一种利用米曲霉发酵制备低嘌呤大豆粉的方法及其应用

1.本发明属于食品技术加工领域，具体涉及一种以米曲霉(aspergillusoryzae)发酵生产低嘌呤大豆粉的方法。本产品既可以用于直接食用，也可作为加工食品的原料。


背景技术：

2.嘌呤代谢发生障碍会导致高尿酸血症，这是痛风产生的主要原因。当人体过多的摄入高嘌呤类的食物时，嘌呤经过体内一系列酶的作用转化成尿酸盐结晶，过多的尿酸就会聚集在人体关节周围，若人体的代谢系统又无法正常的排出，就会形成高尿酸血症，进而导致痛风。现今痛风已经成为我国仅次于糖尿病的第二大代谢类疾病，痛风的发生与膳食嘌呤的摄入量密切相关，除了医疗以外，合理、科学的饮食干预，能够积极调整痛风患者的不良饮食结构和降低血尿酸水平，亦能减轻痛风人群疼痛与促进愈后生活质量的改善。
3.痛风患者膳食禁止摄取海鲜、肉禽制等高嘌呤食物，限制蛋白、脂肪摄入量；而限制蛋白摄入，是因为核酸-核蛋白形式存在；这种膳食结构会导致患病人群营养不平衡，也影响生活质量，因此，开发出适合痛风人群营养均衡的食品具有重要意义。一方面，大豆被认为是人类所需要的最理想的蛋白质，8种必需氨基酸的含量比禾谷作物高6-7倍，还是我国传统食品，性价比高，易于接受和推广；另一方面，随着生活质量提升，开发植物基产品也是大势所趋；但大豆中的嘌呤含量普遍在180-250mg/100g，直接利用大豆为原料加工成产品，并不适宜痛风人群食用。因此，提供一种低嘌呤高蛋白的大豆粉不仅能满足痛风人群的营养需求，更能丰富食物种类。
4.目前，降低嘌呤的方法主要有物理法和生物法。物理法主要是通过吸附方式除去嘌呤类物质，如使用凝胶型离子交换树脂ncuw18填充的吸附柱吸附，除去豆浆中的嘌呤类物质(cn112006107a)；然而，物理方法大多操作复杂，添加物较多，且吸附也不具备专一性，会将大豆中的其它营养成分也一并去除，导致大豆自身营养价值降低。通过微生物发酵方法弥补物理吸附法营养损失问题，而且可以提高原料利用率，赋予原料更多有益成分，这种技术必然成为降低膳食嘌呤新趋势。


