一种聚合物-脂质偶联物及其制备方法和应用

1.本发明属于生物制药领域，涉及一种载药系统，特别是指一种聚合物-脂质偶联物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肝癌是全球第六大常见癌症，2020年新增肝癌病例905,677例，是全球癌症相关死亡的第二大原因。到2025年，预计发病率将超过100万，其中 90% 的病例将是肝细胞癌 (hcc)。化疗是日常治疗中重要的辅助治疗。然而，已发现传统化疗药物具有许多局限性，例如溶解度和生物利用度差、肿瘤积累低、从血液中清除速度快、对正常组织的严重副作用和癌细胞的多药耐药性（mdr）。用于递送化疗药物的纳米药物递送系统在一定程度上可以克服上述缺点。因此，抗肿瘤纳米药物递送系统的开发是近年来的热门话题，阿霉素、紫杉醇等多款产品已在临床上治疗十多年。目前，已经开发出一系列基于两亲性偶联物的智能纳米药物递送系统，包括聚合物-药物偶联物 (pdc)、聚合物-脂质偶联物、纯纳米药物 (pnd)、两亲性药物偶联物 (addc) 和janus树枝状聚合物（jds）。随着纳米药物递送系统研究的深入，传统的低选择性递送系统已逐渐被具有细胞内和细胞外反应的智能递送系统所取代。刺激响应药物递送系统的想法来自患病组织和细胞的异常。谷胱甘肽(gsh)是一种酸性分子，由半胱氨酸残基和 γ 连接的氨基酸组成，可防止细胞蛋白酶水解。gsh的浓度通常在肿瘤微环境中上调。它们已被广泛探索为用于诊断和预后的癌症生物标志物。最近，由于谷胱甘肽的存在可以将二硫键还原为硫醇，因此含二硫键的化合物已被用作强大的肿瘤环境刺激物，用于将药物和显像剂刺激物响应递送至肿瘤。
3.理想的抗癌药物递送系统的设计应优选使用无毒且具有生物相容性的材料作为基质。作为 omega-3 不饱和脂肪酸的二十碳五烯酸 (epa)是一种人类生长发育所必需的脂肪酸。每天食用富含epa的鱼可以预防或减缓疾病的发生。研究表明，epa可以增加肿瘤对放射治疗的敏感性，减少放射引起的黏膜和上皮损伤。体内实验也证实，epa可以与化疗或放疗协同作用，通过增加氧化应激来杀死肿瘤细胞。在这个过程中，epa可以减少肿瘤血管生成，减少炎症，避免肿瘤转移。此外，由于疏水性epa的化学结构中存在共轭烯烃的大π键，分子间自组装理论上可以通过 π-π 堆积来封装和输送水不溶性药物。总体而言，epa 似乎在药物递送系统中具有广阔的应用前景。
4.聚乙二醇（peg）无毒、无免疫原性、无抗原性，易溶于水。与非聚乙二醇化产品相比，聚乙二醇化具有多种优势。它负责通过增加其循环时间来增强药物的治疗潜力。聚乙二醇化可以降低药物的免疫原性和抗原性，因此也会影响药物的稳定性。目前市场上批准的聚乙二醇化药物有很多，其在药物递送系统中发挥着非常重要的作用。


技术实现要素：

5.本发明提出一种聚合物-脂质偶联物及其制备方法和应用，该聚合物胶束（mpeg-ss-epa、mpeg-epa）用于体内抗肿瘤药物的递送，其主要结构是以含有二硫键的胱胺为接
头，胱胺两端分别与mpeg
2000
和epa相连。还合成了 mpeg
2000
与 epa直接共价连接的缀合物。
6.本发明的技术方案是这样实现的：一种氧化还原响应性聚合物-脂质偶联物，以天然鱼油成分epa作为疏水端以及mpeg作为亲水端，通过共价键制备而得；其结构式如式1或式2所示：、。
7.上述聚合物-脂质偶联物的合成步骤如下：mpeg-nh2的合成将mpeg-oh (1 mmol, 2 g) 溶解在 et3n (0.5-3当量) 的无水 dcm 溶液中，并在 0
ꢀ°
c 下逐滴加入甲磺酰氯 (0.5-3当量)。混合物在室温下搅拌2小时。反应完成后，用1m盐酸洗涤混合物3次。合并的有机层用盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。真空除去溶剂，加入冰醚沉淀，得到浅黄色固体(mpeg-ms)。将固体溶解在nh3·
h2o（25-28%，10当量）和硫酸铵（0.5-3当量）的乙醇溶液中。混合物在80℃下回流过夜。反应完成后，混合物用dcm萃取。合并的有机层用盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。从真空中除去溶剂并加入冰醚以沉淀得到呈白色固体状的产物。
8.mpeg-epa的合成在25 ml干燥的schlenk管中，将 epa（2 mmol，604 mg）、edc
·
hcl（0.5-5当量）和 nhs（0.1-3当量）溶解在干燥的 dcm 中。将反应混合物在氩气中于室温搅拌。通过tlc监测反应。反应完成后，加入mpeg
ꢀ‑
nh2（0.1-3当量）。将反应混合物在氩气中在室温下再搅拌12小时。反应完成后，真空除去溶剂，然后加入水。溶液在透析袋(mw：3500 da)中透析24小时，然后通过0.22μm滤水器过滤并冻干得到黄色絮状固体产物。
9.epa-cys的合成在25 ml干燥的schlenk管中，将epa（2 mmol，604 mg）、edc
·
hcl（0.5-5当量）和 nhs（0.5-5当量）溶解在干燥的 dcm 中。将反应混合物在氩气中于室温搅拌。通过tlc监测反应。反应完成后，加入半胱氨酸（胱胺二盐酸盐用1m naoh脱盐，1-8当量）。将反应混合物在氩气中在室温下再搅拌10小时。通过tlc监测反应。反应完成后，真空除去溶剂，加入甲醇过滤脱盐。从真空中除去溶剂。用水沉淀得到黄色固体产物。
