一种利用CRISPR剪切技术提高ctDNA检测灵敏度的方法与流程

一种利用crispr剪切技术提高ctdna检测灵敏度的方法
技术领域
1.本技术属于基因检测领域，具体涉及到切割基因靶点并进行检测领域。


背景技术：

2.作为精准医疗方案的一部分，液体活检可以在一定程度上有效地做到提前诊断，为患者赢得时间同时可以进行指导用药并可以实时监测术后恢复等(snyder,m.w.et al.copy-number variation and false positive prenatal aneuploidy screening results.the new england journal of medicine 372,1639-1645,doi:10.1056/nejmoa1408408(2015))。在液体活检中，循环肿瘤dna(circulating cell-free dna,cfdna)检测是一项重要的组成部分。cfdna是一种游离于血浆或血清中的片段化的dna，大小约170bp，并被证明与转录因子有很强的相关性(snyder,m.w.,kircher,m.,hill,a.j.,daza,r.m.&shendure,j.cell-free dnacomprises an in vivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-origin.cell 164,57-68,doi:10.1016/j.cell.2015.11.050(2016))。在癌肿患者体内，主要来源于凋亡以及坏死的肿瘤细胞的cfdna则被称之为循环肿瘤dna(ctdna)(diehl,f.et al.circulating mutant dna to assess tumor dynamics.nature medicine 14,985-990,doi:10.1038/nm.1789(2008).)。由于ctdna主要来自于肿瘤坏死细胞，包含了肿瘤相关的表观遗传信息以及遗传信息，因此可以利用其实时检测肿瘤状态从而避免了穿刺手术给患者带来的痛苦。
3.在利用液态活检进行检测时需要解决低频突变难以解决的问题。通过下一代基因测序(ngs)进行检测低频突变位点时，由于非突变型位点模板绝对量高，会造成信号淹没的问题，从而无法真正识别低频突变位点(diaz,l.a.,jr.&bardelli,a.liquid biopsies:genotyping circulating tumor dna.journal ofclinical oncology:official journal of the american society of clinical oncology 32,579-586,doi:10.1200/jco.2012.45.2011(2014))。ddpcr虽然可以检测低频突变，但存在通量低的问题，无法充分利用稀有样本，也存在一定局限性(pan,w.,gu,w.,nagpal,s.,gephart,m.h.&quake,s.r.brain tumor mutations detected in cerebral spinal fluid.clinical chemistry 61,514-522,doi:10.1373/clinchem.2014.235457(2015))。
4.crispr(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)和cas核酸酶已经广泛应用于体内体外实验，用以精准切割靶向区域dna序列。2107年，w.gu等人就将crispr引进到rna测序以及针对单基因位点kras(c.35g》a,p.g12d)的检测(gu,w.et al.depletion ofabundant sequences by hybridization(dash):using cas9 to remove unwanted high-abundance species in sequencing libraries and molecular counting applications.genome biology 17,41,doi:10.1186/s13059-016-0904-5(2016))。但在该项目中，w.gu等就只针对一个位点进行切割并进行了分析。对于超低频率的突变、若其低于现有技术的检测限、则无法被识别，这是基因检测领域的痛点(检测灵敏度不足)，


技术实现要素：

5.发明目的：解决ctdna低频突变以及质量不佳的组织样本真实突变难以检测到的问题。
6.技术方案：
7.1、特异性的sgrna序列，其特征在于，sgrna的dna序列见表1。
8.2、特异性的sgrna的应用，其特征在于，应用于检测低频的ctdna(循环肿瘤dna)或应用到肿瘤细胞占比低的ffpe样本。
9.3、利用crispr技术剪切非突变靶点进而凸显低频突变的方法，对dna分子进行建库，设计特异性的sgrna，添加sgrna以及cas9进行体外处理，并将其与cas9蛋白在体外结合后加入到样品dna中，sgrna序列选择表1中任一种或/和多种，其特征在于，包括以下步骤：
