高效液相色谱法测定硫辛酸原料及制剂中有关物质的方法与流程

1.本发明属于药品质量检测技术领域，具体涉及一种高效液相色谱法测定硫辛酸原料及制剂中有关物质的方法。


背景技术：

2.硫辛酸(alpha lipoic acid)是一种存在于线粒体的辅酶，具备很高的自由基反应能力，能消除体内的自由基，具有消炎抗衰老的功效。目前被广泛应用于预防和治疗心脏病、糖尿病、肝病和老年痴呆。
3.硫辛酸原料及制剂不稳定，容易产生杂质，主要包含杂质a、还原杂质、单氧化杂质、双氧化杂质1、双氧化杂质2、杂质h等。为确保药品安全需要对以上杂质进行控制。目前没有公开的对上述杂质的检测方法，因此需要提供一种硫辛酸原料及制剂有关物质的检测方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种高效液相色谱法测定硫辛酸原料及制剂中有关物质的方法，该方法专属性好、灵敏度高、准确度高、耐用性好，便于对硫辛酸原料及制剂的质量检测与监控，有利于硫辛酸的安全推广与应用。
5.为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：
6.所述的高效液相色谱法测定硫辛酸原料及制剂中有关物质的方法，流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为磷酸氢二钠溶液，所述流动相b为乙腈，采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，
7.在第0～15min，所述流动相a的体积为86.5％，所述流动相b的体积为13.5％；
8.在第15～25min，所述流动相a的体积由86.5％递减为65％，所述流动相b的体积由13.5％递增为35％；
9.在第25～60min，所述流动相a的体积为65％，所述流动相b的体积为35％；
10.在第60～65min，所述流动相a的体积由65％递减为45％，所述流动相b的体积由35％递增为55％；
11.在第65～80min，所述流动相a的体积为45％，所述流动相b的体积为55％；
12.在第80～81min，所述流动相a的体积由45％递增为86.5％，所述流动相b的体积由55％递减为13.5％；
13.在第81～90min，所述流动相a的体积为86.5％，所述流动相b的体积为13.5％。
14.本发明发现，采用高效液相色谱法对硫辛酸原料及制剂中容易出现的杂质进行检测时，流动相的选择对杂质的分离有较大的影响，经过大量尝试发现，当采用上述方法进行梯度洗脱时，可以很好地将硫辛酸原料及制剂中容易出现的杂质区分出来。
15.本发明所述的硫辛酸原料及制剂有关物质包括硫辛酸及杂质，所述杂质为选自杂质a、还原杂质、单氧化杂质、双氧化杂质1、双氧化杂质2、杂质h中的一种或一种以上混合
物。
[0016][0017]
通过本发明中的方法可同时将上述6个已知杂质与其他未知杂质分离开来。
[0018]
为了进一步提升检测的准确性和灵敏性，本发明对高效液相色谱法的其他条件进行了优化，得到如下优选方案：
[0019]
流动相a磷酸氢二钠溶液的浓度为0.002～0.004mol/l，优选为0.003mol/l。
[0020]
流动相a磷酸氢二钠溶液的ph值为2.8～3.2，优选为3.0。
[0021]
采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂。
[0022]
色谱柱的规格为4.6mm
×
250mm，5μm。优选为菲罗门ace excel 5c18-amide，4.6mm
×
250mm，5μm。
[0023]
流动相的流速为0.8～1.2ml/min，优选为1.0ml/min。
[0024]
本发明所述的高效液相色谱法测定硫辛酸原料及制剂中有关物质的方法，优选采用以下条件进行测定：
[0025]
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱的规格为菲罗门ace excel 5c18-amide，4.6mm
×
250mm，5μm；
[0026]
流动相a：浓度为0.002～0.004mol/l、ph值为2.8～3.2的磷酸氢二钠溶液；
[0027]
流动相b：乙腈；
[0028]
柱温：30～40℃；
[0029]
检测波长：210nm～220nm；
[0030]
流速：0.8～1.2ml/min；
[0031]
采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，
[0032]
在第0～15min，所述流动相a的体积为86.5％，所述流动相b的体积为13.5％；
[0033]
在第15～25min，所述流动相a的体积由86.5％递减为65％，所述流动相b的体积由13.5％递增为35％；
[0034]
在第25～60min，所述流动相a的体积为65％，所述流动相b的体积为35％；
[0035]