10.mpeg-cdi的合成在 50 ml 干燥的schlenk管中，将mpeg-oh（1 mmol，2 g）和 cdi（1-8当量）溶解在干燥的 dcm 中。将反应混合物在氩气中室温搅拌24小时。反应完成后，将混合物用水洗涤3次。合并的有机层用盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。真空除去溶剂，加入冰醚沉淀，得到白色固体产物。
11.mpeg-ss-epa的合成在 25 ml 干燥的schlenk管中，将epa-cys（1.1 mmol，500 mg）、mpeg-cdi（0.5-3当量）和 tea（0.5-5当量）溶解在干燥的 dcm 中。将反应混合物在氩气中在 80
°
c 下搅拌过夜。反应完成后，真空除去溶剂，然后加入水。溶液在透析袋(mw：3500 da)中透析24小时，然后通过0.22μm滤水器过滤并冻干得到黄色絮状固体产物。
epa@dox (f) 在 37
ꢀ°
c 下的大小演变。
22.图4为胶束的还原触发降解及体外释放研究。(b, d)不同条件下mpeg-ss-epa@dox 的 dox 药物释放曲线。(a, c)mpeg-epa@dox 胶束用作对照。数据表示为平均值
ꢀ±ꢀ
s.e.m. (n = 3)。
23.图5为胶束的体外细胞毒性。(a)epa 和空白胶束、(b) dox 和载药胶束在 48 小时内对 lx-2 的细胞毒性。数据表示为平均值
ꢀ±ꢀ
s.e.m. (n = 3)。
24.图6为胶束对肿瘤细胞的抑制作用。(a)epa 和空白胶束、(b)dox 和载药胶束在24、48 和 72 小时对 hepg2 和 huh-7 细胞的细胞毒性。(c)使用膜联蛋白 v-fitc/pi 染色的不同制剂处理诱导的 hepg2 和 huh-7 细胞凋亡。数据表示为平均值
ꢀ±ꢀ
s.e.m. (n = 3)。（d）不同细胞凋亡相关蛋白的表达结果。(e)使用钙黄绿素-am/pi 染色的不同制剂处理诱导的 hepg2 和 huh-7 细胞活力。（100 倍放大）。
25.图7为细胞内摄取。用载有 dox 的胶束和游离 dox 处理 0.5、4、8 或 12 小时后 hepg2 和 huh-7 细胞的荧光显微镜图像，dox 剂量为 20 μm。(400 倍放大)。
26.图8为体内抗肿瘤功效研究和生物分布。(a)dox 溶液、mpeg-epa@dox 胶束和mpeg-ss-epa@dox 胶束在小鼠肝细胞癌皮下移植模型 (h22) 中的体内抗肿瘤活性，以生理盐水为对照。(b)相对肿瘤体积随时间变化。(c)第 15 天每个治疗组收获的肿瘤和肿瘤重量的代表性图像。(d)肿瘤和器官的离体荧光。(e)不同处理后小鼠体重的变化。(f)各组解剖后器官系数。各组溶血图片及溶血系数直方图。肝肾功能指标直方图：（g）alt和ast、（h）urea、（i）crea。
27.图9为胶束体内安全性初步评价。(a)心脏全图、(b)心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏的 h&e 染色图像。（400 倍放大）。
28.图10为组织病理学和免疫组织学分析。用不同制剂处理的 h22 荷瘤小鼠肿瘤的组织学检测和 tunel 检测图像。（400 倍放大）。
29.图11为空白及载药胶束的粒径。
30.图12为tem 确定空白及载药胶束的平均直径。
31.图13为空白胶束和载有dox的胶束的溶血实验。
32.图14为mpeg-epa的临界胶束浓度（cmc）值。
33.图15为mpeg-ss-epa的临界胶束浓度（cmc）值。
具体实施方式
34.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.本技术应用试验主要试剂、药品及样品：二十碳五烯酸（epa，97%），1-乙基-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（edc
·
hcl，98%）购自江苏艾康化工有限公司（中国南京）。 n-羟基琥珀酰亚胺（nhs，98%），胱胺二盐酸盐（98%），三乙胺（tea，99%），甲磺酰氯（ms-cl，98%），甲基聚（乙二醇）（mpeg-oh，mw：2000 da）购自 aldrich（中国上海）。盐酸多柔比星（dox
·
hcl，98%），4-二甲氨基吡啶（dmap，97%）
购自能源化工有限公司（中国上海）。其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）胎牛血清 (fbs) 和 dmem 培养基由 gibco brl (md, usa) 提供。其他耗材和试剂盒购自solarbio（中国北京）。
36.实验瑞士小鼠（6 周龄，26
ꢀ±ꢀ
2 g）购自河南实验动物中心（中国郑州）。
37.实施例1本实施例的聚合物-脂质偶联物（mpeg-ss-epa）的制备方法，其合成路线如图1所示，具体步骤如下：mpeg-nh2的合成将mpeg-oh (1 mmol, 2 g) 溶解在 et3n (1.2当量) 的无水 dcm 溶液中，并在0
ꢀ°
