一种获取胎盘间充质干细胞的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种获取胎盘间充质干细胞的方法。


背景技术：

2.间充质干细胞是一类具有自我复制和分化能力的多潜能细胞。在一定条件下，间充质干细胞可以分化成多种功能细胞。
3.目前，酶消化法是常用的获取胎盘间充质干细胞的方法，该方法采用组织消化酶孵育消化胎盘块，经过过滤后收集单个核细胞，然后再进行培养，得到克隆细胞后用msc培养基培养，再用胰酶进行消化传代，得到胎盘间充质干细胞。但是，该方法操作繁琐，而且消化时间和消化酶浓度不易控制，同时，获得的胎盘间充质干细胞的细胞活率偏低。这并不利于获取胎盘间充质干细胞，因此，需要一种新的胎盘间充质干细胞提取方法来替代酶消化法。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种提取胎盘间充质干细胞的方法。所述技术方案如下：
5.一方面，本发明提供了一种获取胎盘间充质干细胞的方法，所述方法包括：
6.将脐带与胎盘分离，并将所述胎盘清洗干净，去掉羊膜层，以脐带位置为中心剪取所述脐带位置四周的绒毛膜板；
7.去除所述绒毛膜板上的绒毛、粘液和血管，得到干净的绒毛膜板；
8.将所述干净的绒毛膜板剪成组织块；
9.将所述组织块置于生理盐水中并进行离心，得到沉淀；
10.吸取所述沉淀平铺于培养皿上进行接种；
11.接种完成后，静置所述培养皿至所述组织块固定在所述培养皿上；
12.向固定好所述组织块的培养皿中加入第一培养基并进行培养；
13.在培养过程中向所述组织块中补液，收获原代胎盘间充质干细胞。
14.具体地，所述方法包括：将获得的所述绒毛膜板浸没在生理盐水中待用。
15.具体地，所述组织块的大小为1～2mm2。
16.具体地，将去除粘液的所述绒毛膜板置于生理盐水中，再去除所述绒毛膜板上的血管。
17.具体地，吸取所述沉淀0.5～1ml平铺于规格为100mm的培养皿上。
18.具体地，向所述培养皿中加入5ml所述第一培养基。
19.具体地，所述补液的方法包括：
20.待接种完成后的第3～4天，进行第一次补液；
21.向每个所述培养皿中加入5ml所述第一培养基，并置于二氧化碳培养箱中培养；
22.于接种完成后的第6～7天，进行第二次补液；
23.向每个所述培养皿中再加入5ml所述第一培养基，并置于二氧化碳培养箱中培养；
24.于接种完成后的第9～10天，进行第三次补液；
25.向每个所述培养皿中又加入5ml所述第一培养基，并置于二氧化碳培养箱中培养，得到所述原代胎盘间充质干细胞；
26.具体地，所述方法包括：将所述原代胎盘间充质干细胞进行传代，包括：
27.取所述培养皿中的原代胎盘间充质干细胞置于离心管中进行离心备用；
28.向所述原代胎盘间充质干细胞的培养皿中加入5ml氯化钠注射液进行清洗；
29.向清洗后的所述原代胎盘间充质干细胞的培养皿中加入3ml tryple
tm
express phenol red晃动培养瓶，静置消化；
30.待所述原代胎盘间充质干细胞收缩并从所述培养瓶的瓶底脱落形成圆形亮点后终止消化，得到细胞悬液；
31.将所述细胞悬液转移至50ml离心管中，在所述培养皿中加入5ml氯化钠注射液，震荡清洗，收集清洗液，与所述细胞悬液混合；
32.以(0.80～1.20)
×
104个/cm2的密度接种于培养瓶中。
33.本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：该方法获取的胎盘间充质干细胞，操作简单耗时短，且细胞活率较高，可作为获取胎盘间充质干细胞的技术趋势。
附图说明
34.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
35.图1是本发明实施例提供的接种完成后的组织块的照片；
36.图2是本发明实施例提供的组织块周围细胞爬出情况照片；
37.图3是本发明实施例提供的传代的细胞在镜下的细胞形态的照片；
38.图4是本发明实施例提供的冻存的细胞取出后镜下的细胞形态照片；
39.图5是本发明实施例提供的传代细胞中的传代细胞的流式细胞术分析结果的二维图，图中横坐标和纵坐标均为散射光信号相对强度的值；
40.图6是本发明实施例提供的传代细胞中的p1的流式细胞术分析结果图，图中横坐标为散射光信号相对强度的值，纵坐标为相对细胞数；
