一种趋化型CAR-NK细胞及其制备方法和应用

一种趋化型car-nk细胞及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于细胞免疫治疗技术领域，涉及一种趋化型car-nk细胞及其制备方法和应用。


背景技术：

2.根据世界卫生组织(who)最新统计，2020年因癌症死亡的全球死亡人数接近1000万人。2021年仅在美国就有1,898,160例癌症新发病例和608,570死亡病例，这意味着每5分钟就有大约18名新患者被诊断出患有癌症，约6名患者死于癌症。预计到2040年，全球的癌症患者总数将达到2750万，且预计有1630万患者因此死亡。只有不断研究开发新的癌症预防，诊断及其治疗方法，才能减轻未来几十年癌症的发生发展。从2020年8月到2021年7月，fda已批准16种新的抗癌疗法，同时扩大了11种先前批准的抗癌疗法的使用范围，这为患者带来新的治疗希望。
3.对于早期可切除的肿瘤来说，手术切除仍旧是癌症治疗的首要选择，但患者往往预后不良，通常会发生淋巴结的转移，会导致癌症的复发。而对于晚期已经发生扩散的肿瘤，约50％的患者会选择化疗和放疗，放射疗法能够缩小肿瘤，抑制肿瘤细胞的生长进而防止癌症的复发，但不可避免癌症周边的健康组织会受到放射线造成的损害，对身体产生副作用；另一方面，包括吉西他滨，紫杉醇，卡培他滨，厄洛替尼在内的越来越多的新型化疗药物一定程度上延缓了肿瘤的发生发展进程，但还是不能提高患者的总体生存率。
4.目前，免疫疗法中的嵌合抗原受体(car)t细胞治疗(car-t疗法)，在血液瘤的治疗取得了较大的进展，在过去的一两年中,五款car-t疗法已经fda批准,有四种是针对血液瘤的以cd19靶点的car-t疗法，有高达90％的完全缓解率；值得一提的是，2021年3月获fda批准的首款针对骨髓瘤bcma靶点的car-t细胞疗法，临床试验中显示33％的患者达到完全缓解率。这意味着car-t细胞疗法开启了肿瘤免疫疗法新时代的到来。
5.car-t疗法又称为嵌合抗原受体t细胞免疫疗法，需要先从病人身上提取t细胞，利用基因工程技术，在体外插入能让t细胞识别特定肿瘤细胞的受体基因和帮助激活t细胞的各种影响因子，形成car-t细胞，于实验室中大量培养后，再把这种"加强型"t细胞回输到病人体内进行治疗。car结构由四个主要部分组成：单链可变片段(scfv)、铰链、跨膜结构域(tm)和细胞内信号结构域。这四种成分在优化改造后，最大限度发挥了地识别对应抗原的肿瘤、激活t细胞和消除肿瘤的作用。
6.但与此同时，car-t细胞疗法中产品制造时间成本及其神经毒性，免疫效应细胞相关神经系统综合征(icans)和细胞因子释放综合征(crs)大大限制其使用范围，在最新的研究表明，在nk细胞上表达car可能会克服car-t细胞的某些缺陷，显示出更强的抗肿瘤效果。nk细胞是人体先天性免疫防线的重要一源，本就擅长早期癌细胞的识别和杀伤，且与t细胞相比，nk细胞的抗原谱更广；亲和力更高；免疫应答快速；且nk细胞无记忆性并不会引起自身免疫；移植限制较少；nk细胞杀伤肿瘤时不会产生细胞因子风暴，安全性更好；nk细胞来源广泛；“现货型”产品缩短了治疗的疗程，减少了治疗成本，这都扩大了它的使用范围。值
得一提的是，2021年11月11日，国家药监局正式审批通过国内首例“现货型”异体来源针对晚期上皮卵巢癌治疗靶向间皮素的car-nk产品临床试验申请，这标志着car-nk细胞疗法在实体瘤的治疗研究迈入了新的里程碑。
7.随着这些新型抗癌药的不断开发和研究，使得被称为“绝症”的晚期癌症逐渐变为一种慢性疾病，但这远远不够，不同类型实体瘤中肿瘤免疫微环境的复杂性，合适靶点的选择，肿瘤相关免疫细胞功能抑制等综合因素使得过继细胞转移免疫治疗在实体瘤的治疗中仍处于起步阶段，还需要确定更多的治疗靶点和信号通路。
8.目前，仅经car单一修饰的嵌合抗原受体nk细胞的抗肿瘤能力待进一步提高。


技术实现要素：

9.本发明的主要目的是提供一种趋化型car-nk细胞的制备方法，得到的趋化型car-nk细胞可以特异性识别高表达nkg2d配体的肿瘤细胞，同时car-nk细胞上过表达的趋化因子受体cxcr4可以帮助car-nk细胞向肿瘤细胞的迁移，进而提高car-nk细胞对肿瘤细胞的杀伤，可用于制备抗肿瘤药物。
10.本发明还提供了一种趋化型car-nk细胞，该趋化型car-nk细胞可同时表达cxcr4和靶向nkg2d配体的嵌合抗原受体。