c下逐滴加入甲磺酰氯 (1.1当量)。混合物在室温下搅拌2小时。反应完成后，用1m盐酸洗涤混合物3次。合并的有机层用盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。真空除去溶剂，加入冰醚沉淀，得到浅黄色固体(mpeg-ms)。将固体溶解在nh3·
h2o（25-28%，10当量）和硫酸铵（1当量）的乙醇溶液中。混合物在80℃下回流过夜。反应完成后，混合物用dcm萃取。合并的有机层用盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。从真空中除去溶剂并加入冰醚以沉淀得到呈白色固体状的产物(1.5g，75％)。
38.的合成在25 ml干燥的schlenk管中，将 epa（2 mmol，604 mg）、edc
·
hcl（2 当量）和 nhs（1.2 当量）溶解在干燥的 dcm 中。将反应混合物在氩气中于室温搅拌。通过tlc监测反应。反应完成后，加入mpeg
ꢀ‑
nh2（0.9 当量）。将反应混合物在氩气中在室温下再搅拌12小时。反应完成后，真空除去溶剂，然后加入水。溶液在透析袋(mw：3500 da)中透析24小时，然后通过0.22μm滤水器过滤并冻干得到黄色絮状固体产物(1.8g，75％)。
39.的合成在 25 ml 干燥的schlenk管中，将 epa（2 mmol，604 mg）、edc
·
hcl（2 当量）和 nhs（1.2 当量）溶解在干燥的 dcm 中。将反应混合物在氩气中于室温搅拌。通过tlc监测反应。反应完成后，加入半胱氨酸（胱胺二盐酸盐用1m naoh脱盐，5当量）。将反应混合物在氩气中在室温下再搅拌10小时。通过tlc监测反应。反应完成后，真空除去溶剂，加入甲醇过滤脱盐。从真空中除去溶剂。用水沉淀得到黄色固体产物（500mg，83%）。
40.的合成在 50 ml 干燥的schlenk管中，将mpeg-oh（1 mmol，2 g）和 cdi（4 当量）溶解在干燥的 dcm 中。将反应混合物在氩气中室温搅拌24小时。反应完成后，将混合物用水洗涤3次。合并的有机层用盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。真空除去溶剂，加入冰醚沉淀，得到白色固体产物(1.65g，82.5％)。
41.的合成在 25 ml干燥的schlenk管中，将epa-cys（1.1 mmol，500 mg）、mpeg-cdi（1.1 当量）和 tea（1.5 当量）溶解在干燥的 dcm 中。将反应混合物在氩气中在 80
°
c 下搅拌过夜。反应完成后，真空除去溶剂，然后加入水。溶液在透析袋(mw：3500 da)中透析24小时，然后通过0.22μm滤水器过滤并冻干得到黄色絮状固体产物(1.2g，67％)。通过红外光谱和核磁共振验证了结构。
42.实施例2
本实施例的聚合物-脂质偶联物（mpeg-ss-epa）的制备方法，其合成路线如图1所示，具体步骤如下：mpeg-nh2的合成将mpeg-oh (1 mmol, 2 g) 溶解在 et3n (3当量) 的无水 dcm 溶液中，并在 0
ꢀ°
c 下逐滴加入甲磺酰氯 (0.5当量)。混合物在室温下搅拌2小时。反应完成后，用1m盐酸洗涤混合物3次。合并的有机层用盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。真空除去溶剂，加入冰醚沉淀，得到浅黄色固体(mpeg-ms)。将固体溶解在nh3·
h2o（25-28%，10当量）和硫酸铵（3当量）的乙醇溶液中。混合物在80℃下回流过夜。反应完成后，混合物用dcm萃取。合并的有机层用盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。从真空中除去溶剂并加入冰醚以沉淀得到呈白色固体状的产物。
43.mpeg-epa的合成在25 ml干燥的schlenk管中，将 epa（2 mmol，604 mg）、edc
·
hcl（0.5当量）和 nhs（3当量）溶解在干燥的 dcm 中。将反应混合物在氩气中于室温搅拌。通过tlc监测反应。反应完成后，加入mpeg
ꢀ‑
nh2（0.1当量）。将反应混合物在氩气中在室温下再搅拌12小时。反应完成后，真空除去溶剂，然后加入水。溶液在透析袋(mw：3500 da)中透析24小时，然后通过0.22μm滤水器过滤并冻干得到黄色絮状固体产物。
44.epa-cys的合成在25 ml干燥的schlenk管中，将epa（2 mmol，604 mg）、edc
·
hcl（5当量）和 nhs（0.5当量）溶解在干燥的 dcm 中。将反应混合物在氩气中于室温搅拌。通过tlc监测反应。反应完成后，加入半胱氨酸（胱胺二盐酸盐用1m naoh脱盐，8当量）。将反应混合物在氩气中在室温下再搅拌10小时。通过tlc监测反应。反应完成后，真空除去溶剂，加入甲醇过滤脱盐。从真空中除去溶剂。用水沉淀得到黄色固体产物。
45.mpeg-cdi的合成在 50 ml 干燥的schlenk管中，将mpeg-oh（1 mmol，2 g）和 cdi（8当量）溶解在干燥的 dcm 中。将反应混合物在氩气中室温搅拌24小时。反应完成后，将混合物用水洗涤3次。合并的有机层用盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。真空除去溶剂，加入冰醚沉淀，得到白色固体产物。