技术实现要素：

5.为了解决痛风人群不能长期摄入高嘌呤食品的问题，本发明以米曲霉jmr-1 (aspergillus oryzae)固态发酵大豆生产低嘌呤高蛋白豆制品，生产过程包括菌种活化、制曲、拌曲、批量固态发酵、或干燥获得了低嘌呤大豆产品。本发明不加入任何化学成分，能够将大豆中的嘌呤含量降低62.15％，氨基酸含量是原来的9倍，提高大豆的生物利用率，为低嘌呤食品的制备开辟了新思路。
6.为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现。
7.米曲霉jmr-1(aspergillus oryzae)，现保藏于湖北省武汉市武昌区八一路，保藏单位为武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号：cctccm20211571，保藏日期为2021年12月11日。
8.本发明所提供的菌株特征如下：
9.菌落形态：分生孢子头放射状，直径150-300μm，也有少数为疏松柱状，菌丝较短，呈绒毛状，干燥不透明，初为白色或淡黄色，质地疏松，继而变成黄绿色，无明显边缘。
10.生物学特性：菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶等。
11.1、菌种活化
12.(1)一次活化
13.取保存于甘油管内菌液1ml，转移至已灭菌的pda液体培养基中，30℃培养2d，获得米曲霉孢子液。
14.(2)二次活化
15.a、大豆培养基：大豆去皮，15-20℃浸泡至膨胀，料液比为1∶5(w∶v)，沸水蒸煮0.5h，于破碎机中打成1-3mm的颗粒状，放于60-65℃烘箱中处理3h，期间要搅拌物料，使其均匀干燥，防止粘连，自然冷却至室温。
16.b、4℃ 8000r/min条件下离心孢子液10min，得孢子液沉淀，用无菌生理盐水洗涤菌体，重复操作两次，获得米曲霉菌悬液。按5％(v/w)的接种量接种于大豆培养基中，28-30℃下培养到终点。培养期间注意观察菌丝生长情况，待菌丝体将大豆连结成块状和产生黄绿色孢子后，翻面继续培养24h，即到培养终点。发酵大豆物料，烘干处理，待制曲。
17.2、制曲
18.(1)原料预处理：同1(2)a。
19.(2)一级种曲制备：取500g原料，加入质量分数7.5％的大豆培养基搅拌均匀，压制成曲胚，加入适量水分控制曲胚含水量为34-36％，28-30℃培养48h，得一级种曲。
20.(3)二级种曲制备：取5000g原料，加入质量分数7.5％的一级种曲搅拌均匀，压制成曲胚，加入适量水分控制曲胚含水量为34-36％，28-30℃培养48h，得二级种曲。
21.(4)7.0l发酵罐放大培养：将4.0l大豆原料装入7l发酵罐中，以质量分数 7.5％接种量将二级种曲接入发酵罐中，设置发酵条件，发酵温度28-30℃，搅拌转速200r/min-1，通气量为3.5l/min-1，控制水分含量在34-36％，发酵 2-4天。
22.(5)保藏
23.烘干时，要分两步升温。第一步，在35-40℃温度下促使水分蒸发，48h后，再进行第二步升温，至50-55℃，继续烘干12h，及时分装保存。
24.3、生产
25.(1)原料预处理：同1(2)a，得大豆原料。将固态发酵物料(大豆原料)通过进料仓进料，在连续灭菌设备中进行高温灭菌。
26.(2)在密闭的发酵房内，以质量分数20％的比例接入曲，将所得物料在发酵室发酵72h，控制发酵室中的湿度为80-95％，通过新风系统对发酵室进行通风，发酵温度控制在28-30℃。或采用二步固态发酵法，在第一次发酵24h后，再次通过物料仓进料，以质量分数10％的比例接入新曲，搅拌均匀，发酵至终点。
27.(3)将步骤(2)所得的发酵产物在密闭的净化房中于65-80℃干燥10-12h，得干燥处理后得到低嘌呤大豆粉。
28.根据产量大小，决定低嘌呤大豆产品生产过程，具体方法见实例。
29.本发明具有以下有益效果：
30.(1)生物法制备低嘌呤大豆粉，不会造成营养损失，嘌呤降低率达62.15％，且期间要搅拌物料，使其均匀干燥，防止粘连，自然冷却至室温。
31.b、4℃ 8000r/min条件下离心孢子液10min，得孢子液沉淀，用无菌生理盐水洗涤菌体，重复操作两次，获得米曲霉菌悬液。按5％(v/w)的接种量接种于大豆培养基中，28-30℃下培养到终点。培养期间注意观察菌丝生长情况，待菌丝体将大豆连结成块状和产生黄绿色孢子后，翻面继续培养24h，即到培养终点。发酵大豆物料，烘干处理，待制曲。
32.(3)原料预处理：同(2)a。
33.(4)制曲：取500g原料，加入质量分数7.5％的大豆培养基搅拌均匀，压制成曲胚，加入适量水分控制曲胚含水量为34-36％，30℃培养48h，利用冷冻干燥技术，制成低嘌呤大豆粉。发酵前后嘌呤和氨基酸态氮含量的变化，见表1。
34.表1发酵前后嘌呤和氨基酸态氮含量的变化
[0035] 对照组一次发酵二次发酵嘌呤含量(mg/100g)212.7892.1578.25氨基酸态氮含量(mg/100g)642.565801.194935.97
[0036]
实施例2：低嘌呤大豆营养棒的制作
[0037]
1、菌种活化
[0038]
(1)一次活化
[0039]
取保存于甘油管内菌液1ml，转移至已灭菌的pda液体培养基中，30℃培养2d，获得米曲霉孢子液。
[0040]
(2)二次活化
[0041]
a、大豆培养基：大豆去皮，15-20℃浸泡至膨胀，料液比为1∶5(w∶v)，沸水蒸煮0.5h，于破碎机中打成1-3mm的颗粒状，放于60-65℃烘箱中处理3h，期间要搅拌物料，使其均匀干燥，防止粘连，自然冷却至室温。
