以被纯化。纯化的组合物是目的化合物的至少约60重量％(干重)。优选地，所述制剂为按重量计至少约75％，更优选至少约90％，最优选至少约99％或更高目的化合物。纯度通过任何适当的标准方法测量，例如通过高效液相色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳。
[0132]
当应用于核酸或蛋白时，术语“分离的”表示该核酸或蛋白基本上不含天然状态下与其结合的其他细胞组分。它可以例如处于均质状态并且可以处于干燥或处于水溶液中。纯度和均质性典型地是使用分析化学技术(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法)来确定的。作为制剂中存在的主要种类的蛋白基本上得到纯化。
[0133]
本文所使用到的“细胞”是指执行足以保存或复制其基因组dna的代谢或其他功能的细胞。可以通过本领域众所周知的方法来鉴定细胞，所述方法包括例如完整膜的存在、特定染料的染色、产生子代的能力、或者在配子的情况下与第二配子结合产生活后代的能力。细胞可以包括原核和真核细胞。原核细胞包括但不限于细菌。真核细胞包括但不限于酵母细胞和衍生自植物和动物的细胞，例如哺乳动物、昆虫(例如，夜蛾属(spodoptera))和人细胞。
[0134]
术语“抑制剂”、“阻遏剂”或“拮抗剂”或“下调剂”可互换地指与对照相比导致可检测地降低的表达或活性水平的物质。与对照相比，抑制的表达或活性可以相比于对照的表达或活性是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更低。在某些情况下，与对照相比，抑制是1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。“抑制剂”是抑制细胞功能(例如复制)的肽、sirna(例如shrna、mirna、snorna)，化合物或小分子，所述抑制是例如通过结合，部分或完全阻断刺激，减少、防止或延迟来抑制激活，或灭活，脱敏，或下调蛋白活性所需的信号转导、基因表达或酶促活性。
[0135]“药物组合物”是含有适于施用给受试者的形式的本文所述的组合物(例如本文所述的二聚体蛋白)的配制品。在一些实施例中，药物组合物为散装形式或单位剂型。单位剂型是多种形式中的任一种，包括例如冻干配制品、胶囊、iv袋、片剂、气雾剂吸入器上的单个泵或小瓶。单位剂量组合物中的活性成分(例如，所公开的核酸的配制品)的量是有效量，并
且根据所涉及的具体治疗而变化。本领域技术人员将理解，有时有必要根据患者的年龄和状况对剂量进行常规改变。剂量也将取决于施用径。考虑多种途径，包括口服、肺、直肠、胃肠外、经皮、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、吸入、颊、舌下、胸膜内、鞘内、鼻内等。用于本发明的化合物的局部或经皮施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。
[0136]
如本文所用，短语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内适合于与人和动物的组织接触使用而无过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、阴离子、阳离子、材料、组合物、载剂和/或剂型。
[0137]“药学上可接受的赋形剂”是指以下赋形剂，所述赋形剂可用于制备药物组合物(其通常是安全、无毒且生物学上或其他方面都不是不期望的)，并且包括对于兽医用途和人药学用途可接受的赋形剂。在说明书和权利要求书中使用的“药学上可接受的赋形剂”包括一种或多种这样的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的详细讨论可见remington's pharmaceutical sciences[雷明顿药物科学](mack pub.co.[马克出版公司],新泽西州1991)。治疗组合物中的药学上可接受的赋形剂可以包含液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。另外，在这类媒介物中可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。
[0138]
将本发明的药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、经皮(局部)和透粘膜施用。
[0139]
适用于口服的配制品可以由以下组成：(a)液体溶液，例如有效量的悬浮在稀释剂(例如水，盐水或peg 400)中的包装的核酸；(b)胶囊、药囊或片剂，每者分别含有预定量的活性成分，呈液体、固体、颗粒或明胶；(c)悬浮液，在于适当液体中；和(d)合适的乳液。片剂形式可以包括以下中的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药学上相容的载剂。锭剂形式可包含在调味剂例如蔗糖中的活性成分，以及软锭剂(包含在惰性基质中的活性成分，所述惰性基质是例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶)乳液，凝胶等(其除了包含活性成分还包含本领域已知的载剂)。
[0140]
药物组合物还可包括大的缓慢代谢的大分子，例如蛋白、多糖，例如壳聚糖，聚乳酸，聚乙醇酸和共聚物(例如乳胶官能化的琼脂糖凝胶(tm)、琼脂糖、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。另外，这些载剂可以用作免疫刺激剂(即，佐剂)。
[0141]
用于直肠施用的合适配制品包括例如栓剂，其由包装的核酸和栓剂基质组成。合适的栓剂基质包括天然或合成的甘油三酸酯或石蜡烃。另外，也可以使用明胶直肠胶囊，其由所选化合物与基底(包括例如液体甘油三酸酯、聚乙二醇和石蜡烃)的组合组成。
[0142]
适用于胃肠外施用(例如通过关节内(在关节内)、静脉内、肌肉内、肿瘤内、真皮内、腹膜内和皮下途径)的配制品，包括水性和非水性等渗无菌注射溶液(其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使配制品与预期接受体的血液等渗的溶质)，以及水性和非水性无菌悬浮液(其包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。在本发明的实施中，组合物可以例如通过静脉内输注、口服、局部、腹膜内、膀胱内或鞘内施用。胃肠外施用、口服施用和静脉内施用是优选的施用方法。化合物的配制品可以存在于单位剂量或多剂量密封容器
中，例如安瓿和小瓶。
[0143]
被用于胃肠外、真皮内、或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱调节ph，如盐酸或氢氧化钠。可以将胃肠外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
[0144]
本发明的药物组合物可以通过目前用于化学疗法治疗的许多众所周知的方法施用于受试者。例如，为了治疗癌症，本发明的组合物可以直接注射到肿瘤中，注射到血流或体腔中，或者口服或通过皮肤贴剂应用。选择的剂量应足以构成有效的治疗方法，但又不能高到引起不可接受的副作用。在治疗期间和治疗之后的合理时期内，应优选密切监测疾病状况(例如，癌症、癌前等)的状态和患者的健康。
[0145]
如本文所用，“单一疗法”是指将单一活性或治疗性化合物施用给有需要的受试者。优选地，单一疗法将涉及施用治疗有效量的活性组合物(例如，twist肽、与递送媒介物结合的twist肽、包括twist肽的融合蛋白或本文所述的任何组合物)。例如，本文所述的可以是癌症单一疗法，其中将本文所述的组合物之一施用给需要治疗癌症的受试者。单一疗法可以与组合疗法相反，在组合疗法中，施用多种活性组合物(例如，本文所述的多种组合物)的组合，优选地组合的每种组分以治疗有效量存在。在诱导所需的生物学效应方面，用本文所述的组合物的单一疗法可能比组合疗法更有效。
[0146]
如本文所用，“组合疗法”或“共同疗法”或“共同施用”包括施用本文所述的组合物和至少第二试剂作为旨在从这些治疗剂的共同作用中提供有益作用的特定治疗方案的一部分。组合的有益作用包括但不限于由治疗剂组合产生的药代动力学或药效学共同作用。典型地经限定的时间段(通常是数分钟，数小时，数天或数周，取决于所选择的组合)进行这些治疗剂的组合施用。“组合疗法”可以但不通常旨在涵盖作为偶然的和任意地导致本文所述的组合的单独的单一疗法方案的一部分来施用这些治疗剂中的两种或更多种。
[0147]
在一些实施例中，共同施用包括在第二活性剂的0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20或24小时内施用一种活性剂。共同施用包括同时、近似同时(例如，在彼此之间约1、5、10、15、20或30分钟内)或以任何顺序依次施用两种活性剂。在一些实施例中，可以通过共同配制，即制备包括两种活性剂的单一药物组合物来完成共同施用。在其他实施例中，活性剂可以分开配制。在另一实施例中，活性剂和/或辅助剂可以彼此连接或缀合。在一些实施例中，本文所述的化合物可以与癌症(例如前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如头、颈或食道)、结直肠癌、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、b细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤)的治疗(例如手术)组合或与已知可用于治疗病毒性疾病(例如与疱疹病毒感染相关的疾病或与肝炎病毒感染相关的疾病或与hiv感染相关的疾病)的其他治疗组合。
[0148]“组合疗法”旨在包括以顺序方式施用这些治疗剂，其中每种治疗剂在不同的时间施用，以及以基本上同时的方式施用这些治疗剂或至少两种治疗剂。基本上同时施用可以例如通过对受试者施用具有固定比例的每种治疗剂的单胶囊或多个对于每种治疗剂的单胶囊来实现。每种治疗剂的顺序或基本同时施用可以通过任何合适的途径进行，包括但不
限于口服途径、静脉内途径、肌肉内途径以及通过粘膜组织的直接吸收。可以通过相同途径或不同途径来施用治疗剂。例如，所选择的组合的第一治疗剂可以通过静脉内注射施用，而所述组合的其他治疗剂可以口服施用。可替代地，例如，所有治疗剂可以口服施用或所有治疗剂可以通过静脉内注射施用。施用治疗剂的顺序不是很严格的。
[0149]“组合疗法”还包括与其他生物活性成分和非药物疗法(例如，手术或放射疗法)进一步组合的如上所述的治疗剂的施用。在组合疗法进一步包括非药物治疗的情况下，可以在任何合适的时间进行非药物治疗，只要获得来自治疗剂和非药物治疗的组合的共同作用的有益作用即可。例如，在适当的情况下，当从治疗剂的施用中暂时去除非药物治疗时，可能直到几天甚至几周，仍然可以获得有益作用。
[0150]
本文所述的组合物可以与第二化学治疗剂组合施用。所述第二化学治疗剂(也称为抗肿瘤剂或抗增殖剂)可以是烷基化剂；抗生素；抗代谢物；解毒剂；干扰素；多克隆或单克隆抗体；egfr抑制剂；her2抑制剂；组蛋白脱乙酰基酶抑制剂；激素；有丝分裂抑制剂；mtor抑制剂；多激酶抑制剂；丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂；vegf/vegfr抑制剂；紫杉烷或紫杉烷衍生物、芳香酶抑制剂、蒽环类药物、靶向微管的药物、拓扑异构酶毒药物、分子靶或酶(例如激酶或蛋白质甲基转移酶)的抑制剂、胞苷类似物药物或任何化学治疗剂、www.cancer.org/docroot/cdg/cdg_0.asp.中列出的抗肿瘤剂或抗增殖剂。
[0151]“抗癌疗法”按照其普通的含义使用并且是指任选地符合方案、具有抗肿瘤性质或抑制细胞生长或增殖能力的疗法。
[0152]“抗癌剂”按照其普通的普通含义使用并且是指具有抗肿瘤性质或抑制细胞生长或增殖能力的组合物(例如化合物、药物、拮抗剂、抑制剂、调节剂)。在一些实施例中，抗癌剂是化学治疗剂。在一些实施例中，抗癌剂是本文鉴定的可用于治疗癌症的方法的药剂。在一些实施例中，抗癌剂是经美国以外的国家的fda或类似监管机构批准的用于治疗癌症的药剂。
[0153]
以下列出的抗癌剂是用于说明目的，而不是限制性的。在一些实施例中，至少一种抗癌剂选自以下列表。在一些实施例中，选择一种以上抗癌剂，例如两种、三种、四种或五种抗癌剂以执行其预期功能。在一些实施例中，抗癌剂是il-15(例如，genbank aax37025)/il-15ra(例如，genbank aap69528.1)异复合物(例如wo 2007/001677和wo 20007/084342中公开的和/或由seq id no:67编码的il-15/il-ra异复合物)。在一些实施例中，抗癌剂是抗pd-1抗体或其他pd-1抑制剂。pd-1、pd-l1和pd-l2的抗体、抗体片段和其他抑制剂是本领域可获得的，并且可以与本文所述的本发明的car组合使用。例如，纳武单抗(nivolumab)(也称为bms-936558或mdx1106；百时美施贵宝公司(bristol-myers squibb))是全人igg4单克隆抗体，其特异性阻断pd-1。纳武单抗(克隆5c4)和特异性结合pd-1的其他人单克隆抗体在us 8,008,449和wo2006/121168中公开。匹地利珠单抗(pidilizumab)(ct-011；cure tech)是与pd-1结合的人源化igg1k单克隆抗体。匹地利珠单抗和其他人源化抗pd-1单克隆抗体公开于wo 2009/101611中。派姆单抗(以前称为兰洛利珠单抗(lambrolizumab)，并且也称为mk03475；默克公司)是结合pd-1的人源化igg4单克隆抗体。派姆单抗和其他人源化抗pd-1抗体在us 8,354,509和wo2009/114335中公开。medi4736(医学免疫公司(medimmune))是结合pdl1的人单克隆抗体，并抑制配体与pd1的相互作用。mdpl3280a(基因泰克公司(genentech)/罗氏公司(roche))是结合pd-l1的人fc优化的igg1单克隆抗体。
mdpl3280a和针对pd-l1的其他人单克隆抗体公开于美国专利号：7,943,743和美国公开号：20120039906。其他抗pd-l1结合剂包括yw243.55.s70(重链和轻链可变区显示于wo 2010/077634中的seq id no 20和21中)和mdx-1 105(也称为bms-936559，并且例如，wo 2007/005874中公开的抗pd-l1结合剂)。amp-224(b7-dcig；安普利穆尼公司(amplimmune)；例如，在wo 2010/027827和wo 2011/066342中公开)是阻断pd-1与b7-h1之间的相互作用的pd-l2 fc融合可溶性受体。其他抗pd-1抗体包括amp 514(amplimmune)，尤其例如us 8,609,089、us 2010028330、和/或us 20120114649中公开的抗pd-1抗体。在一些实施例中，抗癌剂是放射性配体，例如但不限于
177
lu-psma-617(镥(117lu)氧代曲肽(oxodotreotide))。在一些实施例中，抗癌剂是癌症疫苗。
[0154]
在一些实施例中，抗癌剂是影响组蛋白修饰的化合物，例如hdac抑制剂。在一些实施例中，抗癌剂选自化学治疗剂(例如2cda、5-fu、6-巯基嘌呤、6-tg、abraxane
tm
、放线菌素-d、d、全反式维甲酸、氨蝶呤、ara-c、阿扎西汀、bcnu、c、阿扎西汀、bcnu、氯法拉滨clolar
tm
、盐酸柔红霉素、dic、磷酸依托泊苷、六甲嘧胺伊沙匹隆、l-左旋天冬酰胺酶、脂质体ara-c、l-pam、解肾腺瘤(lysodren)、光辉霉素制剂(mithracin)丝裂霉素尼洛替尼氮芥带有卡莫司汀植入物的prolifeprospan 20、20、tespa、vidaza
tm
、硫酸长春新碱、vm 26、和)；生物制剂(例如α干扰素、减毒活菌卡介苗、厄洛替尼、白介素-2、来那度胺、来那度胺、tarceva
tm
、和zevalin
tm
)；皮质类固醇、(例如地塞米松磷酸钠、和delta-)；激素疗法(例如)；激素疗法(例如
[0155]
plenaxis
tm
和)；和放射性药物(例如和钐sm-153)。
[0156]
在一些实施例中，抗癌剂是选自包括以下各项的组的化学治疗剂(也称为抗肿瘤剂或抗增生剂)：烷基化剂；抗生素；抗代谢物；解毒剂；干扰素；多克隆或单克隆抗体；egfr抑制剂；her2抑制剂；组蛋白脱乙酰基酶抑制剂；激素；有丝分裂抑制剂；mtor抑制剂；多激酶抑制剂；丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂；vegf/vegfr抑制剂；紫杉烷或紫杉烷衍生物、芳香酶抑制剂、蒽环类药物、靶向微管的药物、拓扑异构酶毒药物、分子靶或酶
(例如激酶或蛋白质甲基转移酶)的抑制剂、胞苷类似物药物或任何化学治疗剂、www.cancer.org/docroot/cdg/cdg_0.asp.中列出的抗肿瘤剂或抗增殖剂。
[0157]
示例性的烷基化剂包括但不限于环磷酰胺(cytoxan；neosar)；苯丁酸氮芥(leukeran)；美法仑(alkeran)；卡莫斯汀(bicnu)；白消安(busulfex)；洛莫司汀(ceenu)；达卡巴嗪(dtic-dome)；奥沙利铂(eloxatin)；卡莫司汀(gliadel)；异环磷酰胺(ifex)；双氯乙基甲胺(mustargen)；白消安(myleran)；卡铂(paraplatin)；顺铂(cddp；platinol)；替莫唑胺(temodar)；噻替派(thioplex)；苯达莫司汀(treanda)；或链脲霉素(zanosar)。
[0158]
示例性抗生素包括但不限于阿霉素(adriamycin)；阿霉素脂质体(doxil)；米托蒽醌(novantrone)；博来霉素(blenoxane)；柔红霉素(cerubidine)；柔红霉素脂质体(daunoxome)；放线菌素(cosmegen)；表柔比星(ellence)；伊达比星(idamycin)；普卡霉素(mithracin)；丝裂霉素(mutamycin)；喷司他丁(nipent)；或戊柔比星(valstar)。
[0159]
典型的抗代谢物包括但不限于氟尿嘧啶(adrucil)；卡培他滨(xeloda)；羟基脲(hydrea)；巯基嘌呤(purinethol)；培美曲塞(alimta)；奈拉滨(arranon)；克拉屈滨(克拉屈滨novaplus)；氯法拉滨(clolar)；阿糖胞苷(cytosar-u)；地西他滨(dacogen)；阿糖胞苷脂质体(depocyt)；羟基脲(droxia)；普拉曲沙(folotyn)；氟尿苷(fudr)；吉西他滨(gemzar)；克拉屈滨(leustatin)；氟达拉滨(oforta)；甲氨蝶呤(mtx；rheumatrex)；甲氨蝶呤(trexall)；硫鸟嘌呤(tabloid)；ts-1或阿糖胞苷(tarabine pfs)。
[0160]
示例性的解毒剂包括但不限于氨磷汀(ethyol)或美司钠(mesnex)。
[0161]
示例性干扰素包括但不限于干扰素α-2b(intron a)或干扰素α-2a(roferon-a)。
[0162]
示例性的多克隆或单克隆抗体包括但不限于曲妥珠单抗(herceptin)；奥法妥木单抗(arzerra)；贝伐单抗(avastin)；利妥昔单抗(rituxan)；西妥昔单抗(erbitux)；帕尼单抗(vectibix)；托西莫单抗/碘131托西莫单抗(bexxar)；阿仑单抗(campath)；替伊莫单抗(zevalin；in-111；y-90zevalin)；吉妥珠单抗(mylotarg)；依库珠单抗(soliris)或迪诺舒单抗。
[0163]
示例性egfr抑制剂包括但不限于吉非替尼(iressa)；拉帕替尼(tykerb)；西妥昔单抗(erbitux)；厄洛替尼(tarceva)；帕尼单抗(vectibix)；pki-166；卡奈替尼(ci-1033)；马妥珠单抗(emd7200)或ekb-569。
[0164]
示例性的her2抑制剂包括但不限于曲妥珠单抗(herceptin)；拉帕替尼(tykerb)或ac-480。
[0165]
示例性组蛋白脱乙酰基酶抑制剂包括但不限于伏立诺他(zolinza)。
[0166]
示例性的激素包括但不限于他莫昔芬(soltamox；nolvadex)；雷洛昔芬(evista)；甲地孕酮(megace)；亮丙瑞林(lupron；lupron depot；eligard；viadur)；氟维司群(faslodex)；来曲唑(femara)；曲普瑞林(trelstar la；trelstar depot)；依西美坦(aromasin)；戈舍瑞林(zoladex)；比卡鲁胺(casodex)；阿那曲唑(arimidex)；氟甲睾酮(androxy；halotestin)；甲羟孕酮(provera；depo-provera)；雌莫司汀(emcyt)；氟他胺(eulexin)；托瑞米芬(fareston)；地加瑞克(firmagon)；尼鲁米特(nilandron)；阿巴瑞克(plenaxis)；或睾内酯(teslac)。
[0167]
示例性有丝分裂抑制剂包括但不限于紫杉醇(taxol；onxol；abraxane)；多西他赛(taxotere)；长春新碱(oncovin；vincasar pfs)；长春碱(velban)；依托泊苷(toposar；
etopophos；vepesid)；替尼泊苷(vumon)；伊沙匹隆(ixempra)；诺考达唑；埃博霉素；长春瑞滨(navelbine)；喜树碱(cpt)；伊立替康(camptosar)；拓扑替康(hycamtin)；安吖啶或片螺素d(lam-d)。
[0168]
示例性mtor抑制剂包括但不限于依维莫司(afinitor)或特罗莫司(torisel)；西罗莫司、地磷莫司；或ap23573。
[0169]
示例性多激酶抑制剂包括但不限于索拉非尼(nexavar)；舒尼替尼(sutent)；bibw 2992；e7080；zd6474；pkc-412；莫替沙尼或ap24534。
[0170]
示例性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂包括但不限于卢博滔林；eril/easudil盐酸盐；夫拉平度；pkc412；苔藓虫素；kai-9803；sf1126；或pd 332991。
[0171]
示例性酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于厄洛替尼(tarceva)；吉非替尼(iressa)；伊马替尼(gleevec)；索拉非尼(nexavar)；舒尼替尼(sutent)；曲妥珠单抗(herceptin)；贝伐单抗(avastin)；利妥昔单抗(rituxan)；拉帕替尼(tykerb)；西妥昔单抗(erbitux)；帕尼单抗(vectibix)；依维莫司(afinitor)；阿仑单抗(campath)；吉妥珠单抗(mylotarg)；特罗莫司(torisel)；帕佐帕尼(votrient)；达沙替尼(sprycel)；尼洛替尼(tasigna)；伐他拉尼(ptk787；zk222584)；whi-p154；whi-p131；ac-220；或amg888。
[0172]
示例性vegf/vegfr抑制剂包括但不限于贝伐赛珠单抗(avastin)；索拉非尼(nexavar)；舒尼替尼(sutent)；雷尼比珠单抗；培加他尼；或vandetinib。
[0173]
示例性微管靶向药物包括但不限于紫杉醇多西他赛长春新碱、长春碱、诺考达唑、埃博霉素和长春瑞滨。
[0174]
示例性拓扑异构酶毒药包括但不限于替尼泊苷、依托泊苷、阿霉素喜树碱、柔红霉素、放线菌素、米托蒽醌、安吖啶、表柔比星和伊达比星。
[0175]
示例性紫杉烷或紫杉烷衍生物包括但不限于紫杉醇和多西紫杉醇。
[0176]
示例性一般化学治疗剂、抗肿瘤剂、抗增殖剂包括但不限于六甲蜜胺(hexalen)；异维a酸(accutane；amnesteem；claravis；sotret)；维甲酸(vesanoid)；阿扎胞苷(vidaza)；硼替佐米(velcade)天冬酰胺酶(elspar)；左旋咪唑(ergamisol)；米托坦(lysodren)；甲基苄肼(matulane)；培门冬酶(oncaspar)；地托-迪尼白介素(ontak)；卟菲尔钠(photofrin)；阿迪白介素(proleukin)；来那度胺(revlimid)；贝沙罗汀(targretin)；瑟利德米(thalomid)；特罗莫司(torisel)；三氧化二砷(trisenox)；维替泊芬(visudyne)；含羞草碱(leucenol)；(1m替加氟-0.4m 5-氯-2,4-二羟基嘧啶-1m草酰钾)、或洛伐他汀。
[0177]
在一些实施例中，抗癌剂是化学治疗剂或细胞因子，例如g-csf(粒细胞集落刺激因子)。
[0178]
在一些实施例中，抗癌剂可以是标准的化疗疗法组合，例如但不限于cmf(环磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶)、caf(环磷酰胺、阿霉素和5-氟尿嘧啶)ac(阿霉素和环磷酰胺)、fec(5-氟尿嘧啶、表柔比星、和环磷酰胺)、act或atc(阿霉素、环磷酰胺、和紫杉醇)、瑞妥昔单抗、希罗达(卡培他滨)、顺铂(cddp)、卡铂、ts-1(替加氟、吉美嘧啶和奥特斯特钾(otastat potassium)，摩尔比为1:0.4:1)、喜树碱11(cpt-11、伊立替康或camptosar
tm
)、chop(环磷酰胺、羟基柔红霉素、oncovin、和泼尼松或泼尼松龙)、r-chop(瑞妥昔单抗、环磷酰胺，羟基柔红霉素、oncovin、泼尼松或泼尼松龙)、或cmfp(环磷酰胺、甲氨蝶呤5-氟尿嘧啶和泼尼松)。
[0179]
在一些实施例中，抗癌剂可以是酶的抑制剂，例如受体或非受体激酶。受体和非受体激酶是例如酪氨酸激酶或丝氨酸/苏氨酸激酶。本文所述的激酶抑制剂是小分子、多核酸、多肽、或抗体。示例性激酶抑制剂包括但不限于贝伐单抗(靶向vegf)、bibw 2992(靶向egfr和erb2)、西妥昔单抗/erbitux(靶向erb1)、伊马替尼/gleevic(靶向bcr-abl)、曲妥珠单抗(靶向erb2)、吉非替尼/iressa(靶向egfr)、雷尼比珠单抗(靶向vegf)、培加他尼(靶向vegf)、厄洛替尼/tarceva(靶向erb1)、尼洛替尼(靶向bcr-abl)、拉帕替尼(靶向erb1和erb2/her2)、gw-572016/二甲苯磺酸拉帕替尼(靶向her2/erb2)、帕尼单抗/vectibix(靶向egfr)、vandetinib(靶向ret/vegfr)e7080(多个靶，包括ret和vegfr)、赫赛汀(靶向her2/erb2)pki-166(靶向egfr)、卡奈替尼/ci-1033(靶向egfr)、舒尼替尼/su-11464/sutent(靶向egfr和flt3)、马妥珠单抗/emd7200(靶向egfr)、ekb-569(靶向egfr)、zd6474(靶向egfr和vegfr)、pkc-412(靶向vegr和flt3)、瓦他拉尼碱/ptk787/zk222584(靶向vegr)、cep-701(靶向flt3)、su5614(靶向flt3)、mln518(靶向flt3)、xl999(靶向flt3)、vx-322(靶向flt3)、azd0530(靶向src)、bms-354825(靶向src)、ski-606(靶向src)、cp-690(靶向jak)、ag-490(靶向jak)、whi-p154(靶向jak)、whi-p131(靶向jak)、索拉非尼/nexavar(靶向raf激酶、vegfr-1、vegfr-2、vegfr-3、pdgfr-β、kit，flt-3、和ret)、达沙替尼/sprycel(bcr/abl和src)、ac-220(靶向flt3)、ac-480(靶向所有her蛋白、“泛her”)、二磷酸莫替沙尼(靶向vegf1-3、pdgfr、和c-kit)、迪诺舒单抗(靶向rankl，抑制src)、amg888(靶向her3)、和ap24534(多个靶，包括flt3)。
