一种盐酸阿比多尔中间体有关物质的检测方法与流程

1.本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种盐酸阿比多尔中间体有关物质的检测方法。


背景技术：

2.盐酸阿比多尔(arbidol hydrochloride)是一种具有免疫增强作用的非核苷类广谱抗病毒药物，其化学名为1-甲基-2-苯硫甲基-4-二甲氨甲基-5-羟基-6-溴
‑ꢀ
1h-吲哚-3-甲酸乙酯盐酸盐，用于治疗甲、乙型流感病毒等引起的上呼吸道感染。阿比多尔是苏联药物化学研究中心研制的非核苷类抗病毒药物，于1993 年在俄罗斯首次上市，在俄罗斯用于治疗流行性感冒已有多年。目前，阿比多尔的疗效已经得到国际专家的认可和青睐，并在日本和欧洲一些国家上市， 2006年在中国获准上市。
3.sr-5化学名称为6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯，是合成盐酸阿比多尔的重要中间体，主要以乙酸乙酯、甲胺水溶液为原料，通过缩合甲氨基化、内尼采斯库环化、酰化、溴化、苯硫化反应合成得到。由于合成时间工艺较长、产品中可能引入副产物及未反应完全的原料，因此，sr-5作为合成盐酸阿比多尔的重要中间体，其质量控制对合成盐酸阿比多尔的有很大影响。
4.在合成sr-5时引入的副产物或未反应的原料均有可能成为合成盐酸阿比多尔时的杂质，且目前并没有相关文献报道该杂质的检测方法，因此，亟需研发一种可以对sr-5的质量进行有效控制的检测方法，进而保证对盐酸阿比多尔质量的效控制，以完善行业标准。


技术实现要素：

5.鉴于此，本发明提供一种盐酸阿比多尔中间体有关物质的检测方法，具有优异的灵敏度、精密度和线性关系，能够满足sr-5原料药中int1-b、int1-c、 int1-d、int1-e和int1-f的检测要求，其中int1-b、int1-c、int1-d、 int1-e和int1-f的结构、名称如下表所示。
[0006][0007]
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
[0008]
本发明第一方面提供一种盐酸阿比多尔中间体有关物质的检测方法，所述盐酸阿比多尔中间体为6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯(sr
‑ꢀ
5)，所述检测方法包括以下步骤：
[0009]
步骤一、配制供试品溶液和对照品溶液；
[0010]
对照品溶液的配制：取5-乙酰氧基-6-溴-2-溴甲基-1-甲基吲哚-3-羧酸乙酯、 1,2-二甲基-6-溴-5-羟基吲哚-3-羧酸乙酯、6,7-二溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯、6-溴-5-乙酰氧基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯、6-溴
‑ꢀ
5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯和5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3
‑ꢀ
羧酸乙酯对照品，用溶剂配制成对照品溶液；
[0011]
供试品溶液的配制：取6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯样品，用溶剂配制成供试品溶液；
[0012]
步骤二、采用液相色谱对所述供试品溶液和对照品溶液进行检测，所述液相色谱的色谱条件为：
[0013]
采用c18色谱柱，以体积比为63～67:33～37的乙腈-水为流动相a，以体积比为38
～42:38～42:18～22的乙腈-甲醇-水为流动相b，梯度洗脱，检测波长为249nm～259nm。
[0014]
相当于现有技术，本技术提供的盐酸阿比多尔中间体有关物质的检测方法具有以下优势：
[0015]
本技术提供的盐酸阿比多尔中间体有关物质的检测方法，实现对6-溴-5
‑ꢀ
羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯(sr-5)中杂质int1-b、int1-c、 int1-d、int1-e和int1-f的定量和定性分析，该方法专属性强，灵敏度高，满足sr-5原料药中int1-b、int1-c、int1-d、int1-e和int1-f的检测要求，而且，其线性关系良好，重复性高，标准曲线的线性范围内的相关系数都大于 0.99；此外，该检测方法还具有分析时间快，能够快速、准确地对sr-5原料药中的杂质int1-b、int1-c、int1-d、int1-e和int1-f进行检测，整个操作过程可靠、可控，适于实际应用和推广，具有广阔的应用前景。
[0016]
可选的，所述梯度洗脱的程序如下：
[0017]
0min
→
14min，100％流动相a，0％流动相b；
[0018]
14min
→
14.1min，0％流动相a，100％流动相b；
[0019]
14.1min
→
25min，0％流动相a，100％流动相b；
[0020]
25min
→
25.1min，100％流动相a，0％流动相b；
[0021]
25.1min
→
35min，100％流动相a，0％流动相b。
[0022]
梯度洗脱对检测目标物的分离效果和峰形有着显著影响，因此，本技术优选的梯度洗脱顺序能将int1-b、int1-c、int1-d、int1-e、int1-f与6-溴
‑ꢀ
5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯(sr-5)或其他干扰物进行分离，分离效果优异。
[0023]