46.mpeg-ss-epa的合成在 25 ml 干燥的schlenk管中，将epa-cys（1.1 mmol，500 mg）、mpeg-cdi（0.5当量）和 tea（5当量）溶解在干燥的 dcm 中。将反应混合物在氩气中在 80
°
c 下搅拌过夜。反应完成后，真空除去溶剂，然后加入水。溶液在透析袋(mw：3500 da)中透析24小时，然后通过0.22μm滤水器过滤并冻干得到黄色絮状固体产物。
47.实施例3本实施例的聚合物-脂质偶联物（mpeg-ss-epa）的制备方法，其合成路线如图1所示，具体步骤如下：mpeg-nh2的合成将mpeg-oh (1 mmol, 2 g) 溶解在 et3n (0.5当量) 的无水 dcm 溶液中，并在 0
ꢀ°
c 下逐滴加入甲磺酰氯 (3当量)。混合物在室温下搅拌2小时。反应完成后，用1m盐酸洗涤混合物3次。合并的有机层用盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。真空除去溶剂，加入冰醚
沉淀，得到浅黄色固体(mpeg-ms)。将固体溶解在nh3·
h2o（25-28%，10当量）和硫酸铵（0.5当量）的乙醇溶液中。混合物在80℃下回流过夜。反应完成后，混合物用dcm萃取。合并的有机层用盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。从真空中除去溶剂并加入冰醚以沉淀得到呈白色固体状的产物。
48.mpeg-epa的合成在25 ml干燥的schlenk管中，将 epa（2 mmol，604 mg）、edc
·
hcl（5当量）和 nhs（0.1当量）溶解在干燥的 dcm 中。将反应混合物在氩气中于室温搅拌。通过tlc监测反应。反应完成后，加入mpeg
ꢀ‑
nh2（3当量）。将反应混合物在氩气中在室温下再搅拌12小时。反应完成后，真空除去溶剂，然后加入水。溶液在透析袋(mw：3500 da)中透析24小时，然后通过0.22μm滤水器过滤并冻干得到黄色絮状固体产物。
49.epa-cys的合成在25 ml干燥的schlenk管中，将epa（2 mmol，604 mg）、edc
·
hcl（0.5当量）和 nhs（5当量）溶解在干燥的 dcm 中。将反应混合物在氩气中于室温搅拌。通过tlc监测反应。反应完成后，加入半胱氨酸（胱胺二盐酸盐用1m naoh脱盐，1当量）。将反应混合物在氩气中在室温下再搅拌10小时。通过tlc监测反应。反应完成后，真空除去溶剂，加入甲醇过滤脱盐。从真空中除去溶剂。用水沉淀得到黄色固体产物。
50.mpeg-cdi的合成在 50 ml 干燥的schlenk管中，将mpeg-oh（1 mmol，2 g）和 cdi（1当量）溶解在干燥的 dcm 中。将反应混合物在氩气中室温搅拌24小时。反应完成后，将混合物用水洗涤3次。合并的有机层用盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。真空除去溶剂，加入冰醚沉淀，得到白色固体产物。
51.mpeg-ss-epa的合成在 25 ml 干燥的schlenk管中，将epa-cys（1.1 mmol，500 mg）、mpeg-cdi（3当量）和 tea（0.5当量）溶解在干燥的 dcm 中。将反应混合物在氩气中在 80
°
c 下搅拌过夜。反应完成后，真空除去溶剂，然后加入水。溶液在透析袋(mw：3500 da)中透析24小时，然后通过0.22μm滤水器过滤并冻干得到黄色絮状固体产物。
52.应用例1、空白胶束的制备与表征通过溶剂蒸发法制备空白胶束：将mpeg-epa (20 mg) 或mpeg-ss-epa (20 mg) 溶解在丙酮 (1 ml) 中，并将溶液滴加到去离子水 (20 ml) 中。混合物在室温下搅拌 24 小时，然后通过 0.45 和 0.22 μm滤水器过滤，得到空白胶束溶液。胶束的粒径和分布通过粒度/zeta 电位分析仪（zeta sizer nanozs90，英国马尔文仪器公司）。透射电子显微镜 (tem) 用于研究空白胶束的形态。mpeg-epa 和mpeg-ss-epa 的临界胶束浓度 (cmc) 值是在荧光光谱仪 (f-4600, hitachi, japan) 上使用芘荧光探针测定的。
53.通过1h nmr 表征，图2a 和 b 中的1h nmr 光谱显示了 3.51 和 2.89 ppm 的特征峰，属于胱胺的
ꢀ‑
ch2-n 质子。 3.38 ppm 和 0.99 ppm 处的峰分别代表 peg 和 epa 的特征峰（图2c 和 d）。因此，图2所示的1h nmr谱证实了mpeg-epa和mpeg-ss-epa的成功合成。mpeg和epa的特征吸收峰出现在图2的g和h中，进一步证明了化合物的合成。
54.、空白胶束的载药和释药
载药胶束采用透析法制备。将mpeg-epa (50 mg) 或mpeg-ss-epa (50 mg) 溶解在 dmso (1 ml) 中。然后加入疏水性多柔比星（dox）（8mg）并超声溶解。将混合物逐滴加入去离子水 (20 ml) 中，然后在室温下搅拌过夜以获得负载 dox 的胶束。之后，胶束在透析袋（mw：3500 da）中透析 24 小时。透析用水每 2 小时更新一次。然后，透析袋中的溶液通过 0.45 和 0.22 μm滤膜过滤。通过动态光散射 (dls) 测量加载 dox 的胶束的粒径和分布。透射电子显微镜 (tem) 用于研究加载 dox 的胶束的形态。为了确定载药量 (dlc)，将 4 mg 冻干的加载 dox 的胶束（mpeg-epa@dox、mpeg-ss
