一种DNA纯化试剂、其制备方法及DNA纯化方法与流程

一种dna纯化试剂、其制备方法及dna纯化方法
技术领域
1.本发明涉及dna纯化领域，具体涉及一种dna纯化试剂、其制备方法及dna纯化方法。


背景技术：

2.sanger法测序是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以a、t、c、g结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的page胶上电泳进行检测，从而获得可见dna碱基序列的一种方法，该方法广泛应用对细菌的质粒和扩增后产物的测序。
3.整个sanger法测序流程中，需要相对dna进行纯化沉淀，常用的纯化沉淀方法为酒精醋酸钠法。磁珠法通过dna在几千分子量的聚乙二醇及高盐环境下，采用固相载体进行吸附，最后经乙醇洗涤脱附回收的过程。现有的磁珠体系包含：磁珠、聚乙二醇以及盐离子，该体系能将dna沉淀并吸附，该磁珠试剂体系能吸附分子量区域窄小的dna片段，但不能吸附pcr扩增产生的所有片段。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供一种dna纯化试剂、其制备方法及dna纯化方法。
5.本发明采用如下技术方案：
6.一种dna纯化试剂，其不同之处在于，其制备原料包括a组分与b组分；所述a组分包括羧基磁珠；所述b组分包括：体积百分比33％～38％的乙醇、体积百分比为3％～5％的四乙二醇及2.0mol/l～3.0mol/l的nacl；所述a组分与所述b组分的比例为：(1.5～2.5)g:1l。
7.与现有技术相比，本发明采用乙醇与四乙二醇共同吸收体系中的水分子，再配合nacl将dna片段析出，能够特异性结合sanger测序反应中的所有片段，但不结合dntps、ddntps，酶等原料。
8.进一步，所述b组分中还包括6.0mmol/l～6.5mmol/l的edta。
9.采取上述进一步技术方案的有益效果在于：edta的加入通过络合反应去除纯化体系中的盐离子，提高其纯度。
10.上述dna纯化试剂的制备方法，其不同之处在于，包括：
11.步骤s1:取羧基磁珠溶液,去除上清，得到羧基磁珠；
12.步骤s2:将乙醇、四乙二醇及nacl混合后，得到预混合液；
13.步骤s3:将所述羧基磁珠与所述预混合液进行所述dna纯化试剂。
14.进一步，所述步骤s2中，将乙醇、四乙二醇、nacl及edta混合后，得到预混合液。
15.一种dna纯化方法，其不同之处在于，包括：
16.步骤a1:往待纯化的样本中加入上述dna纯化试剂和乙醇，混匀，得待处理混合液；
17.步骤a2:将所述待处理混合液放置在磁力架上进行吸附，弃上清；
18.步骤a3:然后加入乙醇混合均匀后得到待纯化液，将所述待纯化液再次放置在磁
力架上进行吸附，弃上清；
19.步骤a4:重复所述步骤a3 1～3次，回收磁珠。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：通过在待纯化dna样品中加入本发明dna纯化试剂与乙醇，能吸附单向pcr扩增产生的所有片段，再通过80％乙醇洗涤，去除反应剩余的所有原料，从而达到纯化的目的。纯化后的产物可直接上3730xl等遗传分析仪进行电泳测序；信号强且均匀，背景噪音极低。
21.进一步，待纯化样本与所述dna纯化试剂的的体积比例为1：(0.8～1.2)。
22.进一步，所述待处理混合液与所述待纯化液中的乙醇体积百分比为40％～50％。
附图说明
23.图1为实施例5的磁珠回收测试图；
24.图2为对比例1a公司的磁珠回收测试图；
25.图3为对比例1b公司的磁珠回收测试图。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
27.以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
28.在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
29.在本发明实施例中，所使用的原料均为常规市售产品。
30.本发明实施例中，涉及的实验原料说明如下：
31.羧基磁珠溶液：本发明羧基磁珠溶液购于(百迈格生物)，规格为300nm，50mg/ml，货号为191116；
32.乙醇溶液：采用80％v/v乙醇溶液，购于(国药集团)500ml无水乙醇；
33.四乙二醇：sigma lot:04818ahv。
34.实施例1～实施例4
35.实施例1～实施例4提供dna纯化试剂，具体成分及含量如表1所示：
36.表1实施例1～实施例4dna纯化试剂成分及含量
[0037][0038]
实施例1～实施例4的制备方法均采用下列步骤进行制备：
[0039]
步骤s1：取羧基磁珠溶液,吸附去上清，得到a组分；
[0040]
步骤s2:将乙醇溶液，四乙二醇，nacl，edta混合后得到b组分；
[0041]
步骤s3:将a组分与b组分混合后得到dna纯化试剂。
[0042]
实施例5～实施例8
[0043]
实施例5～实施例8提供一种dna的纯化方法，具体操作方法如下：
[0044]
步骤a1：在96孔板中加入5ul测序产物，加入羧基磁珠混合液5ul和乙醇震荡混匀，得待处理混合液；
[0045]
步骤a2:将96孔板放置在磁力架上，吸附30s，去上清；
[0046]
步骤a3:加入乙醇，震荡混匀1min，得到待处理液，将96孔板放置在磁力架上，吸附30s，去上清。
[0047]
重复步骤a3一次后，室温静置5min。
[0048]
步骤a1及步骤a3加入乙醇后，其终浓度一样，具体如表2所示。
[0049]
表2实施例5～实施例8步骤a1与步骤a3的乙醇终浓度
[0050]
实施例dna纯化剂乙醇(％v/v)实施例5实施例145实施例6实施例250实施例7实施例340实施例8实施例440
[0051]
对比例1
[0052]
将市售的mclab lot:l580a59m(简称a公司)磁珠体系与thrmo lot:1706084磁珠体系(简称b公司)参照说明书对dna样品进行纯化。
[0053]
将经实施例5、对比例1及对比例2纯化后的dna磁珠的孔中添加40μl的灭菌水，混匀后离心检测其磁珠回收效率，检测方法为：各取20ul的纯化后样品，进行毛细管电泳检测，回收效率越高，荧光信号值越强。
[0054]
可以看出，每张图的荧光信号值都是由强至弱递次分布，但是实施例相较于a公司以及b公司从整体上而言，x轴对应的每个y轴信号均较强，证明采用实施例5磁珠体系的每个区域片段的dna分子回收量是大于市售磁珠体系的。
[0055]
实施例5、对比例1及对比例2的结果如图1～3所示，各实施例以及对比例的磁珠信号强度如表3所示。
[0056]
表3磁珠检测最强的信号
[0057]
检测对象磁珠信号实施例518000对比例1a公司6000对比例1b公司12000
[0058]
从表3可以看出，采用本发明dna纯化试剂及提取方法，其磁珠信号远远大于市售公司。
[0059]
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。