一种基于叶片诱导的银杏再生的方法

1.本发明属于植物叶片诱导及再生体系建立领域，涉及一种银杏的叶片诱导及再生体系的方法与培养基组合。


背景技术：

2.银杏(学名：ginkgo biloba l.)为银杏科、银杏属落叶乔木。银杏出现在几亿年前，是第四纪冰川运动后遗留下来的裸子植物中最古老的孑遗植物，现存活在世的银杏稀少而分散，上百岁的老树已不多见，和它同纲的所有其他植物皆已灭绝，所以银杏又有活化石的美称。变种及品种有:黄叶银杏、塔状银杏、裂银杏、垂枝银杏、斑叶银杏等26种。
3.银杏树的果实俗称白果，因此银杏又名白果树。银杏树生长较慢，寿命极长，自然条件下从栽种到结银杏果要二十多年，四十年后才能大量结果，因此又有人把它称作“公孙树”，有“公种而孙得食”的含义，是树中的老寿星，具有观赏，经济，药用价值。
4.银杏最早出现于3.45亿年前的石炭纪。曾广泛分布于北半球的欧、亚、美洲，中生代侏罗纪银杏曾广泛分布于北半球，白垩纪晚期开始衰退。至50万年前，发生了第四纪冰川运动，地球突然变冷，绝大多数银杏类植物濒于绝种，在一欧洲、北美和亚洲绝大部分地区灭绝，只有中国自然条件优越，才奇迹般的保存下来。所以，被科学家称为“活化石”，“植物界的熊猫”。野生状态的银杏残存于中国江苏徐州北部(邳州市)山东南部临沂(郯城县)地区浙江西部山区。
5.浙江天目山，湖北省宜昌市雾渡河镇、湖北省安陆市、桂林灵川县海洋乡到兴安县高尚镇等周围少数乡镇、大别山、神农架等地都有野生、半野生状态的银杏群落。由于个体稀少，雌雄异株，如不严格保护和促进天然更新，残存林将被取代。银杏分布大都属于人工栽培区域，主要大量栽培于中国、法国和美国南卡罗莱纳州。毫无疑问，国外的银杏都是直接或间接从中国传入的。
6.银杏的再生体系的建立将加快银杏的基础科学研究，促进基因编辑辅助等生物技术培育银杏新品种的研究与应用，拯救濒危银杏品种及种质资源。


技术实现要素：

7.为了弥补现有技术的不足，本发明第一方面提供了一种用于银杏再生的培养基组合，所述培养基组合包括银杏叶片诱导愈伤培养基、银杏不定芽伸长培养基和银杏生根培养基；
8.所述银杏叶片诱导愈伤培养基包括ms培养基、4-8g/l琼脂、25-32g/l蔗糖、0.08-0.15mg/l iaa和0.06-0.10mg/l iba；
9.所述银杏不定芽伸长培养基包括ms培养基、4-8g/l琼脂、25-32g/l蔗糖、0.25-0.40mg/l iba和0.06-0.12mg/l玉米素；
10.所述银杏生根培养基包括1/2ms培养基、4-8g/l琼脂、25-32蔗糖、0.20-0.30mg/l iba和0.2-0.4mg/l naa。
11.在一些实施方式中，所述银杏的品种为大马铃。
12.在一些实施方式中，所述银杏叶片诱导愈伤培养基包括ms培养基、5.6g/l琼脂、28.5g/l蔗糖、0.1mg/l iaa和0.08mg/l iba。
13.在一些实施方式中，所述银杏不定芽伸长培养基包括ms培养基、5.6g/l琼脂、28.5g/l蔗糖、0.3mg/l iba和0.08mg/l玉米素。
14.在一些实施方式中，所述银杏生根培养基包括1/2ms培养基、5.6g/l琼脂、28.5g/l蔗糖、0.25mg/l iba和0.3mg/l naa。
15.在一些实施方式中，所述银杏叶片诱导愈伤培养基中，ph为5.5-6.2。
16.在一些实施方式中，所述银杏不定芽伸长培养基中，ph为5.5-6.2。
17.在一些实施方式中，所述银杏生根培养基中，ph为5.5-6.2。
18.在一些实施方式中，所述ms培养基包括：1900mg/l硝酸钾、332.2mg/l氯化钙、1650mg/l硝酸铵、180.7mg/l硫酸镁、170mg/l磷酸二氢钾；0.025mg/l硫酸铜、6.2mg/l硼酸、16.9mg/l硫酸锰、0.25mg/l钼酸钠、8.6mg/l硫酸锌、0.025mg/l氯化钴、0.83mg/l碘化钾；27.8mg/lfeso4·
7h2o、37.26mg/l na
