一种酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法与流程

1.本发明属于生物制药技术领域，具体涉及到一种酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。


背景技术：

2.环黄芪醇是现今唯一发现的端粒酶激活剂，通过增加端粒酶从而延缓端粒变短，环黄芪醇被认为具有抗衰老的作用。进一步的研究表明，环黄芪醇具有保肝、护肝以及促进肝损伤修复的作用。
3.环黄芪醇是黄芪甲苷及多数黄芪皂苷的苷元。环黄芪醇的制备原理为断开黄芪甲苷c3位木糖和c6位葡萄糖上的糖苷键。目前，环黄芪醇主要以黄芪甲苷为原料进行制备，方法主要有酸水解法、smith降解法和酶催化水解法。
4.酸水解法制备环黄芪醇操作简单，但环黄芪醇在酸性条件下不稳定容易转化为黄芪醇，影响产品的得率；smith降解法条件温和，反应较为专一，但反应过程中需要较多的有机溶剂，对环境带来不利影响。利用酶法制备环黄芪醇，不仅条件温和、反应高效，且成本低、污染少，适宜规模化生产制备。
5.已公开的中国专利中，均使用两种及两种以上的商品酶和/或重组酶组成复合酶水解黄芪甲苷制备环黄芪醇。其中专利cn105734109a中的复合酶为β-葡萄糖苷酶、蜗牛酶、柚苷酶、纤维素酶等酶按不同质量比的形式混合得来；专利cn 105566434a中的复合酶为β-葡萄糖苷酶、柚苷酶、β-木糖苷酶的组合；
6.专利cn107058445a中的复合酶为纤维素酶和来源于phycicoccus sp.soil748的重组β-葡萄糖苷酶。相较于本发明来说，采用复合酶需要按顺序加入不同的酶，不仅步骤繁琐，且增加了生产成本。