可选的，所述流动相a为体积比为65:35的乙腈-水，所述流动相b为积比为40:40:20的乙腈-甲醇-水。
[0024]
进一步可选的，所述检测波长为254nm。
[0025]
可选的，流速为0.9ml/min～1.1ml/min，柱温为25℃～35℃。
[0026]
进一步可选的，流速为1ml/min，柱温为30℃。
[0027]
优选的流速和柱温，能够使得杂质int1-b、int1-c、int1-d、int1-e、 int1-f既能在短时间内出峰，减少分析时间，还能兼顾该色谱峰具有优异的分离效果。
[0028]
可选的，所述色谱柱的规格为4.6mm
×
250mm
×
5μm。
[0029]
可选的，所述色谱柱的型号为capcell pak c18。
[0030]
不同的色谱柱对化合物的保留性能差别较大，因此本技术采用capcellpak c18柱，规格为4.6mm
×
250mm
×
5μmm，能够实现目标物的快速有效分离，且峰形较好。
[0031]
可选的，所述供试品溶液的浓度为0.28mg/ml～0.32mg/ml。
[0032]
进一步可选的，所述供试品溶液的浓度为0.3mg/ml。
[0033]
可选的，所述对照品溶液中的5-乙酰氧基-6-溴-2-溴甲基-1-甲基吲哚-3-羧酸乙酯、1,2-二甲基-6-溴-5-羟基吲哚-3-羧酸乙酯、6,7-二溴-5-羟基-1-甲基-2
‑ꢀ
苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯、6-溴-5-乙酰氧基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯和5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯的浓度均为3μg/ml。
[0034]
可选的，所述溶剂为乙腈。
[0035]
优选乙腈为溶剂，不仅保证能尽量少的提取除int1-b、int1-c、int1-d、 int1-e和int1-f之外的物质，还能尽可能的将sr-5原料药中的int1-b、 int1-c、int1-d、int1-e和
int1-f提取出来，且对液相色谱的检测基本无干扰，保证本发明提供的液相色谱检测结果更准确。
附图说明
[0036]
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0037]
图1是本发明实施例1提供的对照品溶液的高效液相色谱图；
[0038]
图2是本发明实施例1提供的供试品溶液的高效液相色谱图；
[0039]
图3是本发明实施例1提供的空白溶液的高效液相色谱图；
[0040]
图4是本发明提供的int1的线性关系图；
[0041]
图5是本发明提供的int1-b的线性关系图；
[0042]
图6是本发明提供的int1-c的线性关系图；
[0043]
图7是本发明提供的int1-d的线性关系图；
[0044]
图8是本发明提供的int1-e的线性关系图；
[0045]
图9是本发明提供的int1-f的线性关系图。
具体实施方式
[0046]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0047]
实施例1
[0048]
本发明实施例提供一种盐酸阿比多尔中间体有关物质的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0049]
步骤一、配制供试品溶液、对照品溶液和空白溶液；
[0050]
对照品溶液的配制：取5-乙酰氧基-6-溴-2-溴甲基-1-甲基吲哚-3-羧酸乙酯、 1,2-二甲基-6-溴-5-羟基吲哚-3-羧酸乙酯、6,7-二溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯、6-溴-5-乙酰氧基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯、5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯和6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚
‑ꢀ
3-羧酸乙酯对照品，用乙腈配制成各组分浓度均为3μg/ml的对照品溶液；
[0051]
供试品溶液的配制：取6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯样品，用乙腈配制成浓度为0.3mg/ml的供试品溶液；
[0052]
上述空白溶液为乙腈溶剂；
[0053]
步骤二、采用液相色谱对上述对照品溶液、供试品溶液和空白溶液进行检测，记录谱图，其色谱图分别如图1、图2和图3。
[0054]
上述液相色谱的色谱条件为：
[0055]
采用capcell pak c18，规格为4.6mm
×
250mm
×
5μm的色谱柱，以体积比为65:35的乙腈-水为流动相a，以体积比为40:40:20的乙腈-甲醇-水为流动相b，梯度洗脱，流速为
1ml/min，柱温为30℃，检测波长为254nm，进样体积为10μl，其中梯度洗脱的程序如下：
[0056]
0min
→
14min，100％流动相a，0％流动相b；
[0057]
14min
→
14.1min，0％流动相a，100％流动相b；
[0058]
14.1min
→
25min，0％流动相a，100％流动相b；
[0059]
25min
→
25.1min，100％流动相a，0％流动相b；
[0060]
25.1min
→
35min，100％流动相a，0％流动相b。
[0061]