2-edta
·
2h2o；2.0mg/l甘氨酸、100mg/l肌醇、0.50mg/l烟酸、0.1mg/l硫胺vb1和0.5mg/l吡哆醇vb6。
19.在一些实施方式中，所述1/2ms培养基包括：950mg/l硝酸钾、166.1mg/l氯化钙、825mg/l硝酸铵、90.35mg/l硫酸镁、85mg/l磷酸二氢钾；0.025mg/l硫酸铜、6.2mg/l硼酸、16.9mg/l硫酸锰、0.25mg/l钼酸钠、8.6mg/l硫酸锌、0.025mg/l氯化钴、0.83mg/l碘化钾；27.8mg/lfeso4·
7h2o、37.26mg/l na
2-edta
·
2h2o；2.0mg/l甘氨酸、100mg/l肌醇、0.50mg/l烟酸、0.1mg/l硫胺vb1和0.5mg/l吡哆醇vb6。
20.本发明第二方面提供了一种银杏再生的方法，所述方法包括如下步骤：
21.s1：愈伤组织诱导
22.将银杏叶片外植体接种到银杏叶片诱导愈伤培养基中进行诱导培养，形成带有不定芽的银杏愈伤组织；
23.所述银杏叶片诱导愈伤培养基为本发明第一方面所述的培养基组合中的所述银杏叶片诱导愈伤培养基；
24.s2：芽伸长诱导
25.将所述带有不定芽的愈伤组织的愈伤团接种到银杏不定芽伸长培养基中进行芽伸长培养，形成不定芽伸长的银杏植株；
26.所述银杏不定芽伸长培养基为本发明第一方面所述的培养基组合中的所述银杏不定芽伸长培养基；
27.s3：生根诱导
28.将所述不定芽伸长的银杏植株接种到银杏生根培养基中进行生根培养，形成长有不定芽和根的银杏植株；
29.所述银杏生根培养基为本发明第一方面所述的培养基组合中的所述银杏生根培养基。
30.在一些实施方式中，在步骤s1中，将银杏叶片用水清洗干净，用消毒剂消毒处理，再用无菌水冲洗干净，得到所述银杏叶片外植体。
31.在一些实施方式中，在步骤s1中，用70-80％的乙醇水溶液浸泡银杏叶片25-45s，
用无菌水冲洗银杏叶片1-5次，用1.0-2.0w/v％的次氯酸钠水溶液浸泡银杏叶片15-25min，再用无菌水冲洗银杏叶片5-20次，得到所述银杏叶片外植体。
32.在一些实施方式中，在步骤s1中，将所述银杏叶片外植体分割为1-2cm2的叶片组织，将所述叶片组织接种到所述银杏叶片诱导愈伤培养基中进行所述诱导培养。
33.在一些实施方式中，在步骤s1中，所述诱导培养为暗培养，培养温度为22-25℃，培养时间为2-4天。
34.在一些实施方式中，在步骤s2中，培养温度为22-25℃，每日光照14-18小时，光照强度为150-160μmol/m2/s，培养时间为21-28天。
35.在一些实施方式中，在步骤s3中，培养温度为22-25℃、每日光照14-18小时、光照强度为150-160μmol/m2/s，培养时间为30-40天。
36.在一些实施方式中，所述方法还包括如下步骤：
37.s4：炼苗
38.将所述长有不定芽和根的银杏植株进行炼苗培养。
39.在一些实施方式中，在步骤s4中，培养温度为22-25℃，每日光照14-18小时，光照强度为150-160μmol/m2/s，相对湿度为80-90％，培养时间为30-40天。
40.在一些实施方式中，所述方法还包括如下步骤：
41.s5：移栽
42.将经炼苗后的银杏苗从瓶中取出，移栽至土壤中。
43.在一些实施方式中，在步骤s5中，温度为22-25℃，相对湿度为50-60％。
44.本发明基于叶片诱导的银杏再生的方法中，愈伤诱导率可达96.8％，生芽率可达98.2％，生根率可达98.6％，能够有效地应用于科研和林业生产当中。
附图说明
45.图1为本发明实施例1愈伤培养情况的照片之一
46.图2为初始愈伤到逐渐出芽的过程照片。
47.图3为本发明实施例1生芽培养情况的照片之一。
48.图4为本发明实施例1生根培养情况的照片之一(瓶身方向)。
49.图5为本发明实施例1生根培养情况的照片之一(平底方向)。
具体实施方式
50.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