11.越来越多的研究显示，nkg2d/nkg2dls信号轴在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。nkg2d主要的配体mica/b在大多数正常细胞中低表达或者不表达，而细胞在应激条件下表达会上调，比如说肿瘤的恶性转化，多种病原体感染，dna损伤等。已经发现nkg2d主要的配体mica/b在许多肿瘤细胞表达上调，包括结肠癌，胰腺癌，肝癌，乳腺癌等。因此，nkg2d可以作为一个理想的靶点用于制备car-nk。
12.癌症发展到晚期易发生转移，癌症转移会破坏机体组织器官的正常功能，而肿瘤完成组织的转移依赖于复杂的趋化因子网络，包括胰腺癌，骨肉瘤在内的许多类型的肿瘤微环境中，趋化因子的表达会发生改变，这些改变在肿瘤增殖发挥关键作用，并参与调节肿瘤血管生成和非血管性肿瘤基质的形成，进而促进肿瘤的侵袭和转移。其中，cxcr4/cxcl12信号轴被大量报道在包括胰腺癌在内的肿瘤微环境被异常激活，促进肿瘤细胞的生长，另一方面它可以吸引更多cxcr4高表达的血管内皮细胞进入到肿瘤微环境中以促进血管生成，完成肿瘤的侵袭。同时还有报道指出肿瘤微环境中的nk细胞浸润通常较差可能是由于复杂的肿瘤微环境影响着nk细胞在内的免疫细胞上趋化因子受体的分布，进而影响着免疫细胞的浸润。
13.鉴于此，本发明在表达靶向nkg2d配体的嵌合抗原受体的car-nk细胞上，通过进一步修饰嵌合抗原受体nk细胞，使其共表达cxcr4，旨在提高nk细胞向肿瘤微环境的浸润能力，同时增强nkg2d-car-nk92细胞杀伤肿瘤的能力，提高其抗肿瘤活性。该嵌合抗原受体car-nk细胞可用于制备相关的抗肿瘤药物，应用于治疗肿瘤。该嵌合抗原受体car-nk细胞来源更方便，成本更加低廉，抗肿瘤效果更强，功能更加强大。
14.本发明是这样实现的：
15.本发明提供了一种趋化型car-nk细胞，所述趋化型car-nk细胞表达靶向抗原相关受体且在趋化型car-nk细胞上过表达趋化因子受体cxcr4，帮助趋化型car-nk细胞更好地迁移向肿瘤细胞，进一步提高趋化型car-nk细胞抗肿瘤效果。
16.在一个具体的实施方式中，所述的nk细胞为nk92细胞。
17.在一个具体的实施方式中，所述的嵌合抗原受体car定位于所述免疫细胞的细胞膜上。
18.在一个具体的实施方式中，所述的嵌合抗原受体car中含有靶向nkg2d配体的抗原结合结构域。
19.在一个具体的实施方式中，所述的nkg2d配体选自mica、micb、ulbp1、ulbp2、ulbp 3、ulbp 4、ulbp 5和ulbp 6中的任意一种；更佳地为mica、micb。
20.当上述肿瘤相关抗原为nkg2d配体任意一种时，嵌合抗原受体的抗原结构域为nkg2d蛋白，或者是选自nkg2d蛋白的具有结合活性的片段。
21.在一个具体的实施方式中，上述肿瘤相关抗原为nkg2d配体，上述抗原结合结构域为选自nkg2d蛋白的胞外段。
22.在一个具体的实施方式中，上述nkg2d蛋白的胞外段的氨基酸序列seq id no.1所示：
23.malpvtalllplalllhaarpmlfnqevqipltesycgpcpknwicyknncyqffdesknwyesqascmsqnasllkvyskedqdllklvksyhwmglvhiptngswqwedgsilspnlltiiemqkgdcalyassfkgyiencstpntyicmqrtv
24.进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述嵌合抗原受体还具有如下元件：
25.跨膜结构域、共刺激信号传导区和信号传导结构域；
26.所述靶向nkg2d配体的抗原结合结构域、所述跨膜结构域、所述共刺激信号传导区和所述信号传导结构域依次连接。
27.所述靶向nkg2d配体的抗原结合结构域为靶向nkg2d配体的单链抗体scfv；
28.当然，需要说明的是，针对本发明提供的趋化型嵌合抗原受体nk92细胞所表达的靶向nkg2d配体的嵌合抗原受体，其跨膜结构域可以是cd8、cd28、cd33、cd37、cd8α、cd5、cd16、icos、cd9、cd22、cd134、cd137、cd154、cd19、cd45、cd4、和cd3ε中的一种或多种组合；优选地，为cd8α；
29.其共刺激信号传导区可以是cd27、cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd66d、cd2、cd4、cd5、cd28、cd30、cd40、cd134、cd137、icos、cd154、4-1bb、ox40、cd7、light、nkg2c和b7-h3中的一种或多种组合；优选地，为4-1bb；