在第60～65min，所述流动相a的体积由65％递减为45％，所述流动相b的体积由35％递增为55％；
[0036]
在第65～80min，所述流动相a的体积为45％，所述流动相b的体积为55％；
[0037]
在第80～81min，所述流动相a的体积由45％递增为86.5％，所述流动相b的体积由55％递减为13.5％；
[0038]
在第81～90min，所述流动相a的体积为86.5％，所述流动相b的体积为13.5％。
[0039]
供试品溶液的配制：用乙腈将硫辛酸原料及制剂溶解，并用磷酸氢二钠溶液稀释为8.0～12.0mg/ml作为供试品溶液。
[0040]
对照品溶液的配制：用乙腈溶解杂质对照品，并用磷酸氢二钠溶液稀释作为混合对照溶液；
[0041]
其中，所述杂质对照品选自杂质a、还原杂质、单氧化杂质、双氧化杂质1、双氧化杂质2、杂质h中的一种或一种以上混合物；
[0042]
所述杂质的浓度为0.01～0.03mg/ml。
[0043]
采用上述浓度范围的供试品溶液和混合对照溶液均可以较为清晰准确地测出供试品中各成分的含量，在实际应用中为了方便计算，可将供试品溶液的浓度及混合对照溶液中各成分的浓度在上述范围内按比例设置。如设置供试品溶液中硫辛酸的含量为10mg/ml，混合对照溶液中各杂质的浓度均为0.02mg/ml，可以在保证准确的同时，更有利于各成分含量的计算。为了同时达到上述目的，在本发明限定范围内对各组分的浓度可以有多种按比例设置方式，在此不做进一步限定。
[0044]
在实际应用时，优选将供试品溶液过滤后再注入液相色谱仪。
[0045]
稀释用的磷酸氢二钠溶液的浓度为0.05mol/l，ph值为2.6
±
0.1。
[0046]
本发明中采用的磷酸氢二钠溶液(流动相a和稀释用的磷酸氢二钠溶液)的ph值通过磷酸进行调节。
[0047]
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0048]
本发明提供的方法可在高效液相色谱图中将硫辛酸原料及制剂中有关物质(包含硫辛酸和至少6种常见杂质)分离开来；并通过对条件的优化，使得对各组分检测的灵敏性及其含量的准确性进一步得到提升。该方法专属性好、灵敏度高、准确度高、耐用性好，便于对硫辛酸原料及制剂的质量检测与监控，有利于硫辛酸的安全推广与应用。
附图说明
[0049]
图1是本发明一种硫辛酸原料及制剂系统适用性色谱图；
[0050]
图2是本发明一种硫辛酸原料及制剂空白溶剂色谱图；
[0051]
图3是本发明一种硫辛酸片空白辅料色谱图。
具体实施方式
[0052]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0053]
实施例1
[0054]
一种高效液相色谱法测定硫辛酸原料及制剂中有关物质的方法，采用以下条件进行测定：
[0055]
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
[0056]
流动相a：浓度为0.003mol/l、ph值为3.0的磷酸氢二钠溶液；
[0057]
流动相b：乙腈；
[0058]
柱温：35℃；
[0059]
检测波长：215nm；
[0060]
流速：1.0ml/min；
[0061]
采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，
[0062]
在第0～15min，所述流动相a的体积为86.5％，所述流动相b的体积为13.5％；
[0063]
在第15～25min，所述流动相a的体积由86.5％递减为65％，所述流动相b的体积由13.5％递增为35％；
[0064]
在第25～60min，所述流动相a的体积为65％，所述流动相b的体积为35％；
[0065]
在第60～65min，所述流动相a的体积由65％递减为45％，所述流动相b的体积由35％递增为55％；
[0066]
在第65～80min，所述流动相a的体积为45％，所述流动相b的体积为55％；
[0067]
在第80～81min，所述流动相a的体积由45％递增为86.5％，所述流动相b的体积由55％递减为13.5％；
[0068]
在第81～90min，所述流动相a的体积为86.5％，所述流动相b的体积为13.5％。
[0069]
用乙腈将硫辛酸原料及制剂溶解并用磷酸氢二钠溶液稀释为10.0mg/ml的供试品溶液，混合对照溶液中各杂质的浓度均为0.02mg/ml。所述磷酸氢二钠溶液的浓度为0.05mol/l，ph值为2.6。
[0070]
各溶液的具体配制过程及本发明方法的试验验证过程及结果见实验1～4。
[0071]
实验1：专属性试验
[0072]
空白辅料溶液：精密称取硫辛酸片空白混合辅料192mg，置50ml量瓶中，加乙腈25ml，超声5min，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为空白辅料溶液。
[0073]
