促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶及生产方法与流程

1.本发明涉及动物中药饲料技术领域，更具体地说是涉及一种促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶及生产方法。


背景技术：

2.长期以来，化学药品、抗生素和激素的毒副作用和耐药性一直都是困扰医学专家的重要因素，尤其是容易引起动物产品药物残留，这已成为一个全社会关注的问题。中药的毒副作用小，无耐药性，不会在肉、蛋、奶等畜产品中产生有害残留，是中药添加剂的一个独特优势，这一优势，顺应了时代潮流，满足了人们回归自然、追求绿色食品的愿望。
3.中药具有营养和药物的双重作用，其内含有多种成分，包括多糖、生物碱、苷类等。中药在动物肠道内，要发挥药效，活性成分必须从组织中释放出来。但是中药活性成分往往被纤维素等包裹，因此，降解纤维素成为中药有效成分释放的关键。
4.现有的纤维素酶虽然能够降解纤维素，但是其在肠道环境下的活性较低，因此，开发在肠道环境温度下具有更高活性的纤维素酶，对中药在肠道环境下的吸收具有中药意义。
5.因此，如何提供一种在动物肠道内酶活更好的纤维素酶是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种本在肠道环境温度37℃下具有更高酶活的纤维素内切酶，该内切酶在中药饲料领域具有广阔的市场空间。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶，所述纤维素酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
9.一种促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶的编码核苷酸序列，所述序列如seq id no.2所示。
10.一种促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶的生产方法，包括下述步骤：
11.1)以合成的序列endo1为模板，进行pcr，获得目的基因；
12.2)对目的基因和prsfduet-1质粒进行bamhi和ecori双酶切，然后连接酶切产物，获得重组质粒pet28a-endo；
13.3)将重组质粒pet28a-endo转化至大肠杆菌感受态细胞中，获得转化菌株；
14.4)对转化菌株进行诱导培养，离心、取上清、纯化，得纤维素酶。
15.作为上述技术方案优选的技术方案，步骤1)中，
16.pcr反应体系如下：
[0017][0018]
pcr程序如下:
[0019][0020]
作为上述技术方案优选的技术方案，步骤2)中，酶切温度为37℃，酶切时间为3h；
[0021]
endo1序列双酶切体系：
[0022][0023]
pet28a双酶切体系：
[0024][0025]
作为上述技术方案优选的技术方案，，步骤2)中，连接酶切产物的体系包括：将endo1和质粒酶切产物按3：1比例加入，并与1μl t4 dna连接酶混匀，在16℃下连接过夜，获得pet28a-endo。
[0026]
作为上述技术方案优选的技术方案，步骤3)中，诱导、离心、取上清培养包括：
[0027]
(1)将转化菌株接种于6ml含50mg/l硫酸卡那霉素的lb培养基中，37℃220rpm过夜培养14h；
[0028]
(2)按1:100将种子转接至500ml lb培养基，37℃150rpm培养至od
600
＝0.5；用0.7mm的iptg诱导基因的表达，诱导后18℃150rpm过夜培养24h；
[0029]
(3)4000g 4℃离心5min收集菌体，用30ml保存缓冲液重悬菌体，然后破碎菌体；破碎后的细胞悬浮液12000rpm 4℃离心30min，所得上清即为蛋白粗酶液。
[0030]
作为上述技术方案优选的技术方案，步骤3)中，纯化的过程为：
[0031]
(1)将6ml ni-nta纯化介质加入到50ml空的层析柱中，让介质自由沉降，并放干储存液；
[0032]
(2)加入4倍柱体积的洗涤缓冲液平衡层析介质；
[0033]
(3)将蛋白粗酶液上样至柱中，流速控制为0.5ml/min；
[0034]
(4)以流速为1ml/min的洗涤缓冲液洗涤柱子，10倍柱体积的流量去除杂蛋白；
[0035]
(5)用5倍柱体积洗脱缓冲液以0.5-1ml/min的流速洗脱，收集洗脱液；
[0036]