30.其信号传导结构域可以是cd3ζ信号传导结构域。
31.进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述cxcr4的氨基酸序列如seq id no.2所示：
32.megisiytsdnyteemgsgdydsmkepcfreenanfnkiflptiysiifltgivgnglvilvmgyqkklrsmtdkyrlhlsvadllfvitlpfwavdavanwyfgnflckavhviytvnlyssvlilafisldrylaivhatnsqrprkllaekvvyvgvwipallltipdfifanvseaddryicdrfypndlwvvvfqfqhimvglilpgivilscyciiisklshskghqkrkalkttvililaffacwlpyyigisidsfilleiikqgcefentvhkwisitealaffhcclnpilyaflgakfktsaqhaltsvsrgsslkilskgkrgghssvstesesssfhss
33.进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述cd8α跨膜结构域的氨基酸序列如seq id no.3所示：
34.yiwaplagtcgvlllslvitlyc
35.进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述4-1bb共刺激信号传导区的氨基酸序列如seq id no.4所示：
36.krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel
37.进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述cd3ζ信号传导结构域的氨基酸序列如seq id no.5所示：
38.rvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
39.本发明还提供了上述趋化型嵌合抗原受体car-nk细胞的制备方法，包括以下步骤：
40.(a)提供一待改造的免疫细胞；
41.(b)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达靶向nkg2d配体的嵌合抗原受体car和cxcr4，从而获得本发明第一方面所述的趋化型免疫细胞。
42.在本发明的一些实施方案中，步骤a中包括分离或激活待改造的免疫细胞
43.在本发明的一些实施方案中，步骤b，包括将表达上述靶向nkg2d配体的嵌合抗原受体和cxcr4的表达盒转入到免疫细胞中。所述的免疫细胞的最佳选择是nk92细胞。
44.其中，所述嵌合抗原受体具有靶向nkg2d配体的抗原结合结构域。
45.当然，需要说明的是，在其他的一些实施例中，免疫细胞也可以是t细胞、巨噬细胞、b细胞、nkt细胞、cik细胞或dc-cik细胞。
46.在本发明的一些实施方案中，所述表达盒中，表达靶向nkg2d配体的嵌合抗原受体的核苷酸序列与表达cxcr4的核苷酸序列之间通过t2a或ires序列连接。
47.在本发明的一些实施方案中，上述的靶向nkg2d配体的嵌合抗原受体和cxcr4的表达盒位于相同载体上。
48.在本发明的一些实施方案中，上述的载体为病毒载体，可以选自dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统的一种或多种组合。
49.在本发明的一些实施方案中，上述的病毒载体为慢病毒载体。
50.在本发明的一些实施方案中，所述方法还包括对获得趋化型嵌合抗原受体car-nk的功能进行一系列的检测。
51.本发明还提供了一种制剂，所述的制剂中含有上述趋化型嵌合抗原受体car-nk细胞，理论上应为药学中可接受的载体，稀释剂。
52.在本发明的一些实施方案中，上述的制剂为液体制剂。
53.在本发明的一些实施方案中，上述的制剂可以是注射剂。
54.在本发明的一些实施方案中，上述制剂中含有趋化型嵌合抗原受体car-nk细胞的浓度为1
×
10
3-1
×
108个细胞/ml，较佳地1
×
10
4-1
×
107个细胞/ml。
55.本发明还提供了所述制剂在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