技术实现要素：

7.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
8.鉴于上述和/或现有技术中存在的不足，本发明的其中一个目的是提供一种酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，仅仅通过一种糖苷酶，就能高效地将黄芪甲苷几乎完全转化制备得到环黄芪醇，步骤简便，从而有效降低了生产成本。
9.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，由gh3家族的β-葡萄糖苷酶水解黄芪甲苷母核上c3位的β-d-糖苷键和c6位的β-d-糖苷键。
10.作为本发明酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法的一种优选方案，其中：所述gh3家族的β-葡萄糖苷酶来源于dictyoglomus turgidum dsm 6724，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
11.作为本发明酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法的一种优选方案，其中：所述gh3家族的β-葡萄糖苷酶由seq id no.2所示的核苷酸序列通过重组大肠杆菌表达获得。
12.作为本发明酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法的一种优选方案，其中：所述gh3家族的β-葡萄糖苷酶以纯化后的β-葡萄糖苷酶添加，体系中酶添加量为10～20u/ml。
13.作为本发明酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法的一种优选方案，其中：所述纯化后的β-葡萄糖苷酶，将seq id no.2所示的核苷酸序列插入表达载体后导入至大肠杆菌，30℃诱导表达，离心收集菌体，超声破碎并离心，上清液为重组酶粗酶液，将重组酶粗酶液纯化。
14.作为本发明酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法的一种优选方案，其中：所述gh3家族的β-葡萄糖苷酶以含有β-葡萄糖苷酶的细胞催化剂添加，体系中细胞催化剂的添加量为10～30g/l。
15.作为本发明酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法的一种优选方案，其中：所述含有β-葡萄糖苷酶的细胞催化剂，将seq id no.2所示的核苷酸序列插入表达载体后导入至大肠杆菌，30℃诱导表达，离心收集菌体，得到含有β-葡萄糖苷酶的细胞催化剂。
16.作为本发明酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法的一种优选方案，其中：体系中黄芪甲苷的质量浓度为0.5～2g/l。
17.作为本发明酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法的一种优选方案，其中：体系ph为5.0，反应温度为70～80℃，反应时间为1～24h。
18.作为本发明酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法的一种优选方案，其中：所述黄芪甲苷以纯化的黄芪甲苷或黄芪甲苷提取浸膏添加；
19.所述纯化的黄芪甲苷，黄芪甲苷的纯度还不低于90.0％；所述黄芪甲苷提取浸膏，黄芪甲苷的含量不低于2.0％。
20.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
21.与传统的化学法制备环黄芪醇相比，酶解法解决了传统酸水解制备过程中黄芪甲苷三元环易开裂形成副产物黄芪醇的问题，本发明的酶法制备过程中没有副产物黄芪醇产生。
22.与传统的smith降解法制备环黄芪醇相比，酶解法解决了smith降解法中使用较多有机溶剂，对环境带来不利影响的问题。本发明的酶法制备过程中无需使用氧化、还原剂以及有机溶剂等污染环境的试剂，是一种环境友好的环黄芪醇制备方法。
23.与复合酶制备环黄芪醇相比，本发明中的gh3家族的β-葡萄糖苷酶能有效水解黄芪甲苷c3位的木糖残基和c6位的葡萄糖残基，仅仅通过一种糖苷酶，就能高效地将黄芪甲苷几乎完全转化制备得到环黄芪醇，工艺简便，生产成本大大降低。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
25.图1为本发明重组质粒pet-dtg6724的质粒图谱。
26.图2为本发明重组β-葡萄糖苷酶sds-page电泳分析；其中，lane m为蛋白marker；lane 1为空质粒对照；lane 2为β-葡萄糖苷酶粗酶液。
27.图3为本发明β-葡萄糖苷酶催化黄芪甲苷的hplc分析。
28.图4为本发明β-葡萄糖苷酶催化黄芪甲苷的薄层层析分析；其中，(a)展开剂为乙酸乙酯:甲醇:水＝25:5:1，(b)展开剂为三氯甲烷:甲醇＝10:1；lane a为黄芪甲苷标准品,lane c为环黄芪醇标准品,lane 1和lane 2为反应22h后，lane 3为反应前。
具体实施方式
29.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
30.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
31.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
32.实施例1重组β-葡萄糖苷酶的制备
33.由苏州金唯智公司合成如seq id no.2所示的基因序列，将合成的基因用限制性内切酶ndei、bamhi双酶切后，插入到用相同限制性内切酶切的质粒载体pet-28a获得表达载体pet-dtg6724。
34.将表达载体pet-dtg6724导入至大肠杆菌bl21(de3)，在含有卡那霉素(50μg/ml)的tb培养基(胰蛋白胨11.8g/l，酵母提取物23.6g/l，k2hpo
4 9.4g/l，kh2po
4 15g/l，甘油4ml/l)中于37℃培养至od
600
为0.5时，加入终浓度为0.1mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，30℃培养24h，发酵液于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。去上清，加入ph 5.0、50mmol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，超声波破碎细胞，离心取上清，得到重组β-葡萄糖苷酶粗酶液。该β-葡萄糖苷酶分子量的测定采用sds-page方法进行，如图2所示，分子量约为90kda，与理论值相近。
35.将实施例1制备的重组β-葡萄糖苷酶粗酶液通过ge histrap ff(his-标记蛋白纯化柱，5ml)纯化。
36.其中，大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)，载体pet-28a( )均购于invitrogen公司。
37.实施例2酶催化转化黄芪甲苷制备环黄芪醇
38.准确配制ph 5.0，50mmol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液20ml置于圆底烧瓶中，加入黄芪甲苷，黄芪甲苷的纯度为95.1％，反应体系中黄芪甲苷的质量浓度为1g/l，同时加入纯化后的重组β-葡萄糖苷酶，体系中酶添加量为10u/ml，于100rpm、70℃下反应7h，取样进行高效液相分析，结果如图3显示，黄芪甲苷的摩尔转化率为96.3％。
39.实施例3酶催化转化黄芪甲苷提取浸膏制备环黄芪醇
40.准确配制ph 5.0，50mmol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液20ml置于圆底烧瓶中，加入黄芪甲苷提取浸膏，黄芪甲苷的纯度为3.0％，反应体系中黄芪甲苷的质量浓度为0.5g/l，
同时加入纯化后的重组β-葡萄糖苷酶，体系中酶添加量为10u/ml，于100rpm、70℃下反应5h，取样进行薄层层析分析，结果如图4显示，黄芪甲苷完全转化为环黄芪醇。
41.实施例4细胞催化转化黄芪甲苷制备环黄芪醇
42.将含有pet-dtg6724表达载体的大肠杆菌bl21(de3)，在含有卡那霉素(50μg/ml)的tb培养基(胰蛋白胨11.8g/l，酵母提取物23.6g/l，k2hpo
4 9.4g/l，kh2po
4 15g/l，甘油4ml/l)中于37℃培养至od
600
为0.5时，加入终浓度为0.1mm异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导剂，30℃培养24h，发酵液于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体，获得含有β-葡萄糖苷酶的细胞催化剂。
43.准确配制ph 5.0，50mmol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液20ml置于圆底烧瓶中，加入黄芪甲苷，黄芪甲苷的纯度为99.0％，反应体系中黄芪甲苷的质量浓度为1g/l，同时加入含有β-葡萄糖苷酶的细胞催化剂，体系中湿细胞的添加量为20g/l，于100rpm、75℃下反应10h，取样进行高效液相分析，结果显示，黄芪甲苷的摩尔转化率为99.5％。
44.应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。