[0180]
示例性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂包括但不限于西罗莫司(靶向mtor/frap1)、雷帕霉素(靶向mtor)、certican/依维莫司(靶向mtor/frap1)、ap23573(靶向mtor/frap1)、埃里尔/法舒地尔盐酸盐(靶向rho)、夫拉平度(靶向cdk)、瑟利西利/cyc202/roscovitrine(靶向cdk)、sns-032/bms-387032(靶向cdk)、卢博滔林(靶向pkc)、pkc412(靶向pkc)、苔藓抑素(靶向pkc)、kai-9803(靶向pkc)、sf1126(靶向pi3k)、vx-680(靶向aurora激酶)、azd1152(靶向aurora激酶)、arry-142886/azd-6244(靶向map/mek)、scio-469(靶向map/mek)、gw681323(靶向map/mek)、cc-401(靶向jnk)、cep-1347(靶向jnk)、和pd 332991(靶向cdk)。
[0181]
另外，本文所述的肽组合物可以与常规的免疫治疗剂共同施用，所述免疫治疗剂包括但不限于免疫刺激剂(例如卡介苗(bcg)、左旋咪唑、白介素-2、α-干扰素、等等)、单克隆抗体(例如抗cd20、抗her2、抗cd52、抗hla-dr、和抗vegf单克隆抗体)、免疫毒素(例如抗cd33单克隆抗体-卡利车霉素缀合物、抗cd22单克隆抗体-假单胞菌外毒素缀合物等等)、和放射免疫疗法(例如抗cd20单克隆抗体，其与
111
in、
90
y、或
131
i等缀合)。
[0182]
在一些实施例中，本文所述的肽组合物可以与常规放射治疗剂共同施用，所述常规放射治疗剂包括但不限于放射性核素，例如
47
sc、
64
cu、
67
cu、
89
sr、
86
y、
87
y、
90
y、
105
rh、
111
ag、
111
in、
117m
sn、
149
pm、
153
sm、
166
ho、
177
lu、
186
re、
188
re、
211
at和
212
bi，任选地与针对肿瘤抗原的抗体缀合。
[0183]
在一些实施例中，本文使用的抗癌剂是指阿霉素、顺铂、卡铂、紫杉烷类、喜树碱或其任何组合。
[0184]“受试者”或“患者”包括哺乳动物。哺乳动物可以是例如人或适当的非人类哺乳动物，例如灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪。受试者也可以是鸟或
禽。在一些实施例中，哺乳动物是人。因此，所述方法适用于人疗法和兽医应用。在一些实施例中，受试者或有需要的受试者是具有表达nkg2d配体的疾病的受试者。“表达nkg2d配体的疾病”是nkg2d配体(例如mica，micb，ulbp1，ulbp2，ulbp3，ulbp4，ulbp5和/或ulbp6)的表达异常(例如更高或更低)的疾病或病症，这是与没有这种疾病或病症的受试者相比。表达nkg2d配体的示例性疾病包括但不限于癌症、自身免疫性疾病。在一些实施例中，受试者或有需要的受试者是患有癌症的受试者或患有癌前病症的受试者。在一些实施例中，有需要的受试者患有癌症。在一些实施例中，受试者或有需要的受试者是患有自身免疫性疾病的受试者。
[0185]
术语“自身免疫性疾病”是指其中哺乳动物的免疫系统对哺乳动物自己的组织或对哺乳动物本身无害的抗原产生体液或细胞免疫应答从而在这种哺乳动物中产生组织损伤的疾病。症状和严重程度因患者而异。此外，患者中疾病的临床特征随时间变化很大。
[0186]
自身免疫性疾病的实例包括但不限于系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎和i型糖尿病。自身免疫性疾病还包括急性肾小球肾炎、艾迪生氏病(addison's disease)、成人发作性特发性甲状旁腺功能低下(aoih)、全秃、肌萎缩侧索硬化、强直性脊柱炎、自身免疫性再生障碍性贫血；自身免疫性溶血性贫血、白塞氏病(behcet's disease)；乳糜泻、慢性活动性肝炎、crest综合征、克罗恩病、皮肌炎、扩张型心肌病、嗜酸性粒细胞肌痛综合征、后天性大疱性表皮松解(eba)、巨细胞动脉炎、古德帕斯彻氏综合征(goodpasture's syndrome)、格雷夫斯病(graves'disease,)、格林巴利综合征(guillain-barre syndrome)、血色素沉着症、过敏性紫癜、特发性iga肾病、胰岛素依赖型糖尿病(iddm)青少年类风湿性关节炎、兰伯特-伊顿综合征(lambert-eaton syndrome)、线性iga皮肤病、红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、心肌炎、嗜睡症、坏死性血管炎、新生儿狼疮综合征(nle)、肾病综合征、类天疱疮(pemphigoid)、天疱疮(phemphigus)、多肌炎、原发性硬化性胆管炎、银屑病、急进性肾小球肾炎(rpgn)、瑞特氏综合征(reiter's syndrome)、类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征(sjogren's syndrome)、僵人综合征、甲状腺炎、和溃疡性结肠炎。这并不是详尽的清单，而是旨在证明自身免疫是范围广泛的临床现象。在下文中将更详细地讨论该领域的示例性疾病，例如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、混合性结缔组织病和apls，以提供对这些致虚弱性和潜在致命性障碍的临床诊断和治疗中涉及的问题的一些理解。
[0187]
在一些实施例中，自身免疫性疾病是类风湿性关节炎、结肠炎、乳糜泻、多发性硬化症、斑秃、1型糖尿病、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化或与2型糖尿病相关的代谢综合征。
[0188]
如本文所用，术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、赘生物或恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌肿瘤、上皮癌和肉瘤。可以用本文提供的组合物、药物组合物或方法治疗的示例性癌症包括淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌脑肿瘤、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性、er阳性、er阴性、化学疗法抗性、赫赛汀抗性、her2阳性、阿霉素抗性、他莫昔芬抗性、导管癌、小叶癌、原位、转移性)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌、肉瘤)、多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如头、颈、或食道)、结直肠癌、白血病、急性髓性白血病、
淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、或多发性骨髓瘤。另外的实例包括甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或髓母细胞瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌、膀胱癌、皮肤癌前病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺肿瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺髓质瘤、黑素瘤、结直肠癌、甲状腺乳头状癌、肝细胞癌、乳头佩吉特病、叶状瘤、小叶癌、导管癌、胰腺星状细胞癌、肝星状细胞癌、或前列腺癌。在一些实施例中，表达nkg2d配体的癌症是肺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肝细胞癌(hcc)、肾癌、鼻咽癌(npc)、前列腺癌、黑素瘤、浆细胞癌、白血病、淋巴瘤、神经胶质瘤或神经母细胞瘤。
[0189]
术语“白血病”广义上是指造血器官的进展性、恶性疾病且其特征通常在于白血球及其前体在血液及骨髓中的异常增殖及发育。白血病一般根据以下方面进行临床分类：(1)急性或慢性疾病的持续时间和特征；(2)所涉及的细胞类型；髓系(髓样)、淋巴系(淋巴样)或单核细胞；(3)血液白血病或无白血病(亚白血病)中异常细胞的数量增加或不增加。可以用本文提供的组合物、药物组合物或方法治疗的示例性白血病包括例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、成人t细胞性白血病、动脉性白血病、白细胞性白血病、嗜碱粒细胞性白血病、母细胞性白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病嗜酸粒细胞白血病、格瑞斯白血病(gross'leukemia)、毛细胞白血病、成血细胞性白血病、成血母细胞白血病、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞性白血病、淋巴白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴球性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小成髓细胞性白血病、单核细胞白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、髓样粒细胞性白血病、髓单核细胞白血病、内格利型白血病(naegeli leukemia)、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、早幼粒细胞白血病、里德尔细胞白血病(rieder cell leukemia)、希林氏白血病(schilling's leukemia)、干细胞白血病、亚白血病、或未分化的细胞白血病。
[0190]
术语“肉瘤”通常是指由诸如胚胎结缔组织的物质构成的肿瘤，并且通常由嵌入纤维状或均质物质中的紧密堆积的细胞构成。可以用本文提供的组合物、药物组合物或方法治疗的肉瘤包括软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、黏肉瘤、骨肉瘤、阿贝西米肉瘤(abemethy's sarcoma)、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、威尔姆斯瘤肉瘤(wilms'tumor sarcoma)、子宫内膜肉瘤、基质肉瘤、尤因氏肉瘤(ewing's sarcoma)、筋膜肉瘤、纤维母细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素性出血肉瘤、b细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、t细胞免疫母细胞肉瘤、詹恩逊氏肉瘤(jensen's sarcoma)、卡波济氏肉瘤(kaposi's sarcoma)、枯否细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病肉瘤、恶性间质瘤肉瘤、骨旁骨肉瘤、网状细胞肉瘤、鲁斯氏肉瘤(rous sarcoma)、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤、或毛细血管扩张肉瘤(telangiectaltic sarcoma)。
[0191]
术语“黑素瘤”是指源自皮肤和其他器官的黑素细胞系统的肿瘤。可以用本文提供
的组合物、药物组合物或方法治疗的黑素瘤包括，例如，肢端雀斑样痣黑素瘤(acral-lentiginous melanoma)、无黑素性黑素瘤、良性青少年黑素瘤、cloudman黑素瘤、s91黑素瘤、harding-passey黑素瘤、青少年黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤、舌下黑素瘤或浅表扩散性黑素瘤。
[0192]“乳腺癌”包括所有形式的乳房的癌症。乳腺癌可以包括原发性上皮性乳腺癌。乳腺癌可以包括其中乳房被其他肿瘤(如淋巴瘤、肉瘤或黑色素瘤)涉及的癌症。乳腺癌可以包括乳房上皮癌、乳房导管癌、乳房小叶癌、乳房未分化癌、乳房囊状肉瘤、乳房血管肉瘤和乳房原发性淋巴瘤。乳腺癌可以包括i、ii、iiia、iiib、iiic和iv期乳腺癌。乳房导管癌可包括侵袭性癌、具有主要导管内成分的原位侵袭性癌、炎性乳腺癌和具有选自下组的组织学类型的乳房导管癌，该组由以下组成：粉刺性、粘液性(胶体)、延髓性、伴有淋巴细胞浸润的延髓性、乳突性、硬化性和管状。乳房小叶癌可包括具有主要原位成分的侵袭性小叶癌、侵袭性小叶癌和浸润性小叶癌。乳腺癌可以包括佩吉特氏病(paget’s disease)、具有导管内癌的佩吉特氏病和具有侵袭性导管癌的佩吉特氏病。乳腺癌可以包括具有组织学和超结构异质性(例如，混合细胞类型)的乳房肿瘤。
[0193]
待治疗的乳腺癌可以包括家族性乳腺癌。待治疗的乳腺癌可以包括散发性乳腺癌。待治疗的乳腺癌可以在男性受试者中发生。待治疗的乳腺癌可以在女性受试者中发生。待治疗的乳腺癌可以发生在绝经前女性受试者或绝经后女性受试者中。待治疗的乳腺癌可以出现在等于或大于30岁的受试者或小于30岁的受试者中。待治疗的乳腺癌可以出现在等于或大于50岁的受试者或小于50岁的受试者中。待治疗的乳腺癌可以出现在等于或大于70岁的受试者或小于70岁的受试者中。
[0194]
可以对待治疗的乳腺癌进行分类型，以鉴定brca1、brca2或p53中的家族性或自发性突变。可以将待治疗的乳腺癌分类型为具有her2/neu基因扩增、过度表达her2/neu或分类型为具有低、中或高水平的her2/neu表达。可以针对选自下组的标志物将待治疗的乳腺癌分类型，该组由以下组成：雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)、人表皮生长因子受体2、ki-67、ca15-3、ca 27-29和c-met。可以将待治疗的乳腺癌分类型为未知er、富含er或缺乏er。可以将待治疗的乳腺癌分类型为er阴性或er阳性。乳腺癌的er分类型可以通过任何可重复的手段进行。乳腺癌的er分类型可以如onkologie 27:175-179(2004)中所述进行。可以将待治疗的乳腺癌分类型为未知pr、富含pr或缺乏pr。可以将待治疗的乳腺癌分类型为pr阴性或pr阳性。可以将待治疗的乳腺癌分类型为受体阳性或受体阴性。可以将待治疗的乳腺癌分类型为与ca 15-3或ca 27-29或两者的血液水平升高相关。待治疗的乳腺癌可以是“三阴性乳腺癌”(tnbc)(雌激素受体[er]阴性，孕激素受体[pr]阴性并且人表皮生长因子受体2[her2]阴性)。
[0195]
待治疗的乳腺癌可以包括乳房局部肿瘤。待治疗的乳腺癌可以包括与阴性前哨淋巴结(sln)活检相关的乳房肿瘤。待治疗的乳腺癌可以包括与阳性前哨淋巴结(sln)活检相关的乳房肿瘤。待治疗的乳腺癌可以包括与一个或多个阳性腋窝淋巴结相关的乳房肿瘤，其中腋窝淋巴结已经通过任何适用的方法进行了分期。待治疗的乳腺癌可以包括已经被分类型为具有淋巴结阴性状态(例如，淋巴结阴性)或淋巴结阳性状态(例如，淋巴结阳性)的乳房肿瘤。待治疗的乳腺癌可以包括已经转移到身体其他部位的乳房肿瘤。可以将待治疗的乳腺癌分类型为已转移到选自由骨、肺、肝或脑组成的组的位置。可以根据选自下组的特
征对待治疗的乳腺癌进行分类型，该组由以下组成：转移性、局部性、区域性、局部区域性、局部晚期、远处、多中心性、双侧、同侧、对侧、新诊断、复发和不能手术。
[0196]
术语“癌”是指由上皮细胞构成的恶性新生长，趋于浸润周围组织并引起转移。可以用本文提供的组合物、药物组合物或方法治疗的示例性癌包括例如甲状腺髓样瘤、家族性甲状腺髓样癌、腺泡癌、腺癌、腺囊癌、腺样囊性癌、腺瘤癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底上皮细胞癌、基底样癌、基底鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、支气管癌、支气管源性癌、脑样癌、胆管细胞癌、绒膜上皮癌、胶样癌、粉刺性癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、导管的癌、硬脑膜癌、胚胎性癌、髓样癌、上皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性胃癌(carcinoma ex ulcere)、纤维瘤、胶样癌、胶状癌、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌、粒层细胞癌、发母质癌、血癌、肝细胞癌、许特耳氏细胞癌(hurthle cell carcinoma)、透明癌(hyaline carcinoma)、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩切氏癌(krompecher's carcinoma)、kulchitzky细胞癌、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂肪瘤癌、小叶癌、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素鳞癌、软癌、粘液性癌、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌(carcinoma myxomatode)、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化癌(carcinoma ossifican)、骨样癌、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、脑样癌、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌、阴囊癌(carcinoma scroti)、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、茄状癌(solanoid carcinoma)、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓样癌(carcinoma spongiosum)、鳞状细胞癌(squamous carcinoma)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)、绳捆癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、小管癌、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌、或绒毛状癌。
[0197]
如本文所用，术语“转移”、“转移性”和“转移性癌症”可以互换使用，并且是指增殖性疾病或障碍例如癌症从一个器官或另一非相邻器官或身体部分的扩散。癌症发生在起源部位，例如乳房，该部位称为原发性肿瘤，例如原发性乳腺癌。原发性肿瘤或起源部位中的某些癌细胞具有穿透和浸润局部区域周围正常组织的能力，和/或穿透淋巴系统或血管系统的壁通过所述系统循环至身体其他部位和组织的能力。由原发性肿瘤的癌细胞形成的第二临床上可检测的肿瘤称为转移性或继发性肿瘤。当癌细胞转移时，推测转移性肿瘤及其细胞与原始肿瘤的那些相似。因此，如果肺癌转移至乳房，则乳房部位的继发性肿瘤由异常的肺细胞而不是异常的乳房细胞组成。乳房中的继发性肿瘤被称为转移性肺癌。因此，短语转移性癌症是指其中受试者患有或曾经患有原发性肿瘤并患有一个或多个继发性肿瘤的疾病。短语非转移性癌症或患有非转移性癌症的受试者是指其中受试者患有原发性肿瘤但没有一个或多个继发性肿瘤的疾病。例如，转移性肺癌是指患有原发性肺肿瘤或具有原发性肺肿瘤病史并且在第二位置或多个位置(例如在乳房中)具有一个或多个继发性肿瘤的受试者中的疾病。
[0198]
可以根据美国癌症联合委员会(ajcc)tnm分类系统将待治疗的癌症进行分期，其
中已为肿瘤(t)分配了以下期：tx、t1、t1mic、t1a、t1b、t1c、t2、t3、t4、t4a、t4b、t4c或t4d；并且其中已为区域淋巴结(n)分配了以下期：nx、n0、n1、n2、n2a、n2b、n3、n3a、n3b或n3c；并且其中已为远处转移(m)分配了以下期：mx、m0或m1。可以根据美国癌症联合委员会(ajcc)分类将待治疗的癌症进行分期为i期、iia期、iib期、iiia期、iiib期、iiic期或iv期。可以根据ajcc分类将待治疗的癌症分配为等级gx(不能评估等级)、等级1、等级2、等级3或等级4。可以根据ajcc病理学分类(pn)将待治疗的癌症进行分期为pnx、pn0、pn0(i-)、pn0(i )、pn0(mol-)、pn0(mol )、pn1、pn1(mi)、pn1a、pn1b、pn1c、pn2、pn2a、pn2b、pn3、pn3a、pn3b或pn3c。
[0199]
待治疗的癌症可包括已确定直径小于或等于约2厘米的肿瘤。待治疗的癌症可包括已确定直径为约2至约5厘米的肿瘤。待治疗的癌症可包括已确定直径大于或等于约3厘米的肿瘤。待治疗的癌症可包括已确定直径大于5厘米的肿瘤。可以通过显微外观将待治疗的癌症分类为高分化、中分化、低分化或未分化。可以通过关于有丝分裂计数(例如，细胞分裂量)或核多态性(例如，细胞变化)的显微外观来分类待治疗的癌症。可以通过显微外观将待治疗的癌症分类为与坏死区域(例如，垂死或退化的细胞的区域)相关。可以将待治疗的癌症分类为具有异常核型、具有异常染色体数目或具有一个或多个外观异常的染色体。待治疗的癌症可分类为非整倍体、三倍体、四倍体或具有改变的倍性。可以将待治疗的癌症分类为具有染色体易位，或整个染色体的缺失或重复，或部分染色体的缺失、重复或扩增的区域。
[0200]
可以通过dna细胞计数、流式细胞术计数或图像细胞计数评估待治疗的癌症。可以将待治疗的癌症分类型为具有约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细胞在细胞分裂的合成阶段(例如，处于细胞分裂的s期)。可以将待治疗的癌症分类型为具有低s期分数或高s期分数。
[0201]
如本文所提供的“有效量”或“治疗有效量”是足以实现所述目的(例如达到其被施用的作用，治疗疾病，降低酶活性，增加酶活性，降低转录活性，增加转录活性，减少疾病或病症的一种或多种症状)的量。“有效量”的实例是足以有助于治疗、预防或减轻疾病的一个或多个症状的量，其也可以称为“治疗有效量”。一个或多个症状的“减轻”(和该短语的语法等价形式)是指一个或多个症状的严重程度或频率的降低，或一个或多个症状的消除。药物的“预防有效量”是当施用给受试者时具有预期的预防作用(预防或延迟损伤、疾病、病理或病症的发作(或再发生)，或减少损伤、疾病、病理或病症或其症状的发作(或再发生)的可能性)的药物量。完全预防作用不一定通过施用一个剂量而发生，而可能仅在施用一系列剂量后才发生。因此，可以一次或多次施用来施用预防有效量。如本文所用，“活性降低量”是指相对于不存在拮抗剂而言降低酶或蛋白(例如转录因子)的活性所需的拮抗剂(抑制剂)的量。如本文所用，“活性增加量”是指相对于不存在激动剂而言增加酶或蛋白(例如转录因子)的活性所需的激动剂(活化剂)的量。如本文所用，“功能破坏量”是指相对于不存在拮抗剂而言破坏酶或蛋白(例如转录因子)的功能所需的拮抗剂(抑制剂)的量。如本文所用，“功能增加量”是指相对于不存在激动剂而言增加酶或蛋白(例如，转录因子)的功能所需的激动剂(活化剂)的量。确切的量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，lieberman,pharmaceutical dosage forms[药物剂型](第1-3卷,1992)；lloyd,the art,science and technology of pharmaceutical compounding[药物复配的
艺术、科学技术](1999)；pickar,dosage calculations[剂量计算](1999)；以及remington:the science and practice of pharmacy[雷明顿：药学的科学与实践],第20版,2003,gennaro编,lippincott williams&wilkins[利平科特
·
威廉斯
·
威尔金斯出版公司])。在一些实施例中，待治疗的疾病或标准是癌症。
[0202]
如本文所使用的，“治疗(treating或treat)”描述了出于对抗疾病、病症或障碍的目的而对患者进行的管理和护理，并且包括施用本文所述的组合物以减轻疾病、病症或障碍的症状或并发症，或者消除所述疾病、病症或障碍。术语“治疗”还可以包括体外细胞或动物模型的治疗。
[0203]
如本文所使用的，术语“减轻”意指描述如下过程，通过所述过程障碍的体征或症状的严重程度降低。重要的是，体征或症状可以在不被消除的情况下得到减轻。本发明的组合物或药物组合物的施用可以或能够导致体征或症状的消除，但是，不要求消除。应该预期有效剂量可降低体征或症状的严重程度。例如，如果癌症的严重程度在多个位置中的至少一个内降低，则可以减轻在多个位置可能发生的诸如癌症的障碍的体征或症状。
[0204]
如本文所用，术语“严重程度”是指描述癌症从癌前状态或良性状态转变为恶性状态的可能性。可替代地或另外地，严重程度是指根据例如tnm系统(国际抗癌联盟(uicc)和美国癌症联合委员会(ajcc)接受)或通过其他本领域公认的方法描述癌症分期。癌症分期是指癌症的程度或严重程度，这取决于诸如原发性肿瘤的位置、肿瘤的大小、肿瘤的数量和淋巴结受累(癌症扩散到淋巴结)等因素。可替代地或另外地，严重程度是指通过本领域公认的方法描述肿瘤分期(参见，国家癌症研究所，www.cancer.gov)。肿瘤分级是一种用于根据癌细胞在显微镜下的外观异常以及肿瘤生长和扩散的速度来对癌细胞进行分类的系统。确定肿瘤分级时要考虑许多因素，包括细胞的结构和生长模式。用于确定肿瘤分级的特定因素因每种癌症而异。严重程度还描述了组织学分级，也称为分化，是指肿瘤细胞与相同组织类型的正常细胞相似的程度(参见国家癌症研究所，www.cancer.gov)。此外，严重程度描述了核分级，其指的是肿瘤细胞中核的大小和形状以及正在分裂的肿瘤细胞的百分比(参见国家癌症研究所，www.cancer.gov)。
[0205]
严重程度还可以描述肿瘤已分泌生长因子、降低细胞外基质、成为血管、失去粘附到并列组织、或转移的程度。此外，严重程度可以描述原发性肿瘤已转移到的位置数量。最后，严重程度可以包括治疗各种类型和位置的肿瘤的困难。例如，无法手术的肿瘤、那些更容易进入多个身体系统的癌症(血液和免疫肿瘤)以及那些对传统治疗最具抵抗力的癌症被认为是最严重的。在这些情况下，延长受试者的预期寿命和/或减轻疼痛、减少癌细胞的比例或将细胞限制在一个系统中以及改善癌症分期/肿瘤分级/组织学分级/核分级被认为可以减轻癌症的体征或症状。
[0206]
如本文所用，术语“症状”被定义为疾病、疾患、损伤或体内某些不适的指示。经历过症状的人会感觉到或注意到症状，但其他人可能不容易注意到。其他人被定义为非医疗保健专业人员。