ꢀ‑
epa@dox) 溶解在 dmso 中，使用荧光酶标仪 48-50 (enspire, perkinelmer, usa) (ex: 507 nm; em: 590 nm) 根据 dox 的标准曲线测定 dox 的含量-dmso 溶液，浓度范围为 0.5
–
8.0 μg/ml。
55.载有 dox 的胶束在具有不同 ph 值（ph 7.4\6.8\5.5、0.01 m、0.5% w/v sds）或 pbs（ph 7.4、0.01 m、0.5% w/ v sds) 具有不同 gsh 水平（10
ꢀµ
m 和 10 mm）。将mpeg-epa@dox 或mpeg-ss-epa@dox 胶束（500 μl）加入透析袋（mw：1000 da）。然后将袋子浸入试管中的 5 ml 缓冲溶液中。将管子放入 37
°
c 的孵化摇床中，转速为 120 rpm。为了监测释放，在特定时间点：1、2、4、8、12、24、36、48 和 72 h。吸出 200 μl释放培养基并更换为等体积的新鲜培养基根据浓度范围为 0.5
–
8.0 μg/ml 的 dox-pbs 溶液的标准曲线，通过荧光酶标仪（ex：498 nm；em：591 nm）测定 dox 的浓度。释放实验一式三份进行，计算平均值以获得释放曲线。
56.mpeg-epa 和mpeg-ss-epa 可以在水溶液中自组装成胶束。使用芘荧光探针测得mpeg-epa 和mpeg-ss-epa 的 cmc 值分别为 7.46 和 4.14 μg/ml（图14、图15）。mpeg-ss-epa 的 cmc 比mpeg-epa 略低，类似于其他地方报道的两亲性嵌段共聚物 75。相对较低的 cmc 值表明mpeg-epa 和mpeg-ss-epa 胶束在水溶液中具有高稳定性。 dls 测量表明mpeg-epa 和mpeg-ss-epa 胶束的平均直径分别为 182.6 和 211.9 nm。负载 dox 的mpeg-epa 胶束（mpeg-epa@dox）的平均直径为 180.5 nm，负载 dox 的mpeg-ss-epa 胶束（mpeg-ss-epa@dox）的平均直径为 190.8 nm（图3、图11)。mpeg-epa@dox 和mpeg-ss-epa@dox 的dlc分别为5.7% 和 6.5%。加载 dox 后，两种胶束的尺寸均明显减小。胶束 dlc 值的轻微下降可能归因于疏水相互作用的增加，将 dox 掺入胶束核心。由于 tem 样品在干燥条件下的收缩，由 tem 确定的平均直径（图2i-l 和图 12）比 dls 表征的平均直径小 50 nm。通过静脉注射给药后，胶束溶液将在血流中稀释，并且需要在血流中保持其完整性。载药胶束的稀释稳定性是根据不同稀释条件下的大小演变来评估的（图3b）。发现胶束制剂在稀释至近 200 倍时表现出优异的稳定性。因此，稀释微扰胶束的结构，载药胶束的稳定性有利于延长循环时间。除了胶束的解离外，蛋白质对血流的干扰是载药胶束失效的另一个原因。在含 10% fbs 的培养基中，48 小时内未观察到载药胶束的粒径有明显变化。两种载药胶束的大小保持不变，表明没有明显的蛋白质吸附，胶束稳定性极佳。良好的血浆稳定性得益于胶束结构（mpeg）的亲水壳层，可以保护易降解的基团（酯类、酰胺类和内酯类），有效减少血浆蛋白的吸附，从而延长体内循环时间。此外，在 4
°
c 时，水溶液中的mpeg-epa@dox 和mpeg-ss-epa@dox 在一个月内没有表现出明显的变化（图3c）。 dox 和 epa 之间的非共价分子间相互作用，如氢键和 π-π 堆积，可能有助于胶束稳定性。
57.、载有 dox 的胶束的体外稳定性和氧化还原反应行为包括稀释、血浆、室温储存和不同 gsh 水平（0、10
µ
m 和 10 mm），加载 dox 的胶
束的稳定性通过尺寸的 dls 测量进行评估。为了研究稀释的影响，不同体积的去离子用水将载有 dox 的胶束 (1 mg/ml) 稀释成不同倍数 (5/50/200)。为了研究胶束在血浆中的稳定性，将冷冻干燥的胶束 (5 mg) 重新溶解在管中的 dmem 培养基（5 毫升，含 10% fbs）中。然后将管子放入 37
°
c、120 rpm 的孵化摇床中 48 小时。对于粒度测量，在 0、12、24 和 48 小时采集样品。为了研究每日储存的影响，将胶束 (1 mg/ml) 储存在 4
°
c。然后观察外观并在第 5、15 和 45 天测量粒度分布。
58.研究mpeg-ss-epa@dox 在含有 gsh 的环境 (10 mm) 中的氧化还原响应行为 55。胶束 (1 mg/ml) 与 gsh (10 mm) 在管中混合。然后将管在振荡器中于 37
°
c 以 120 rpm 孵育。在相同条件下处理没有二硫键的基团，观察外观并在12、24和48小时测量粒度分布。