51.本发明没有详细描述的步骤均为本领域常规操作，没有详细记录的材料均为本领域常规材料。
52.本发明所用银杏品种为：大马铃。
53.实施例1
54.(一)培养基的配制
55.(1)银杏叶片诱导愈伤培养基
56.基础培养基为ms培养基，具体包括大量元素：1900mg/l硝酸钾、332.2mg/l氯化钙、
1650mg/l硝酸铵、180.7mg/l硫酸镁、170mg/l磷酸二氢钾；微量元素：0.025mg/l硫酸铜、6.2mg/l硼酸、16.9mg/l硫酸锰、0.25mg/l钼酸钠、8.6mg/l硫酸锌、0.025mg/l氯化钴、0.83mg/l碘化钾；铁盐：27.8mg/lfeso4·
7h2o、37.26mg/l na
2-edta
·
2h2o；有机成分：2.0mg/l甘氨酸、100mg/l肌醇、0.50mg/l烟酸、0.1mg/l硫胺vb1、0.5mg/l吡哆醇vb6。配方中还包括5.6g/l琼脂、28.5g/l蔗糖，ph 5.85
±
0.2。培养基中的激素为iaa和iba，激素的含量分别参见表1。
57.(2)银杏不定芽伸长培养基
58.基础培养基为ms培养基，具体包括大量元素：1900mg/l硝酸钾、332.2mg/l氯化钙、1650mg/l硝酸铵、180.7mg/l硫酸镁、170mg/l磷酸二氢钾；微量元素：0.025mg/l硫酸铜、6.2mg/l硼酸、16.9mg/l硫酸锰、0.25mg/l钼酸钠、8.6mg/l硫酸锌、0.025mg/l氯化钴、0.83mg/l碘化钾；铁盐：27.8mg/lfeso4·
7h2o、37.26mg/l na
2-edta
·
2h2o；有机成分：2.0mg/l甘氨酸、100mg/l肌醇、0.50mg/l烟酸、0.1mg/l硫胺vb1、0.5mg/l吡哆醇vb6。配方中还包括5.6g/l琼脂、28.5g/l蔗糖，ph5.85
±
0.1。培养基中的激素为iba和玉米素，激素的含量分别参见表2。
59.(3)银杏生根培养基
60.基础培养基为1/2ms培养基，具体包括大量元素：950mg/l硝酸钾、166.1mg/l氯化钙、825mg/l硝酸铵、90.35mg/l硫酸镁、85mg/l磷酸二氢钾；微量元素：0.025mg/l硫酸铜、6.2mg/l硼酸、16.9mg/l硫酸锰、0.25mg/l钼酸钠、8.6mg/l硫酸锌、0.025mg/l氯化钴、0.83mg/l碘化钾；铁盐：27.8mg/lfeso4·
7h2o、37.26mg/l na
2-edta
·
2h2o；有机成分：2.0mg/l甘氨酸、100mg/l肌醇、0.50mg/l烟酸、0.1mg/l硫胺vb1、0.5mg/l吡哆醇vb6。配方中还包括5.6g/l琼脂28.5g/l蔗糖，ph5.85
±
0.2。培养基中的激素为iba和naa，激素的含量分别参见表3。
61.(二)愈伤组织诱导培养：
62.外植体的选择：选择3年生，且生长状态良好，健康的银杏，选取叶片嫩绿且生长状态良好，健康的叶片，用剪刀剪下叶片。
63.外植体的预处理：用流动的清水冲洗叶片8h，叶片冲洗后后置于无菌的吸水纸上将其水分吸干室超净工作台上，往后的操作需要在超净工作台上进行无菌操作。
64.外植体的消毒：用75％的乙醇水溶液浸泡叶片30s，用无菌水冲洗叶片3次，再用1.5w/v％(每100ml水溶液中含有1.5g次氯酸钠)的次氯酸钠水溶液浸泡叶片18min，消毒后用无菌水冲洗叶片12次，用无菌纸吸干水分，用无菌剪刀将叶片分割为1.5cm2左右的叶片组织小块备用。
65.将消毒处理过的外植体分别接种到装有表1所述6种银杏愈伤诱导培养基，每种培养基配制10瓶，每瓶3-10个叶片组织小块。
66.将上述外植体暗室中培养3天，培养温度为22-25℃，观察外植体即叶片组织的愈伤组织诱导情况以及长势，其中一瓶的照片参见图1。另3个培养瓶中分别取下的1块愈伤组织，其照片参见图2中a-c，其中a到c为银杏叶片愈伤由初始愈伤到逐渐出芽(不定芽)的过程，愈伤诱导率参见表1。