[0207]
如本文所使用的，术语“体征”也被定义为体内某些不适的指示。但是体征被定义为医生、护士或其他医疗保健专业人员可以看到的事物。
[0208]
癌症是可能导致几乎任何体征或症状的一组疾病。体征和症状将取决于癌症在哪里、癌症的大小以及对附近器官或结构的影响程度。如果癌症扩散(转移)，则症状可能出现
在身体的不同部位。例如，癌症也可能引起症状，例如发烧、疲劳或体重减轻。疼痛可能是某些癌症(如骨癌或睾丸癌)的早期症状。但最常见的是疼痛是晚期疾病的症状。除皮肤癌外，一些内部癌症也会引起可见的皮肤症状。这些变化包括皮肤看起来较暗(色素沉着)、黄色(黄疸)或红色(红斑)；瘙痒；或毛发过度生长。
[0209]
可替代地，或另外地，癌症亚型表现出特定的体征或症状。排便习惯或膀胱功能的改变可能预示着癌症。长期便秘、腹泻或粪便大小改变可能是结肠癌的体征。排尿疼痛、尿液中的血液或膀胱功能的改变(例如尿频率更大或更小)可能与膀胱癌或前列腺癌有关。
[0210]
皮肤状况的改变或新皮肤状况的出现可能表明癌症。皮肤癌可能会流血，看起来像无法愈合的疮。口腔中长久的疮可能是口腔癌，尤其是在吸烟、咀嚼烟草或经常喝酒的患者中。阴茎或阴道上的疮可能是感染体征或早期癌症。
[0211]
异常出血或分泌物可能表示癌症。在早期或晚期癌症中均可发生异常出血。痰(粘液)中的血液可能是肺癌的体征。粪便(或深色或黑色粪便)中的血液可能是结肠癌或直肠癌的体征。子宫颈癌或子宫内膜癌(子宫的内膜)可引起阴道出血。尿液中的血液可能是膀胱癌或肾癌的体征。乳头流血可能是乳腺癌的体征。
[0212]
乳房或身体其他部位的增厚或肿块可能表明存在癌症。通过皮肤(主要是在乳房、睾丸、淋巴结(腺体)和身体的软组织中)可以感觉到许多癌症。肿块或增厚可能是癌症的早期或晚期体征。任何肿块或增厚都可能表示癌症，特别是如果形成的是新的或尺寸增大。
[0213]
消化不良或吞咽困难可能表示癌症。尽管这些症状通常还有其他原因，但消化不良或吞咽问题可能是食道、胃或咽部(喉)癌的体征。
[0214]
疣或痣的最新变化可能预示着癌症。颜色、大小或形状发生变化或失去明确边界的任何疣、痣或雀斑均指示可能患上了癌症。例如，皮肤病变可能是黑色素瘤。
[0215]
持续咳嗽或声音嘶哑可能表示癌症。咳嗽不消失可能是肺癌的体征。声音嘶哑可能是喉癌(喉头)或甲状腺癌的体征。
[0216]
尽管上面列出的体征和症状是癌症中最常见的症状和体征，但还有许多其他的症状和体征则较不常见，因此未在此处列出。
[0217]
治疗癌症可以导致或能够导致肿瘤尺寸减小。肿瘤尺寸的减小也可以称为“肿瘤消退”。优选地，在治疗之后，相对于治疗之前的肿瘤尺寸，肿瘤尺寸将减小约5％或更多；更优选地，肿瘤尺寸减小约10％或更多；更优选地减小约20％或更多；更优选地减小约30％或更多；更优选地减小约40％或更多；甚至更优选地减小约50％或更多；并且最优选地减小大于约75％或更多。肿瘤的大小可以通过任何可重复的测量手段来测量。肿瘤的大小可以测量为肿瘤的直径。
[0218]
治疗癌症可以导致或能够导致肿瘤体积减小。优选地，在治疗之后，相对于治疗之前的肿瘤尺寸，肿瘤体积将减小约5％或更多；更优选地，肿瘤体积减小约10％或更多；更优选地减小约20％或更多；更优选地减小约30％或更多；更优选地减小约40％或更多；甚至更优选地减小约50％或更多；并且最优选地减小大于约75％或更多。肿瘤体积可以通过任何可重复的测量手段来测量。
[0219]
治疗癌症可以导致或能够导致肿瘤数量减少。优选地，在治疗之后，相对于治疗之前的肿瘤数量，肿瘤数量将减少约5％或更多；更优选地，肿瘤数目减少约10％或更多；更优选地减少约20％或更多；更优选地减少约30％或更多；更优选地减少约40％或更多；甚至更
优选地减少约50％或更多；并且最优选地减少大于约75％。肿瘤数量可以通过任何可重复的测量手段来测量。肿瘤数量可以通过计数肉眼可见或指定放大率下的肿瘤来测量。优选地，指定放大率是2x、3x、4x、5x、10x或50x。
[0220]
治疗癌症可以导致或能够导致远离原发性肿瘤部位的其他组织或器官的转移性病变数量减少。优选地，在治疗之后，相对于治疗之前的数量，转移性病变数量将减少约5％或更多；更优选地，转移性病变数量减少约10％或更多；更优选地减少约20％或更多；更优选地减少约30％或更多；更优选地减少约40％或更多；甚至更优选地减少约50％或更多；并且最优选地减少大于约75％。转移性病变数量可以通过任何可重复的测量手段来测量。转移性病变数量可以通过对肉眼可见或指定放大率下的转移性病变进行计数来测量。优选地，指定放大率是2x、3x、4x、5x、10x或50x。
[0221]
与仅接受载剂的群体相比，治疗癌症可以导致或能够导致治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间将增加超过30天；更优选地超过60天；更优选地超过90天；最优选地超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可重复的手段来测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过针对群体计算在开始用活性组合物治疗之后的平均存活时间长度来测量。群体的平均存活时间的增加也可以例如通过针对群体计算活性组合物的第一轮治疗完成后的平均存活时间长度来测量。
[0222]
与未治疗的受试者群体相比，治疗癌症可以导致或能够导致治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间将增加超过30天；更优选地超过60天；更优选地超过90天；最优选地超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可重复的手段来测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过针对群体计算在开始用活性组合物治疗之后的平均存活时间长度来测量。群体的平均存活时间的增加也可以例如通过针对群体计算活性组合物的第一轮治疗完成后的平均存活时间长度来测量。
[0223]
与接受非本文所述组合物的药物的单一疗法的群体相比，治疗癌症可以导致或能够导致治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间将增加超过30天；更优选地超过60天；更优选地超过90天；最优选地超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可重复的手段来测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过针对群体计算在开始用活性组合物治疗之后的平均存活时间长度来测量。群体的平均存活时间的增加也可以例如通过针对群体计算活性组合物的第一轮治疗完成后的平均存活时间长度来测量。
[0224]
与仅接受载剂的群体相比，治疗癌症可以导致或能够导致治疗的受试者群体的死亡率降低。与未治疗的群体相比，治疗癌症可以导致或能够导致治疗的受试者群体的死亡率降低。与接受非本文所述组合物的药物或其药学上可接受的盐、前药、代谢产物、类似物或其衍生物的单一疗法的群体相比，治疗癌症可以导致或能够导致治疗的受试者群体的死亡率降低。优选地，死亡率将降低超过2％；更优选地超过5％；更优选地超过10％；并且最优选地超过25％。可以通过任何可重复的手段来测量治疗的受试者群体的死亡率的降低。群体的死亡率的降低例如可以通过针对群体计算在开始用活性组合物治疗后每单位时间与疾病相关的死亡的平均数量来测量。群体的死亡率的降低例如还可以通过针对群体计算活性组合物第一轮治疗完成后每单位时间与疾病相关的死亡的平均数量来测量。
[0225]
治疗癌症可以导致或能够导致肿瘤生长速率降低。优选地，在治疗之后，相对于治疗之前的数目，肿瘤生长速率将降低至少5％；更优选地，肿瘤生长速率将降低至少10％；更
优选地降低至少20％；更优选地降低至少30％；更优选地降低至少40％；更优选地降低至少50％；甚至更优选地降低至少50％；并且最优选地降低至少75％。肿瘤生长速率可以通过任何可重复的测量手段来测量。可以根据每单位时间肿瘤直径的变化来测量肿瘤生长速率。
[0226]
治疗癌症可以导致或能够导致肿瘤再生长减少。优选地，在治疗之后，肿瘤再生长将小于5％；更优选地，肿瘤再生长将小于10％；更优选地小于20％；更优选地小于30％；更优选地小于40％；更优选地小于50％；甚至更优选地小于50％；并且最优选地小于75％。肿瘤再生长可以通过任何可重复的测量手段来测量。例如，通过测量在治疗后先前的肿瘤缩小后肿瘤直径的增加来测量肿瘤再生长。停止治疗后肿瘤无法复发，则表明肿瘤再生长减少。
[0227]“接触”按照其一般的含义使用，并且是指使至少两个不同的种类(例如，化合物(包括生物分子)或细胞)变得足够近以反应、相互作用或物理接触的过程。然而，应当理解，所得反应产物可以直接由添加的试剂之间的反应产生，或者从来自一种或多种添加的试剂的可以在反应混合物中产生的中间体产生。在一些实施例中，接触包括例如允许本文所述的核糖核酸与核酸内切酶和增强子元件相互作用。
[0228]“对照”样品或值是指用作参照物的样品，通常是已知的参照物，用于与测试样品进行比较。例如，从测试条件例如在测试化合物存在下获取测试样品，并将其与已知条件(例如不存在测试化合物的情况(阴性对照)，或存在已知化合物的情况(阳性对照))下的样品进行比较。对照也可以代表从多个测试或结果中收集的平均值。本领域技术人员将认识到，可以将对照设计为用于评估任意数量的参数。例如，可以设计对照以基于药理学数据(例如，半衰期)或治疗措施(例如，比较副作用)比较治疗益处。本领域技术人员将理解哪种标准对照在给定情况下最合适，并且能够基于与标准对照值的比较来分析数据。标准对照对于确定数据的显著性(例如统计显著性)也很有价值。例如，如果给定参数的值在标准对照中变化很大，则测试样品中的变化将不被认为是显著的。
[0229]
如本文所定义，术语“抑制(inhibition、inhibit、inhibiting)”等是指在相对于不存在抑制剂的情况下的活性或功能，负面地影响(例如降低)生物分子或生物系统的活性或功能。在一些实施例中，抑制是指疾病或疾病症状的减轻。
[0230]
如本文所定义，关于激活剂(例如激动剂)相互作用的术语“激活(activation、activate、activating)”等是指在相对于不存在激活剂的情况下的活性或功能，正面地影响(例如增加)生物分子或生物系统的活性或功能。
[0231]
如本文所用，术语“施用”是指口服施用、以栓剂施用、局部接触、静脉内、胃肠外、腹膜内、肌肉内、病灶内、鞘内、颅内、鼻内或皮下施用或植入缓释装置(例如微型渗透泵)至受试者。施用可以通过任何途径进行，包括胃肠外和透粘膜(例如，颊、舌下、颚、牙龈、鼻、阴道、直肠或经皮)。在一些实施例中，施用包括直接施用至肿瘤。胃肠外施用包括例如静脉内、肌肉内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。其他递送方式包括但不限于脂质体配制品的使用、静脉内输注、经皮贴剂等。“共同施用”是指本文所述的组合物与施用一种或多种另外的治疗剂(例如抗癌剂或化学治疗剂)同时施用、在其之前立即施用、或在其之后立即施用。本发明的组合物可以单独施用或可以共同施用给患者。共同施用是指包括将化合物单独或组合(一种以上的化合物或药剂)同时或顺序施用。因此，当希望时，所述制剂也可以与其他活性物质组合(例如以减少代谢降解)。本文所述的组合物可以通过以下经皮
递送：局部途径、配制成施用棒、溶液、悬浮液、乳液、凝胶、乳膏、软膏、糊剂、果胶、涂剂、粉末和气雾剂。口服制剂包括适合于患者摄入的片剂、丸剂、粉剂、糖衣丸、胶囊、液体、锭剂、扁囊剂、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等。固体形式制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒。液体形式制剂包括溶液、悬浮液和乳液，例如水或水/丙二醇溶液。本文所述的组合物可另外包括提供持续释放和/或舒适性的组分。这样的组分包括高分子量的阴离子的类粘液聚合物、凝胶化的多糖和精细分散的药物载剂底物。这些组分在以下中更详细讨论：美国专利号4,911,920；5,403,841；5,212,162；和4,861,760。出于所有目的，这些专利的全部内容通过引用整体并入本文。本文所述的组合物也可以作为微球递送以在体内缓慢释放。例如，微球可以通过以下来施用：经由皮内注射含药物的微球，所述微球在皮下缓慢释放(参见rao,j.biomater sci.polym.[生物材料科学与聚合物杂志]编辑7:623-645,1995；作为可生物降解和可注射的凝胶配制品(例如，参见gaopharm.res.[药物研究]12:857-863,1995)；或作为口服施用微球(例如，参见eyles,j.pharm.pharmacol.[药物与药理学杂志]49:669-674,1997)。在另一个实施例中，本文所述的组合物的配制品可以通过使用脂质体来递送，所述脂质体与细胞膜融合或被内吞(即，通过采用与脂质体附接的受体配体，所述受体配体与细胞表面膜蛋白受体结合，导致内吞)。通过使用脂质体，特别是在脂质体表面带有对靶细胞特异或以其他方式优先针对特定器官的受体配体的情况下，可以专注于将本文所述的组合物递送到体内靶细胞中。(参见例如，al-muhammed,j.microencapsul.[微囊化杂志]13:293-306,1996；chonn,curr.opin.biotechnol.[生物技术当前观点]6:698-708,1995；ostro,am.j.hosp.pharm.[美国医院与药房杂志]46:1576-1587,1989)。本文所述的组合物也可以纳米颗粒的形式递送。
[0232]
施用给哺乳动物的剂量和频率(单个或多个剂量)可以根据多种因素而变化，例如，哺乳动物是否患有其他疾病及其施用途径；接受者的体型、年龄、性别、健康、体重、体重指数和饮食；所治疗疾病的症状的性质和程度(例如癌症(例如前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如头、颈、或食道)、结直肠癌、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、b细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤)的症状)，同时治疗的类型，正在治疗的疾病的并发症或其他与健康相关的问题。其他治疗方案或药剂可以与申请人的发明的方法和化合物联合使用。调整和操纵确定的剂量(例如频率和持续时间)完全在本领域技术人员的能力范围内。
[0233]
对于本文所述的化合物或组合物，治疗有效量可以首先从细胞培养测定中确定。目标浓度将是能够实现的本文所述方法的一种或多种活性化合物的浓度(如使用本文所述方法或本领域已知方法测量)。
[0234]
如本领域众所周知的，还可以从动物模型中确定用于人的治疗有效量。例如，可以配制人剂量，以达到已经在动物中发现有效的浓度。如上所述，可以通过监测化合物的有效性并向上或向下调节剂量来调节人中的剂量。基于上述方法和其他方法调整剂量以在人中获得最大功效完全在普通技术人员的能力范围内。
[0235]
剂量可以根据患者的需要和所用化合物而变化。施用给患者的剂量应足以在一段时间内实现患者中的有益治疗应答。剂量的大小也将取决于任何不良副作用的存在、性质和程度。确定用于特定情况的适当剂量在从业者的技术范围内。通常，以小于化合物最佳剂量的较小剂量开始治疗。此后，以小增量增加剂量，直到在特定情况下达到最佳效果。
[0236]
剂量和间隔时间可单独调节，以提供对所治疗的特定临床适应症有效的给药化合物水平。这将提供与个体疾病状态的严重程度相称的治疗方案。
[0237]
利用本文提供的教导，可以计划有效的预防或治疗方案，所述方案不会引起实质性毒性并且有效地治疗特定患者所表现出的临床症状。所述计划应通过考虑诸如化合物效力、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的存在和严重程度、优选的施用方式以及所选药剂的毒性谱等因素来仔细选择活性化合物。
[0238]
如本文所用，术语“约”是指包括指定值的值的范围，本领域普通技术人员会认为所述范围与所述指定值合理地相似。在一些实施例中，术语“约”是指在使用本领域通常可接受的测量值情况下的标准偏差内。在一些实施例中，约是指延伸至指定值的 /-10％的范围。在一些实施例中，约是指指定值。
[0239]
如本文所述，根据现有技术要解决的目标技术问题是提供用于预防和治疗表达nkg2d配体(nkg2d-l )的疾病和病症的改善的组合物和方法。在一些实施例中，此类表达nkg2d配体的疾病和病症包括癌症和自身免疫性疾病。本文首次提供了对该问题的解决方案。重组蛋白的剪裁是细胞培养中的主要问题。通过重组dna技术在细菌和哺乳动物宿主细胞中产生的蛋白通常会在培养物中完全或部分降解。这对生物技术行业构成了重大挑战，在该行业中，通常需要以较低的成本实现效率和高生产率。因此，对于基于重组蛋白的疗法而言，降低剪裁的风险或将剪裁的水平降至最低至关重要。在一些实施例中，与现有技术的一种或多种构建体相比，本文所述的组合物在细胞内部已显示出出乎意料的优异的和较高的稳定性(例如较低的剪裁)(参见例如图5a-5c)。在一些实施例中，本文所述的组合物的组合和经修饰的cho细胞系(例如，包含灭活的或敲除的蛋白裂解酶基因(cho-mako)的cho细胞)的使用降低剪裁风险至最小水平。另外，本文所述的组合物已显示出优异的体外和体内治疗作用。在一些实施例中，本文所述的组合物已展示出在改善adcc活性方面的优异作用(参见，例如，图9a-9e)。在一些实施例中，本文所述的组合物已经显示出对所有nkg2d配体的以一位数字nm ec50的优异结合特异性(参见，例如，图11a-11b，图12a-12b)。在一些实施例中，本文所述的组合物在杀伤nkg2d-l 肿瘤中显示出优异的体内功效(参见，例如，图18、24a-24b)。同样重要的是，本文所述的组合物基于它们的可开发性评估在低风险和中等技术投入方面已显示出优异的可开发性。
[0240]
组合物
[0241]
因此，本文提供了包括两个单体的二聚体蛋白，其中每个单体包括(1)第一nkg2d肽或其变体；(2)第二nkg2d肽或其变体；(3)连接所述第一nkg2d肽或其变体和所述第二nkg2d肽或其变体的第一肽接头；以及(4)免疫球蛋白(ig)的可结晶区(fc区)。
[0242]
在一些实施例中，两个单体具有相同的氨基酸序列。
[0243]
在一些实施例中，两个单体具有不同的氨基酸序列。
[0244]
在一些实施例中，第一nkg2d肽或其变体和第二nkg2d肽或其变体具有相同的氨基酸序列。
[0245]
在一些实施例中，第一nkg2d肽或其变体和第二nkg2d肽或其变体具有不同的氨基酸序列。
[0246]
在一些实施例中，二聚体蛋白的每个nkg2d肽或其变体包含nkg2d序列的细胞外部分，例如人nkg2d的氨基酸残基78-216；鼠科nkg2d的78-232、94-232或92-232。在一些实施
例中，二聚体蛋白包含nkg2d的细胞外结构域的一部分。在一些实施例中，二聚体蛋白的nkg2d的细胞外结构域可在n末端、c末端或两者处缩短。在一些实施例中，用于产生二聚体蛋白的细胞外结构域的n末端可以相对于多肽的完整细胞外部分缩短一个或多个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、约30、约40、约50、约60个等。在一些实施例中，用于产生二聚体蛋白的细胞外结构域的c末端可以相对于多肽的完整细胞外部分缩短一个或多个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、约30、约40、约50、约60个等。以人nkg2d为例，二聚体蛋白可包含人nkg2d的细胞外结构域的片段，其中所述结构域的n末端开始于氨基酸残基79、80、81、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、约110、约120、约130、约140或约150。在一些实施例中，二聚体蛋白可包含nkg2d的细胞外结构域的片段，其中所述结构域的c末端结束于氨基酸残基231、230、229、228、227、226、225、224、223、222、221、220、219、218、217、216、215、214、213、212、211、210、209、208、207、206、205等。在nkg2d序列的细胞外结构域的每个末端处的这种缺失可以被组合。
[0247]
在一些实施例中，第一nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:1、2、3或4具有至少85％(例如85％、的86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0248]
在一些实施例中，第一nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:1具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0249]
在一些实施例中，第一nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:2具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0250]
在一些实施例中，第一nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:3具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0251]
在一些实施例中，第一nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:4具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0252]
在一些实施例中，第一nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:1、2、3或4的氨基酸序列。
[0253]
在一些实施例中，第一nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:1的氨基酸序列。
[0254]
在一些实施例中，第一nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:2的氨基酸序列。
[0255]
在一些实施例中，第一nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:3的氨基酸序列。
[0256]
在一些实施例中，第一nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:4的氨基酸序列。
[0257]
在一些实施例中，第二nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成
或由以下组成：与seq id no:1、2、3或4具有至少85％(例如85％、的86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0258]
在一些实施例中，第二nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:1具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0259]
在一些实施例中，第二nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:2具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0260]
在一些实施例中，第二nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:3具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0261]
在一些实施例中，第二nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:4具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0262]
在一些实施例中，第二nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:1、2、3或4的氨基酸序列。
[0263]
在一些实施例中，第二nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:1的氨基酸序列。
[0264]
在一些实施例中，第二nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:2的氨基酸序列。
[0265]
在一些实施例中，第二nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:3的氨基酸序列。
[0266]
在一些实施例中，第二nkg2d肽或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:4的氨基酸序列。
[0267]
在一些实施例中，所述fc区包含人免疫球蛋白g(igg)的fc区。在一些实施例中，所述fc区包含人igg1的fc区。在一些实施例中，所述fc区包含人igg2的fc区。在一些实施例中，所述fc区包含人igg3的fc区。在一些实施例中，所述fc区包含人igg4的fc区。在一些实施例中，所述fc区包含小鼠igg2a的fc区。在一些实施例中，所述fc区包含人igm的fc区。在一些实施例中，所述fc区包含人iga1的fc区。在一些实施例中，所述fc区包含人iga2的fc区。在一些实施例中，所述fc区包含人igd的fc区。在一些实施例中，所述fc区包含人ige的fc区。
[0268]
免疫球蛋白的fc区在介导免疫防御中起重要作用。fcyr在多种细胞类型(包括巨噬细胞、nk细胞、树突状细胞、b细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞)上广泛表达为跨膜糖蛋白。fc介导的活性包括通过fc-fcyr相互作用募集效应细胞。可以在功能上区分两类fc受体：激活性fc受体类别和抑制性fc受体类别。激活性fc受体包括人fcyria、fcyriia和fcyriiia，以及它们的鼠科直向同源物，即fcyri、fcyriii fcyriv。激活性fcyr介导adcc和adcp，诱导免疫复合物的内吞作用(这导致抗原呈递)，并有助于细胞因子和促炎因子的产生和释放。有关igg结构和作用机理的一般综述，请参见liu等人(2008；immunological reviews[免疫学综述],222:9-27)。在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白的fc部分是结合激活性fc受
体的结构域，并且在一些实施例中是激活性fc ig结构域并且包括允许二聚化的铰链区。
[0269]
可用于本公开的二聚体蛋白的fc部分可以容易地被调适使其具有物种特异性。在用于鼠科系统例如来自小鼠的细胞的一些实施例中，用于产生二聚体蛋白的fc片段是鼠科起源的。在一些实施例中，使用鼠科igg2a的fc片段。在用于人受试者的一些实施例中，用于产生二聚体蛋白的fc片段是人起源的。在一些实施例中，二聚体蛋白的每个单体包含激活性fc ig结构域。在一些实施例中，fc包含人免疫球蛋白(igg)的片段可结晶区(fc)。在一些实施例中，人免疫球蛋白是iggl。