59.在谷胱甘肽存在的情况下，二硫键可以很容易地还原为游离硫醇。mpeg-ss-epa 的亲水性和疏水性嵌段之间的二硫键连接使胶束响应 gsh 可还原断裂。为了证明响应性，通过含有 10 mm gsh 的 pbs (ph 7.4) 中的 dls 测量胶束的大小变化。如图3e 所示，经过 gsh 处理的胶束的平均直径在 12 小时内增加到约 300 nm。进一步孵育导致颗粒变大和严重聚集，表明亲水性聚乙二醇壳与胶束分离，内核的疏水相互作用增强。然而，mpeg-epa@dox 胶束用 10 mm gsh 处理（图3d），而不含 gsh 的 pbs 中的mpeg-ss-epa@dox 胶束（图3f）在 pbs 中稳定 48 小时。
60.然后在不同条件下仔细研究了 dox 的药物释放行为（图4）。肿瘤细胞的细胞外环境ph值约为7.4，细胞质约为6.8，内体和溶酶体约为5.581。如图4b 所示，在 ph 7.4 的溶液中，mpeg-ss-epa@dox 的 dox 释放缓慢，在大约 72 小时内达到最大值，低于 40%。在 ph 6.8 和 7.4 下释放没有显着差异。然而，在 ph 5.5 时，释放效率提高到 70.3
±
7%，表明归因于胺基团的质子化的 ph 响应性药物释放。肿瘤细胞中的 gsh 浓度（约 2-10 mm）远高于细胞外液中的 gsh 浓度（约 2-20 μm）。如图4d 所示，dox 释放行为在 10mm gsh 存在下有所不同，因为它显示出更快的释放，在 72 小时时达到 82.6
±
10.1% 以上，并且在低浓度或不存在的情况下，dox 的释放相对减少gsh的。作为对照组（图4a 和 c），mpeg-epa@dox 在相同 ph 下释放较少的 dox（ph 5.5 时为 55.5
±
4.6%），并且 gsh 浓度对 dox 的释放没有影响（35.9
±
2.4% 在存在10mm gsh）。基于上述结果，由于谷胱甘肽含量低，ph值高，胶束可以稳定在血流和细胞外基质中，显着减少对正常组织的副作用，而细胞内化后，部分dox被触发释放通过低ph环境。此外，二硫键在细胞质中被谷胱甘肽裂解，进一步促进了 dox 的释放。
61.4、细胞毒性试验通过 mtt 测定评估了 epa、mpeg-epa、mpeg-ss-epa、mpeg-epa@dox 和mpeg-ss-epa@dox 对肝细胞和肝细胞癌细胞的细胞毒性。将 lx-2 细胞（每孔 1.4
ꢀ×ꢀ
104 个细胞）接种到 96 孔板中的 100 μl完全培养基中 24 小时。然后100
ꢀµ
l含有不同浓度活性化合物的完全培养基（epa：25
ꢀµ
m、50
ꢀµ
m、100
ꢀµ
m、200
ꢀµ
m、400
ꢀµ
m、800
ꢀµ
m；dox：1.25
ꢀµ
m、2.5
ꢀµ
m、5
ꢀµ
m、10
ꢀµ
m、20
ꢀµ
m、 40
ꢀµ
m、80
ꢀµ
m)，或空白胶束，或添加 dox 胶束。纯完全培养基和 dmso (0.5%) 用作对照。孵育48小时后，弃去培养基，每孔用pbs洗涤两次，加入mtt溶液（100μl，5mg/ml）。细胞再孵育 4 小时后，弃去培养基，每孔加入 100 μl dmso。通过 spectrum 酶标仪（multiscan，thermo，usa）在 570 nm 处测量每组的吸光度。根据这些实
验组的平均吸光度，计算细胞活力，并通过graphpad prism 7.0 计算半抑制浓度 (ic50) 值。
62.肝细胞癌细胞的细胞毒性试验与上述相似。不同细胞的药物处理时间不同，每孔细胞数也不同（hepg2：2
×
104细胞/孔24h，1.5
×
104细胞/孔48h，1
×
104细胞/孔72 h 和 huh-7：24 h 每孔 1.5
×
104个细胞，48 h 每孔 1
×
104个细胞，72 h 每孔 0.8
×
104个细胞）。
63.通过 mtt 方法研究了 epa 和空白胶束、dox 和载药胶束对 lx-2 细胞和 hcc 细胞系（hepg2 和 huh-7）的细胞毒性。如图 4 所示，空白胶束的细胞毒性低于 epa，并且与 dox 相比，载药胶束也降低了细胞毒性。当给定最大有效物质浓度时，胶束组的细胞活性优于游离药物组。随后，评估了mpeg-epa 和mpeg-ss-epa 胶束对 hepg2 和 huh-7 细胞的细胞毒性。孵育后，聚乙二醇化 epa 胶束在最大 epa 浓度下对 hepg2 和 huh-7 细胞显示出更好的活性抑制（图6a），因为衍生物的亲水性增加了 epa85 的有效剂量。 dox 在两种 hcc 细胞系中的细胞毒性最强，而mpeg-ss-epa@dox 比mpeg-epa@dox 毒性更大。 72 小时的延长孵育时间导致mpeg-ss-epa@dox 更大的肿瘤细胞死亡和更大的胶束毒性（图6b）。孵育时间越长，观察到的毒性就越大，这可能是因为在较长的孵育时间内，epa 与mpeg的分离程度更高。在酸性条件和一定的 gsh 浓度下，含二硫化物的胶束比对照更好地释放 epa 和 dox。图 5e 中活细胞和死细胞的荧光图像用于进一步评估细胞活性。 dox处理组杀死的细胞最多，绿色细胞最少，红细胞最多，mpeg-ss-epa@dox组的效果优于mpeg-epa@dox。流式细胞术和蛋白质印迹进一步验证了细胞凋亡的结果（图6c 和 d）。阿霉素组细胞凋亡率较高，促凋亡蛋白（caspase-3）表达较高，抗凋亡蛋白（bcl-2）表达较低，dna损伤蛋白（parp）表达较多。mpeg-ss-epa@dox 组的表现优于mpeg-epa@dox 组，但不如游离药物组。
64.5、细胞摄取hepg2 和 huh-7 细胞分别以每孔 1.0
ꢀ×ꢀ
