一种拮抗植物病原菌的生防菌株及其应用

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种拮抗植物病原菌的生防菌株及其应用。


背景技术：

2.马铃薯为我国四大粮食作物之一，栽培面积居世界首位，随着栽培面积的不断增加，导致土传病害加重。马铃薯枯萎病是由镰刀菌(fusarium)引起的一类真菌性土传病害，全国各地普遍发生，重茬地更为严重且病菌复杂，遗传变异性强，防治难度大，严重时导致整株枯死，造成减产严重，严重影响我国马铃薯产业发展。
3.目前，马铃薯枯萎病的防治措施以化学防治为主，但化学药剂的长期单一使用会导致病原菌产生抗药性，并且严重威胁环境及食品安全。生物防治具有绿色、无污染，不产生抗药性，对人畜无害等优点，是目前最有应用前景的防治方法。


技术实现要素：

4.因此，基于以上背景，本发明提供一种拮抗植物病原菌的生防菌株，其对马铃薯枯萎病的致病菌具有优异的拮抗的特性，并且对茄匐柄霉菌、立枯丝核菌也具有良好的拮抗作用。
5.本发明提供的技术方案为：
6.一种拮抗植物病原菌的生防菌株，其为贝莱斯芽孢杆菌，保藏编号为：cgmcc no.23555。
7.进一步地，所述植物病原菌包括茄匐柄霉菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、短肥镰刀菌。
8.进一步地，所述生防菌株具有固氮、解磷、产蛋白酶的特性。
9.进一步地，所述生防菌株对四环素和链霉素具有抗性。
10.本发明还提供了上述生防菌株的应用，其可用于制备用来防治马铃薯枯萎病的制品。
11.本发明还提供了上述生防菌株的发酵液应用，其可用于制备用来防治马铃薯枯萎病的制品。
12.进一步地，所述制品为用来防治马铃薯枯萎病的农药或肥料。
13.本发明还可用来制备用于抑制上述植物病原菌的制品，所述制品可以为农药或肥料。
14.采取上述技术方案，具有的有益效果如下：
15.本发明的生防菌株为从内蒙古呼和浩特市的番茄园的根际土壤中筛选出的新的菌株，该菌株经检测结果分析为贝莱斯芽孢杆菌；经过试验验证，该菌株不仅对茄匐柄霉菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌等具有优异的拮抗作用，并且其还具有固氮、解磷、产蛋白酶等特性，因此其除了具有拮抗性外，本身还有利于植物的生长；可为防治马铃薯枯萎病病原菌
及其茄匐柄霉菌等病原菌的生物防治提供菌源和基础。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
17.图1为本发明实施例中的番茄固氮细菌拮抗效果照片；
18.图2为本发明实施例番茄细菌抑菌率柱状对比图；
19.图3为本发明实施例的生防菌株fqd25与fqc7上清液对禾谷镰刀菌抑菌实验效果；
20.图4为本发明实施例的生防菌株fqd25与fqc7发酵液对病原真菌的抑制活性曲线图；
21.图5为本发明实施例生防菌株fqd25发酵液对4种病原真菌抑制效果照片；
22.a为尖孢镰刀菌；b为短肥镰刀菌；c为立枯丝核菌；d为茄匐柄霉菌；每组图片左边为对照组，右边为处理组；
23.图6为本发明实施例生防菌株fqd25功能特性研究相关照片；
24.a：胶体几丁质平板；b：产蛋白酶培养基；c：有机磷卵磷脂平板；d：无机磷磷酸三钙平板；e：无机磷磷矿粉平板；
25.图7为本发明实施例不同饱和度硫酸铵浓度提取物对病原菌菌落大小影响；
26.注：ck为清水对照、1：30％硫酸铵提取、2：50％硫酸铵提取、3：70％硫酸铵提取
27.图8为本发明实施例中的不同菌株解有机磷效果照片；
28.图9为本发明的不同菌株解磷矿粉效果照片；
29.图10为本发明的生防菌株fqd25凝胶电泳照片；
30.本发明的所述生防菌株fqd25的保藏编号为cgmcc no.23555；保藏日期为2021年10月09日；其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)；保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
31.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.下面结合附图对本发明做进一步说明。
33.实施例1：本实施例中从番茄植株及土壤样品对fqd25进行筛选。
34.土壤样品来源：番茄植株及土壤样品于2021年4月21日采自内蒙古呼和浩特市贺新草莓园(40.663199
°
n,111.775257e)番茄大田。
35.本实施例所用培养基为：lb培养基，马铃薯葡萄糖琼脂培养基，阿须贝培养基，蒙金娜无机磷培养基，有机磷卵磷脂培养基，磷矿粉培养基。
36.本实施例供试病原真菌由内蒙古农业大学病毒实验室保存。
37.1、相关实验的操作如下：
38.1)菌株筛选实验