[0270]
在一些实施例中，fc片段的突变体或同种异型体用于本文所述的二聚体蛋白中。已经描述了fc结构域内的许多有用的突变，其可以影响fc及其受体的相互作用、fc的效应子功能以及含fc分子的半衰期。这些包括在fc中的特定氨基酸取代和/或对碳水化合物部分的修饰。对于综述，参见例如liu等人,2008,immunological reviews[免疫学综述],222:9-27；nimmerjahn&ravetch,2007,curr.opin.immunol.[当前免疫学观点],19(2):239-45。在一些实施例中，本文使用的突变fc对fcyriiia但不对fcyriib表现出更高的亲和力，从而促进adcc。在一些实施例中，本文使用的突变fc对fcyriiia表现出更高亲和力以及对fcyriib的结合减少。在一些实施例中，本文使用的突变fc包括突变ser298ala/glu333ala/lys334ala。在一些实施例中，本文使用的突变fc包含突变ser239asp/ile332glu，预期其将起作用改善adcc。用于增强adcc的其他突变包括但不限于ser239asp/ala330leu/ile332glu、ser239asp/ser298ala/ile332ala和phe243leu/arg292pro/tyr300leu/val305ile/pro396leu。在一些实施例中，本文使用的突变fc是“fc沉默的”，即与效应细胞的相互作用最小。沉默的效应子功能可以通过抗体fc区的突变获得，并且在本领域已有描述：lala和n297a(strohl,w.,2009,curr.opin.biotechnol.[当前生物技术观点]vol.20(6):685-691)；和d265a(baudino等人,2008,j.immunol.[免疫学杂志]181:6664-69)还参见heusser等人,wo2012065950。fc沉默突变的实例包括在igg1 fc氨基酸序列中包含l234a和l235a突变的lala突变体、dapa(d265a、p329a)(参见，例如us 6,737,056)、n297a、danapa(d265a、n297a和p329a)和/或laladanaps(l234a、l235a、d265a、n297a和p331s)。
[0271]
在一些实施例中，fc区包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:5、6、63、64、65或68具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0272]
在一些实施例中，fc区包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:5具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0273]
在一些实施例中，fc区包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:6具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0274]
在一些实施例中，fc区包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:63具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0275]
在一些实施例中，fc区包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:64具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0276]
在一些实施例中，fc区包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:65具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0277]
在一些实施例中，fc区包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:68具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0278]
在一些实施例中，所述fc区包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:5、6、63、64、65或68的氨基酸序列。
[0279]
在一些实施例中，所述fc区包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:5的氨基酸序列。
[0280]
在一些实施例中，所述fc区包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:6的氨基酸序列。
[0281]
在一些实施例中，所述fc区包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:63的氨基酸序列。
[0282]
在一些实施例中，所述fc区包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:64的氨基酸序列。
[0283]
在一些实施例中，所述fc区包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:65的氨基酸序列。
[0284]
在一些实施例中，所述fc区包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:68的氨基酸序列。
[0285]
在一些实施例中，两个单体中的一个或两个从n末端到c末端包括所述第一nkg2d肽或其变体、所述第一肽接头、所述第二nkg2d肽或其变体和所述fc区。在一些实施例中，所述第二nkg2d肽或其变体在没有肽接头情况下直接与所述fc区融合。在一些实施例中，所述第二nkg2d肽或其变体通过第二肽接头与所述fc区连接。
[0286]
在一些实施例中，二聚体包括两个相同的单体，其中每个单体从n末端到c末端包括所述第一nkg2d肽或其变体、所述第一肽接头、所述第二nkg2d肽或其变体和所述fc区。在一些实施例中，所述第二nkg2d肽或其变体在没有肽接头情况下直接与所述fc区融合。在一些实施例中，所述第二nkg2d肽或其变体通过第二肽接头与所述fc区连接。
[0287]
在一些实施例中，两个单体中的一个或两个从n末端到c末端包括所述fc区、所述第一nkg2d肽或其变体、所述第一肽接头和所述第二nkg2d肽或变体区。在一些实施例中，所述fc区与所述第一nkg2d肽或其变体在没有肽接头情况下直接融合。在一些实施例中，所述fc区通过第二肽接头与所述第一nkg2d肽或其变体连接。
[0288]
在一些实施例中，二聚体包括两个相同的单体，其中每个单体从n末端到c末端包括所述fc区、所述第一nkg2d肽或其变体、所述第一肽接头和所述第二nkg2d肽或变体区。在一些实施例中，所述fc区与所述第一nkg2d肽或其变体在没有肽接头情况下直接融合。在一些实施例中，所述fc区通过第二肽接头与所述第一nkg2d肽或其变体连接。
[0289]
在一些实施例中，两个单体中的一个或两个还包含一个或两个另外的nkg2d肽或其变体。
[0290]
在一些实施例中，另外的一个或两个nkg2d肽或其变体中的每一个包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:1、2、3或4具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0291]
在一些实施例中，所述另外的一个或两个nkg2d肽中的每一个或其变体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:1、2、3或4的氨基酸序列。
[0292]
在一些实施例中，本文使用的接头是肽接头。在一些实施例中，接头是柔性肽接头。在一些实施例中，柔性肽接头(例如，第一肽接头或第二肽接头)的长度是约20或更少(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个氨基酸。在一些实施例中，肽接头包含约12个或更少个氨基酸残基，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。在一些实施例中，肽接头(例如，第一肽接头或第二肽接头)的长度是约20个氨基酸。在一些实施例中，肽接头(例如，第一肽接头或第二肽接头)的长度范围是约4至约16(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16)个氨基酸。在一些实施例中，肽接头(例如，第一肽接头或第二肽接头)的长度是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些实施例中，肽接头(例如，第一肽接头或第二肽接头)的长度长于25个氨基酸。
[0293]
在一些实施例中，肽接头(例如，第一肽接头或第二肽接头)包含以下氨基酸中的两个或更多个：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和脯氨酸。在一些实施例中，肽接头是甘氨酸-丝氨酸接头。在一些实施例中，甘氨酸-丝氨酸接头由式(gs)n表示，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12(seq id no:7)。在一些实施例中，肽接头是由式(ggggs)n表示的g4s接头，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:8)。在一些实施例中，肽接头是由式(gggga)n表示的g4a接头，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:12)。在一些实施例中，肽接头是由式(ggggp)n表示的g4p接头，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:13)。在一些实施例中，肽接头是由式(ggga)n表示的g3a接头，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:14)。在一些实施例中，肽接头由式(gggs)n表示，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:9)。在一些实施例中，甘氨酸-丝氨酸接头包含gggsgggs的氨基酸序列(seq id no:10)。在一些实施例中，甘氨酸-丝氨酸接头包含ggggs的氨基酸序列(seq id no:11)。在一些实施例中，甘氨酸-丝氨酸接头包含gggs的氨基酸序列(seq id no:66)。
[0294]
在一些实施例中，第一肽接头的长度是约20或更少个氨基酸。在一些实施例中，第一肽接头包含约12或更少个氨基酸残基，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。在一些实施例中，第一肽接头的长度是20个氨基酸。在一些实施例中，第一肽接头的长度是约4至约16个氨基酸。在一些实施例中，第一肽接头的长度是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些实施例中，第一肽接头的长度是约2至约25个氨基酸。在一些实施例中，第一肽接头的长度长于25个氨基酸。在一些实施例中，第一肽接头包含以下氨基酸中的两个或更多个：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和脯氨酸。在一些实施例中，第一肽接头是甘氨酸-丝氨酸接头。在一些实施例中，第一肽接头由式(gs)n表示，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12(seq id no:7)。在一些实施例中，第一肽接头是由式(ggggs)n表示的g4s接头，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:8)。在一些实施例中，第一肽接头是由式(gggga)n表示的g4a接头，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:12)。在一些实施例中，
第一肽接头是由式(ggggp)n表示的g4p接头，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:13)。在一些实施例中，第一肽接头是由式(ggga)n表示的g3a接头，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:14)。在一些实施例中，第一肽接头由式(gggs)n表示，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:9)。在一些实施例中，第一肽接头包含gggsgggs的氨基酸序列(seq id no:10)。在一些实施例中，第一肽接头包含ggggs的氨基酸序列(seq id no:11)。在一些实施例中，第一肽接头包含gggs的氨基酸序列(seq id no:66)。
[0295]
在一些实施例中，第二肽接头的长度是约20或更少个氨基酸。在一些实施例中，第二肽接头包含约12或更少个氨基酸残基，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。在一些实施例中，第二肽接头的长度是20个氨基酸。在一些实施例中，第二肽接头的长度是约4至约16个氨基酸。在一些实施例中，第二肽接头的长度是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些实施例中，第二肽接头的长度是约2至约25个氨基酸。在一些实施例中，第二肽接头的长度长于25个氨基酸。在一些实施例中，第二肽接头包含以下氨基酸中的两个或更多个：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和脯氨酸。在一些实施例中，第二肽接头是甘氨酸-丝氨酸接头。在一些实施例中，第二肽接头由式(gs)n表示，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12(seq id no:7)。在一些实施例中，第二肽接头是由式(ggggs)n表示的g4s接头，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:8)。在一些实施例中，第二肽接头是由式(gggga)n表示的g4a接头，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:12)。在一些实施例中，第二肽接头是由式(ggggp)n表示的g4p接头，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:13)。在一些实施例中，第二肽接头是由式(ggga)n表示的g3a接头，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:14)。在一些实施例中，第二肽接头由式(gggs)n表示，其中n是1、2、3、4或5(seq id no:9)。在一些实施例中，第二肽接头包含gggsgggs的氨基酸序列(seq id no:10)。在一些实施例中，第二肽接头包含ggggs的氨基酸序列(seq id no:11)。在一些实施例中，第二肽接头包含gggs的氨基酸序列(seq id no:66)。
[0296]
在一些实施例中，肽接头(例如，第一肽接头和/或第二肽接头)包括蛋白酶依赖性可切割位点。蛋白酶可切割的肽接头的实例包括但不限于mmp敏感接头ggplgl w agg(seq id no:15)和因子xa敏感接头iegr(seq id no:16)。本领域技术人员将认识到，多种可切割序列可用于本文提供的接头。
[0297]
在一些实施例中，连接分子或接头可以是非肽接头。如本文所用，非肽接头是生物相容性聚合物，其包括彼此连接的两个或更多个重复单元。非肽聚合物的实例包括但不限于：聚乙二醇(peg)、聚丙二醇(ppg)、共聚(乙二醇/丙二醇)、聚氧乙烯(poe)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙基醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂质聚合物、几丁质、透明质酸和肝素。对于可用于fc融合分子的非肽接头的更详细描述，参见，例如，wo/2006/107124，其通过引用并入本文。在一些实施例中，这样的接头将具有约1kda至50kda的分子量范围，这取决于特定的接头。在一些实施例中，典型的peg具有约1至5kda的分子量，并且聚乙二醇具有约5kda至50kda，并且更优选地约10kda至40kda的分子量。
[0298]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61或69具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0299]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:17具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0300]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:19具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0301]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:21具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0302]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:23具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0303]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:25具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0304]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:27具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0305]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:29具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0306]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:31具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0307]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:33具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0308]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:35具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0309]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:37具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0310]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:39具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0311]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:41具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0312]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:43具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0313]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:45具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0314]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:47具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0315]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:49具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0316]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:51具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0317]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:53具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0318]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:55具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0319]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:57具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0320]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:59具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0321]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:61具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0322]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:69具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0323]
在一些实施例中，二聚体包括两个单体，其中每个单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：与seq id no:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61或69具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的氨基酸序列。
[0324]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：
seq id no:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61或69的氨基酸序列。
[0325]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:17的氨基酸序列。
[0326]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:19的氨基酸序列。
[0327]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:21的氨基酸序列。
[0328]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:23的氨基酸序列。
[0329]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:25的氨基酸序列。
[0330]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:27的氨基酸序列。
[0331]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:29的氨基酸序列。
[0332]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:31的氨基酸序列。
[0333]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:33的氨基酸序列。
[0334]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:35的氨基酸序列。
[0335]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:37的氨基酸序列。
[0336]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:39的氨基酸序列。
[0337]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:41的氨基酸序列。
[0338]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:43的氨基酸序列。
[0339]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:45的氨基酸序列。
[0340]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:47的氨基酸序列。
[0341]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:49的氨基酸序列。
[0342]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:51的氨基酸序列。
[0343]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：
seq id no:53的氨基酸序列。
[0344]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:55的氨基酸序列。