41.图7是本发明实施例提供的传代细胞中的p2的流式细胞术分析结果图，图中横坐标为散射光信号相对强度的值，纵坐标为相对细胞数；
42.图8是本发明实施例提供的传代细胞中的p3的流式细胞术分析结果图，图中横坐标为散射光信号相对强度的值，纵坐标为相对细胞数；
43.图9是本发明实施例提供的传代细胞中的p4的流式细胞术分析结果图，图中横坐标为散射光信号相对强度的值，纵坐标为相对细胞数；
44.图10是本发明实施例提供的传代细胞中的p5的流式细胞术分析结果图，图中横坐标为散射光信号相对强度的值，纵坐标为相对细胞数；
45.图11是本发明实施例提供的传代细胞中的p6的流式细胞术分析结果图，图中横坐
标为散射光信号相对强度的值，纵坐标为相对细胞数；
46.图12是本发明实施例提供的传代细胞中的p7的流式细胞术分析结果图，图中横坐标为散射光信号相对强度的值，纵坐标为相对细胞数；
47.图13是本发明实施例提供的传代细胞中的p8的流式细胞术分析结果图，图中横坐标为散射光信号相对强度的值，纵坐标为相对细胞数；
48.图14是本发明实施例提供的传代细胞中的p9的流式细胞术分析结果图，图中横坐标为散射光信号相对强度的值，纵坐标为相对细胞数；
49.图15是本发明实施例提供的传代细胞中的p10的流式细胞术分析结果图，图中横坐标为散射光信号相对强度的值，纵坐标为相对细胞数；
50.图16是本发明实施例提供的传代细胞中的p11的流式细胞术分析结果图，图中横坐标为散射光信号相对强度的值，纵坐标为相对细胞数。
具体实施方式
51.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。
52.实施例
53.本发明实施例提供了一种获取胎盘间充质干细胞的方法，该方法包括：
54.组织选取及预处理：选取检测合格的胎盘，将脐带与胎盘分离，并将胎盘用生理盐水清洗干净，用手术剪去掉羊膜层，以脐带位置为中心剪取脐带位置四周的绒毛膜板，同时注意避开血管。将获得的绒毛膜板浸没在生理盐水中待用。在实现时，可将获得的绒毛膜板浸没在盛有生理盐水的平皿中。
55.清洗：去除绒毛膜板上的绒毛、粘液和血管，得到干净的绒毛膜板，并置于离心管中；具体地，用镊子去除绒毛膜板上的绒毛，用手术剪的刀背刮除绒毛膜板上的粘液，刮2～3次，然后再去掉绒毛膜板上的血管；
56.在刮除粘液的过程中，要更换新的培养皿；
57.将除净粘液的绒毛膜板装进干净的规格为50ml离心管中。
58.剪碎：将干净的绒毛膜板剪成组织块；具体地，用手术剪剪碎绒毛膜板，使其成为(1～2)mm2的小块；
59.向离心管中加满生理盐水，于500g离心加速度下离心5min，弃掉上清液，得到沉淀。
60.接种：用巴氏吸管吸取0.5～1ml沉淀平铺于1个规格为100mm的培养皿上进行接种；
61.接种完成后，打开皿盖静置20～30min，同时观察组织块是否固定在培养皿上，如果并未固定则应继续静置直至组织块固定在培养皿上为止；接种完成后的组织块如图1所示。
62.向固定好组织块的培养皿中加入5ml第一培养基，在培养皿的外壁上贴上带有id的标签，并于co2培养箱中进行培养，培养箱中培养的温度为37℃，二氧化碳的浓度为5％；
63.在本实施例中，第一培养基包括：α-mem基础培养基 elitegrotm-adv(血清替代物)，使血清替代物的终浓度占总体积的10％。
64.在培养过程中向组织块中补液，收获原代胎盘间充质干细胞。
65.具体地，补液的方法包括：
66.待接种完成后的第3～4天，进行第一次补液；
67.向每个100mm的培养皿中加入5ml第一培养基，并置于二氧化碳培养箱中培养，培养箱中培养的温度为37℃，二氧化碳的浓度为5％；
68.于接种完成后的第6～7天，镜下观察组织块周围细胞爬出情况及细胞形态，拍照记录，拍照结果如图2所示，由图2可见，通过显微镜可观察到细胞已经形成较大的集落，并进行第二次补液；
69.向每个培养皿中再加入5ml第一培养基，并置于二氧化碳培养箱中培养，培养箱中培养的温度为37℃，二氧化碳的浓度为5％；
70.于接种完成后的第9～10天，镜下观察组织块周围细胞爬出情况及细胞形态，拍照记录，并进行第三次补液；
71.向每个培养皿中又加入5ml第一培养基，并置于二氧化碳培养箱中培养，培养箱中培养的温度为37℃，二氧化碳的浓度为5％，得到原代胎盘间充质干细胞；
72.具体地，该方法包括：将原代胎盘间充质干细胞进行传代，包括：
73.将需要传代的细胞培养皿从培养箱中拿出，镜下观察细胞形态和汇合率，拍照记录；拍照结果图3所示。