混合对照溶液：精密称取杂质a、还原杂质、单氧化杂质、双氧化杂质1、双氧化杂质2、杂质h各10mg，分别置10ml量瓶中，加乙腈5ml使溶解，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)稀释至刻度，摇匀，作为各杂质对照品贮备液，分别精密量取2ml，置同一100ml量瓶中，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)稀释至刻度，摇匀，作为混合对照溶液。
[0074]
供试品溶液：精密称取硫辛酸片细粉适量(相当于硫辛酸500mg)，置50ml量瓶中，加乙腈25ml，超声5min，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)稀释至刻度，
摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0075]
对照溶液：精密量取上述供试品溶液1ml，置50ml量瓶中，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置20ml量瓶中，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
[0076]
系统适用性溶液：精密量取各杂质对照品贮备液适量，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)稀释制成各含0.1mg/ml的溶液，作为混合对照溶液(系统适用性溶液用)。精密称取硫辛酸原料100mg，置10ml量瓶中，加乙腈4ml使溶解，精密加入2ml混合对照溶液(系统适用性溶液用)，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。
[0077]
测定：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相a为0.003mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调ph值至3.0)，流动相b为乙腈，柱温为35℃，检测波长为215nm，流速1.0ml/min，进样体积50μl，采用梯度洗脱，其运行的比例变化过程见表1。
[0078]
表1有关物质梯度洗脱程序
[0079][0080]
精密量取上述各溶液50μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果见表2，系统适用性色谱图见附图1，空白溶剂色谱图见图2，空白辅料色谱图见图3。
[0081]
表2有关物质方法学-专属性-系统适用性结果
[0082][0083]
结论：空白溶剂、空白辅料均不干扰供试品溶液中有关物质的检测，系统适用性溶液中各峰与其相邻色谱峰之间的分离度均符合规定，表明本发明提供的高效液相色谱法测定硫辛酸片有关物质的方法的专属性良好。
[0084]
实验例2：线性与范围试验
[0085]
硫辛酸和各杂质贮备液：精密称取硫辛酸、杂质a、还原杂质、单氧化杂质、双氧化杂质1、双氧化杂质2和杂质h各10mg，分别置不同10ml量瓶中，加乙腈5ml使溶解，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)稀释至刻度，摇匀，作为硫辛酸和各杂质贮备液。
[0086]
线性溶液：精密量取硫辛酸和各杂质储备液1ml置同一10ml量瓶中，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)稀释至刻度，摇匀，作为线性储备液。分别精密量取以上线性储备液3ml、2ml置不同10ml量瓶中，加0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)稀释至刻度，摇匀。分别作为线性150％、线性100％的溶液。精密量取线性150％的溶液5ml置10ml量瓶中，加0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)稀释至刻度，摇匀。作为线性75％的溶液。精密量取线性100％的溶液5ml置10ml量瓶中，加0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)稀释至刻度，摇匀。作为线性50％的溶液。精密量取线性75％的溶液5ml置10ml量瓶中，加0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)稀释至刻度，摇匀。作为线性37.5％的溶液。作为线性50％的溶液。精密量取线性50％的溶液5ml置10ml量瓶中，加0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)稀释至刻度，摇匀。作为线性25％的溶液。另取硫辛酸及各杂质定量限溶液。