[0345]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:57的氨基酸序列。
[0346]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:59的氨基酸序列。
[0347]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:61的氨基酸序列。
[0348]
在一些实施例中，单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:69的氨基酸序列。
[0349]
在一些实施例中，二聚体包括两个单体，其中每个单体包含以下，或可替代地基本上由以下组成或由以下组成：seq id no:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61或69的氨基酸序列。
[0350]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62或70具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0351]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:18具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0352]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:20具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0353]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:22具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0354]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:24具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0355]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:26具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0356]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:28具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0357]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:30具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0358]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:32具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0359]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:34具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0360]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:36具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0361]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:38具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0362]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:40具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0363]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:42具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0364]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:44具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0365]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:46具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0366]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:48具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0367]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:50具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0368]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:52具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0369]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:54具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0370]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:56具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0371]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:58具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0372]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:60具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0373]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:62具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0374]
在一些实施例中，单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:70具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0375]
在一些实施例中，二聚体包括两个单体，其中每个单体由核酸序列编码，所述核酸序列包含以下或由以下组成：与seq id no:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62或70具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的核酸序列。
[0376]
在一些实施例中，单体由包含以下或由以下组成的核酸序列编码：seq id no:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62或70。
[0377]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:18或由其组成的核酸序列编码。
[0378]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:20或由其组成的核酸序列编码。
[0379]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:22或由其组成的核酸序列编码。
[0380]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:24或由其组成的核酸序列编码。
[0381]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:26或由其组成的核酸序列编码。
[0382]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:28或由其组成的核酸序列编码。
[0383]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:30或由其组成的核酸序列编码。
[0384]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:32或由其组成的核酸序列编码。
[0385]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:34或由其组成的核酸序列编码。
[0386]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:36或由其组成的核酸序列编码。
[0387]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:38或由其组成的核酸序列编码。
[0388]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:40或由其组成的核酸序列编码。
[0389]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:42或由其组成的核酸序列编码。
[0390]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:44或由其组成的核酸序列编码。
[0391]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:46或由其组成的核酸序列编码。
[0392]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:48或由其组成的核酸序列编码。
[0393]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:50或由其组成的核酸序列编码。
[0394]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:52或由其组成的核酸序列编码。
[0395]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:54或由其组成的核酸序列编码。
[0396]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:56或由其组成的核酸序列编码。
[0397]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:58或由其组成的核酸序列编码。
[0398]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:60或由其组成的核酸序列编码。
[0399]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:62或由其组成的核酸序列编码。
[0400]
在一些实施例中，单体由包含seq id no:70或由其组成的核酸序列编码。
[0401]
在一些实施例中，二聚体包括两个单体，其中每个单体由包含以下或由以下组成的核酸序列编码：seq id no:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62或70。
[0402]
在一些实施例中，所述两个单体是共价连接的。例如，单体的第一生物缀合物反应性基团(例如，-nh2、-cooh、-n-羟基琥珀酰亚胺或-马来酰亚胺)和另一个单体的第二生物缀合物反应性基团(例如，巯基、含硫氨基酸、胺、含胺侧链的氨基酸或羧酸酯)之间的在此提供的缀合物可以是直接的，例如通过共价键或接头。在一些实施例中，所述单体通过cys-cys桥连接。
[0403]
在一些实施例中，所述二聚体蛋白还包含药物部分。
[0404]
如本文所用，“药物部分”是指旨在递送至靶细胞(例如癌细胞)的治疗剂。通常，药物部分与本文所述的二聚体蛋白的单体的羧基末端缀合(例如，直接或间接共价结合)。然而，本领域技术人员认识到在一些实施例中，药物部分与本文所述的二聚体蛋白的单体的氨基末端缀合。“药物部分”的实例包括药物(例如小分子)、毒素(例如淋巴毒素家族的分子)、放射性核素、酶、细胞因子、趋化因子、针对激活化合物或阻断血管生成的抗体单链可变片段、或基本上任何抗肿瘤化合物。在一些实施例中，药物部分直接与本文所述的二聚体蛋白的单体的氨基末端和/或羧基末端融合。
[0405]
在一些实施例中，药物部分包含细胞因子或其功能部分。细胞因子是能够调节免疫细胞功能的蛋白和肽。细胞因子的“功能部分”是保留调节免疫细胞功能(例如结合一种或多种细胞因子受体)的能力的细胞因子片段。细胞因子的实例包括但不限于转化生长因子β(tgfβ)、干扰素α(ifn-a)、干扰素β(ifn-β)和干扰素-γ(ifn-γ)、白介素(例如il-1至il-36、特别是il-2、il-5、il-6、il-7、il-10、il-12、il-15和il-18)、肿瘤坏死因子(例如tnf-α和tnf-β)、促红细胞生成素(epo)、mip3a、单核细胞趋化蛋白(mcp)-l、细胞内粘附分子(icam)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。在一些实施例中，药物部分包含选自下组的细胞因子，该组由以下组成：tgfβ、il-2、il-4、il-12、il-15、il-18、il-21和ifn-α。
[0406]
在一些实施例中，药物部分包含细胞因子/细胞因子受体异复合物。细胞因子/细胞因子受体异复合物是本领域已知的，并且描述于例如rowley等人,eur j immunol.[欧洲免疫学杂志]2009年2月；39(2):491-506。在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白包括包含il-15(例如，genbank aax37025)/il-15ra(例如，genbank aap69528.1)异复合物的药物部分。在一些实施例中，药物部分包含与il-15(genbank aax37025)的氨基酸22-135融合的人il-15受体α(hil15ra，genbank aap69528.1)的氨基酸31-107。在一些实施例中，il-15和il-15ra被接头，例如20-氨基酸(g4s)4(seq id no:3)接头分开。在实例部分中进一步描述了包含il-15/il-15ra异复合物的二聚体nkg2d-fc嵌合体。在一些实施例中，二聚体nkg2d-fc嵌合体包括包含il-12p35和il-12p40的异复合物的药物部分。在一些实施例中，il-12p35和il-12p40被本文所述的肽接头分开。在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白包括包含il-23pl9和il-23p40的异复合物的药物部分。在一些实施例中，il-23pl9和il-23p40
被本文所述的肽接头分开。在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白包括包含il-27p28和eb 1的异复合物的药物部分。在一些实施例中，il-27p28和eb 1被本文所述的肽接头分开。在一些实施例中，细胞因子/细胞因子受体异复合物的每个亚基在本文所述的二聚体蛋白的不同单体上。
[0407]
在一些实施例中，药物部分是抗体单链可变片段(scfv)。如本文所用，“抗体单链可变片段”是指免疫球蛋白的重链(vh)和轻链(vl)的可变区与短接头肽连接的融合蛋白。尽管去除了恒定区并引入了接头，scfv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。在一些实施例中，scfv结合免疫检查点蛋白(例如，pd1或ctla4)。在一些实施例中，scfv阻断血管生成(例如，结合血管生成的调节剂，例如vegf)。
[0408]
在一些实施例中，药物部分是趋化因子。如本文所用，“趋化因子”是指刺激白细胞募集的低分子量蛋白。通常，趋化因子是继发性促炎性介质，其由主要促炎性介质例如白介素-1(il-1)或肿瘤坏死因子(tnf)诱导。趋化因子可分为四个家族：cc趋化因子(例如ccll至ccl-28)、cxc(例如cxcl1至cxcl17)、c(例如xcl1、xcl2)和cx3c(cx3cl1)。
[0409]
在一些实施例中，药物部分是小分子。如本文所用，“小分子”是指在实验室中合成或在自然界中发现的非肽的非寡聚的有机化合物。小分子药物的非限制性实例包括小分子激酶抑制剂(例如依维莫司、吉非替尼、伊马替尼等)、布罗莫结构域抑制剂(例如jq1、1-bet 151、rvx-208等)、抗生素(例如卡那霉素、新霉素、环丙沙星等)和抗病毒药(例如利巴韦林、金刚乙胺、齐多夫定等)。在一些实施例中，小分子是抗肿瘤化合物。抗肿瘤化合物在本公开的其他地方进一步详细讨论。
[0410]
在一些实施例中，药物部分是放射性核素。如本文所用，“放射性核素”是指医学上有用的放射性核素。放射性核素的实例包括：
99m
tc、
188
re、
186
re、
153
sm、
166
ho、
90
y、
89
sr、
67
ga、
68
ga、min、
183
gd、
59
fe、
225
ac、
212
bi、
211
at、
45
ti、
60
cu、
61
cu和
67
cu。
[0411]
本文还提供了包含核酸序列的分离的多核苷酸，所述核酸序列包含以下或由以下组成：seq id no:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62或70。
[0412]
本文还提供了包含本文所述的分离的多核苷酸的载体。
[0413]
在一些实施例中，本文使用的示例性载体包括但不限于ep 3027646b1或wo 2009/080720中公开的那些，其各自的内容通过引用并入本文。
[0414]
本文还提供了包含本文所述的二聚体蛋白、本文所述的分离的多核苷酸或本文所述的载体的组合物。
[0415]
在一些实施例中，所述组合物还包含药学上可接受的载剂。“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载剂”是指有助于向受试者施用活性剂并被其吸收的物质，并且可以被包括在本公开的组合物中而不会对患者产生明显的不良毒理作用。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、nacl、生理盐水溶液、乳酸盐林格溶液、生理蔗糖、生理葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、调味剂、盐溶液(如林格氏溶液)、醇、油、明胶、碳水化合物(例如乳糖、直链淀粉或淀粉)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷和色素等。可以对这些制剂进行灭菌，并且如果需要，可以与不会有害地与本公开的化合物反应的辅助剂(如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂和/或芳香族物质等)混合。本领域技术人员将认识到其他药物赋形剂可用于本公开。
[0416]
本文还提供包含本文所述的二聚体蛋白、本文所述的分离的多核苷酸、本文所述的载体或本文所述的组合物的细胞。
[0417]
在一些实施例中，所述细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
[0418]
在一些实施例中，所述细胞是经修饰的cho细胞。
[0419]
在一些实施例中，所述经修饰的cho细胞包含灭活的蛋白裂解酶基因或蛋白裂解酶基因的敲除(缺失)。在一些实施例中，经修饰的cho细胞包含wo 2015166427中描述的细胞，其内容通过引用并入本文。用于生产细胞系的合适选择方法公开于wo 2010/022961和wo2015/015419，其各自的内容通过引用并入本文。
[0420]
在一些实施例中，由经修饰的cho细胞产生的本文所述的二聚体蛋白比由其他类型的细胞系(例如，hek细胞)产生的二聚体蛋白更有效(参见，例如，图9)。在一些实施例中，由经修饰的cho细胞产生的本文所述的二聚体蛋白相比于其他类型的细胞系产生的二聚体蛋白效力高至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更高。在一些实施例中，可以根据本领域已知的任何方法通过其adcc活性来测量本文所述的二聚体蛋白的效力。因此，在一些实施例中，由经修饰的cho细胞产生的本文所述的二聚体蛋白具有的adcc活性相比于其他类型的细胞系产生的二聚体蛋白的adcc活性高至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更高。在一些实施例中，可以根据本领域已知的任何方法通过动力学结合亲和常数(kd)来测量二聚体蛋白的效力。因此，在一些实施例中，由经修饰的cho细胞产生的本文所述的二聚体蛋白具有的针对nkg2d配体的kd相比于其他类型的细胞系产生的二聚体蛋白的kd低至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10倍或更低(即更强)。
[0421]
在一些实施例中，由经修饰的cho细胞产生的本文所述的二聚体蛋白具有比由其他类型的细胞系(例如，hek细胞)产生的那些更好的体内药代动力学(pk)性质(参见，例如，图20)。在一些实施例中，pk性质包括但不限于分布体积(vd)，施用后药物的峰血浆浓度(c最大)，达到c最大的时间(t最大)，每单位时间药物清除的血浆量(cl)，浓度-时间曲线的积分(单次给药后或处于稳态)(曲线下面积，auc)，药物浓度达到其原始值的一半所需的时间(t
1/2
)。
[0422]
在一些实施例中，由经修饰的cho细胞产生的本文所述的二聚体蛋白的体内pk值比其他类型的细胞系产生的二聚体蛋白的pk值好至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％。在一些实施例中，可以基于根据本领域已知的方法计算的vd、t
1/2
和/或auc来确定pk值。
[0423]
本文提供由本文所述的细胞产生的二聚体蛋白。在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白或由本文所述的细胞产生的二聚体蛋白被糖基化。在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白的或由本文所述的细胞产生的二聚体蛋白的fc区被糖基化。在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白或由本文所述的细胞产生的二聚体蛋白被去岩藻糖基化。在一些实
施例中，本文所述的二聚体蛋白的或由本文所述的细胞产生的二聚体蛋白的fc区被去岩藻糖基化。
[0424]
在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白或由本文所述的细胞产生的二聚体蛋白包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个糖基化位点。
[0425]
在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白或由本文所述的细胞产生的二聚体蛋白包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个岩藻糖基化位点。
[0426]
在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白或由本文所述的细胞产生的二聚体蛋白的每个单体的糖基化水平是至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0427]
在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白或由本文所述的细胞产生的二聚体蛋白的每个单体的去岩藻糖基化水平是至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0428]
在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白或由本文所述的细胞产生的二聚体蛋白的每个fc区的糖基化水平是至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0429]
在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白或由本文所述的细胞产生的二聚体蛋白的每个fc区的去岩藻糖基化水平是至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、
59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0430]
在实施例中，本文所述的糖基化的二聚体蛋白与本文所述的较少或没有糖基化的二聚体蛋白相比具有更高的(例如，至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10倍更大)对nkg2d配体的结合亲和力。
[0431]
在一些实施例中，本文所述的糖基化的二聚体蛋白与本文所述的较少或没有糖基化的二聚体蛋白相比具有更高的(例如，至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10倍或更大)adcc活性。
[0432]
在一些实施例中，本文所述的具有较高去岩藻糖基化水平的二聚体蛋白与本文所述的具有较低去岩藻糖基化水平的二聚体蛋白相比具有更高的(例如，至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更大)对fc受体(cd16)的结合亲和力。
[0433]
在一些实施例中，本文所述的具有较高去岩藻糖基化水平的二聚体蛋白与本文所述的具有较低去岩藻糖基化水平的二聚体蛋白相比具有更高的(例如，至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10倍或更大)adcc活性。
[0434]
糖基化水平或去岩藻糖基化水平可以通过本领域已知的任何方法来确定，例如通过lc-ms或2ab-hilic(2-氨基苯甲酰胺(2-ab)标记的n-聚糖)。此外，产生具有不同的去岩藻糖基化水平的蛋白的方法是本领域已知的。例如，可以在缺乏岩藻糖基化酶的细胞中产生蛋白，也可以在包含rmd(其破坏岩藻糖基化)的细胞中产生蛋白。