从图1中可以看出，6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯(主成分int1)与其他杂质int1-b、int1-c、int1-d、int1-e、int1-f的色谱峰分离度良好，其中在保留时间为12.941min处出现杂质int1-b的色谱峰、在保留时间5.562min处出现杂质int1-c的色谱峰，在保留时间19.733min处出现杂质int1-d的色谱峰，在保留时间19.171处出现杂质int1-e的色谱峰，在保留时间7.374min处出现杂质int1-f的色谱峰，在保留时间11.75min处出现 6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯的色谱峰。
[0062]
从图2中可以看出，int1-c、int1-d、int1-e和int1(6-溴-5-羟基-1
‑ꢀ
甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯)的色谱峰分离度良好，int1-b和int1-f 均未检出。
[0063]
从图1-图3中可以看出，乙腈溶剂和sr-5原料药对杂质int1-b、int1-c、 int1-d、int1-e、int1-fd的检测无干扰，说明本发明提供的液相色谱法专属性良好。
[0064]
实施例2
[0065]
本发明实施例提供一种盐酸阿比多尔中间体有关物质的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0066]
步骤一、配制供试品溶液和对照品溶液；
[0067]
对照品溶液的配制：取5-乙酰氧基-6-溴-2-溴甲基-1-甲基吲哚-3-羧酸乙酯、 1,2-二甲基-6-溴-5-羟基吲哚-3-羧酸乙酯、6,7-二溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯、6-溴-5-乙酰氧基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯、5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯和6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚
‑ꢀ
3-羧酸乙酯对照品，用乙腈配制成各组分浓度均为3μg/ml的对照品溶液；
[0068]
供试品溶液的配制：取6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯样品，用乙腈配制成浓度为0.4mg/ml的供试品溶液；
[0069]
步骤二、采用液相色谱对上述对照品溶液和供试品溶液进行检测，液相色谱的色谱条件为：
[0070]
采用capcell pak c18、规格为4.6mm
×
250mm
×
5μm的色谱柱，以体积比为63:37的乙腈-水为流动相a，以体积比为38:42:20的乙腈-甲醇-水为流动相b，梯度洗脱，流速为1ml/min，柱温为30℃，检测波长为254nm，进样体积为10μl，其中梯度洗脱的程序如下：
[0071]
0min
→
14min，100％流动相a，0％流动相b；
[0072]
14min
→
14.1min，0％流动相a，100％流动相b；
[0073]
14.1min
→
25min，0％流动相a，100％流动相b；
[0074]
25min
→
25.1min，100％流动相a，0％流动相b；
[0075]
25.1min
→
35min，100％流动相a，0％流动相b。
[0076]
实施例3
[0077]
本发明实施例提供一种盐酸阿比多尔中间体有关物质的检测方法，所述检测方法
包括以下步骤：
[0078]
步骤一、配制供试品溶液和对照品溶液；
[0079]
对照品溶液的配制：取5-乙酰氧基-6-溴-2-溴甲基-1-甲基吲哚-3-羧酸乙酯、 1,2-二甲基-6-溴-5-羟基吲哚-3-羧酸乙酯、6,7-二溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯、6-溴-5-乙酰氧基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯、5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯和6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚
‑ꢀ
3-羧酸乙酯对照品，用乙腈配制成各组分浓度均为3μg/ml的对照品溶液；
[0080]
供试品溶液的配制：取6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯样品，用乙腈配制成浓度为0.2mg/ml的供试品溶液；
[0081]
步骤二、采用液相色谱对上述对照品溶液和供试品溶液进行检测，液相色谱的色谱条件为：
[0082]
采用capcell pak c18、规格为4.6mm
×
250mm
×
5μm的色谱柱，以体积比为67:33的乙腈-水为流动相a，以体积比为42:40:18的乙腈-甲醇-水为流动相b，梯度洗脱，流速为1ml/min，柱温为30℃，检测波长为254nm，进样体积为10μl，其中梯度洗脱的程序如下：
[0083]
0min
→
14min，100％流动相a，0％流动相b；
[0084]
14min
→
14.1min，0％流动相a，100％流动相b；
[0085]
14.1min
→
25min，0％流动相a，100％流动相b；
[0086]
25min
→
25.1min，100％流动相a，0％流动相b；
[0087]
25.1min
→
35min，100％流动相a，0％流动相b。
[0088]
实施例4
[0089]
本发明实施例提供一种盐酸阿比多尔中间体有关物质的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0090]