10.a)从ffpe样本中提取gdna；
11.b)对步骤a)所得的gdna进行酶切打断后进行末端修复；
12.c)对经步骤b)处理的片段化的dna分子的两端连接含分子标签的接头；
13.d)对步骤c)中获得的dna分子进行纯化后，加入cas9以及sgrna进行切割；其中sgrna为sg-kras-gu-chr12:25398284以及sg-egfr-chr7:55249010；
14.e)对步骤d)中获得的dna分子进行纯化；进行pcr扩增；
15.f)对步骤e)所得dna文库进行杂交后进行深度测序，获得测序结果；
16.g)对步骤f)测序结果通过样品索引及分子标签进行鉴别分类，去除或降低ngs测序中pcr扩增以及测序阶段引入的系统误差后分析crispr处理前和处理后的特定位点频率的变化。
17.有益效果：本技术利用crispr系统需要cas9与sgrna结合才能精确识别靶向区域这一特点，并结合w.gu等人的研究，试图在同一个ngs反应中使用多个sgrna，可以在一次反应中同时针对多个位点，从而减少成本和提高效率。由于取样原因以及肿瘤异质性等问题的存在，不能保证所获的组织样本的肿瘤细胞组织达到检测标准。因此，可以利用本项发明对低质量的组织样本进行处理获得有用信息，进而更加精准地指导患者治疗。
18.本发明中，设计了12条sgrna，在项目中可以自由组合，最多同时切割12种靶向序列。相对w.gu的方案以及ddpcr等只能检测一个位点有了本质的提高。本发明也提供了位点选择原则和设计方法以及具体实验操作方法，可以根据需要针对更多位点进行设计sgrna和切割，用以识别更多位点，进一步提高其所占比率进而获得准确信息。本发明通过crispr剪切的方法实现2个关键基因(肺癌强相关)的关键位点(与临床用药指导密切相关)突变信号的放大、使得超低频率的突变可以被检测到，将使关键位点的基因检测灵敏度得到实质提升，有望惠及临床诊断及治疗。同时检测还有一个应用场景的创造性问题，做肿瘤早期诊断和筛查的技术人员对于超低频率的联合监测一直是难点，基本都是依赖pcr模板量以及超深度测序以积累数据进而分析，靠的是以量取胜的策略，本技术希望通过crispr技术剪切目标位点来实现超低频率的这两个基因的关键位点的检测(与肺癌用药指导直接相关)
19.且本技术且提供了可迁移的技术方案，对于其他癌种的其他位点，或可通行。本发明不仅可以针对离体的血液样本，也可以针对质量不佳的离体的组织样本。应用前景包括肿瘤液体活检早筛，用药指导等方面。具有检测灵敏度高，通量高以及效率高等优点。
附图说明
20.图1.crispr原理示意图；
21.图2a.通过qpcr检测表明，结果crispr处理后egfr-chr7:55249010以及kras-chr12:25398284所在的模板有所减少。经处理的egfr模板量是对照组的1/10，经处理的kras的模板量是对照组的1/5；
22.图2b.测序后对模板reads数进行统计发现kras-chr12:25398284以及egfr-chr7:55249010及其周边的位点的reads数显著下降。
具体实施方式
23.以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
24.本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。
25.本发明实施例中若特别说明，测序文库构建参照罗氏、illumina或abi的高通量测序文库构建说明书。
26.发明原理：在本发明利用ngs结合crispr技术可以针对两个或更多潜在低频突变位点进行联合检测。本发明基于crispr系统需要cas9与sgrna结合才能精确识别靶向区域的原理。sgrna与靶向区域互补，cas9则需要与靶向区域之后的pam(ngg)结合后才能发挥其功能。如果pam(ngg)发生了突变，特别是第二位的g发生了突变则无法切割目的序列。结合这些位点设计的sgrna也是本发明重点保护项目之一。
27.本发明所述的深度测序法采用的测序设备包括但不限于roche/454、illumina测序仪(nextseq系列，hiseq系列，miseq系列，xten，以及后续测序仪系列)、bgi(华大公司，bgi500系列以及后续测序仪)的测序仪、lifetech测序仪器(ion，proton以及后续测序仪器系列)、pacbio测序仪器(rsii，sequel以及后续测序仪器)或基于nanopore的测序仪器(genia，nanopore以及类似的第三代测序仪)。
28.本发明提供了一种利用crispr切割非突变型的dna并进行测序，从而提高突变型dna所占比率。本发明通过设计特异性的sgrna，并将其与cas9蛋白在体外结合后加入到样品dna中。sgrna可以识别并切割非突变型的dna，使其碎片化无法进行测序，进而凸显了低频的dna的突变频率。本发明适用于检测低频的ctdna(循环肿瘤dna),也可以应用到肿瘤细胞占比低的ffpe样本。在本发明中提供了一个可以同时切除多种非突变型dna的技术，并且可以根据需要灵活调整切除类型的技术。本发明一具体实施例中，检测肿瘤细胞占比低的ffpe样本，包括以下步骤：
29.a)从ffpe样本中提取gdna；