[0087]
精密量取上述各溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表3。
[0088]
表3有关物质方法学-线性结果
[0089]
成分标准曲线线性与范围r单氧化杂质y＝20102x-4637.82.9899～29.8987μg/ml0.9997双氧化杂质1y＝5488.8x 715.832.0377～30.5656μg/ml0.9999双氧化杂质2y＝2409.7x
–
48.4771.9221～28.8311μg/ml1.0000
杂质hy＝27758x 1697.90.2034～30.5059μg/ml1.0000硫辛酸y＝23020x 3057.30.1020～30.5922μg/ml1.0000还原杂质y＝5617.2x
–
3540.81.2190～30.4744μg/ml0.9998杂质ay＝39453x 3849.90.2008～30.1194μg/ml1.0000
[0090]
结论：单氧化杂质在2.9899～29.8987μg/ml浓度范围内(相当于限度浓度的15％～150％)，线性方程为y＝20102x-4637.8，相关系数r为0.9997＞0.990，峰面积与浓度线性关系良好。
[0091]
双氧化杂质1在2.0377～30.5656μg/ml浓度范围内(相当于限度浓度的10％～150％)，线性方程为y＝5488.8x 715.83，相关系数r为0.9999＞0.990，峰面积与浓度线性关系良好。
[0092]
双氧化杂质2在1.9221～28.8311μg/ml浓度范围内(相当于限度浓度的10％～150％)，线性方程为y＝2409.7x
–
48.477，相关系数r为1.0000＞0.990，峰面积与浓度线性关系良好。
[0093]
杂质h在0.2034～30.5059μg/ml浓度范围内(相当于限度浓度的1％～150％)，线性方程为y＝27758x 1697.9，相关系数r为1.0000＞0.990，峰面积与浓度线性关系良好。
[0094]
硫辛酸在0.1020～30.5922μg/ml浓度范围内(相当于限度浓度的0.5％～150％)，线性方程为y＝23020x 3057.3，相关系数r为1.0000＞0.990，峰面积与浓度线性关系良好。
[0095]
还原杂质在1.2190～30.4744μg/ml浓度范围内(相当于限度浓度的5％～150％)，线性方程为y＝5617.2x
–
3540.8，相关系数r为0.9998＞0.990，峰面积与浓度线性关系良好。
[0096]
杂质a在0.2008～30.1194μg/ml浓度范围内(相当于限度浓度的1％～150％)，线性方程为y＝39453x 3849.9，相关系数r为1.0000＞0.990，峰面积与浓度线性关系良好。
[0097]
实验例3：回收率试验
[0098]
供试品溶液：精密称取硫辛酸片细粉适量(相当于硫辛酸500mg)，置50ml量瓶中，加乙腈25ml，超声5min，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0099]
各杂质贮备液：精密称取杂质a、还原杂质、单氧化杂质、双氧化杂质1、双氧化杂质2和杂质h各10mg，分别置不同10ml量瓶中，加乙腈5ml使溶解，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)稀释至刻度，摇匀，作为各杂质贮备液。
[0100]
回收率对照品贮备液：精密量取各杂质贮备液5ml置同一50ml量瓶中，加0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)稀释至刻度，摇匀，即得。
[0101]
回收率对照品溶液：精密量取各杂质贮备液2ml，置同一100ml量瓶中，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)稀释至刻度，摇匀，即得。
[0102]
回收率供试品溶液：精密称取硫辛酸片细粉适量(相当于硫辛酸100mg)，置10ml量瓶中，加乙腈4.5ml，超声5min，精密加入上述回收率对照品贮备液1ml，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，同法配制3份，作为50％回收率供试品溶液；精密称取硫辛酸片细粉适量(相当于硫辛酸100mg)，置10ml量瓶中，加乙腈4ml，超声5min，精密加入上述回收率对照品贮备液2ml，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，同法配制3份，作为100％
回收率供试品溶液；精密称取硫辛酸片细粉适量(相当于硫辛酸100mg)，置10ml量瓶中，加乙腈3.5ml，超声5min，精密加入上述回收率对照品贮备液3ml，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，同法配制3份，作为150％回收率供试品溶液。