39.内生细菌的分离与纯化：新鲜的植物根、茎、叶组织清洗干净后，晾干，在无菌操作台依次采用75％乙醇、1％次氯酸钠各2min进行表面消毒，无菌水反复重新洗3-5次，将根茎叶分别剪成小块称取1g，在无菌研钵种加入1ml无菌水充分研磨后加入到8ml无菌水中180r/min充分震荡30min制成菌悬液母液，稀释成10-1
、10-2
、10-3
、10-4
进行lb培养基涂布，每板50微升，每个梯度3个重复，28℃培养2-3天，根据菌的外观、形态、色泽，凹凸等特点进行挑取单菌落，在lb培养基上划线纯化培养，重复直至获得单菌落。
40.根际土壤细菌的分离：称取5g土样于三角瓶中，加入45ml水，28℃160r/min振荡30min，静置10分钟，即的土壤悬浮液母液，分别稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7选取10-4、10-5、10-6、10-7涂布于lb培养基上，每板50微升，每个梯度3个重复，28摄氏度培养2-3天，待菌落长出在lb培养基划线纯化培养，所有分离得到的番茄根茎叶以及土壤中的细菌50％甘油保存。
41.2)固氮能力研究
42.阿须贝无氮培养基划线，28℃培养5天观察有无菌落生长。
43.3)拮抗能力研究
44.采用五点对峙法初筛，将供试病原真菌活化，打取3mm菌饼接于pda培养基中央，周围点接4株待测细菌，28℃培养，每天观察记录，是否产生抑菌圈，可初步确定具有拮抗能力的菌株。
45.采用两点对峙法复筛，将供试病原真菌菌饼接于培养基中点左侧2cm处，初筛得到的所具有拮抗能力的菌株点接于中点右侧2cm处，每株菌3个重复，28℃培养5天，测定抑菌带宽度及计算抑菌率。
46.fqd25和fqc7发酵液对禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)的抑制活性，为将上述2株拮抗菌株接种lb摇床震荡培养测定od600≈0.6，吸取上述菌液2ml接种于100ml lb培养基，28℃、180r/min培养2天，4℃、12000r/min离心10min，0.22μm细菌过滤器抽滤灭菌，pda固体培养基与细菌发酵液10：1制成含有发酵液平板，每个处理3个重复，0.5mm打孔器制作上述病原真菌菌饼，接种于pda平板中央，2、3、4、5天观察，十字交叉法测量菌落直径并记录。
47.4)菌株fqd25抑菌普测定
48.方法同3)中发酵液对其他4种病原真菌抑制活性测定。
49.5)溶磷能力研究
50.菌株解磷定性：将纯化后的菌株点接于蒙金娜无机磷、磷矿粉、有机磷卵磷脂培养基上，每株菌3个重复，28℃培养一周，观察菌株周围是否有透明圈的产生，以此来判断是否具有解磷能力，并记录测量透明圈的直径(d)与菌落的直径(d)，计算可溶性指数d/d。
51.6)生防菌株fqd25对温室盆栽马铃薯枯萎病病菌的防治效果
52.以fqd25为供试菌株，采用温室马铃薯盆栽法研究生防菌株对马铃薯枯萎病的防治效果，将播种于无菌基质土中20天后分为3个处理组每组20个重复。采用管根法以菌株fqd25发酵液浇灌盆栽马铃薯根际土壤，每株30ml，隔48h再进行一次浇灌，以多菌灵1500倍液为阳性对照，以清水为阴性对照ck，于最后一次处理间隔24h后接种镰刀菌包子悬液
20ml，待阳性对照表现明显症状后观察盆栽马铃薯发病情况，参考马铃薯枯萎病病情分级标准进行调查，计算病情指数。病情指数＝100
×
∑(各级病株数
×
相对级数值)/(调查总株数
×
最高级代表值)，防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数
×
100。
53.孢子悬浮液制备：病原真菌接种于pdb培养基，28℃、180r/min摇床培养，无菌纱布过滤掉菌丝，血球计数板观察计算孢子数为10
6-107cfu/ml备用。
54.土壤的处理：菌株fqd25接种于lb培养基测定od600＝0.8，育苗基质与菌悬液为1：10充分混合搅拌。以拌有多菌灵1500倍液化学基质为阳性对照。
55.7)菌株fqd25生理生化鉴定与16srdna鉴定及系统发育树的构建
56.参照《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰细菌鉴定手册》对菌株进行生理生化鉴定，包括v.p实验、柠檬酸盐、丙酸盐、d-木糖、l-阿拉伯糖、d-甘露醇、明胶液化、7％氯化钠生长、ph5.7生长、硝酸盐还原、淀粉水解等11项实验。细菌全基因组序列提取试剂盒提取细菌dna后，采用细菌通用引物7f-1540r进行pcr扩增，反应体系为(25μl)：r-taq 0.125μl、dntp 2μl、10
×