30.b)对步骤a)所得的gdna进行酶切打断后进行末端修复；
31.c)对经步骤b)处理的片段化的dna分子的两端连接含分子标签的接头；
32.d)对步骤c)中获得的dna分子进行纯化后，加入cas9以及sgrna进行切割；其中sgrna为sg-kras-gu-chr12:25398284以及
33.sg-egfr-chr7:55249010；
34.e)对步骤d)中获得的dna分子进行纯化；进行pcr扩增；
35.f)对步骤e)所得dna文库进行杂交后进行深度测序，获得测序结果；
36.g)对步骤f)测序结果通过样品索引及分子标签进行鉴别分类，去除或降低ngs测序中pcr扩增以及测序阶段引入的系统误差后分析crispr处理前和处理后的特定位点频率的变化。
37.在本发明一具体实施例中，所述的crispr系统特异性识别pam(ngg),当第二个g发生突变时crispr系统无法通过识别，结合并切除该段序列，从而得到保留。而非突变型则会被切除。本发明一具体实施例中根据pam以及突变位点设计sgrna。在本发明中针对的是有明确有临床意义或者具有潜在临床意义的位点。参考设计网站(http://crispr.mit.edu/batch)结果，根据所给分数采用sgrna，本项目中应用到的sgrna序列见表1，是本发明专利着重保护的方向之一。表1是本实施例中使用的sgrna的dna序列，在实际使用中通过逆转录形成rna分子。sgrna中，前20nt特异性识别靶向区域。
38.表1.逆转录成sgrna的原始dna序列
[0039][0040]
在本发明一具体实施例中，采用的是sg-kras-gu-chr12:25398284以及sg-egfr-chr7:55249010这两条sgrna对ffpe样本进行处理。所针对的靶点分别为chr12:25398284和chr7:55249010(表1黄色区域)。
[0041]
应用本发明的技术方案，通过一次性添加多种sgrna可以同时在一个反应内对多种非突变dna分子进行切割。在本发明中，首先要对dna分子进行建库，然后添加sgrna以及cas9进行体外处理，将靶向链切割成两条链。由于两条链不具有完整的p5/p7端，因此在下一步的pcr过程中，不能得到有效地扩增，所占比例下降。而同时，由于pam盒子缺失，cas9无法识别突变靶点区域，该区域可以完整保留接头部分，因此在pcr过程中可以得到有效扩
增，所占比例上升。本发明的检测原理示意见图1。
[0042]
下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0043]
实施例1
[0044]
分子标签结合深度测序法从外周血游离dna检测癌症基因的方法
[0045]
利用crispr技术剪切非突变靶点进而凸显低频突变的方法
[0046]
1、样本提取
[0047]
本实例中使用的是ffpe样本。dna提取方法按照qiaamp dna ffpe tissue handbook(qiagen)。ffpe样本经脱蜡，裂解，加热，柱结合dna，洗脱，溶解等步骤后获得dna样本。qubit定量。
[0048]
2、dna片段化
[0049]
按下表配比配制反应体系(以kapahyperprep kit建库试剂盒为例)
[0050]
试剂体积dna(200ng/不含edta) ddh2o35ulfragmentbuffer(盖)5ulfragmentenzyme(盖)10ul总计50ul
[0051]
冰上加样，混匀后放置在冰上。提前将pcr仪程序进行到以下条件，确保混样后可以立即进行反应。
[0052]
反应完成后，立即进行后续步骤。
[0053][0054]
3、末端修复及3’端加碱基a
[0055]
按下表配比配制反应体系(以kapahyperprep kit建库试剂盒为例)
[0056]
试剂体积提取好的游离dna模板50μl末端修复及a缓冲液7μl末端修复及加a酶混合液3μl总计60μl
[0057]
将配制好的反应体系按下表反应条件放入pcr仪进行反应
[0058]
步骤温度时间末端修复20℃(不盖热盖)30min加碱基a65℃(热盖85℃)30min
保温4℃(若立即连接，20℃)∞
[0059]
4、接头连接
[0060]
步骤3所得加a产物60μl无核酸酶水6μl连接缓冲液30μldna连接酶10μl步骤2所得接头4μl总计110μl
[0061]
将配制好的反应体系放于pcr仪上，20℃反应15min-4h。反应结束后，使用0.8x的ampure xp磁珠(贝克曼公司)进行纯化，31ul dd h2o溶解，取30ul dna。
[0062]
5、crispr处理
[0063]
反应体系：
[0064]
预先配置crispr体系(neb,m0386)，反应体系：
[0065][0066]
25℃反应10min后加入30ul dna，37℃反应15min后加入1.0μl proteinase k(neb，p8107s)室温孵育10min。
[0067]
反应结束后，使用1x的ampure xp磁珠(贝克曼公司)进行纯化，24ul dd h2o溶解，取23ul dna。
[0068]
6、pcr扩增放大模板量
[0069]
反应体系：
[0070]