(6)收集目的蛋白洗脱液，用millipore超滤管对纯化后的蛋白进行脱盐浓缩，用保存缓冲液置换含咪唑的洗脱缓冲液。
具体实施方式
[0037]
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0038]
实施例1
[0039]
材料
[0040]
e.coli dh5а，实验室保藏；限制性内切酶，takara公司；质粒提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；即用型易错pcr试剂盒，北京天恩泽科技有限公司；bca蛋白浓度测定试剂盒，福州奥研实验器材有限责任公司；质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；质粒pet28a实验室保存；序列endo1基因全合成，擎科生物有限公司合成；羟甲基纤维素钠(cmcna)上海源叶生物科技有限公司；
[0041]
primer f1:ggatccatggctactc gcctgat；seq id no.3所示；
[0042]
primer r1:gaattcttagtggtggtgatgat；seq id no.4所示。
[0043]
擎科生物有限公司合成。
[0044]
方法
[0045]
易错pcr
[0046]
以合成的引物primerf和primer r1为引物，以合成的序列endo1为模板，进行易错pcr.易错pcr反应体系如下：
[0047]
[0048][0049]
易错pcr程序如下:
[0050][0051]
酶切和转化
[0052]
获得目的基因和prsfduet-1表达载体后，分别在pcr小管中加入双蒸水、内切酶缓冲液、酶切底物、限制性内切酶，进行双酶切反应，加入顺序从多到少。目的基因和prsfduet-1置于37℃下进行双酶切，反应体系如下：
[0053]
合成endo1序列双酶切体系：
[0054][0055]
pet28a双酶切体系：
[0056][0057]
使用bamhi和ecori限制性内切酶在37℃下进行双酶切反应3h后，加入loading buffer终止反应，并根据照凝胶回收试剂盒说明书纯化、回收双酶切产物。
[0058]
经过相同的限制性内切酶切割后，双酶切产物具有相同的粘性末端，可以通过dna连接酶连接成完整的质粒。将含有相同粘性末端的合成endo1序列和pet28a双酶切产物置于同一个pcr小管中，连接反应采用10μl体系，将目的基因和质粒酶切产物按3：1比例加入，和1μlt4 dna连接酶混匀，在16℃下连接过夜。将连接的质粒命名为pet28a-endo。
[0059]
转化步骤：
[0060]
将连接产物转化到大肠杆菌e.coli dh5α感受态细胞中，转化步骤如下：
[0061]
1)首先调节恒温水浴的温度，将其调至42℃。
[0062]
2)将一管(100μl)感受态菌由-80℃的超低温冰柜中取出，立刻使用手指将其加温
融化，然后插入冰中，对其进行10分钟冰浴。
[0063]
3)将10μl连接产物pet28a-endo加入，轻轻震荡后放置冰上20min。
[0064]
4)将其轻轻摇匀后插入42℃水浴中，进行90s的热休克，然后迅速放回冰中，静置5分钟。
[0065]
5)将900μl不含抗菌素的lb培养基分别加入到上述各管中轻轻混匀，之后再摇床的弹簧架上固定，将其在37℃下震荡50分钟。
[0066]
6)往含合适抗菌素的固体lb平板培养皿中分别滴加从超净工作台中取出的300μl上述转化混合液，使用经过酒精灯灼烧并且冷却后的玻璃涂布棒进行均匀的涂布。
[0067]
7)标记涂好的培养皿，先放置在37℃恒温培养箱中30-60分钟，待表面的液体都渗透到培养基里后，再倒过来放置于37℃恒温培养箱过夜。
[0068]
将长出的单菌落进行重组质粒鉴定：挑取上述lb固体培养基上长出的单菌落，接种于5m l卡那霉素的lb培养基中，于37℃、200r.min-1
条件下培养过夜，取部分菌液用甘油管保存菌种，作为转化的菌株，依次编号。
[0069]
表达和纯化
[0070]
蛋白表达和纯化过程中用到的培养基和缓冲液
[0071]
lb培养基：10g/l胰蛋白胨，10g/l氯化钠，5g/l酵母浸粉
[0072]
洗涤缓冲液：10mm咪唑，50mm k2hpo4-kh2p
o4
，300mm nacl，10％甘油，ph 8.0。
[0073]
洗脱缓冲液：200mm咪唑，50mm k2hpo
4-kh2po4，300mm nacl，10％甘油，ph 8.0。