74.取培养皿中的原代胎盘间充质干细胞置于离心管中进行离心备用，具体地，用移液枪吸取100mm平皿中的细胞上清置于50ml离心管中备用，离心时的离心加速度为600g离心时间为5min；
75.向原代胎盘间充质干细胞的培养皿中加入5ml氯化钠注射液进行清洗；
76.向清洗后的原代胎盘间充质干细胞的培养皿中加入3ml trypletmexpress phenol red晃动培养瓶，使其覆盖瓶底，静置消化2min；其中，trypletmexpress phenol red为一种无动物源的重组酶，用于解离多种贴壁哺乳动物细胞。
77.待原代胎盘间充质干细胞收缩并从培养瓶的瓶底脱落形成圆形亮点后终止消化，得到细胞悬液；具体地，加入等体积的备用上清终止消化，并吹打均匀。
78.将细胞悬液转移至50ml离心管中，在培养皿中加入5ml氯化钠注射液，震荡清洗，收集清洗的细胞悬液，与细胞悬液混合；
79.将混合后的细胞悬液于400g离心加速度下离心5min，弃掉上清液，得到第一细胞沉淀，向第一细胞沉淀中加入2～5ml第一培养基进行重悬，重悬之后取100μl计数；
80.以(0.80～1.20)
×
104个/cm2的密度接种于t75 cm2培养瓶中，向t75 cm2培养瓶中补加第二培养基至10ml在培养瓶外贴上带有id的标签，将标注好的培养瓶置于co2培养箱中培养。其中，第二培养基包括：α-mem基础培养基 elitegrotm-adv(血清替代物)，使血清替代物的终浓度占总体积的5％。
81.具体地，该方法还包括：
82.冻存：将需要冻存的细胞取出，镜下观察细胞形态和汇合率，拍照记录，拍照结果如图4所示；
83.用移液管吸取细胞上清置于50ml离心管中，离心加速度为600g离心时间为5min，备用；
84.向t75 cm2培养瓶中加入5ml氯化钠注射液清洗清洗1次，吸取清洗液丢弃；
85.向培养瓶中加入3ml trypletmexpress phenol red，晃动培养瓶，使其覆盖瓶底，静置消化2min。镜下观察消化情况，至细胞收缩，从瓶底脱落形成圆形亮点即可；
86.加入等体积的备用上清终止消化，将细胞悬液转移至50ml离心管中。
87.向培养瓶中加入5ml氯化钠注射液，震荡清洗，收集清洗的细胞悬液，与之前的细胞悬液混合。取上述悬液100μl计数；
88.将剩余细胞悬液于400g离心加速度下离心5min。倒去剩余上清，保留第二细胞沉淀，冻存液重悬，装入冻存管；在本实施例中，p0～p2代细胞的冻存密度为(1.00～5.00)
×
106个/ml；
89.在冻存管(使用程序降温盒)外贴上带有id的标签；降温后放入-80℃冰箱待检测结果为合格后方可转入液氮罐中。
90.用流式细胞仪检测传代的原代胎盘间充质干细胞的表面抗原标记，获得的结果如图5至图16所示，传代细胞中的p1至p11的表达量分别为0.04％、0.04％、0.04％、0.11％、0.02％、0.31％、99.96％、99.93％、99.73％、99.97％和99.98％。
91.细胞str检测：
92.取适量检材用microread genomic dna kit提取dna，采用microreadertm21 id system扩增20个str位点和性别鉴定位点，使用abi3730xl型遗传分析仪进行pcr产物检测，使用genemapperid-x软件(applied biosystems)对检测结果进行分析，并与atcc和dsmz数据库进行比对。
93.实验中阴性及阳性对照结果均正确。
94.检测样品细胞dna扩增后图谱清晰，分型结果良好，该细胞的str位点和amelogenin位点的基因分型结果见表1所示，同时，检测结果多等位基因数量为0。
95.表1为数据库比对展示匹配度最高的结果
96.[0097][0098]
由表1可知，该细胞dna进行细胞str分型结果显示，细胞中没有发现人类细胞交叉污染。该细胞与atcc中hcc1500breast ductal carcinomahuman细胞的str数据匹配率为78％。该细胞与dsmz中的hup-t4细胞str数据匹配率(ev值)为0.72。
[0099]
该方法获取的胎盘间充质干细胞，操作简单耗时短，且细胞活率较高，可作为获取胎盘间充质干细胞的技术趋势。
[0100]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。