56.包括给需要对象施用所述趋化型嵌合抗原受体car-nk细胞。
57.在本发明的一些实施方案中，所述肿瘤可选自血液瘤，实体瘤的一种或组合，优选地，所述的肿瘤为实体瘤。
58.在本发明的一些实施方案中，所述的血液瘤可选自：急性髓细胞白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴白血病(all)、弥漫性大b细胞淋巴
瘤(dlbcl)的一种或组合。
59.在本发明的一些实施方案中，所述的实体瘤可以选自胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、肺鳞癌、肛门癌、头颈部肿瘤的一种或组合；优选地，所述的实体瘤为胰腺癌。
60.在可选的实施方案中，所述的需要的对象为人或非人哺乳动物。
61.本发明还提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白中包括靶向nkg2d配体的嵌合抗原受体car和cxcr4。
62.在本发明的一些实施方案中，所述靶向nkg2d配体的嵌合抗原受体car和cxcr4通过连接肽连接。
63.在本发明的一些实施方案中，所述连接肽为2a肽或ires；优选地，为2a肽。
64.在本发明的一些实施方案中，所述融合蛋白的结构如下式所示
65.l-s-h-tm-c-cd3ζ-a-q
66.其中，l为无或信号肽序列；
67.s为靶向nkg2dls的抗原结合结构域；
68.h为无或铰链区；
69.tm为跨膜结构域；
70.c为共刺激信号分子；
71.cd3ζ为源于cd3ζ的胞浆信号传导序列；
72.a为连接肽，较佳地为t2a；
73.q为cxcr4。
74.本发明还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如上所述的融合蛋白。
75.在本发明的一些实施方案，所述的多核苷酸序列如seq id no.7所示。
76.在本发明的一些实施方案，所述多核苷酸序列与如seq id no.7所示的序列具有≥75％(较佳地≥80％)序列同源性的多核苷酸序列；
77.在本发明的一些实施方案，所述多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸。
78.本发明还提供了一种载体，所述载体包括如上所述的多核苷酸。
79.在本发明的一些实施方案中，所述的载体可以是dna、rna。
80.在本发明的一些实施方案中，所述的载体可以选自下组：质粒、病毒载体、转座子、或其组合。
81.在本发明的一些实施方案中，所述的载体包括dna病毒、逆转录病毒载体。
82.在本发明的一些实施方案中，所述的载体可以选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体的一种或者多种组合。
83.优选地，所述载体为慢病毒载体。
84.在本发明的一些实施方案中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、内含子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。
85.优选地，所述载体为含有或插入有本发明所述的多核苷酸的载体。
86.优选地，所述载体用于表达本发明所述的融合蛋白。
87.本发明还提供了一种组合物，其包含如上所述的趋化型嵌合抗原受体car-nk细胞、制剂、融合蛋白、多核苷酸、载体。
88.本发明还提供了所述药物组合物、或所述多核苷酸、或所述载体在制备预防和/或治疗肿瘤的药物或制剂中的应用。
89.在本发明的一些实施方案中，所述肿瘤可选自血液瘤，实体瘤的一种或组合，优选地，所述的肿瘤为实体瘤。
90.在本发明的一些实施方案中，所述的血液瘤可选自：急性髓细胞白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴白血病(all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)的一种或组合。
91.在本发明的一些实施方案中，所述的实体瘤可以选自胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、肺鳞癌、肛门癌、头颈部肿瘤的一种或组合；优选地，所述的实体瘤为胰腺癌。