67.由此可见，本发明的方法能够有效地诱导银杏外植体生成愈伤组织并可以出现芽的萌动。
68.(三)芽伸长诱导
69.选取步骤(二)中长势良好的愈伤组织于无菌超净工作台中，用无菌的镊子夹取愈伤团分别移至表2所示6种银杏芽伸长培养基中，每瓶3-10个，在培养温度22-25℃、光暗周期16/8h/d、光照强度150-160μmol/m2/s的条件下培养21-28天左右，观察记录生芽率以及生芽后幼苗的长势，每种培养基的瓶数为10个，其中一瓶的照片参见图3，生芽率参见表2。
70.由此可见，本发明的方法能够有效地诱导银杏愈伤组织不定芽伸长。
71.(四)生根诱导
72.将步骤(三)中长势茁壮的生芽小苗切割后，将其分别移至表3所示6种银杏生根培养基中，每瓶1株，在培养温度22-25℃、光暗周期16/8h/d、光照强度150-160μmol/m2/s的条件下培养35天，观察小苗生根状况并记录生根率。其中一瓶瓶身方向观察的照片参见图4，瓶底方向观察的照片见图5，生根率参见表3。
73.由此可见，本发明的方法能够有效地诱导银杏不定芽植株生根。
74.(五)炼苗
75.将所述长有不定芽和根的银杏植株进行炼苗培养，培养温度为22-25℃，光暗周期为16/8h/d(即每天光照16h，暗培养8h)，光照强度为150-160μmol/m2/s，相对湿度为80-90％，培养时间为35天。
76.(六)移栽
77.将经35天炼苗后的银杏植株从瓶中取出，移栽至温室大棚内土壤中温度控制在22-25℃，相对湿度控制在50-60％。
78.表1.银杏诱导愈伤培养基及培养结果
79.编号iaa(mg/l)iba(mg/l)愈伤诱导率愈伤生长状态10.10.0438.9％ 20.10.0659.8％ 30.10.0896.8％ 40.20.1040.6％ 50.20.1266.5％ 60.20.1635.6％
80.注：“ ”表示愈伤组织生长状态。
[0081]“ ”为生长状态最好，出愈时间短，生长快，愈伤团大，呈颗粒状，结构松散，微淡黄色；
[0082]“ ”表示愈伤生长状态较好，出愈时间短，愈伤生长较快，颗粒状，淡黄色；
[0083]“ ”表示愈伤生长状态一般，生长较慢，呈块状，黄绿色；
[0084]“ ”表示愈伤生长状态差，出愈时间长，生长慢，呈块状，结构致密，质地较硬，黄绿色。
[0085]
表2.银杏芽伸长培养基及培养结果
[0086]
编号iba(mg/l)玉米素(mg/l)生芽率(％)生长状态10.30.0445.6％ 20.30.0665.4％ 30.30.0898.2％
40.40.1259.8％ 50.40.1665.2％ 60.40.1839.6％
[0087]
注：“ ”表示芽生长状态。
[0088]“ ”为生长状态最好，出芽快、芽多、长势壮、叶绿色；
[0089]“ ”表示生长状态较好，芽多、长势壮、叶绿色；
[0090]“ ”表示芽生长状态一般，长势一般、叶绿色；
[0091]“ ”表示芽生长状态差，长势弱、叶绿色。
[0092]
表3.银杏生根培养基及培养结果
[0093]
编号iba(mg/l)naa(mg/l)生根率(％)生长状态10.250.1039.3％ 20.250.2056.7 30.250.3098.6 40.300.4063.2％ 50.300.5033.6％ 60.300.6037.8％
[0094]
注：“ ”表示生根状态。
[0095]“ ”生根时间最短、不定根多；
[0096]“ ”表生根时间较短、不定根多；
[0097]“ ”表示生根慢、不定根少；
[0098]“ ”表示生根很慢、不定根很少。
[0099]
由此可见，本发明基于叶片诱导的银杏再生的方法中，愈伤诱导率可达96.8％，生芽率可达98.2％，生根率可达98.6％，能够有效地应用于科研和林业生产当中。
[0100]
由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。