[0103]
精密量取上述溶液各50μl，分别注入液相色谱仪，结果见表4。
[0104]
表4有关物质方法学-回收率结果
[0105]
成分相当于限度50％相当于限度100％相当于限度150％平均回收率％单氧化杂质100.098.699.499.3双氧化杂质195.597.197.996.8双氧化杂质296.897.896.196.9杂质h103.4101.2100.5101.7还原杂质102.6100.4102.7101.9杂质a99.898.498.098.7
[0106]
结论：50％、100％、150％浓度下，各杂质的组内平均回收率及组间平均回收率均在90％～108％之间，表明本方法用于检测上述杂质，准确度良好。
[0107]
实验例4：耐用性试验
[0108]
空白辅料溶液：精密称取硫辛酸片空白混合辅料192mg，置50ml量瓶中，加乙腈25ml，超声5min，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为空白辅料溶液。
[0109]
混合对照溶液：精密称取杂质a、还原杂质、单氧化杂质、双氧化杂质1、双氧化杂质2、杂质h各10mg，分别置10ml量瓶中，加乙腈5ml使溶解，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)稀释至刻度，摇匀，作为各杂质对照品贮备液，分别精密量取2ml，置同一100ml量瓶中，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)稀释至刻度，摇匀，作为混合对照溶液。
[0110]
供试品溶液：精密称取硫辛酸片细粉适量(相当于硫辛酸500mg)，置50ml量瓶中，加乙腈25ml，超声5min，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0111]
对照溶液：精密量取上述供试品溶液1ml，置50ml量瓶中，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置20ml量瓶中，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
[0112]
系统适用性溶液：精密量取各杂质对照品贮备液适量，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)稀释制成各含0.1mg/ml的溶液，作为混合对照溶液(系统适用性溶液用)。精密称取硫辛酸原料100mg，置10ml量瓶中，加乙腈4ml使溶解，精密加入2ml混合对照溶液(系统适用性溶液用)，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。
[0113]
精密量取上述溶液50μl，于各色谱条件下注入液相色谱仪，结果见表5～6。
[0114]
表5有关物质方法学-耐用性-系统适用性结果
[0115]
[0116]
[0117][0118]
表6有关物质方法学-耐用性-杂质检出情况
[0119]
[0120][0121]
结论：当柱温变化
±
5℃、磷酸盐浓度变化
±
0.001mol/l，流动相ph值变化
±
0.2以及更换相同厂家、相同型号、不同批号色谱柱的条件下，与正常条件相比，系统适用性及杂质检出量均无明显差异。上述结果表明，色谱条件有微小变动(柱温变化
±
5℃、磷酸盐浓度变化
±
0.001mol/l，流动相ph值变化
±
0.2以及更换相同厂家、相同型号、不同批号色谱柱)时，本色谱条件耐用性良好。
[0122]
实验例5：灵敏度试验
[0123]
考察各杂质和硫辛酸的检测限和定量限。取各杂质及硫辛酸对照品贮备溶液适量用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至2.6)-乙腈(1：1)逐步稀释，信噪比为10:1时对应的样品浓度即为定量限，信噪比为3:1时对应的样品浓度即为检测限。
[0124]
精密量取上述溶液50μl，注入液相色谱仪，结果见表7～8。
[0125]
表7有关物质方法学-灵敏度-定量限
[0126][0127]
表8有关物质方法学-灵敏度-检测限
[0128]
[0129][0130]
结论：以上结果表明，各杂质及硫辛酸的定量限和检测限均良好，该方法的灵敏度良好。
[0131]
根据以上实验例测试结果可知，本技术提供的一种高效液相色谱法测定硫辛酸原料及制剂中有关物质的方法，操作简单、易控，灵敏度高，具有良好的专属性、线性和范围、准确性和耐用性，为监测产品质量提供了一种有效的检测方法，进一步保障了产品的安全性。
[0132]
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。本文所述硫辛酸制剂包括常见剂型，如片剂、注射剂和颗粒剂等。