92.本发明还提供了所述趋化型嵌合抗原car-nk细胞在制备预防和/或治疗肿瘤的药物或制剂中的应用。包括给需要对象施用上述趋化型嵌合抗原受体car-nk细胞。
93.在本发明的一些实施方案中，所述肿瘤可选自血液瘤，实体瘤的一种或组合，优选地，所述的肿瘤为实体瘤。
94.在本发明的一些实施方案中，所述的血液瘤可选自：急性髓细胞白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴白血病(all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)的一种或组合。
95.在本发明的一些实施方案中，所述的实体瘤可以选自胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、肺鳞癌、肛门癌、头颈部肿瘤的一种或组合；优选地，所述的实体瘤为胰腺癌。
96.在可选的实施方案中，所述的需要的对象为人或非人哺乳动物。
97.本发明的有益效果在于：本发明提供的趋化型car-nk92细胞可同时表达cxcr4和靶向nkg2d配体的嵌合抗原受体，该趋化型car-nk92细胞增加了nk细胞向肿瘤细胞的浸润能力，同时更好地增强了nk细胞对肿瘤细胞的杀伤效果，可用于制备抗肿瘤药物，为治疗肿瘤提供了一种新的思路和方法。
附图说明
98.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
99.图1为pll3.7-nkg2d-car-nk92和pll3.7-cxcr4-nkg2d-car-nk92的部分各表达原件的结构示意图。
100.图2为流式细胞仪检测nkg2d表达阳性细胞百分比的结果。
101.图3为经pll3.7-nkg2d-car和pll3.7-cxcr4-nkg2d-car感染和未感染的nk92细胞的cxcr4基因转录结果。pll3.7-cxcr4-nkg2d-car感染的nk92细胞的cxcr4的基因转录明显上调。
102.图4为不同效靶比的nk92、nkg2d-car-nk92、cxcr4-nkg2d-car-nk92细胞对胰腺癌细胞panc28细胞、sw1990细胞、panc1细胞的杀伤效果。
103.图5为nk92、nkg2d-car-nk92、cxcr4-nkg2d-car-nk92各细胞的颗粒酶b和γ干扰素的检测结果。
104.图6为car-nk92细胞趋化能力的检测。
105.图7为肿瘤荧光强度的统计学分析。
106.图8为肿瘤生长曲线图。
具体实施方式
107.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
108.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
109.实施例1
110.制备共表达cxcr4的靶向nkg2d配体的趋化型嵌合抗原受体nk细胞1慢病毒包装质粒的构建
111.通过https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/和https://www.uniprot.org/网站查到nkg2d蛋白的胞外段基因序列然后加入cd8a信号肽的序列。经过rt-pcr的方式扩增得到sig-nkg2d胞外段序列如下seq id no.6：
112.atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgatgttattcaaccaagaagttcaaattcccttgaccgaaagttactgtggcccatgtcctaaaaactggatatgttacaaaaataactgctaccaattttttgatgagagtaaaaactggtatgagagccaggcttcttgtatgtctcaaaatgccagccttctgaaagtatacagcaaagaggaccaggatttacttaaactggtgaagtcatatcattggatgggactagtacacattccaacaaatggatcttggcagtgggaagatggctccattctctcacccaacctactaacaataattgaaatgcagaagggagactgtgcactctatgcctcgagctttaaaggctatatagaaaactgttcaactccaaatacatacatctgcatgcaaaggactgtg；
113.氨基酸序列如下(seq id no.1)：