步骤一、配制供试品溶液和对照品溶液和；
[0091]
对照品溶液的配制：取5-乙酰氧基-6-溴-2-溴甲基-1-甲基吲哚-3-羧酸乙酯、 1,2-二甲基-6-溴-5-羟基吲哚-3-羧酸乙酯、6,7-二溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯、6-溴-5-乙酰氧基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯、5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯和6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚
‑ꢀ
3-羧酸乙酯对照品，用乙腈配制成各组分浓度均为3μg/ml的对照品溶液；
[0092]
供试品溶液的配制：取6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯样品，用乙腈配制成浓度为0.3mg/ml的供试品溶液；
[0093]
步骤二、采用液相色谱对上述对照品溶液和供试品溶液进行检测，液相色谱的色谱条件为：
[0094]
采用capcell pak c18、规格为4.6mm
×
250mm
×
5μm的色谱柱，以体积比为65:35的乙腈-水为流动相a，以体积比为40:40:20的乙腈-甲醇-水为流动相b，梯度洗脱，流速为1.1ml/min，柱温为35℃，检测波长为259nm，进样体积为10μl，其中梯度洗脱的程序如下：
[0095]
0min
→
14min，100％流动相a，0％流动相b；
[0096]
14min
→
14.1min，0％流动相a，100％流动相b；
[0097]
14.1min
→
25min，0％流动相a，100％流动相b；
[0098]
25min
→
25.1min，100％流动相a，0％流动相b；
[0099]
25.1min
→
35min，100％流动相a，0％流动相b。
[0100]
实施例5
[0101]
本发明实施例提供一种盐酸阿比多尔中间体有关物质的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0102]
步骤一、配制供试品溶液和对照品溶液；
[0103]
对照品溶液的配制：取5-乙酰氧基-6-溴-2-溴甲基-1-甲基吲哚-3-羧酸乙酯、 1,2-二甲基-6-溴-5-羟基吲哚-3-羧酸乙酯、6,7-二溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯、6-溴-5-乙酰氧基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯、5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯和6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚
‑ꢀ
3-羧酸乙酯对照品，用乙腈配制成各组分浓度均为3μg/ml的对照品溶液；
[0104]
供试品溶液的配制：取6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯样品，用乙腈配制成浓度为0.3mg/ml的供试品溶液；
[0105]
上述空白溶液为乙腈溶剂；
[0106]
步骤二、采用液相色谱对上述对照品溶液和供试品溶液进行检测，上述液相色谱的色谱条件为：
[0107]
采用capcell pak c18、规格为4.6mm
×
250mm
×
5μm的色谱柱，以体积比为65:35的乙腈-水为流动相a，以体积比为40:40:20的乙腈-甲醇-水为流动相b，梯度洗脱，流速为0.9ml/min，柱温为25℃，检测波长为249nm，进样体积为10μl，其中梯度洗脱的程序如下：
[0108]
0min
→
14min，100％流动相a，0％流动相b；
[0109]
14min
→
14.1min，0％流动相a，100％流动相b；
[0110]
14.1min
→
25min，0％流动相a，100％流动相b；
[0111]
25min
→
25.1min，100％流动相a，0％流动相b；
[0112]
25.1min
→
35min，100％流动相a，0％流动相b。
[0113]
实施例2～实施例5均能实现6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯(主成分int1)与其他杂质int1-b、int1-c、int1-d、int1-e、int1-f良好分离，且色谱峰的分离度良好。
[0114]
实施例6检测限和定量限
[0115]
检测限：将实施例1制备的各组分浓度为3μg/ml的对照品溶液采用乙腈逐级定量稀释，然后采用液相色谱进行检测，液相色谱的具体条件如实施例1 所述，记录谱图，按信噪比不低于3:1，得到检测限，结果见表1。
[0116]
定量限：将实施例1制备的各组分浓度为3μg/ml的对照品溶液采用乙腈逐级定量稀释，然后采用液相色谱进行检测，液相色谱的具体条件如实施例1 所述，记录谱图，按信噪比不低于10:1作为定量限，以信噪比不低于10:1作为检出限，结果见表1。
[0117]
表1检测限和定量限检测结果
[0118][0119]
实施例7重复性试验
[0120]
取同一批样品，按照实施例1所述盐酸阿比多尔中间体有关物质的检测方法的供试品制备方法制备6份供试品溶液，采用液相色谱进行检测，液相色谱的具体条件如实施例1所述，结果如表2所示。从表2中可以看出，int1-c、 int1-d、int1-e和int1(6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯) 的6次结果rsd％均小于5％，int1-b和int1-f均未检出，表明本技术提供的检测方法的重复性良好。