试剂体积纯化的dna产物23μlp5index(25μm)1.0μlp7index(25μm)1.0μlkapahifihotstartreadymix(2x)25μl总计50μl
[0071]
反应条件：
[0072][0073][0074]
7.杂交
[0075]
取500ng dna，按照以下体系加入试剂后56℃干燥
[0076]
试剂体积混合好的杂交样本(《5ug)ncot-1human(1ug/ul)5ulxgenuniversalblockers-tsmix2ul
[0077]
使用idt探针进行杂交，按以下方法添加试剂溶解dna干燥产物
[0078]
试剂体积干燥的混合杂交样本(《5ug)-ddh2o1.8ulhybridizationbufferenhancer2.7ul2xhybridizationbuffer8.5ultotal13ul
[0079]
将回溶的杂交样本转移至0.2ml pcr管中，孵育95℃10min后，立即加入4ul xgen lockdown probe pool(0.75pmol/ul)。混匀后，立即65℃(热盖75℃)16h。
[0080]
8.磁珠捕获探针杂交产物
[0081]
将dynabeads m-270磁珠按照说明要求预处理后与探针杂交产物混合，之后按照产品说明进行洗涤，最后加入20ul ddh2o，重悬磁珠。
[0082]
带有m-270磁珠的dna产物进行pcr扩增。反应如下：
[0083]
试剂体积idt探针杂交捕获产物(带磁珠)23universal p5 primer(25p)1uluniversal p7 primer(25p)1ulkapa hifi hotstart readymix(2x)(绿盖)25ultotal50ul
[0084][0085]
9、文库检测及上机测序
[0086]
反应结束后，使用1x的ampure xp磁珠(贝克曼公司)进行纯化，41μldd h2o溶解，取40μl。分别取用1μl用qubit(life)和agilent 2100bioanalyzer检测。符合上机质量则进行测序。
[0087]
10、测序结果分析
[0088]
文库构建好后首先使用q-pcr检测dna模板量，通过特异性的引物(序列见表2)扩增模板来检测crispr处理的模板量是否减少。qpcr检测表明，结果crispr处理的样品，egfr模板量是对照组的1/10，kras的模板量是对照组的1/5(见图2a)。
[0089]
表2.本实施例中用以检测egfr-chr7:55249010以及kras-chr12:25398284的引物序列
[0090]
primerseqegfr-chr7:55249010-fccaggaagcctacgtgatggegfr-chr7:55249010-rggtggaggtgaggcagatgkras-gu-chr12:25398284-ftagctgtatcgtcaaggcackras-gu-chr12:25398284-rggcctgctgaaaatgactga
[0091]
根据所捕获区域大小要求总数据量。本实施例中捕获区域为29kb，下机总数据量为10g。本实例中还是用了本实验室专利技术，通过添加分子标签可对相同标记的reads归入一个集群，将一个集群合并成一条模板链。通过对模板reads数的分析可知，结果处理的模板，kras-chr12：25398284以及egfr-chr7：55249010及其周边的位点的reads数显著下降，证明了crispr系统可以有效切割这两个位点所在的dna模板(图2b).
[0092]
质控合格的数据会进入突变检测分析。结果分析表明，对照组的样品1的kras-chr12：25398284以及egfr-chr7：55249010突变频率(af)分别为31.82％及0％；样品2的kras-chr12：25398284以及egfr-chr7：55249010突变频率(af)分别为28.82％及0％。而经过crispr处理的样品1的kras-chr12：25398284以及egfr-chr7：55249010突变频率(af)则分别提升到50.0％及0.35％，经过crispr处理的样品2的kras-chrl2：25398284以及egfr-chr7：55249010突变频率(af)则分别提升到50.0％及0.21％.特别是针对egfr-chr7：55249010这个低频突变位点，crispr处理可以大幅提高其突变频率(表3)。
[0093]
表3.在两个样品进行crispr处理，发现经处理后的样品中突变的egfr-chr7：
55249010以及kras-chr12：25398284的位点比率上升
[0094] untreated krasdash treated krasuntreated egfrdash treated egfr af consensusaf consensusaf consensusaf consensussample 131.82％50.00％0.00％0.35％sample 228.82％50.00％0.00％0.21％
[0095]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。