[0435]
在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白具有低于约20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的剪裁水平。在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白具有低于约5％、4％、3％、2％或1％的剪裁
水平。
[0436]
在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白具有的剪裁水平比现有技术的二聚体构建体的剪裁水平低至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
[0437]
在一些实施例中，在如本文所述的经修饰的cho细胞中产生的二聚体蛋白具有的剪裁水平比在不同的细胞类型中产生的二聚体蛋白的剪裁水平低至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
[0438]
剪裁水平可以根据本领域已知的任何方法来确定，例如，实例4中描述的方法。
[0439]
在本公开描述的任何实施例中，本文所述的二聚体蛋白能够结合nkg2d受体的内源性配体。人中已知的nkg2d配体包括mica、micb、ulbp1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5和ulbp6。在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白能够结合一种以上(例如2、3、4、5、6、7或8种)类型的nkg2d受体配体。
[0440]
在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白以一位数字nm ec50结合所有八种配体(参见例如图11)。在一些实施例中，二聚体分子对其配体的结合亲和力(kd)是约10e-06m至10e-12m。在一些实施例中，本文所述的二聚体分子的kd是约0.01nm至50nm-例如约0.06至12.97nm(例如约0.06nm、0.07nm、0.08nm、0.09nm、0.1nm、0.11nm、0.12nm、0.13nm、0.14nm、0.15nm、0.16nm、0.17nm、0.18nm、0.19nm、0.2nm、0.21nm、0.22nm、0.23nm、0.24nm、0.25nm、0.26nm、0.27nm、0.28nm、0.29nm、0.3nm、0.31nm、0.32nm、0.33nm、0.34nm、0.35nm、0.36nm、0.37nm、0.38nm、0.39nm、0.4nm、0.41nm、0.42nm、0.43nm、0.44nm、0.45nm、0.46nm、0.47nm、0.48nm、0.49nm、0.5nm、0.51nm、0.52nm、0.53nm、0.54nm、0.55nm、0.56nm、0.57nm、0.58nm、0.59nm、0.6nm、0.61nm、0.62nm、0.63nm、0.64nm、0.65nm、0.66nm、0.67nm、0.68nm、0.69nm、0.7nm、0.71nm、0.72nm、0.73nm、0.74nm、0.75nm、0.76nm、0.77nm、0.78nm、0.79nm、0.8nm、0.81nm、0.82nm、0.83nm、0.84nm、0.85nm、0.86nm、0.87nm、0.88nm、0.89nm、0.9nm、0.91nm、0.92nm、0.93nm、0.94nm、0.95nm、0.96nm、0.97nm、0.98nm、0.99nm、1nm、1.01nm、1.02nm、1.03nm、1.04nm、1.05nm、1.06nm、1.07nm、1.08nm、1.09nm、1.1nm、1.11nm、1.12nm、1.13nm、1.14nm、1.15nm、1.16nm、1.17nm、1.18nm、1.19nm、1.2nm、1.21nm、1.22nm、1.23nm、1.24nm、1.25nm、1.26nm、1.27nm、1.28nm、1.29nm、1.3nm、1.31nm、1.32nm、1.33nm、1.34nm、1.35nm、1.36nm、1.37nm、1.38nm、1.39nm、1.4nm、1.41nm、1.42nm、1.43nm、1.44nm、1.45nm、1.46nm、
1.47nm、1.48nm、1.49nm、1.5nm、1.51nm、1.52nm、1.53nm、1.54nm、1.55nm、1.56nm、1.57nm、1.58nm、1.59nm、1.6nm、1.61nm、1.62nm、1.63nm、1.64nm、1.65nm、1.66nm、1.67nm、1.68nm、1.69nm、1.7nm、1.71nm、1.72nm、1.73nm、1.74nm、1.75nm、1.76nm、1.77nm、1.78nm、1.79nm、1.8nm、1.81nm、1.82nm、1.83nm、1.84nm、1.85nm、1.86nm、1.87nm、1.88nm、1.89nm、1.9nm、1.91nm、1.92nm、1.93nm、1.94nm、1.95nm、1.96nm、1.97nm、1.98nm、1.99nm、2nm、2.01nm、2.02nm、2.03nm、2.04nm、2.05nm、2.06nm、2.07nm、2.08nm、2.09nm、2.1nm、2.11nm、2.12nm、2.13nm、2.14nm、2.15nm、2.16nm、2.17nm、2.18nm、2.19nm、2.2nm、2.21nm、2.22nm、2.23nm、2.24nm、2.25nm、2.26nm、2.27nm、2.28nm、2.29nm、2.3nm、2.31nm、2.32nm、2.33nm、2.34nm、2.35nm、2.36nm、2.37nm、2.38nm、2.39nm、2.4nm、2.41nm、2.42nm、2.43nm、2.44nm、2.45nm、2.46nm、2.47nm、2.48nm、2.49nm、2.5nm、2.51nm、2.52nm、2.53nm、2.54nm、2.55nm、2.56nm、2.57nm、2.58nm、2.59nm、2.6nm、2.61nm、2.62nm、2.63nm、2.64nm、2.65nm、2.66nm、2.67nm、2.68nm、2.69nm、2.7nm、2.71nm、2.72nm、2.73nm、2.74nm、2.75nm、2.76nm、2.77nm、2.78nm、2.79nm、2.8nm、2.81nm、2.82nm、2.83nm、2.84nm、2.85nm、2.86nm、2.87nm、2.88nm、2.89nm、2.9nm、2.91nm、2.92nm、2.93nm、2.94nm、2.95nm、2.96nm、2.97nm、2.98nm、2.99nm、3nm、3.01nm、3.02nm、3.03nm、3.04nm、3.05nm、3.06nm、3.07nm、3.08nm、3.09nm、3.1nm、3.11nm、3.12nm、3.13nm、3.14nm、3.15nm、3.16nm、3.17nm、3.18nm、3.19nm、3.2nm、3.21nm、3.22nm、3.23nm、3.24nm、3.25nm、3.26nm、3.27nm、3.28nm、3.29nm、3.3nm、3.31nm、3.32nm、3.33nm、3.34nm、3.35nm、3.36nm、3.37nm、3.38nm、3.39nm、3.4nm、3.41nm、3.42nm、3.43nm、3.44nm、3.45nm、3.46nm、3.47nm、3.48nm、3.49nm、3.5nm、3.51nm、3.52nm、3.53nm、3.54nm、3.55nm、3.56nm、3.57nm、3.58nm、3.59nm、3.6nm、3.61nm、3.62nm、3.63nm、3.64nm、3.65nm、3.66nm、3.67nm、3.68nm、3.69nm、3.7nm、3.71nm、3.72nm、3.73nm、3.74nm、3.75nm、3.76nm、3.77nm、3.78nm、3.79nm、3.8nm、3.81nm、3.82nm、3.83nm、3.84nm、3.85nm、3.86nm、3.87nm、3.88nm、3.89nm、3.9nm、3.91nm、3.92nm、3.93nm、3.94nm、3.95nm、3.96nm、3.97nm、3.98nm、3.99nm、4nm、4.01nm、4.02nm、4.03nm、4.04nm、4.05nm、4.06nm、4.07nm、4.08nm、4.09nm、4.1nm、4.11nm、4.12nm、4.13nm、4.14nm、4.15nm、4.16nm、4.17nm、4.18nm、4.19nm、4.2nm、4.21nm、4.22nm、4.23nm、4.24nm、4.25nm、4.26nm、4.27nm、4.28nm、4.29nm、4.3nm、4.31nm、4.32nm、4.33nm、4.34nm、4.35nm、4.36nm、4.37nm、4.38nm、4.39nm、4.4nm、4.41nm、4.42nm、4.43nm、4.44nm、4.45nm、4.46nm、4.47nm、4.48nm、4.49nm、4.5nm、4.51nm、4.52nm、4.53nm、4.54nm、4.55nm、4.56nm、4.57nm、4.58nm、4.59nm、4.6nm、4.61nm、4.62nm、4.63nm、4.64nm、4.65nm、4.66nm、4.67nm、4.68nm、4.69nm、4.7nm、4.71nm、4.72nm、4.73nm、4.74nm、4.75nm、4.76nm、4.77nm、4.78nm、4.79nm、4.8nm、4.81nm、4.82nm、4.83nm、4.84nm、4.85nm、4.86nm、4.87nm、4.88nm、4.89nm、4.9nm、4.91nm、4.92nm、4.93nm、4.94nm、4.95nm、4.96nm、4.97nm、4.98nm、4.99nm、5nm、5.01nm、5.02nm、5.03nm、5.04nm、5.05nm、5.06nm、5.07nm、5.08nm、5.09nm、5.1nm、5.11nm、5.12nm、5.13nm、5.14nm、5.15nm、5.16nm、5.17nm、5.18nm、5.19nm、5.2nm、5.21nm、5.22nm、5.23nm、5.24nm、5.25nm、5.26nm、5.27nm、5.28nm、5.29nm、5.3nm、5.31nm、5.32nm、5.33nm、5.34nm、5.35nm、5.36nm、5.37nm、5.38nm、5.39nm、5.4nm、5.41nm、5.42nm、5.43nm、5.44nm、5.45nm、5.46nm、5.47nm、5.48nm、5.49nm、5.5nm、5.51nm、5.52nm、5.53nm、5.54nm、5.55nm、5.56nm、5.57nm、5.58nm、5.59nm、5.6nm、5.61nm、5.62nm、5.63nm、5.64nm、5.65nm、5.66nm、5.67nm、5.68nm、5.69nm、5.7nm、5.71nm、5.72nm、5.73nm、5.74nm、5.75nm、
5.76nm、5.77nm、5.78nm、5.79nm、5.8nm、5.81nm、5.82nm、5.83nm、5.84nm、5.85nm、5.86nm、5.87nm、5.88nm、5.89nm、5.9nm、5.91nm、5.92nm、5.93nm、5.94nm、5.95nm、5.96nm、5.97nm、5.98nm、5.99nm、6nm、6.01nm、6.02nm、6.03nm、6.04nm、6.05nm、6.06nm、6.07nm、6.08nm、6.09nm、6.1nm、6.11nm、6.12nm、6.13nm、6.14nm、6.15nm、6.16nm、6.17nm、6.18nm、6.19nm、6.2nm、6.21nm、6.22nm、6.23nm、6.24nm、6.25nm、6.26nm、6.27nm、6.28nm、6.29nm、6.3nm、6.31nm、6.32nm、6.33nm、6.34nm、6.35nm、6.36nm、6.37nm、6.38nm、6.39nm、6.4nm、6.41nm、6.42nm、6.43nm、6.44nm、6.45nm、6.46nm、6.47nm、6.48nm、6.49nm、6.5nm、6.51nm、6.52nm、6.53nm、6.54nm、6.55nm、6.56nm、6.57nm、6.58nm、6.59nm、6.6nm、6.61nm、6.62nm、6.63nm、6.64nm、6.65nm、6.66nm、6.67nm、6.68nm、6.69nm、6.7nm、6.71nm、6.72nm、6.73nm、6.74nm、6.75nm、6.76nm、6.77nm、6.78nm、6.79nm、6.8nm、6.81nm、6.82nm、6.83nm、6.84nm、6.85nm、6.86nm、6.87nm、6.88nm、6.89nm、6.9nm、6.91nm、6.92nm、6.93nm、6.94nm、6.95nm、6.96nm、6.97nm、6.98nm、6.99nm、7nm、7.01nm、7.02nm、7.03nm、7.04nm、7.05nm、7.06nm、7.07nm、7.08nm、7.09nm、7.1nm、7.11nm、7.12nm、7.13nm、7.14nm、7.15nm、7.16nm、7.17nm、7.18nm、7.19nm、7.2nm、7.21nm、7.22nm、7.23nm、7.24nm、7.25nm、7.26nm、7.27nm、7.28nm、7.29nm、7.3nm、7.31nm、7.32nm、7.33nm、7.34nm、7.35nm、7.36nm、7.37nm、7.38nm、7.39nm、7.4nm、7.41nm、7.42nm、7.43nm、7.44nm、7.45nm、7.46nm、7.47nm、7.48nm、7.49nm、7.5nm、7.51nm、7.52nm、7.53nm、7.54nm、7.55nm、7.56nm、7.57nm、7.58nm、7.59nm、7.6nm、7.61nm、7.62nm、7.63nm、7.64nm、7.65nm、7.66nm、7.67nm、7.68nm、7.69nm、7.7nm、7.71nm、7.72nm、7.73nm、7.74nm、7.75nm、7.76nm、7.77nm、7.78nm、7.79nm、7.8nm、7.81nm、7.82nm、7.83nm、7.84nm、7.85nm、7.86nm、7.87nm、7.88nm、7.89nm、7.9nm、7.91nm、7.92nm、7.93nm、7.94nm、7.95nm、7.96nm、7.97nm、7.98nm、7.99nm、8nm、8.01nm、8.02nm、8.03nm、8.04nm、8.05nm、8.06nm、8.07nm、8.08nm、8.09nm、8.1nm、8.11nm、8.12nm、8.13nm、8.14nm、8.15nm、8.16nm、8.17nm、8.18nm、8.19nm、8.2nm、8.21nm、8.22nm、8.23nm、8.24nm、8.25nm、8.26nm、8.27nm、8.28nm、8.29nm、8.3nm、8.31nm、8.32nm、8.33nm、8.34nm、8.35nm、8.36nm、8.37nm、8.38nm、8.39nm、8.4nm、8.41nm、8.42nm、8.43nm、8.44nm、8.45nm、8.46nm、8.47nm、8.48nm、8.49nm、8.5nm、8.51nm、8.52nm、8.53nm、8.54nm、8.55nm、8.56nm、8.57nm、8.58nm、8.59nm、8.6nm、8.61nm、8.62nm、8.63nm、8.64nm、8.65nm、8.66nm、8.67nm、8.68nm、8.69nm、8.7nm、8.71nm、8.72nm、8.73nm、8.74nm、8.75nm、8.76nm、8.77nm、8.78nm、8.79nm、8.8nm、8.81nm、8.82nm、8.83nm、8.84nm、8.85nm、8.86nm、8.87nm、8.88nm、8.89nm、8.9nm、8.91nm、8.92nm、8.93nm、8.94nm、8.95nm、8.96nm、8.97nm、8.98nm、8.99nm、9nm、9.01nm、9.02nm、9.03nm、9.04nm、9.05nm、9.06nm、9.07nm、9.08nm、9.09nm、9.1nm、9.11nm、9.12nm、9.13nm、9.14nm、9.15nm、9.16nm、9.17nm、9.18nm、9.19nm、9.2nm、9.21nm、9.22nm、9.23nm、9.24nm、9.25nm、9.26nm、9.27nm、9.28nm、9.29nm、9.3nm、9.31nm、9.32nm、9.33nm、9.34nm、9.35nm、9.36nm、9.37nm、9.38nm、9.39nm、9.4nm、9.41nm、9.42nm、9.43nm、9.44nm、9.45nm、9.46nm、9.47nm、9.48nm、9.49nm、9.5nm、9.51nm、9.52nm、9.53nm、9.54nm、9.55nm、9.56nm、9.57nm、9.58nm、9.59nm、9.6nm、9.61nm、9.62nm、9.63nm、9.64nm、9.65nm、9.66nm、9.67nm、9.68nm、9.69nm、9.7nm、9.71nm、9.72nm、9.73nm、9.74nm、9.75nm、9.76nm、9.77nm、9.78nm、9.79nm、9.8nm、9.81nm、9.82nm、9.83nm、9.84nm、9.85nm、9.86nm、9.87nm、9.88nm、9.89nm、9.9nm、9.91nm、9.92nm、9.93nm、9.94nm、9.95nm、9.96nm、9.97nm、9.98nm、9.99nm、10nm、10.01nm、10.02nm、10.03nm、
10.04nm、10.05nm、10.06nm、10.07nm、10.08nm、10.09nm、10.1nm、10.11nm、10.12nm、10.13nm、10.14nm、10.15nm、10.16nm、10.17nm、10.18nm、10.19nm、10.2nm、10.21nm、10.22nm、10.23nm、10.24nm、10.25nm、10.26nm、10.27nm、10.28nm、10.29nm、10.3nm、10.31nm、10.32nm、10.33nm、10.34nm、10.35nm、10.36nm、10.37nm、10.38nm、10.39nm、10.4nm、10.41nm、10.42nm、10.43nm、10.44nm、10.45nm、10.46nm、10.47nm、10.48nm、10.49nm、10.5nm、10.51nm、10.52nm、10.53nm、10.54nm、10.55nm、10.56nm、10.57nm、10.58nm、10.59nm、10.6nm、10.61nm、10.62nm、10.63nm、10.64nm、10.65nm、10.66nm、10.67nm、10.68nm、10.69nm、10.7nm、10.71nm、10.72nm、10.73nm、10.74nm、10.75nm、10.76nm、10.77nm、10.78nm、10.79nm、10.8nm、10.81nm、10.82nm、10.83nm、10.84nm、10.85nm、10.86nm、10.87nm、10.88nm、10.89nm、10.9nm、10.91nm、10.92nm、10.93nm、10.94nm、10.95nm、10.96nm、10.97nm、10.98nm、10.99nm、11nm、11.01nm、11.02nm、11.03nm、11.04nm、11.05nm、11.06nm、11.07nm、11.08nm、11.09nm、11.1nm、11.11nm、11.12nm、11.13nm、11.14nm、11.15nm、11.16nm、11.17nm、11.18nm、11.19nm、11.2nm、11.21nm、11.22nm、11.23nm、11.24nm、11.25nm、11.26nm、11.27nm、11.28nm、11.29nm、11.3nm、11.31nm、11.32nm、11.33nm、11.34nm、11.35nm、11.36nm、11.37nm、11.38nm、11.39nm、11.4nm、11.41nm、11.42nm、11.43nm、11.44nm、11.45nm、11.46nm、11.47nm、11.48nm、11.49nm、11.5nm、11.51nm、11.52nm、11.53nm、11.54nm、11.55nm、11.56nm、11.57nm、11.58nm、11.59nm、11.6nm、11.61nm、11.62nm、11.63nm、11.64nm、11.65nm、11.66nm、11.67nm、11.68nm、11.69nm、11.7nm、11.71nm、11.72nm、11.73nm、11.74nm、11.75nm、11.76nm、11.77nm、11.78nm、11.79nm、11.8nm、11.81nm、11.82nm、11.83nm、11.84nm、11.85nm、11.86nm、11.87nm、11.88nm、11.89nm、11.9nm、11.91nm、11.92nm、11.93nm、11.94nm、11.95nm、11.96nm、11.97nm、11.98nm、11.99nm、12nm、12.01nm、12.02nm、12.03nm、12.04nm、12.05nm、12.06nm、12.07nm、12.08nm、12.09nm、12.1nm、12.11nm、12.12nm、12.13nm、12.14nm、12.15nm、12.16nm、12.17nm、12.18nm、12.19nm、12.2nm、12.21nm、12.22nm、12.23nm、12.24nm、12.25nm、12.26nm、12.27nm、12.28nm、12.29nm、12.3nm、12.31nm、12.32nm、12.33nm、12.34nm、12.35nm、12.36nm、12.37nm、12.38nm、12.39nm、12.4nm、12.41nm、12.42nm、12.43nm、12.44nm、12.45nm、12.46nm、12.47nm、12.48nm、12.49nm、12.5nm、12.51nm、12.52nm、12.53nm、12.54nm、12.55nm、12.56nm、12.57nm、12.58nm、12.59nm、12.6nm、12.61nm、12.62nm、12.63nm、12.64nm、12.65nm、12.66nm、12.67nm、12.68nm、12.69nm、12.7nm、12.71nm、12.72nm、12.73nm、12.74nm、12.75nm、12.76nm、12.77nm、12.78nm、12.79nm、12.8nm、12.81nm、12.82nm、12.83nm、12.84nm、12.85nm、12.86nm、12.87nm、12.88nm、12.89nm、12.9nm、12.91nm、12.92nm、12.93nm、12.94nm、12.95nm、12.96nm、或12.97nm)。
[0441]
在一些实施例中，本文所述的二聚体蛋白结合(例如，以更高的亲和力)nkg2d受体配体的子集。与诱变分析相组合的3d结构数据表明，nkg2d在识别和结合各种其内源性配体方面是允许的。nkg2d的配体可以在细胞表面表达。在一些实施例中，nkg2d的配体可从细胞表面“脱落”并以可溶性配体形式存在。已知在某些癌症中，nkg2d配体例如mica被过表达，并且在某些情况下以可溶性形式释放(例如脱落)到血流或周围组织(例如血清中)中。据信，这至少部分地促成了癌症的发病机理和/或进展。因此，本文所述的二聚体蛋白可用于
结合存在于细胞表面上或作为释放形式存在的这种配体，以通过充当中和剂来平衡以异常升高的水平存在的所述配体的表达。当nkg2d配体在受试者的癌细胞表面上表达时，本文所述的二聚体蛋白在施用于受试者时与细胞表面配体结合。本文所述的二聚体蛋白与其配体的结合可以防止nk细胞上存在的内源性nkg2d受体的激活。当nkg2d配体从癌细胞“脱落”，例如释放到受试者的血流中时，本文所述的二聚体蛋白与可溶性配体结合，使其隔离不能进一步作用。
[0442]
在一些实施例中，与野生型nkg2d受体或本领域已知的其他嵌合蛋白相比，本文所述的二聚体蛋白具有增强的adcc能力。
[0443]
药物组合物
[0444]
本文还提供了包含本文公开的二聚体蛋白(例如，在经修饰的cho细胞中产生的二聚体蛋白)与至少一种药学上可接受的赋形剂或载剂组合的药物组合物。
[0445]“药物组合物”是包含本文公开的二聚体蛋白的配制品，其形式适合于施用于受试者。在一个实施例中，药物组合物为散装形式或单位剂型。单位剂型是多种形式中的任一种，包括例如冻干配制品、胶囊、iv袋、片剂、气雾剂吸入器上的单个泵或小瓶。单位剂量组合物中的活性成分(例如，所公开的二聚体蛋白的配制品)的量是有效量，并且根据所涉及的具体治疗而变化。本领域技术人员将理解，有时有必要根据患者的年龄和状况对剂量进行常规改变。剂量也将取决于施用径。考虑多种途径，包括口服、肺、直肠、胃肠外、经皮、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、吸入、颊、舌下、胸膜内、鞘内、鼻内等。用于本发明的化合物的局部或经皮施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。在一个实施例中，将活性化合物在无菌条件下与药学上可接受的载剂、以及需要的任何防腐剂、缓冲液或推进剂进行混合。
[0446]
如本文所用，短语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内适合于与人和动物的组织接触使用而无过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、阴离子、阳离子、材料、组合物、载剂和/或剂型。
[0447]“药学上可接受的赋形剂”是指以下赋形剂，所述赋形剂可用于制备药物组合物(其通常是安全、无毒且生物学上或其他方面都不是不期望的)，并且包括对于兽医用途和人药学用途可接受的赋形剂。在说明书和权利要求书中使用的“药学上可接受的赋形剂”包括一种或多种这样的赋形剂。
[0448]
将本发明的药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、经皮(局部)和透粘膜施用。被用于胃肠外、真皮内、或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱调节ph，如盐酸或氢氧化钠。可以将胃肠外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。在一些实施例中，用于胃肠外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液的ph是约6至约8(例如，约6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8)。
[0449]
方法和用途
[0450]
本文提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的二聚体蛋白或本文所述的组合物或本文所述的药物组合物。
[0451]