[0074]
保存缓冲液：50mm k2hpo
4-kh2po4，300mm nacl，10％甘油，ph 8.0。
[0075]
蛋白表达
[0076]
将转化菌株接种于6ml lb培养基(含50mg/l硫酸卡那霉素)，37℃220rpm过夜培养14h；
[0077]
按1:100将种子转接至500ml lb培养基，37℃150rpm培养至od600＝0.5；用0.7mm的iptg诱导基因的表达；诱导后18℃150rpm过夜培养24h；
[0078]
4000g 4℃离心5min收集菌体，用30ml保存缓冲液重悬菌体，然后用超声破碎机(工作3s，间隔7s，时间为10min，超声功率约200w)破碎菌体；
[0079]
破碎后的细胞悬浮液12,000rpm 4℃离心30min，所得上清即为蛋白粗酶液。
[0080]
纯化
[0081]
本发明采用上海生工的ni-nta纯化介质(南京金斯瑞生物科技有限公司)对蛋白进行纯化。
[0082]
第1步，将6ml ni-nta纯化介质加入到50ml空的层析柱中，让介质自由沉降，并放干储存液；
[0083]
第2步，加入4倍柱体积的洗涤缓冲液平衡层析介质。
[0084]
第3步，将蛋白粗酶液上样至柱中，流速控制为0.5ml/min；
[0085]
第4步，以流速为1ml/min的洗涤缓冲液洗涤柱子，10倍柱体积的流量以去除杂蛋白；
[0086]
第5步，用5倍柱体积洗脱缓冲液以0.5-1ml/min的流速洗脱，收集洗脱液；
[0087]
第6步，收集目的蛋白洗脱液，用millipore超滤管(15ml 100kda)对纯化后的蛋白进行脱盐浓缩，用保存缓冲液置换含咪唑的洗脱缓冲液，得到纯化的纤维素酶液。
[0088]
酶活性分析
[0089]
除测定温度为37℃外，其它同文献文献(冯月，蒋建新，朱莉伟，菅红磊。纤维素酶活力及混合纤维素酶协同作用的研究。北京林业大学学报，2009，第31卷，增刊1)测定纤维素酶内切酶酶活。纯化的蛋白浓度用bca蛋白浓度测定试剂盒。测定纤维素酶比酶活为10.50u/mg，转化菌株编号为endosh89。
[0090]
大黄颗粒溶出度测定
[0091]
大黄亳州市永熹堂药业；大黄素标准品和大黄酚广州分析测试中心科力技术开发公司；胰蛋白酶sigma公司(250u/g)；纤维素酶r-102000u/g北京经科宏达公司生产。
[0092]
模拟肠液：磷酸二氢钾6.8g加水500ml溶解0.1m氢氧化钠调ph6.8，得到溶液a；胰蛋白酶10g，加入200ml自来水溶解，得到溶液b。溶液a和溶液b混合，加水定容到1000ml，然后用0.1m氢氧化钠调ph6.8，得到模拟肠液。
[0093]
得到的纯化的纤维素酶液，在冷冻干燥机(冷冻干燥机sz-lgj-5b(压盖型)上海舜制)中干燥，冷冻干燥38h，得到冷冻干燥的纤维素酶酶粉。称取适量酶粉，保存缓冲液适当稀释，测定稀释液酶活性(测定方法：除测定温度为37℃外，其它同文献文献(冯月，蒋建新，朱莉伟，菅红磊。纤维素酶活力及混合纤维素酶协同作用的研究。北京林业大学学报，2009，第31卷，增刊1))，计算得到纤维素酶酶粉的比酶活为6850u/g
[0094]
大黄粉粉碎，过100目筛。称取100g大黄粉，加入400g模拟肠液，加入纤维素酶r-10，加入量为大黄酚的0.2000％(每克大黄酚加入4u的纤维素酶)，作为对照组；加入本发明生产的纤维素酶酶粉，加入量为大黄酚的0.0584％(每克大黄酚加入4u的纤维素酶)，作为实验组。在37℃,温浴2h，得到对照组处理液和实验组处理液。对照组处理液或实验组处理液用微孔滤膜(上海未熹生物科技有限公司)过滤，得到对照组虑液或实验组虑液。
[0095]
得到对照组滤液或实验组滤液测定采用文献的方法，文献为：汪德刚，李艳玲，樊克锋，汤法银.纤维素酶对大黄成分析出的影响研究.安徽农业科学，2008，36(24)10513-10514。根据对照组虑液中的大黄素或大黄酚的含量，推算出大黄中的大黄素或大黄酚的溶出效率，溶出效率为滤液中大黄酚的质量/大黄粉质量和大黄素的质量/大黄粉质量
[0096]
结果为：大黄酚溶出效率为0.0246％，实验组溶出效率为0.0258％；对照组大黄素大黄素溶出效率为0.0136％，实验组大黄素溶出效率为0.0158％。
[0097]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0098]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。