114.malpvtalllplalllhaarpmlfnqevqipltesycgpcpknwicyknncyqffdesknwyesqascmsqnasllkvyskedqdllklvksyhwmglvhiptngswqwedgsilspnlltiiemqkgdcalyassfkgyiencstpntyicmqrtv。
115.将得到的signkg2dex序列通过重叠pcr的方式连接到二代car cd8-cd3-4-1bb)。通过测序鉴定后确定构建成功，获得pll3.7-nkg2d-car载体。
116.将nkg2d蛋白的胞外段的嵌合抗原受体的核苷酸序列通过t2a序列与cxcr4的核苷酸序列相连，得到共表达核苷酸序列seq id no.7：
117.atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgatgtta
ttcaaccaagaagttcaaattcccttgaccgaaagttactgtggcccatgtcctaaaaactggatatgttacaaaaataactgctaccaattttttgatgagagtaaaaactggtatgagagccaggcttcttgtatgtctcaaaatgccagccttctgaaagtatacagcaaagaggaccaggatttacttaaactggtgaagtcatatcattggatgggactagtacacattccaacaaatggatcttggcagtgggaagatggctccattctctcacccaacctactaacaataattgaaatgcagaagggagactgtgcactctatgcctcgagctttaaaggctatatagaaaactgttcaactccaaatacatacatctgcatgcaaaggactgtgaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcacagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctatggaggggatcagtatatacacttcagataactacaccgaggaaatgggctcaggggactatgactccatgaaggaaccctgtttccgtgaagaaaatgctaatttcaataaaatcttcctgcccaccatctactccatcatcttcttaactggcattgtgggcaatggattggtcatcctggtcatgggttaccagaagaaactgagaagcatgacggacaagtacaggctgcacctgtcagtggccgacctcctctttgtcatcacgcttcccttctgggcagttgatgccgtggcaaactggtactttgggaacttcctatgcaaggcagtccatgtcatctacacagtcaacctctacagcagtgtcctcatcctggccttcatcagtctggaccgctacctggccatcgtccacgccaccaacagtcagaggccaaggaagctgttggctgaaaaggtggtctatgttggcgtctggatccctgccctcctgctgactattcccgacttcatctttgccaacgtcagtgaggcagatgacagatatatctgtgaccgcttctaccccaatgacttgtgggtggttgtgttccagtttcagcacatcatggttggccttatcctgcctggtattgtcatcctgtcctgctattgcattatcatctccaagctgtcacactccaagggccaccagaagcgcaaggccctcaagaccacagtcatcctcatcctggctttcttcgcctgttggctgccttactacattgggatcagcatcgactccttcatcctcctggaaatcatcaagcaagggtgtgagtttgagaacactgtgcacaagtggatttc
118.将共表达核苷酸序列seq id no.7克隆至pll3.7载体，酶切位点是ecor i。各表达元件的结构位置关系如图1所示。
119.靶向nkg2d配体的嵌合抗原受体的核苷酸序列依次包括：单链抗体scfv、cd8α跨膜结构域、4-1bb共刺激信号传导区和cd3ζ信号传导结构域。
120.其中，cxcr4为人的cxcr4，其氨基酸序列如seq id no.2所示：