在一些实施例中，所述疾病是表达nkg2d配体的疾病。在一些实施例中，所述疾病是癌症、自身免疫性疾病、肝病、神经损伤、遗传性运动和感觉神经病、衰老或病毒感染。在一些实施例中，所述疾病是癌症或自身免疫性疾病。在一些实施例中，所述癌症是表达nkg2d配体的癌症。在一些实施例中，所述受试者具有表达nkg2d配体的癌症。
[0452]
在一些实施例中，表达配体的癌症是肺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肝细胞癌(hcc)、肾癌、鼻咽癌(npc)、前列腺癌、黑素瘤、浆细胞癌、白血病、淋巴瘤、神经胶质瘤或神经母细胞瘤。
[0453]
在一些实施例中，所述白血病是急性髓性白血病(aml)、慢性髓性白血病(cml)或慢性淋巴细胞性白血病(cll)。
[0454]
在一些实施例中，所述nkg2d配体是mica、micb、ulbp1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5或ulbp6。
[0455]
在一些实施例中，自身免疫性疾病是类风湿性关节炎、结肠炎、乳糜泻、多发性硬化症、斑秃、1型糖尿病、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化或与2型糖尿病相关的代谢综合征。
[0456]
在一些实施例中，所述肝病是肝纤维化、门静脉高压症、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、脂肪肝病和肝硬化。
[0457]
在一些实施例中，神经损伤是对外周或颅神经、脊髓或脑、颅神经的创伤或中毒、创伤性脑损伤、中风、脑动脉瘤、脊髓损伤或与潜在遗传疾病有关的损伤。
[0458]
在一些实施例中，遗传性运动和感觉神经病是杜斯氏症(charcot-marie-tooth)(例如1a型、2型、3型(具有锥体特征)、或6型)或雷夫叙姆病(refsum disease)。
[0459]
在一些实施例中，所述病毒感染是肝炎、爱泼斯坦-巴尔(epstein-barr)或巨细胞病毒。
[0460]
可以通过测试受试者中一种或多种nkg2d配体的异常表达来确定特定受试者(例如患者)是否应该接受包含本文所述的二聚体蛋白的癌症疗法。在受试者中“一种或多种nkg2d配体的异常表达”是指与对照水平(例如，来自健康受试者的表达水平)相比，在从受试者获得的生物样品中一种或多种配体的过表达。在一些实施例中，生物样品可以包括取自怀疑是癌的受试者组织的活检样品。在一些实施例中，从实体瘤收集生物学样品以测试恶性。在一些实施例中，生物学样品可以构成血液样品，例如血清、粪便样品、尿液样品等。在一些实施例中，生物学样品可以是出于以下目的从受试者收集的任何细胞或组织样品：测试疾病的诊断或进展，例如癌症或自身免疫性疾病。
[0461]
本领域普通技术人员熟悉用于测定生物样品中一种或多种标志物的存在和水平的多种实验室技术和方案。为了确定受试者是否患有与一种或多种nkg2d配体的过度表达相关的癌症，通常进行免疫亲和测定。在某些情况下，根据可用的生物样品的类型，可以进行免疫组织学或免疫细胞化学分析。许多抗体可商购以进行这些分析。通常用于该目的的方法包括但不限于elisa、免疫印迹和免疫组织化学。
[0462]
本文所述的组合物可以直接施用于受试者。术语“施用(administration和administer)”是指向受试者提供药剂的手段，以使药剂在体内即在受试者体内接触其靶细胞，例如患病细胞。在一些实施例中，将包含nkg2d-fc的组合物全身性地施用给受试者。在
一些实施例中，通过静脉内注射来进行全身性施用。在一些实施例中，包含二聚体蛋白的组合物是局部施用的。在一些实施例中，可以将组合物直接递送至实体瘤或紧邻实体瘤递送。
[0463]
本文所述的任何组合物可以通过各种施用途径施用至受试者身体的任何部分。所述组合物可以通过静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、肌肉内、直肠内、阴道内、鞘内、气管内、真皮内或经皮注射，通过口服或鼻内施用，通过吸入或通过随着时间的逐渐灌注来施用。所述组合物可以被递送至特定组织。例如，可以将组合物递送至但不限于哺乳动物的关节、鼻粘膜、血液、肺、肠、肌肉组织、皮肤或腹膜腔。在另一个实例中，组合物的气雾剂制剂可以通过吸入给予受试者。
[0464]
所需剂量取决于施用途径、配制品的性质、患者疾病的性质、受试者的体型、体重、表面积、年龄和性别、正在施用的其他药物以及主治医师的判断。合适的剂量典型地在约0.01g至约5g的范围内(例如，约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5g)。在一些实施例中，合适的剂量在约250mg至约1400mg的范围内(例如，约250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390或1400)。考虑到可用的二聚体组合物的多样性和各种施用途径的不同效率，预期所需剂量的宽泛变化。这些剂量水平的变化可以使用本领域公知的用于优化的标准经验程序来调节。施用可以是单次或多次(例如2倍或3倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、50倍、100倍、150倍或更多倍)。将组合物包封在合适的递送媒介物中(例如，聚合物微粒或可植入装置)可以提高递送效率。
[0465]
用本文提供的任何组合物治疗的持续时间可以是从短至一天到长至宿主的寿命(例如，多年)的任意时间长度。例如，二聚体组合物可以每月一次施用，持续三个月，或者每年一次，持续十年。还应注意，治疗频率可以是可变的。在一些实施例中，二聚体组合物可以每天、每周、每月或每年施用一次(或两次、三次等)。在一些实施例中，二聚体组合物可以每两周施用一次。二聚体组合物可以与一种或多种其他癌症疗法一起例如在同一时间点或顺序地一起施用。
[0466]
可以将有效量的本文所述的任何组合物施用于受试者。如本文所用，术语“有效的”是指诱导所需的治疗效果，例如免疫应答，而不会在受试者中引起明显毒性的任何量。在施用已知量的特定组合物之后，可以通过评估受试者的生物学反应，例如免疫应答和症状改善来确定该量。另外，如果有毒性，则可以通过在施用已知量的特定组合物之前和之后评估受试者的临床症状来确定毒性水平。注意，可以根据期望的结果以及宿主的应答和毒性水平来调节施用给受试者的特定组合物的有效量。明显的毒性可能对于每个特定的宿主会有所不同，并取决于多种因素，包括但不限于受试者的疾病状态、年龄和对疼痛的耐受
性。
[0467]
在一些实施例中，所述方法进一步包括用另外的抗癌疗法或抗癌剂治疗受试者。在一些实施例中，另外的抗癌疗法是手术、放射疗法、化学疗法、基因疗法、dna疗法、病毒疗法、rna疗法、辅助疗法或免疫疗法。在一些实施例中，所述另外的癌症疗法是损伤dna的化学疗法。在一些实施例中，抗癌剂是il-15(例如，genbank aax37025)/il-15ra(例如，genbank aap69528.1)异复合物(例如wo 2007/001677和wo 20007/084342中公开的和/或由seq id no:67编码的il-15/il-ra异复合物)。在一些实施例中，抗癌剂是抗pd-1抗体或其他pd-1抑制剂。pd-1、pd-l1和pd-l2的抗体、抗体片段和其他抑制剂是本领域可获得的，并且可以与本文所述的本发明的car组合使用。例如，纳武单抗(nivolumab)(也称为bms-936558或mdx1106；百时美施贵宝公司(bristol-myers squibb))是全人igg4单克隆抗体，其特异性阻断pd-1。纳武单抗(克隆5c4)和特异性结合pd-1的其他人单克隆抗体在us8,008,449和wo 2006/121168中公开。匹地利珠单抗(pidilizumab)(ct-011；cure tech)是与pd-1结合的人源化igg1k单克隆抗体。匹地利珠单抗和其他人源化抗pd-1单克隆抗体公开于wo 2009/101611中。派姆单抗(以前称为兰洛利珠单抗(lambrolizumab)，并且也称为mk03475；默克公司)是结合pd-1的人源化igg4单克隆抗体。派姆单抗和其他人源化抗pd-1抗体在us 8,354,509和wo 2009/114335中公开。medi4736(医学免疫公司(medimmune))是结合pdl1的人单克隆抗体，并抑制配体与pd1的相互作用。mdpl3280a(基因泰克公司(genentech)/罗氏公司(roche))是结合pd-l1的人fc优化的igg1单克隆抗体。mdpl3280a和针对pd-l1的其他人单克隆抗体公开于美国专利号：7,943,743和美国公开号：20120039906。其他抗pd-l1结合剂包括yw243.55.s70(重链和轻链可变区显示于wo 2010/077634中的seq id no 20和21中)和mdx-1 105(也称为bms-936559，并且例如，wo 2007/005874中公开的抗pd-l1结合剂)。amp-224(b7-dcig；安普利穆尼公司(amplimmune)；例如，在wo 2010/027827和wo 2011/066342中公开)是阻断pd-1与b7-h1之间的相互作用的pd-l2 fc融合可溶性受体。其他抗pd-1抗体包括amp 514(amplimmune)，尤其例如us 8,609,089、us 2010028330、和/或us 20120114649中公开的抗pd-1抗体。在一些实施例中，抗癌剂是放射性配体，例如但不限于
177
lu-psma-617(镥(117lu)氧代曲肽(oxodotreotide))。在一些实施例中，抗癌剂是癌症疫苗。
[0468]
在一些实施例中，另外的癌症疗法包括细胞毒性剂和/或非细胞毒性剂。“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。所述术语旨在包括放射性同位素(例如131i、125i、90y和186re)、化学治疗剂和毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或合成毒素或其片段。非细胞毒性剂是指不抑制或不阻止细胞功能和/或不引起细胞破坏的物质。“非细胞毒性剂”可以包括可以被激活为细胞毒性的药剂。非细胞毒性剂可包括珠、脂质体、基质或颗粒(参见，例如，美国专利公开2003/0028071和2003/0032995，将其通过引用并入本文)。这些药剂可以与本文所述的二聚体组合物缀合、偶联、连接或缔合。
[0469]
在一些实施例中，常规的癌症药物与本文所述的组合物一起施用。在一些实施例中，用本文所述的二聚体组合物与针对靶癌细胞的一种或多种另外药剂联合治疗需要癌症治疗的受试者。高度合适的药剂包括在癌细胞中促进dna损伤例如细胞dna中的双链断裂的那些药剂。可以使用本领域技术人员已知的任何形式的dna损伤剂。dna损伤典型地可以通
过放射疗法和/或化学疗法产生。dna损伤剂也称为遗传毒性剂。如本文所用，“与......联合”是指将二聚体组合物与一种或多种另外的疗法并行(同时或分开但紧密接近)地施用于受试者，将二聚体组合物在施用一种或多种另外的疗法之前或之后施用于受试者。
[0470]
放射疗法的实例包括但不限于外部放射疗法和内部放射疗法(也称为近距离放射疗法)。外部放射疗法的能源包括x射线、γ射线和粒子束，内部放射中使用的能源包括放射性碘(碘或碘)，锶或磷、钯、铯、铟、磷酸盐或钴的放射性同位素。施用放射疗法的方法是本领域技术人员众所周知的。
[0471]
可能特别有用的损伤dna的化学治疗剂的实例包括但不限于：白消安(myleran)、卡铂(paraplatin)、carmustme(bcnu)、苯丁酸氮芥(leukeran)、顺铂(platmol)、环磷酰胺(cytoxan、neosar)、达卡巴嗪(dtic-dome)、异环磷酰胺(ifex)、lomustme(ccnu)、双氯乙基甲胺(氮芥、mustargen)、美法仑(alkeran)、和甲基苄肼(matulane)。
[0472]
许多其他化学治疗剂也可以单独或组合用于本文所述的方法。这些包括：甲氨蝶呤、长春新碱、阿霉素顺铂、不含糖的氯乙基亚硝基脲、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素c、博来霉素、阿霉素、达卡巴嗪、紫杉醇、fragyline、meglamine gla、戊柔比星、卡莫司汀和poliferposan、mmi270、bay12-9566、ras法呢基转移酶抑制剂、法呢基转移酶抑制剂、mmp、mta/ly231514、ly264618/lometexol、glamolec、ci-994、tnp-470、hycamtin/拓扑替康、pkc412、valspodar/psc833、novantrone/米托蒽醌、metaret/苏拉明、巴马司他、e7070、bch-4556、cs-682、9-ac、ag3340、ag3433、incel/vx-710、vx-853、zd0101、isi641、odn 698、ta2516/marmistat、bb2516/marmistat、cdp 845、d2163、pd183805、dx8951f、lemonal dp 2202、fk 317、沙培林/ok-432、ad 32/戊柔比星、metastron/锶衍生物、temodal/替莫唑胺、evacet/脂质体阿霉素、yewtaxan/紫杉醇、taxol/紫杉醇、xeload/卡培他滨、furtulon/去氧氟尿苷cyclopax/口服紫杉醇、口服紫杉类、spu-077/顺铂、hmr 1275/夫拉平度、cp-358(774)/egfr、cp-609(754)/ras致癌基因抑制剂、bms-182751/口服铂、uft(替加氟/尿嘧啶)ergamisol/左旋咪唑、eniluracil/776c85/5fu增强剂、campto/左旋咪唑、camptosar/伊立替康、tumodex/雷替曲塞、leustatin/克拉屈滨、paxex/紫杉醇、doxil/脂质体阿霉素、caelyx/脂质体阿霉素、fludara/氟达拉滨、pharmarubicin/表阿霉素、depocyt、zd 1839、lu 79553/双-萘甲酰亚胺、lu 103793/dolastain、caetyx/脂质体阿霉素、gemzar/吉西他滨、zd 0473/anormed、ym 116、碘种子、cdk4和cdk2抑制剂、parp抑制剂、d4809/dexifosamide、ifes/美司钠/异环磷酰胺、vumon/替尼泊苷、paraplatin/卡铂plantinol/顺铂、vepeside/依托泊苷、zd 9331、taxotere/多西他赛、鸟嘌呤阿拉伯糖苷的前药、紫杉烷类似物、亚硝基脲、烷基化剂例如美菲仑和环磷酰胺、氨鲁米特、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、阿糖胞苷hc1、放线菌素、柔红霉素hc1、雌莫司汀磷酸钠、依托泊苷(vp16-213)、氟尿苷氟脲嘧啶(5-fu)、氟他胺、羟基脲(羟基尿素)、异环磷酰胺、干扰素α-2a、α-2b、醋酸亮丙瑞林(lhrh-释放因子类似物)、环己亚硝脲(ccnu)、双氯乙基甲胺hc1(氮芥)巯基嘌呤、美司钠、米托坦(o.p'-ddd)、米托蒽醌hc1、奥曲肽、普卡霉素、丙卡巴肼hc1、链脲佐菌素、枸橼酸它莫西芬、硫鸟嘌呤、噻替派、硫酸长春碱安吖啶(m-amsa)、阿扎胞苷、红细胞生成素、六甲嘧胺(hmm)、白介素2米托胍腙(甲基-gag；甲基乙二醛双胍腙；mgbg)、喷司他丁(2'脱氧助间型霉素)、甲基环己亚硝脲(甲基-ccnu)、替尼泊苷(vm-26)、和硫酸长春地辛，但不限于此。
[0473]
另外，以下药剂也可用于本发明：烷基化剂(例如卡铂和顺铂)、氮芥菜烷基化剂、亚硝基脲烷基化剂(例如卡莫司汀(bcnu))、抗代谢物(例如甲氨蝶呤、亚叶酸、嘌呤类似物抗代谢物、巯基嘌呤、嘧啶类似物抗代谢物例如氟尿嘧啶(5-fu)和吉西他滨)、激素抗肿瘤药(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林、和他莫昔芬)、天然抗肿瘤药(例如阿地白介素、mterleukin-2、多西他赛、依托泊苷(vp-16)、干扰素α紫杉醇和维甲酸(atra))、抗生素天然抗肿瘤药(例如博来霉素、放线菌素、柔红霉素、阿霉素、道诺霉素和丝裂霉素(包括丝裂霉素c))、和长春花生物碱天然抗肿瘤药(例如长春碱、长春新碱、长春地碱)、羟基脲、丙酮、阿霉素异环磷酰胺、依诺他滨、环硫雄醇、阿柔比星、环胞苷、尼莫司汀、盐酸异丙嗪、卡波醌、卡铂、卡莫氟、色霉素a3、抗肿瘤多糖、抗肿瘤血小板因子、环磷酰胺裂褶菌多糖、阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、达卡巴嗪、硫吗啡、噻替派、替加氟、尾海兔素、尾海兔素类似物、例如奥西汀、cpt-11(伊立替康)、米托蒽醌、长春瑞滨、替尼泊苷、氨基蝶呤、卡波霉素、埃斯佩拉霉素(esperamicin)(参见例如美国专利号4,675,187、其通过引用并入本文)、新抑癌蛋白、ok 432、博来霉素、氟铁龙、布罗沙定、白消安、honvan、培洛霉素、乌苯美司干扰素-β、美雄烷、米索前列醇(mitobromtol)、美法仑、层粘连蛋白肽、香菇多糖、云芝提取物、替加氟/尿嘧啶雌莫司汀(雌激素/双氯乙基甲胺)、沙利度胺、和来那度胺
[0474]
其他合适的化学治疗剂包括蛋白酶体抑制剂。蛋白酶体抑制剂阻断蛋白酶体的作用，蛋白酶体是降解蛋白质(特别是那些参与细胞维持、生长、分裂和细胞死亡的短寿命蛋白)的细胞复合物。蛋白酶体抑制剂的实例包括硼替佐米乳胞素(ag科学公司(ag scientific,inc)、圣地亚哥、加利福尼亚州)、mg1 32(白尔摩国际公司(biomol international)、普利茅斯(plymouth meeting)、宾夕法尼亚州)ps-519、eponemycin、epoxomycin、阿克拉霉素a、二肽苯甲酰胺、cvt-63417和乙烯基砜三肽蛋白酶体抑制剂。
[0475]
在一些实施例中，本文所述的方法与一种或多种其他癌症治疗(包括癌症免疫疗法)联合使用。癌症免疫疗法是利用免疫系统排斥癌症。主要前提是刺激受试者的免疫系统攻击导致疾病的肿瘤细胞。这可以通过对受试者进行免疫(在这种情况下，受试者自身的免疫系统可以识别肿瘤细胞作为要破坏的靶)，或通过施用治疗剂(例如抗体)作为药物(在这种情况下，受试者的免疫该系统被募集以通过治疗剂破坏肿瘤细胞)。癌症免疫疗法包括基于抗体的疗法和基于细胞因子的疗法。
[0476]
fda已经批准了许多治疗性单克隆抗体用于人，并且更多还在进行中。fda批准的用于癌症免疫疗法的单克隆抗体包括针对cd52、cd33、cd20、erbb2、血管内皮生长因子和表皮生长因子受体的抗体。因此，靶向一种或多种癌症相关抗原的这些和其他抗体适用于与本文所述的二聚体组合物联合在有待施用的组合疗法中使用。fda批准用于癌症疗法的单克隆抗体的实例包括但不限于：利妥昔单抗(作为rituxan
tm
提供)、曲妥珠单抗(作为herceptin
tm
提供)、阿仑妥珠单抗(作为campath-ih
tm
提供)、西妥昔单抗(作为erbitux
tm
提供)、贝伐单抗(作为avastin
tm
提供)、帕尼妥木单抗(作为vectibix
tm
提供)、奥-吉妥珠单抗(作为mylotarg
tm
提供)、替坦-替伊莫单抗(作为zevalin
tm
提供)和托西莫单抗(作为bexxar
tm
提供)。目前在美国接受人临床测试用于癌症疗法的单克隆抗体的实例包括但不限于：wx-g250(作为rencarex
tm
提供)、伊木单抗(作为mdx-010提供)、扎诺利木单抗(作为
humax-cd4提供)、ofatunumab(作为humax-cd20提供)、chl4.18、扎诺利木单抗(作为humax-egfr提供)、奥戈伏单抗(作为b43.13，ovalrex
tm
提供)、依决洛单抗(作为ign-101，panorex
tm
提供)、131i-chtnt-i/b(作为cotara
tm
提供)、pemtumomab(作为r-1549，theragyn
tm
提供)、林妥珠单抗(作为sgn-33提供)、拉贝妥单抗(作为hmn14，ceacide
tm
提供)、卡妥索单抗(作为removab
tm
提供)、cnto 328(作为cclb8提供)、3f8、177lu-j591、尼妥珠单抗、sgn-30、替西莫单抗(作为cp-675206提供)、达利珠单抗(作为zenapax
tm
提供)、依帕妥珠单抗(作为hll2，lymphocide
tm
提供)、90y-依普妥珠单抗、加利昔单抗(作为idec-114提供)、mdx-060、ct-011、cs-1008、sgn-40、玛帕妥木单抗(作为trm-i提供)、阿波珠单抗(作为huidlo，remitogen
tm
提供)和沃洛赛昔单抗(作为m200提供)。
[0477]
癌症免疫疗法还包括基于细胞因子的疗法。基于细胞因子的癌症疗法利用一种或多种调节受试者免疫应答的细胞因子。可用于癌症治疗的细胞因子的非限制性实例包括干扰素-a(ifn-a)、白介素-2(il-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和白介素-12(il-12)。
[0478]
贯穿本技术引用的所有参考文献的全部内容(包括文献参考文献、授权专利、已公开的专利申请和共同未决的专利申请)在此明确地通过引用并入。
[0479]
本文还提供了用于诊断表达nkg2d配体的疾病的方法，所述方法包括：(1)从患有表达nkg2d配体的疾病的受试者中获得生物样品；(2)使所述生物样品与包含本文所述的二聚体蛋白或本文所述的组合物的结合试剂接触；(3)检测所述nkg2d配体与所述结合剂的结合；其中nkg2d配体与所述结合试剂的结合指示对受试者中表达nkg2d配体的疾病的诊断。
[0480]
在一些实施例中，所述nkg2d配体是mica、micb、ulbp1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5或ulbp6。
[0481]
本文提供了本文所述的二聚体蛋白、本文所述的多核苷酸、本文所述的载体或本文所述的组合物，作为药物使用。
[0482]
本文提供了本文所述的二聚体蛋白、本文所述的多核苷酸、本文所述的载体或本文所述的组合物，用于治疗疾病。
[0483]
本文提供本文所述的二聚体蛋白、本文所述的多核苷酸、本文所述的载体或本文所述的组合物，用于治疗疾病，其中所述疾病是表达nkg2d配体的疾病。
[0484]
本文提供本文所述的二聚体蛋白、本文所述的多核苷酸、本文所述的载体或本文所述的组合物，用于治疗疾病，其中所述疾病是癌症或自身免疫性疾病。
[0485]
nkg2d-fc二聚体蛋白的制备
[0486]
在一些实施例中，二聚体nkg2d-fc嵌合构建体通过常规重组dna方法产生。在一些实施例中，本文所述的二聚体nkg2d蛋白被产生为单个(例如，连续的)重组多肽。在其他实施例中，二聚体nkg2d蛋白的两个或更多个部分作为单独的片段产生，并且随后连接在一起以产生二聚体nkg2d-fc分子。在一些实施例中，二聚体蛋白的每个nkg2d部分和二聚体蛋白的fc部分各自作为单独的重组多肽产生，然后通过化学连接手段融合在一起以产生融合的nkg2d-fc。特别是在使用非肽连接分子的情况下，该生产方法可以是优选的。类似地，如果二聚体nkg2d-fc蛋白被制成单个连续多肽时不能正确折叠(例如，不能正确结合配体)，则该生产方法也可以是优选的。在一些实施例中，二聚体蛋白的每个单体(例如，nkg2d部分和fc部分)由单个连续核苷酸序列编码，并在细胞中作为单个重组多肽产生。在一些实施例
中，二聚体nkg2d分子是通过蛋白-蛋白相互作用例如通过fc片段产生的。
[0487]
为了产生重组多肽，可以使用多种宿主生物。合适的宿主包括但不限于：细菌例如大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。合适的宿主生物的选择将取决于二聚体nkg2d-fc蛋白的特定应用。技术人员将理解如何在选择合适的宿主以产生重组多肽时考虑某些标准。影响选择合适宿主的因素包括，例如翻译后修饰，例如磷酸化和糖基化模式，以及技术因素，例如一般预期的产量和纯化的容易程度。应该仔细考虑将要在体内使用的二聚体nkg2d-fc的宿主特异性翻译后修饰，因为已知某些特异性后修饰具有很高的免疫原性(抗原性)。
[0488]
产生后，二聚体nkg2d-fc可以通过任何合适的手段，例如本领域技术人员已知的色谱方法来纯化。色谱方法的实例包括凝胶过滤色谱。参见，例如，caine等人,protein expr.purif.[蛋白质实验与纯化],1996,8:159-66。在一些实施例中，二聚体nkg2d-fc通过蛋白a免疫亲和色谱纯化。
[0489]
如本领域普通技术人员将认识到的，也可以分别制备和分离二聚体nkg2d嵌合体部分，并通过化学合成进行连接。
[0490]
实例
[0491]
实例1.构建体设计
[0492]
使用moe(化学计算集团(chemical computing group)ula)，基于对全长人igg1抗体(pdb 1hzh)和复合物nkg2d/mica(pdb ihyr)的结构分析，构建了nkg2d-fc变体模型。图1a显示了nkg2d-fc变体的示意图。所述模型在pymol分子图形系统(薛定谔公司(schroedinger llc))中可视化。在所述模型中，蓝色区域代表nkg2d-fc变体的fc部分，绿色区域代表nkg2d-fc变体的nkg2d部分，橙色区域代表结合的mica蛋白(图1b)。
[0493]
实例2.工程改造与序列
[0494]
实例2.1(图2a-2b)
[0495]
nkg2d作为二聚体与其配体结合。当将nkg2d融合至fc部分时，可以通过fc片段的二聚化形成nkg2d二聚体，或者可以通过肽接头将两个nkg2d片段连接起来并与fc片段融合，从而生成二价同二聚体蛋白(带有两个nkg2d二聚体)。
[0496]
在报道基因测定法(rga)中测试了诱导前述变体以及n末端和c末端fc融合体的adcc信号传导的能力。
[0497]
首先将四个人二聚体nkg2d-fc变体瞬时表达到hek293t细胞中，并通过蛋白a免疫亲和色谱纯化。将过表达重组人mica*008的1.5e4个工程改造的稳定ct26.wt细胞(靶细胞)重悬浮于补充有10％fbs的rpmi-glutamax培养基(吉布科公司(gibco))(测定培养基)中，并铺板在白色96孔板的孔中。将细胞与稀释在测定培养基中的不同摩尔浓度的二聚体nkg2d-fc变体孵育。孵育一小时后，将9e4个fcγriiia v158 nfat萤光素酶jurkat(jnl)细胞(效应细胞)添加到实验孔中，从而产生靶细胞:效应细胞比例为1:6。将测定板在37℃和5％co2下孵育4小时。通过每孔添加60ul bright-glo
tm
(普洛麦格公司(promega))并避光在室温下孵育3分钟，揭示了fcγriiia受体的浓度依赖性激活。使用synergy ht读板仪(拜尔泰克公司(biotek))测量所得的生物发光。用减去背景的荧光信号确定以ng/ml为单位的半最大有效浓度(ec50)(参见例如，图2a-2b)。
[0498]
实例2.2(图3a-3b)
[0499]
进行针对细胞表面表达的小鼠nkg2d配体的基于流激活细胞分选(facs)的结合测定，以表征与fc区的n末端或c末端融合(没有肽接头或具有不同肽接头长度(10、20或30个氨基酸))的二聚体小鼠nkg2d-fc变体的结合。
[0500]
在两种不同的工程改造的稳定ct26.wt细胞系(在它们的表面过表达重组配体小鼠rae-1α和小鼠rae-1ε)上测定nm的半最大有效浓度(ec50)。将细胞与补充了5％fcs和0.04％nan3(facs缓冲液)的dpbs中的不同浓度的蛋白一起孵育。用标记有r-藻红蛋白(r-pe)的抗小鼠fc抗体检测结合的蛋白(杰克森免疫研究公司(jackson immunoresearch，参考号115-115-164))。对于每个样品，使用cell quest pro软件(bd生物科学公司(bd biosciences))提取存活的门控细胞产生的荧光的平均值。