[0121]
表2重复性试验结果
[0122][0123]
实施例8中间精密度试验
[0124]
取实施例1所制备的供试品溶液，并采用液相色谱法进行检测，液相色谱的具体条件如实施例1所述，采用不同的检测人员在不同时间分别进样6次，每次进样10μl，检测结果见表3。从表3中可以看出，int1-c、int1-d、 int1-e和int1(6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯)的12次结果rsd％均小于5％，int1-b和int1-f均未检出，表明本技术提供的检测方法的中间精密度良好。
[0125]
表3中间精密度试验结果
[0126][0127]
实施例9稳定性
[0128]
取实施例1制备的供试品溶液，分别放置0h、2h、4h、6h、8h后，采用液相色谱进行检测，液相色谱的具体条件如实施例1所述，每次进样10μl，记录谱图，考察其含量，计算其rsd(％)，试验结果如下表4所示。从表4中可以看出，供试品溶液在室温条件下，放置8小时，int1-c、int1-d、int1
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e和int1(6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯)的rsd％均小于 5％，int1-b和int1-f均未检出，表明上述供试品溶液的稳定性均良好。
[0129]
表4稳定性试验结果
[0130][0131]
实施例10线性关系
[0132]
取6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯适量，用乙腈溶解并定量稀释制成系列浓度溶液，并采用液相色谱进行检测，液相色谱条件具体如实施例1所示，记录谱图，以浓度(μg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，结果见表5和图4。从结果中可以看出，int1 (6-溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯)在 0.1259μg/ml～6.0446μg/ml的浓度范围内线性关系良好。
[0133]
表5int1线性试验结果
[0134][0135]
取5-乙酰氧基-6-溴-2-溴甲基-1-甲基吲哚-3-羧酸乙酯(int1-b)用乙腈溶解并定量稀释制成系列浓度溶液，并采用液相色谱进行检测，液相色谱条件具体如实施例1所示，记录谱图，以浓度(μg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，结果见表6和图5。从结果中可以看出， int1-b在0.09623μg/ml～6.3720μg/ml的浓度范围内线性关系良好。
[0136]
表6 int1-b线性试验结果
[0137][0138]
取1,2-二甲基-6-溴-5-羟基吲哚-3-羧酸乙酯(int1-c)用乙腈溶解并定量稀释制成系列浓度溶液，并采用液相色谱进行检测，液相色谱条件具体如实施例1所示，记录谱图，以浓度(μg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，结果见表7和图6。从结果中可以看出，int1-c 在0.04153μg/ml～6.2291μg/ml的浓度范围内线性关系良好。
[0139]
表7 int1-c线性试验结果
[0140][0141]
取6,7-二溴-5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯(int1-d)用乙腈溶解并定量稀释制成系列浓度溶液，并采用液相色谱进行检测，液相色谱条件具体如实施例1所示，记录谱图，以浓度(μg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，结果见表8和图7。从结果中可以看出，int1-d在0.18528μg/ml～5.8508μg/ml的浓度范围内线性关系良好。
[0142]
表8 int1-d线性试验结果
[0143][0144][0145]
取6-溴-5-乙酰氧基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯(int1-e)用乙腈溶解并定量稀释制成系列浓度溶液，并采用液相色谱进行检测，液相色谱条件具体如实施例1所示，记录谱图，以浓度(μg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方
程，结果见表9和图8。从结果中可以看出，int1-e在0.12274μg/ml～5.8913μg/ml的浓度范围内线性关系良好。
[0146]
表9 int1-e线性试验结果
[0147][0148]
取5-羟基-1-甲基-2-苯硫甲基吲哚-3-羧酸乙酯(int1-f)用乙腈溶解并定量稀释制成系列浓度溶液，并采用液相色谱进行检测，液相色谱条件具体如实施例1所示，记录谱图，以浓度(μg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，结果见表10和图8。从结果中可以看出， int1-f在0.05314μg/ml～17.7119μg/ml的浓度范围内线性关系良好。
[0149]
表10 int1-f线性试验结果
[0150][0151]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。