104个细胞的密度接种到 24 孔板中。孵育 12 小时后，将培养基更换为浓度为 20 μm dox 的游离 dox、mpeg-epa@dox 或mpeg-ss-epa@dox。在确定的时间间隔（0.5、4、8、12 小时）46、57、58，细胞暴露于 4% 多聚甲醛 15 分钟。细胞进一步用冷 pbs 洗涤，用 dapi (1
ꢀµ
g/ml) 染色 10 分钟，然后通过荧光显微镜观察 (olympus bx43 ckx31)。
65.为了进一步验证epa衍生胶束作为药物载体在药物递送中的作用，通过荧光显微镜观察游离dox和载药胶束在hepg2和huh-7细胞中的摄取和释放行为（图7）。游离的 dox 基团在细胞核中显示出强烈的红色荧光，因为阿霉素是一种小分子，可以被动扩散穿过细胞膜并进入细胞核。 dox组能更快进入细胞，0.5 h内细胞主要集中在细胞核内。由于缓慢的内吞作用，胶束组进入更慢。红色荧光在 4 h 时主要集中在细胞核中，mpeg-ss-epa@dox 比mpeg-epa@dox 更快地将 dox 释放到细胞核中。胶束组在 8 小时和 12 小时持续释放 dox。
66.6、钙黄绿素 am 和碘化丙啶细胞染色试验通过钙黄绿素-am 和 pi 染色评估胶束处理的细胞活力成像。将 hepg2 和 huh-7 细胞与浓度为 20 μm dox 的胶束孵育 24 小时后，然后将细胞用calcein-am (0.2 μm) 和 pi (1 mg/ml) 染色。最后，在荧光显微镜下观察细胞。
67.在 h22 皮下肿瘤模型中研究了基于 epa 的治疗载体的肿瘤生长抑制能力。如图8a 和 b 所示，对照组（盐水）的肿瘤体积和重量约为 3500 mm3和 2.7 g。接受药物治疗的组显示出肿瘤体积和重量的显着减少。与体外结果类似，epa 的聚乙二醇化不会导致任何显着的肿瘤体积减少。含二硫键的epa衍生物的抗肿瘤活性略有增强。令人印象深刻的是，与游离 dox 胶束和空白胶束相比，载有 dox 的胶束mpeg-epa@dox 和mpeg-ss-epa@dox 表现出更好的抗肿瘤作用，表明通过将 dox 封装在基于 epa 的治疗载体中实现了协同治疗效果在 h22 肿瘤模型中。这种效应在mpeg-ss-epa@dox 组中更为明显，因为mpeg-ss-epa@dox 的氧化还原反应导致胶束结构的破坏，触发 epa 和 dox 的同时释放。
68.在给药 6、12、24、48 小时后，在 h22 荷瘤小鼠中研究了 dox 和载药胶束的组织分布。如图 5c 所示，与 dox 溶液相比，在用载药胶束治疗的肿瘤中发现了显着更高的 dox 积累。这些结果表明，通过 epr 效应介导肿瘤靶向积累，dox 以载药胶束复合物作为优良载体被有效递送到肿瘤中。注射后24 h，mpeg-ss-epa@dox组在肿瘤中观察到最强的荧光信号，mpeg-ss-epa@dox在肿瘤部位的荧光强度高于其他组。可以预期，更多积累的 dox 和 epa 可以继续在这些肿瘤细胞中释放，进一步促进肿瘤生长抑制。
69.7、流式细胞术检测细胞凋亡hepg2 和 huh-7 细胞分别以每孔 1.0
ꢀ×ꢀ
105个细胞的密度接种到 6 孔板中。孵育 12 小时后，将培养基更换为浓度为 20 μm dox 的游离 dox、mpeg-epa@dox 或mpeg-ss-epa@dox 24 小时。然后消化、收集细胞，用冷 pbs 洗涤 2 次，然后用 yf488-膜联蛋白 v 和 pi (1 mg/ml)61 染色细胞。将每管吸出的 10,000 个细胞置于流式细胞仪中，以获得早期细胞凋亡、晚期细胞凋亡和坏死细胞的特定结果。如图6b所示，阿霉素组细胞凋亡率较高，mpeg-ss-epa@dox 组的凋亡表现优于 mpeg-epa@dox 组，但不如游离药物组。
70.8、蛋白质印迹分析hepg2 和 huh-7 细胞的表达以每孔 1
ꢀ×ꢀ
106个细胞的密度接种在 6 孔板中 24 h。然后用浓度为 20 μm dox 的游离 dox、mpeg-epa@dox 或mpeg-ss-epa@dox 替换培养基 24 小时。根据制造商的指南提取蛋白质。 bca测定用于测量蛋白质浓度。将蛋白质变性、分离并转移到聚偏二氟乙烯膜上，然后与一抗在 4
°
c 下孵育过夜。然后将膜与二抗在室温下孵育 2 小时，并用 tbs 和 tween 20 (tbst) 洗涤。使用兔单克隆抗体（bcl-2、cleaved caspase3、cleaved rarp 和 gapdh）进行蛋白质印迹分析。 hrp 偶联的抗兔 igg 抗体用作二抗。所有抗体均来自proteintech group and inc.（美国），并通过化学发光成像系统（fluorchem q，proteinsimple，美国）检测信号。如图6d所示，阿霉素组促凋亡蛋白（caspase-3）表达较高，抗凋亡蛋白（bcl-2）表达较低，dna损伤蛋白（parp）表达较多，mpeg-ss-epa@dox 组的凋亡表现优于 mpeg-epa@dox 组，但不如游离药物组。
71.9、溶血试验为了研究纳米颗粒（空白胶束和载有 dox 的胶束）与红细胞（rbc）的相互作用，根据先前发表的方法评估了溶血效果。简而言之，获得 rbc 单位并添加溶解在 pbs 中的胶束，浓度范围为 0.25 至 1.0 mg/ml。将混合物在 37 ℃下孵育 2 h，然后在 3000 rpm 下离心 10 min。在 540 nm 处通过分光光度计读取吸光度。使用以下等式计算溶血百分比：溶血 (%) = (asample-aps) / (awater-aps)