[0501]
所有变体的结合都类似于rae-1e，而与接头的长度和方向无关。相反，接头长度为20或30aa的c末端变体显示与rae-1a的结合大大降低。所有其他变体均显示出与该配体相当的结合。
[0502]
实例2.3(图4a-4d)
[0503]
在报道基因测定中测试了诱导具有不同结构和nkg2d价的二聚体nkg2d-fc变体的adcc信号传导的能力。
[0504]
首先将变体瞬时表达到hek293t细胞中，并通过蛋白a免疫亲和色谱纯化。
[0505]
将过表达重组人mica*008的1.5e4个工程改造的稳定ct26.wt细胞(靶细胞)重悬浮于补充有10％fbs的rpmi-glutamax培养基(吉布科公司(gibco))(测定培养基)中，并铺板在白色96孔板的孔中。将细胞与稀释在测定培养基中的不同摩尔浓度的二聚体nkg2d-fc变体孵育。孵育一小时后，将预先用抗ulbp2、ulbp5、ulbp6山羊抗体(赛默飞科技公司(thermo scientific)，参考号pa5-47118)封闭1-2小时的9e4个fcγriiia v158 nfat萤光素酶jurkat(jnl)细胞(效应细胞)添加到实验孔中，从而产生靶细胞:效应细胞比例为1:6。作为对照，通过在不存在靶细胞(c e孔)的情况下将nkg2d-fc蛋白与效应细胞一起孵育来评估nkg2d-fc变体与效应细胞的反应性。将测定板在37℃和5％co2下孵育4小时。通过每孔添加60ul one-glo
tm
(普洛麦格公司)并避光在室温下孵育3分钟，揭示了fcγriiia受体的浓度依赖性激活。使用synergy ht读板仪(拜尔泰克公司)测量所得的生物发光。用减去背景的荧光信号确定以ng/ml为单位的半最大有效浓度(ec50)(参见例如，图4a-4d)。
[0506]
价和结构在靶向细胞和诱导细胞杀伤的能力中发挥作用。图4b显示从单价(hh17)结合到二价(hh16)结合，ec50增加至少一个log。出人意料的是，分子的结构(这里是hh16相比于hh8)在细胞杀伤(ec50)方面有至少一个log差异。将价从2进一步提高到4或其他架构(图4c-4d)不改善细胞杀伤。
[0507]
实例2.4(图5a-5d)
[0508]
相关表达宿主中蛋白酶切割和降解的分析是该表达宿主中用于进一步开发的重要参数。
[0509]
通过流电穿孔将变体瞬时表达到cho mako细胞中，并通过蛋白a免疫亲和色谱纯化。
[0510]
在蛋白完全变性还原和去糖基化之后，通过lc-ms评估每个变体的剪裁蛋白的水平。
[0511]
进行了针对重组人nkg2d配体的直接结合测定，以确定五个氨基酸缺失是否影响
二聚体nkg2d-fc与其配体的结合。
[0512]
使用重组人mica*001配体作为分析物，对蛋白a捕获的nkg2d-fc变体测量了动力学结合亲和常数(kd)。在室温下在t200(瑞士格拉特布鲁格市ge医疗公司(ge healthcare,glattbrugg,switzerland))上进行测量。nkg2d-fc变体被捕获在蛋白a研究级传感器芯片(ge医疗公司，参考号29127555)的流通池上。将所有蛋白稀释在0.01m hepes ph 7.4、0.15m nacl、3mm edta、0.005％v/v表面活性剂p20中。作为参考，一个流通池留空，没有任何捕获的蛋白。通过随后在参考和测量流动池上注射分析物稀释液系列获得结合数据。纳入零浓度样品(仅操作缓冲液)以允许在数据评价期间进行双重参考。为了进行数据评价，使用了双重参考的传感图并分析了解离常数(kd)。
[0513]
由于可以在第二nkg2d结构域中通过lc-ms鉴定特异性蛋白酶切割位点(图5a-5c)。通过缺失该位点，可以实现降解产物的显著减少(图5d)。如所预期的，在aa位置149处的剪裁仅导致单体级分减少6％，结合亲和力与测试样品相当(图5d)。
[0514]
实例3.构建体形式
[0515]
测试来自接近开发生产的细胞系的材料以确认结合和细胞杀伤活性。
[0516]
将过表达重组人mica*008、人mica*001、人micb*001或食蟹猴micb05配体和无关靶gus的1.5e4个工程改造的稳定的ct26.wt细胞(靶细胞)重悬浮于补充有10％fbs的rpmi-glutamax培养基(吉布科公司)(测定培养基)中，并铺板在白色96孔板的孔中。将细胞与稀释在测定培养基中的不同摩尔浓度的二聚体nkg2d-fc变体孵育。孵育一小时后，将预先用抗ulbp2、ulbp5、ulbp6山羊抗体(赛默飞科技公司(thermo scientific)，参考号pa5-47118)封闭1-2小时的9e4个fcγriiia v158 nfat萤光素酶jurkat(jnl)细胞(效应细胞)添加到实验孔中，从而产生靶细胞:效应细胞比例为1:6。将测定板在37℃和5％co2下孵育4小时。通过每孔添加60ul one-glo
tm
(普洛麦格公司)并避光在室温下孵育3分钟，揭示了fcγriiia受体的浓度依赖性激活。使用synergy ht读板仪(拜尔泰克公司)测量所得的生物发光。用减去背景的荧光信号确定以ng/ml为单位的半最大有效浓度(ec50)。
[0517]
出人意料地，结果表明，cho衍生材料相比于来自遗传相同的构建体的hek衍生材料的活性提高至少10倍。对于至少2个相关的人靶，发现是相似的(图9e)。
[0518]
实例4.生产和剪裁
[0519]
针对衍生自不同表达宿主但遗传上相同的材料，分析了蛋白酶切割的水平，特别是针对位置149/150。
[0520]
通过将25微克溶解于8m尿素、0.4m nh4co3、0.17m dtt中并在50℃加热30分钟，然后在添加40微升的milliq水后在37℃与1微克png酶f孵育1小时，来变性还原和去糖基化每个蛋白批次。将还原变性的去糖基化蛋白注射在液相色谱-质谱(lc-ms)(beh c4 1mm*150mm，uv在214nm，主沃特斯(waters)qtof)中(参见例如，图10)。
[0521]
将2mg hh2参考样品(由hek-6e生产)掺入接种有2e5细胞/ml的cho-c8td、cho-mako和cho-hpt3的50ml dm133细胞培养基(伊文科学公司(irvine scientific))中。将摇瓶(康宁公司(corning))在36.5℃下在定轨摇床(infors ht公司)中在150rpm和10％co2在使用beckman coulter vicell监测细胞密度和活力下培养8天。收集所有上清液并在《-60℃冷冻直至纯化。在水浴中于30℃解冻后，将上清液进行无菌过滤，然后在1ml mabselect sure柱(ge医疗公司)上纯化，其中使用50mm乙酸(ph 3.0)进行逐步洗脱。用1m tris将所有
洗脱液直接滴定至ph 5.0。取出用于分析的等分试样，并立即在《-60℃下冷冻，直至通过质谱分析。每个样品的25ug蛋白用尿素变性，用dtt还原并用png酶f去糖基化。随后，使用lc/ms qtof主系统(waters)在beh c4 rp柱(沃特斯)上使用水/乙腈梯度分析所有蛋白。结果总结在下面的表1中。
[0522]
表1.对hh2的cho共培养剪裁研究的结果总结
[0523][0524][0525]
在稳定的cho-mako细胞中进一步生产hh2、hh8、hh8-afuco和hh10证实了共培养测定的初步结果。通过rp-ms分析，对于所有提交的样品，仅检测到少量的剪裁产物(低水平，1％或以下)。
[0526]
方法1(还原和烷基化的rp-ms)：用milli-q水将400ug蛋白稀释至总体积356ul，并通过添加20ul 1m tris(ph 8.0)调节ph。添加24ul png酶f(gnf，1mg/ml)进行去糖基化，并在37℃下孵育过夜。将44ul的去糖基化样品与50ul的8m胍-hcl、5ul的1m tris ph 8.0、1ul的1m dtt混合。在37℃下孵育1小时后，立即添加2ul 1m iam，并在黑暗中于室温下再孵育1小时。最后将1ul 1m dtt加入样品中以淬灭烷基化反应，随后使用lc-ms qtof系统(沃特斯)在plrp-s柱(安捷伦(agilent))上在60℃下使用水/异丙醇和乙腈梯度分析3ug蛋白。
[0527]
方法2(还原的rp-ms)：用milli-q水将100ug蛋白按1:18稀释至总体积9ul，并通过
添加1.7ul 0.5m tris(ph 7.5)调节ph。添加6ul png酶f(gnf，1mg/ml)和1ul endoh(neb，125,000u/ml)进行去糖基化。将样品在37℃下孵育过夜。将7.3ul的去糖基化样品与50ul的8m胍-hcl、5ul的1m tris ph 8.0、1ul的1m dtt混合，并在37℃下孵育1小时。立即将1ul 10％tfa添加到样品中。随后，使用lc-ms qtof系统(沃特斯)在acquity csh c18(沃特斯)上在80℃下使用水/异丙醇和乙腈梯度分析3ug蛋白。
[0528]
实例5.体外结合
[0529]
进行直接结合测定以表征adcc增强的和野生型的nkg2d-fc变体与重组人mica*001和micb*001配体的结合。将nkg2d-fc变体首先用作配体，以表征每个nkg2d二聚体与mica和micb的结合(单价结合设置)，其次用作分析物，以便确定具有两个同二聚体时对结合的影响(二价结合设置)。
[0530]
对于单价结合设置，使用重组人nkg2d配体作为分析物，对蛋白a捕获的nkg2d-fc变体测量了动力学结合亲和常数(kd)。在室温下在t200(瑞士格拉特布鲁格市ge医疗公司(ge healthcare,glattbrugg,switzerland))上进行测量。nkg2d-fc变体被捕获在蛋白a研究级传感器芯片(ge医疗公司，参考号29127555)的流通池上。将所有蛋白稀释在0.01m hepes ph 7.4、0.15m nacl、3mm edta、0.005％v/v表面活性剂p20中。作为参考，一个流通池留空，没有任何捕获的蛋白。通过随后在参考和测量流动池上注射分析物稀释液系列获得结合数据。纳入零浓度样品(仅操作缓冲液)以允许在数据评价期间进行双重参考。为了进行数据评价，使用了双重参考的传感图并分析了解离常数(kd)。
[0531]
对于二价结合设置，使用nkg2d-fc变体作为分析物，对链霉亲和素捕获的重组人nkg2d配体测量了动力学结合亲和常数(kd)。在室温下在t200(瑞士格拉特布鲁格市ge医疗公司(ge healthcare,glattbrugg,switzerland))上进行测量。将所有蛋白稀释在0.01m hepes ph 7.4、0.15m nacl、3mm edta、0.005％v/v表面活性剂p20中。根据制造商的建议(ge医疗公司)，使用标准程序将生物素化的nkg2d配体共价捕获在sa研究级传感器芯片(ge医疗公司，参考号29104992)的流通池上。为了用作参考，将一个流动池作为空白样固定。通过随后在参考和测量流动池上注射分析物稀释液系列获得结合数据。纳入零浓度样品(仅操作缓冲液)以允许在数据评价期间进行双重参考。为了进行数据评价，使用了双重参考的传感图并分析了解离常数(kd)。
[0532]
在二价结合设置中，所有3个分析样品(具有igg1-fc wt的hh8、具有igg1-fc_sdie的hh10、以及具有igg1-fc wt的hh8_afuc(具有低浓度岩藻糖的))在亚纳摩尔范围内对两个配体(mica*001和micb*001)具有相当的结合。如所预期的，由于亲合力效应，在单价结合设置中测得的亲和力较低。在这里，所有样品与mica*001的结合都在两位数nm范围内，而与micb*001的结合降低了2倍。
[0533]
表2.二价和单价结合
[0534][0535]
将6e6个293ft细胞(英杰公司(invitrogen))铺板到带有10ml cd10的10cm皿中，然后3小时后将培养基换为5ml预热的opti-mem1。在添加optimem-1后4小时，根据制造商的说明使用lipofectamine-2000用编码指定配体的dna质粒转染细胞。过夜孵育后，用5ml pbs 2mm edta的连续两次洗涤来收获细胞。在nexcelom细胞计数器上对细胞计数，并将100e3个细胞重悬浮于具有10ug/ml hh8或10ug/ml人igg1同种型的pbs 2mm edta 2％胎牛血清(facs缓冲液)中。将细胞在4度下染色15分钟，然后在200ul facs缓冲液中洗涤一次，并用二抗alexa488标记的山羊抗huigg(a11013，赛默飞世尔公司(thermo fisher))在4度下染色15分钟。然后将细胞在200ul facs缓冲液中洗涤一次，重悬浮于100ul facs缓冲液中，并用另外的100ul ic固定缓冲液(艺生物科学公司(ebioscience))固定，然后在bd fortessa上运行并在flowjo中进行分析(参见图11a-11b)。
[0536]
将6e6个293ft细胞(英杰公司(invitrogen))铺板到带有10ml cd10的10cm皿中，然后3小时后将培养基换为5ml预热的opti-mem1。在添加optimem-1后4小时，根据制造商的说明使用lipofectamine-2000用编码指定配体的dna质粒转染细胞。过夜孵育后，用5ml pbs 2mm edta的连续两次洗涤来收获细胞。在nexcelom细胞计数器上对细胞计数，并将100e3个细胞重悬浮于具有10ug/ml hh8或10ug/ml人igg1同种型的pbs 2mm edta 2％胎牛血清(facs缓冲液)中。将细胞在4度下染色15分钟，然后在200ul facs缓冲液中洗涤一次，并用二抗alexa488标记的山羊抗huigg(a11013，赛默飞世尔公司(thermo fisher))在4度下染色15分钟。然后将细胞在200ul facs缓冲液中洗涤一次，重悬浮于100ul facs缓冲液中，并用另外的100ul ic固定缓冲液(艺生物科学公司(ebioscience))固定，然后在bd fortessa上运行并在flowjo中进行分析(参见图12a-12b)。
[0537]
将1e6-5e6个肿瘤细胞直接接种到t-75烧瓶中的25ml dmem 10％fbs中，并且然后在5％co2中于37度培养。72小时后，通过移液于pbs 2mm edta中收获细胞。从leukopaks(荷马医疗公司(hemacare))收获正常供体pbmc，并用ficoll纯化。在nexcelom细胞计数器上计数细胞，并将100e3个细胞重悬浮于pbs 2mm edta 2％胎牛血清(facs缓冲液)(具有5ul trustain fcx(艺生物科学公司))中，在4摄氏度下15分钟。然后将细胞离心并重悬浮于facs缓冲液 10ug/ml hh8或10ug/ml人igg1同种型中。将细胞在4度下染色15分钟，然后在200ul facs缓冲液中洗涤一次，并用二抗alexa488标记的山羊抗huigg(a11013，赛默飞世
尔公司)在4度下染色15分钟。然后将细胞在200ul facs缓冲液中洗涤一次，重悬浮于100ul facs缓冲液中，并用另外的100ul ic固定缓冲液(艺生物科学公司)固定，然后在bd fortessa上运行并在flowjo中进行分析(参见图13a-13b)。
[0538]
实例6.体外功能
[0539]
从白细胞纯化原代人nk细胞，并冷冻在90％胎牛血清 10％dmso中。在测定当天，将nk细胞解冻到无酚红rpmi 10％热灭活的fbs 50umβ-巯基乙醇 50iu/ml人il-2(康宁公司)(测定培养基)中。将工程改造为过表达指定的nkg2d-l的ct26.wt细胞在测定培养基中培养，然后用pbs 2mm edta收获。向每个孔中添加50,000个nk细胞和25,000个ct26.wt细胞，并按照指示添加nkg2d-fc抗体的稀释液。然后将测定在37摄氏度 5％co2下孵育24小时。然后收集非贴壁细胞并用抗cd45 apc-cy7(艺生物科学公司hi-30)和抗nkg2d apc(艺生物科学公司1d11)染色15分钟，然后洗涤并固定，并且然后在bd fortessa和flowjo上进行分析。将cd45 的nkg2d中值荧光强度标准化为同种型(100％)或基于珠的下调(0％)(参见，例如，图14a-14b)。
[0540]
实例7.体内功能-adcc
[0541]
由于效应细胞上受体的更强激活，增强的fcγ受体结合也导致adcc活性增加，这是在使用过表达人mica*008的细胞系作为细胞rga中的靶细胞系的设置中进行测试的(图15)。
[0542]
将过表达重组人mica*008配体的1.5e4个工程改造的稳定ct26.wt细胞(靶细胞)重悬浮于补充有10％fbs的rpmi-glutamax培养基(吉布科公司(gibco))(测定培养基)中，并铺板在白色96孔板的孔中。将细胞与稀释在测定培养基中的不同摩尔浓度的二聚体nkg2d-fc变体孵育。孵育一小时后，将9e4个fcγriiia v158 nfat萤光素酶jurkat(jnl)细胞(效应细胞)添加到实验孔中，从而产生靶细胞:效应细胞比例为1:6。将测定板在37℃和5％co2下孵育4小时。通过每孔添加60ul one-glo
tm
(普洛麦格公司)并避光在室温下孵育3分钟，揭示了fcγriiia受体的浓度依赖性激活。使用synergy ht读板仪(拜尔泰克公司)测量所得的生物发光。用减去背景的荧光信号确定以ng/ml为单位的半最大有效浓度(ec50)。
[0543]
与具有野生型igg1-fc(hh8)的nkg2d-fc版本相比，具有增强fc_γ受体结合的突变的nkg2d-fc版本(hh10)显示出10倍更强的细胞杀伤活性。具有废除fc_γ受体结合的突变的nkg2d-fc版本没有细胞杀伤活性(图15)。衍生自hek表达的具有igg1wt的nkg2d-fc的样品显示出至少10倍更低的细胞杀伤活性，如已经在图9中所示。
[0544]
表3.在cho mako细胞中表达的nkg2d-fc二聚体的人cd16rga
[0545][0546]
通过体外adcc测定法(图16a-16d)(例如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述)使用表达人cd16的效应细胞系来确定adcc增强的(hh10和hh8-afuco)和野生型(hh8)的nkg2d-fc变体的adcc活性。根据nkg2d-fc变体在表达nkg2d配体的靶细胞和nk效应细胞存在下触发adcc的能力，测量其生物学adcc活性。将用人mica*008、micb*001、ulbp1或ulbp2稳定转染的钙黄绿素标记的ct26.wt细胞与不同浓度的nkg2d-fc变体和过量的自然杀伤细胞(此处为nk3.3细胞系(圣路易斯大学(saint louis university)，参考号slu-1011))一起孵育。将细胞洗涤，并重悬浮于rpmi无苯酚培养基中，以达到靶细胞与效应细胞的比例为1:20。向测定培养基中补充1.5mm的丙磺舒(英杰公司，参考号p36400)以减少靶细胞的钙黄绿素的自发释放。在37℃/5％co2下孵育一个半小时后通过在每个孔中测量钙黄绿素从死细胞中释放，分析了ct26.wt靶细胞的浓度依赖性杀伤。每个测定板包括实验孔和对照孔的组合。几种不同类型的对照孔用于解释(i)从靶细胞的钙黄绿素自发释放(靶自发)和(ii)从靶细胞的最大钙黄绿素释放(靶最大)。如下计算特异性杀伤百分比：(实验-靶自发)/(靶最大-靶自发)。对于每种靶细胞系，以ng/ml确定半最大有效浓度(ec50)。
[0547]
将10,000个hct-116或ovcar-3细胞铺板到96孔板中的50ul低igg cr10 50um 2-me 100iu/ml人il-2中，并在acea xcelligence上于37度孵育51小时。在肿瘤铺板后51小时，针对100ul测定培养基的最终体积，以50ul添加指定浓度的100e3个nk细胞和nkg2d-fc。在肿瘤铺板后72小时或添加nk细胞后21小时读取杀伤，并通过将添加nk细胞之前的阻抗设定为100％活并且将添加肿瘤细胞之前的阻抗设定为0％活进行归一化。在添加nk细胞后96小时，分离孔的非贴壁级分进行流式细胞术，并用抗cd56(艺生物科学公司cmssb pe-cy7)、抗cd69(艺生物科学公司h1.2f3 fitc)、抗cd45(艺生物科学公司hi30 apc-cy7)、抗nkg2d(赛默飞世尔公司1d11 bv421)和活/死蓝(赛默飞世尔公司l34962)染色，并在becton dickinson fortessa和flowjo(树星公司(treestar))上进行分析(参见，例如，图17a-17e)。
[0548]
从在4e6/10ml cr10 50ng/ml m-csf(派普泰克公司(peprotech))/10cm培养皿中培养的冲洗小鼠股骨骨髓产生原代小鼠巨噬细胞。每隔一天更新一次培养基，直到总共培
养2周为止。培养的第一周后，不添加另外的m-csf。两周后使用细胞刮刀收获巨噬细胞，并在rpmi 1640 10％fbs中以10um用细胞示踪紫(celltrace violet)(生命技术公司(life technologies))标记。转导以过表达人ulbp2的ct26.wt细胞在rpmi 1640 10％fbs中以1um用cfse标记。将50,000个ct26.wt细胞铺板到96孔v型底板中，并以效应子:靶比例为2:1添加小鼠巨噬细胞。然后以指定浓度添加nkg2d-fc。将细胞在37度下孵育2.5小时，然后离心并在流动前立即在100ul pbs 2％fbs 2mm edta中用1ug/ml 7-aad染色。通过在bd fortessa上的流式细胞术定量吞噬的细胞(cfse celltraceviolet )，并在flowjo中进行分析(参见，例如，图18)。
[0549]
将过表达重组人和食蟹猴nkg2d配体的1.5e4个工程改造的稳定ct26.wt细胞(靶细胞)重悬浮于补充有10％fbs的rpmi-glutamax培养基(吉布科公司)(测定培养基)中，并铺板在白色96孔板的孔中。将细胞与稀释在测定培养基中的不同摩尔浓度的二聚体nkg2d-fc变体孵育。孵育一小时后，将9e4个fcγriiia v158 nfat萤光素酶jurkat(jnl)细胞(效应细胞)添加到实验孔中，从而产生靶细胞:效应细胞比例为1:6。将测定板在37℃和5％co2下孵育4小时。通过每孔添加60ul one-glo
tm
(普洛麦格公司)并避光在室温下孵育3分钟，揭示了fcγriiia受体的浓度依赖性激活。使用synergy ht读板仪(拜尔泰克公司)测量所得的生物发光。用减去背景的荧光信号确定以ng/ml为单位的半最大有效浓度(ec50)(参见，例如，图19a-19f)。
[0550]
表4.hh8分子和hh10分子的adcc ec50值
[0551][0552][0553]
实例8.体内pk
[0554]
向8-10周大的雌性c57bl/6小鼠注射5mg/kg的指定蛋白。在指定时间点，从尾静脉中抽出足以产生20-25ul血清的血液量，并离心以分离出血清。然后将血清冷冻，并且然后解冻。使用包被有生物素抗人(南方生物技术公司(southern biotech)2049-08)的msd链霉亲和素板，添加小鼠血清，并使用抗人sulfotag(南方生物技术公司2049-01)检测并根据制造商的说明检测信号来定量人igg1。然后在msd仪器上读取样品并进行定量。使用衍生自hek细胞的材料以5mg/kg剂量在hh8和sqx244上初始小鼠pk显示出nkg2d-fc的快速消除和
短血清半衰期。与hek相比，cho细胞衍生的材料在小鼠和nhp中具有显著改善的pk。来自cho的hh8和sqx244具有与igg同种型相似的pk，其中分布阶段稍微更快。在测试剂量下，未观察到由于膜靶介导的药物处置(tmdd)导致的快速消除，并且在nhp中未检测到抗药物抗体(ada)。来自cho-hysi的高唾液酸化对pk没有另外的影响，并且因此对于在先导研发阶段进一步表征而言，cho-hysi被取消选择(参见，例如，图20a-20b)。
[0555]
表5.pk参数
[0556][0557][0558]
给52-77个月大的雌性食蟹猴注射1至100mg/kg的hh8。在指示时间点，从股静脉中抽出足以产生200-250ul血清的血液量，并离心以分离出血清。然后将血清冷冻，并且然后解冻。使用fc捕获或靶捕获对人igg1进行定量。对于fc捕获，将链霉亲和素包被的板用生物素抗人(南方生物技术公司2049-08)包被，并且对于基于靶的捕获，将微量滴定板直接用mica包被。然后添加食蟹猴血清并用hrp缀合的抗人(南方生物技术公司2049-05)检测。使用比色法读出来测量信号。将来自基于fc捕获的pk测定的单个食蟹猴pk数据连同食蟹猴中典型的igg pk预测一起作图。食蟹猴中典型的igg pk预测基于两区室pk模型，其中对于3kg猴，v1＝41ml/kg，v2＝44ml/kg，cl＝6ml/天/kg和q＝17ml/天/kg(dostalek m等人,mabs,2017)。除了稍微更快的分布和消除阶段外，hh8 pk通常与典型的igg抗体pk相当(参见，例如，图21a-21b)。
[0559]
实例9.体内pd
[0560]
ct26.wt细胞(atcc)被工程改造以过表达人ulbp2，并在rpmi-1640 10％热灭活的fbs中扩增。将1e6细胞皮下植入6-8周龄balb/c小鼠(杰克森公司(jackson))的左上胁。从第0天开始，给小鼠腹膜内注射5mg/kg的人igg1同种型或hek hh8。每隔一天重复注射一次，共6个剂量。在第6个剂量后2天，收获肿瘤并消化成单细胞悬浮液，用抗cd45、抗nkp46和抗cd8染色，并在bd fortessa和flowjo上进行分析。nk细胞被鉴定为nkp46 cd45 细胞。cd8 t细胞被鉴定为cd8 cd45 细胞，并对浸润到肿瘤中的百分比进行定量(参见，例如，图22a-22b)。
[0561]
el4细胞经工程改造以过表达人mica*001。将这些细胞在dmem 10％热灭活的fbs
中扩增，然后将500e3个细胞皮下植入6-8周龄c57bl/6小鼠(杰克森公司)的右上胁。然后在肿瘤植入后第2天给小鼠给予20mg/kg hh8或人igg1同种型，并在5天后通过酶消化来收获肿瘤，并用抗cd69、抗nkg2d、抗cd45、抗nkp46染色，并在bd fortessa和flowjo上进行分析。nk细胞被鉴定为nkp46 cd45 细胞。计算了cd69和nkg2d中值荧光强度，并在此处给出(参见，例如，图23a-23b)。
[0562]
实例10.体内功效
[0563]
el4细胞经工程改造以过表达人mica*001。将这些细胞在dmem 10％热灭活的fbs中扩增，然后将500e3个细胞皮下植入6-8周龄c57bl/6小鼠(杰克森公司)的右上胁。然后在肿瘤植入后第2、9和16天给予小鼠5mg/kg hh8、hh10或人igg1同种型。用卡尺测量肿瘤，并以达到1,000mm3的时间计算存活(参见，例如，图24a-24b)。
[0564]
表6.序列表
[0565]
[0566]
[0567]
[0568]
[0569]
[0570]
[0571]
[0572]
[0573]
[0574]
[0575]
[0576]
[0577]
[0578]
[0579]
[0580]
[0581]
[0582]
[0583]
[0584]
[0585]
[0586]
[0587]
[0588]
[0589]
[0590]
[0591]
[0592]
[0593]
[0594]
[0595]
[0596]
[0597][0598]
等同物
[0599]
本文引用的每一个专利、专利申请和出版物的公开内容据此通过引用以其整体并入本文。虽然已经参照具体方面公开了本发明，但是本领域其他技术人员可以在不偏离本发明的真实精神以及范围的情况下设想本发明的其他方面以及变化。所附权利要求旨在理解为包括所有这类方面以及等同变化。