buffer 2.5μl、引物各1μl、dna模板1μl、ddh2o补足，反应程序：98℃3min、98℃10s、52℃30s、72℃1min40s、34个循环72℃10min。pcr产物进行电泳检测。送去北京六合华大基因科技有限公司测序后得到拼接序列，通过与blast数据库中的所有序列进行核苷酸同源性比较，mega 7.0构建系统发育树。菌株fqd25通过提取dna采用16srdna通用引物7f和1540r，得到pcr产物大小约1500kb，测序成功，通过ncbi进行blast分析。菌株fqd25通过11种生理生化鉴定(见表1)以及16srdna序列分析结果见seq id1，初步鉴定为芽孢杆菌，归属于贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)。
57.表1：菌株fqd25生理生化鉴定
[0058][0059]
8)数据处理
[0060]
单因素方差分析采用spss 20.0(p《0.05)，graphpad prism 8进行数据分析和作图。不同字母代表存在显著性差异。
[0061]
2、实验结果与分析
[0062]
1)番茄细菌固氮能力研究
[0063]
从番茄根、叶、土壤共分离得到79株番茄细菌作为供试菌株，通过阿须贝无氮培养基划线培养，79株番茄细菌中有15株不能固氮；排除不能固氮的菌株；
[0064]
2)番茄固氮菌抑菌作用研究
[0065]
通过初筛和复筛，共获得35株可以拮抗马铃薯枯萎病禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)的番茄菌株，选取其中6株抑菌效果好的菌株，见图1和2，分别命名为fac7、fqd25、fad56、fqa7、fqd39、fqd36，其中fqa7为番茄根内生细菌，fqc7为叶内生细菌，其他4
株来自根际土壤。
[0066]
通过图3和图4可以明显看出fqd25和fqc7上清液对禾谷镰刀菌具有明显抑制作用，抑制效果显示为：fd25》fqc7，且从第三天开始两株细菌发酵液对病原真菌的抑制活性具有明显差异。
[0067]
并且本实施例中还以fqd25为供试菌株制备发酵液，测定其对4种病原真菌的抑制活性，结果显示对：fqd25发酵液对4种病原真菌均具有不同程度的抑制作用，对茄匐柄霉菌的抑制效果最好，几乎达到了100％(图5和表2)，对短肥镰刀菌抑制效果不明显，但经菌株fqd25发酵液处理后，与对照相比菌落颜色有所变化，表面菌丝极少。
[0068]
表2：生防菌株fqd25发酵液对4种病原真菌的抑制活性研究
[0069][0070]
3)菌株fqd25的功能特性研究
[0071]
通过不同筛选培养基，测定菌株fqd25固氮、解有机磷及无机磷、产几丁质酶、产蛋白酶、及对7种抗生素的耐药性(见图6)，结果显示菌株fqd25在ashby培养基上可以生长并在有机磷、无机磷磷矿粉及蛋白酶培养基上又透明圈出现，但并没有产几丁质酶特性。7种抗生素抗性实验表明：菌株对链霉素和四环素具有抗性。
[0072]
本实施例中采用的7种抗生素的及其浓度见表3。
[0073]
表3：7种抗生素及其浓度
[0074][0075]
本实施例中对不同的菌株的解有机和无机磷进行实验，结果见图8和图9、表4。图中显示了6株菌都具有解有机磷特性，在无机磷磷酸三钙培养基上均不产生透明圈，磷源换为磷矿粉时fqd56、fqc7、fqd25有溶磷圈的产生。
[0076]
表4：菌株对有机磷的溶解能力
[0077][0078]
4)菌株fqd25抑菌物质初步研究
[0079]
本实施例中还以不同饱和度硫酸铵沉淀菌株fqd25无菌发酵液蛋白，测定不同浓度下的硫酸铵提取物对三种不同病原真菌的抑制活性，结果表示不同饱和度的蛋白粗提液对茄匐柄霉菌(stemphyliumsolaniweber)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)都具有抑制活性，对立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)无抑制作用，在硫酸铵为50％饱和度时对尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)的抑制效果最好，70％硫酸铵饱和度下对茄匐柄霉菌(stemphyliumsolaniweber)抑制效果最佳(见图7)。
[0080]
5)菌株fqd25对温室盆栽马铃薯的防治作用
[0081]
盆栽实验结果表明：生防菌株对马铃薯的病情指数低于空白对照ck，ck的病情指数为85，接种生防菌株fqd25的病情指数为50，比ck减少了35，防治效果为41.17％，略低于多菌灵对马铃薯的防效(具体见表5)。
[0082]
表5：生防菌株fqd25对马铃薯枯萎病的防治效果
[0083][0084]
本发明中的生防菌株fqd25的发酵液对盆栽马铃薯防治枯萎病的实验，结果表明：具有明显的防治效果，并且病情指数具有明显下降。同时进行了菌株fqd25的功能特性研究，结果显示生防菌株fqd25具有解磷、固氮、产蛋白酶等功，其使用有利于植物的生长。
[0085]
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。