ꢀ×ꢀ
100%其中asample表示样品的吸光度。 ps (aps) 和去离子水 (awater) 分别用作阴
性和阳性对照。
72.如图8d 所示，除游离 dox 组外，所有组的小鼠体重均略有增加（对照组体重增加最多，优先于肿瘤生长），对系统的毒性可忽略不计。器官系数的结果（图8e）显示，除dox组显示的显着脾脏毒性外，其他组小鼠的所有器官均正常。从图8f 和图 13，我们可以清楚地看到，胶束在 1mg/ml 时几乎不会引起溶血副作用。与生理盐水组相比，任一给药组对小鼠的肝（图8g）和肾（图 8h 和 i）功能均无显着影响。这些结果充分证明了胶束基团的体内安全性。
73.10、体内抗肿瘤功效研究和生物分布实验小鼠（6周龄雌性，26
ꢀ±ꢀ
2 g）在右侧区域皮下注射h22 细胞（200
ꢀµ
l pbs 中的1
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106个细胞）。当肿瘤体积达到200 mm3时，将小鼠随机分为六组（每组6只）：（1）生理盐水； (2) mpeg-epa (41.36 mg/kg)； (3) mpeg-ss-epa (35.96 mg/kg)； (4) dox (2.5 mg/kg)； (5) mpeg-epa@dox (43.86 mg/kg)； (6) mpeg-ss-epa@dox (38.46 mg/kg)。在第 1、3、5、7、9、11 和 13 天通过尾静脉向小鼠给药这些制剂。每天记录小鼠体重和肿瘤体积，然后使用以下公式计算肿瘤大小 (v)公式68：体积=0.5
×
（宽）2
×
长。
74.接种肿瘤的小鼠静脉注射含有 2.5 mg/kg dox 的复合制剂。在尾静脉注射 nps 后的特定小时（6、12、24 和 24），使用 ivis（perkinelmer）收集和分析主要器官和肿瘤。如图8所示。在 h22 皮下肿瘤模型中研究了基于 epa 的治疗载体的肿瘤生长抑制能力。如图8a 和 b 所示，对照组（盐水）的肿瘤体积和重量约为 3500 mm3和 2.7 g。接受药物治疗的组显示出肿瘤体积和重量的显着减少。与体外结果类似，epa 的聚乙二醇化不会导致任何显着的肿瘤体积减少。含二硫键的epa衍生物的抗肿瘤活性略有增强。令人印象深刻的是，与游离 dox 胶束和空白胶束相比，载有 dox 的胶束 mpeg-epa@dox 和 mpeg-ss-epa@dox 表现出更好的抗肿瘤作用，表明通过将 dox 封装在基于 epa 的治疗载体中实现了协同治疗效果在 h22 肿瘤模型中。这种效应在 mpeg-ss-epa@dox 组中更为明显，因为 mpeg-ss-epa@dox 的氧化还原反应导致胶束结构的破坏，触发 epa 和 dox 的同时释放。
75.在给药 6、12、24、48 小时后，在 h22 荷瘤小鼠中研究了 dox 和载药胶束的组织分布。如图8c 所示，与 dox 溶液相比，在用载药胶束治疗的肿瘤中发现了显着更高的 dox 积累。这些结果表明，通过 epr 效应介导肿瘤靶向积累，dox 以载药胶束复合物作为优良载体被有效递送到肿瘤中。注射后24 h，mpeg-ss-epa@dox组在肿瘤中观察到最强的荧光信号，mpeg-ss-epa@dox在肿瘤部位的荧光强度高于其他组。可以预期，更多积累的 dox 和 epa 可以继续在这些肿瘤细胞中释放，进一步促进肿瘤生长抑制。
76.11、组织学分析在治疗后第15天，处死小鼠。检测天冬氨酸转氨酶（ast）、丙氨酸转氨酶（alt）、血尿素氮（urea）、肌酐（crea）的活性作为肝肾功能指标。收集主要器官（心、肺、肝、脾和肾），然后固定在 4% 甲醛中进行 h&e 染色。在光学显微镜下观察组织学变化。根据制造商的方案，通过末端脱氧核糖核酸酶 (tat) 介导的dutp缺口末端标记 (tunel) 检测肿瘤冷冻切片中的凋亡细胞，并在荧光显微镜下检查。
77.小鼠主要器官切片的组织学分析显示无显着毒性（图9b）。与其他组相比，多柔比星给药组心肌细胞轻微破裂，肝内少量细胞肿胀，细胞膜不完整。脾白髓区减少；有一定程度的肾间质水肿。在低倍显微镜下（图9a），与其他组的心肌组织相比，dox给药组小鼠的心
腔明显扩大，心室壁变薄。
78.在肿瘤切片的组织学图像中（图10），生理盐水组的肿瘤细胞分布密集，形态正常。然而，所有用含 dox 制剂治疗的组都表现出不同程度的肿瘤细胞坏死，其特征是不同的碎片、大量的去核细胞、深核染色和细胞质浓缩，表明肿瘤细胞已经经历了凋亡。在这些治疗组中，mpeg-ss-epa@dox治疗小鼠的肿瘤组织表现出最高水平的坏死和最低数量的增殖细胞，表明对恶性增殖的抑制作用很强。对于 tunel 分析，用mpeg-ss-epa@dox 处理的肿瘤显示出最强的 fitc 绿色荧光，这是肿瘤细胞凋亡的指标。生理盐水组几乎没有绿色荧光。具有二硫键的胶束组比没有二硫键的组观察到更多的绿色荧光细胞，因此mpeg-ss-epa@dox 比mpeg-epa@dox 更具毒性。
79.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。