[0042]
b、4℃ 8000r/min条件下离心孢子液10min，得孢子液沉淀，用无菌生理盐水洗涤菌体，重复操作两次，获得米曲霉菌悬液。按5％(v/w)的接种量接种于大豆培养基中，28-30℃下培养到终点。培养期间注意观察菌丝生长情况，待菌丝体将大豆连结成块状和产生黄绿色孢子后，翻面继续培养24h，即到培养能有效提高养分利用率，发酵后游离氨基酸含量(5801.19mg/100g)发酵前的(642.56mg/100g)的9倍，其中发酵后(2522.72mg/100g)的必需氨基酸含量是发酵前(152.41mg/100g)的16倍。
[0043]
(2)真菌发酵，稳定性好，遗传稳定，适应性强，对发酵条件要求低。
[0044]
(3)采用固态发酵的培养方式，不需严格无菌条件，易操作，后处理简便、污染少，基本无废水排放，保护环境，也是社会和政府提倡和支持的生产方式，有利于推广。
[0045]
(4)自然菌种纯菌发酵，不需要安全性实验，节省大量时间成本。
[0046]
(5)以大豆植物基为生产原料，植物蛋白中的氨基酸组成基本平衡，还具有低饱和脂肪酸、零胆固醇、无抗生素等优点，在满足人们追求健康饮食的同时，还为人体提供充足的营养物质和能量。
[0047]
(6)企业大规模发酵生产时无需购买复杂设备，发酵过程可采用开放式，故本发明工艺简单、无复杂生产设备，只需满足发酵条件即可实现，有效减少企业投入，降低企业成
本，增加企业利润。
附图说明
[0048]
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
[0049]
图1为本生产方法工艺流程示意图。
具体实施方式
[0050]
下面结合具体的施例，对本发明的步骤做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0051]
实施例1：低嘌呤大豆粉的制作
[0052]
(1)一次活化
[0053]
取保存于甘油管内菌液1ml，转移至已灭菌的pda液体培养基中，30℃培养2d，获得米曲霉孢子液。
[0054]
(2)二次活化
[0055]
a、大豆培养基：大豆去皮，15-20℃浸泡至膨胀，料液比为1∶5(w∶v)，沸水蒸煮0.5h，于破碎机中打成1-3mm的颗粒状，放于60-65℃烘箱中处理3h，终点。发酵大豆物料，烘干处理，待制曲。
[0056]
2、发酵
[0057]
(1)原料预处理：同1(2)a。
[0058]
(2)种曲制备：取500g原料，加入质量分数7.5％的扩大培养后的大豆培养基搅拌均匀，压制成曲胚，加入适量水分控制曲胚含水量为34-36％，30℃培养48h，得种曲。
[0059]
3、固态发酵
[0060]
在超净台内，以质量分数20％的比例接入曲，发酵72h，控制发酵室中的湿度为80-95％，发酵温度控制在25-30℃。在发酵24h，以质量分数20％的比例再次拌入新曲，搅拌均匀，发酵至终点。利用冷冻干燥技术，制成低嘌呤大豆粉。
[0061]
4、营养棒制作
[0062]
将低嘌呤大豆粉与藜麦粉以9∶1的比例混匀，燕麦片入烤箱中120℃烤15min，冷却后混合均匀，加入适量坚果，倒入烤盘中压实，入预热120℃的烤箱，中层烤30min至金黄，表面刷上蜂蜜水，再继续烤5min，出炉(蜂蜜∶水比例为1∶1)，冷却，切块。
[0063]
实施例3：低嘌呤蛋白营养固体饮料的制作
[0064]
1、菌种活化
[0065]
(1)一次活化
[0066]
取保存于甘油管内菌液1ml，转移至已灭菌的pda液体培养基中，30℃培养2d，获得米曲霉孢子液。
[0067]
(2)二次活化
[0068]
a、大豆培养基：大豆去皮，常温浸泡10h，料液比为1∶5(w∶v)，沸水蒸煮 0.5h，于破碎机中打成渣状，放于65℃烘箱中处理3h，期间要搅拌物料，使其均匀干燥，防止粘连，自然冷却至室温。
[0069]
b、4℃ 8000r/min条件下离心米曲霉菌液10min，加入等体积的生理盐水吹打菌体，重复操作两次，获得菌悬制备液。按5％(v/w)的接种量接种于大豆培养基中，30℃下发酵到终点即可。期间要注意观察菌丝生长情况，待菌丝体将大豆连结成块状和产生黄绿色孢子后，翻面继续培养24h，即可烘干处理。
[0070]
2、制曲
[0071]
(1)原料预处理：同1(2)a。
[0072]
(2)种曲制备：取500g原料，加入质量分数7.5％的扩大培养后的大豆培养基搅拌均匀，压制成曲胚，加入适量水分控制曲胚含水量为34-36％，30℃培养48h，得种曲。
[0073]
3、固态发酵
[0074]
在超净台内，以质量分数20％的比例接入曲，发酵72h，控制发酵室中的湿度为80-95％，发酵温度控制在25-30℃。在发酵24h，以质量分数20％的比例再次拌入新曲，搅拌均匀，发酵至终点。利用冷冻干燥技术，制成低嘌呤大豆粉。
[0075]
4、低嘌呤蛋白营养固体饮料的制作
[0076]
按照低嘌呤大豆粉和藜麦粉3∶1的比例混合混合，按照(1-2)g∶(15-25)ml 料液比，加水制成匀浆液，90℃热水浸提0.5h。100份低嘌呤蛋白粉加入各类果蔬粉4-5份、木糖醇2-3份、维生素c(抗坏血酸)1-2份、维生素b1 1-2份、维生素b6 1-2份和叶酸0.5份，热水浸提，冷冻干燥，混合包装后得低嘌呤蛋白营养固体饮料。
[0077]
介绍上述实施实例中的一些实验状况
[0078]
结论：以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围。