121.megisiytsdnyteemgsgdydsmkepcfreenanfnkiflptiysiifltgivgnglvilvmgyqkklrsmtdkyrlhlsvadllfvitlpfwavdavanwyfgnflckavhviytvnlyssvlilafisldrylaivhatnsqrprkllaekvvyvgvwipallltipdfifanvseaddryicdrfypndlwvvvfqfqhimvglilpgivilscyciiisklshskghqkrkalkttvililaffacwlpyyigisidsfilleiikqgcefentvhkwisitealaffhcclnpilyaflgakfktsaqhaltsvsrgsslkilskgkrgghssvstesesssfhss
122.相应的核苷酸序列如seq id no.8所示：
123.atggaggggatcagtatatacacttcagataactacaccgaggaaatgggctcaggggactatgactccatgaaggaaccctgtttccgtgaagaaaatgctaatttcaataaaatcttcctgcccaccatctactccatcatctt
cttaactggcattgtgggcaatggattggtcatcctggtcatgggttaccagaagaaactgagaagcatgacggacaagtacaggctgcacctgtcagtggccgacctcctctttgtcatcacgcttcccttctgggcagttgatgccgtggcaaactggtactttgggaacttcctatgcaaggcagtccatgtcatctacacagtcaacctctacagcagtgtcctcatcctggccttcatcagtctggaccgctacctggccatcgtccacgccaccaacagtcagaggccaaggaagctgttggctgaaaaggtggtctatgttggcgtctggatccctgccctcctgctgactattcccgacttcatctttgccaacgtcagtgaggcagatgacagatatatctgtgaccgcttctaccccaatgacttgtgggtggttgtgttccagtttcagcacatcatggttggccttatcctgcctggtattgtcatcctgtcctgctattgcattatcatctccaagctgtcacactccaagggccaccagaagcgcaaggccctcaagaccacagtcatcctcatcctggctttcttcgcctgttggctgccttactacattgggatcagcatcgactccttcatcctcctggaaatcatcaagcaagggtgtgagtttgagaacactgtgcacaagtggatttccatcaccgaggccctagctttcttccactgttgtctgaaccccatcctctatgctttccttggagccaaatttaaaacctctgcccagcacgcactcacctctgtgagcagagggtccagcctcaagatcctctccaaaggaaagcgaggtggacattcatctgtttccactgagtctgagtcttcaagttttcactccagc
124.采用pcr方法从cdna中扩增出cxcr4基因；用ecor i单酶切实验室质粒pll3.7-nkg2d-car；接着用一步克隆法连接cxcr4和载体，得到质粒pll3.7-cxcr4-nkg2d-car-t2a-cxcr4。得到的包装质粒命名为pll3.7-cxcr4-nkg2d-car。
125.按相同的方法构建不含t2a和cxcr4核苷酸序列，仅含靶向nkg2d配体的嵌合抗原受体的核苷酸序列的包装质粒，命名为pll3.7-nkg2d-car。
126.载体转化到dh5α大肠杆菌菌株中，通过氨苄青霉素筛选获得阳性克隆。提取质粒，酶切鉴定克隆，获得慢病毒的表达质粒pll3.7-cxcr4-nkg2d-car。
127.2.慢病毒包装
128.方法如下：
129.2.1质粒转染
130.2.1.1转染前24h内传代293t细胞，根据细胞生长密度和状态调整细胞密度并接种于10cm的细胞培养皿，转染时293t细胞需完全贴壁且贴壁均匀，生长密度达80％左右开始转染。
131.2.1.2根据每皿的转染体系计算包装质粒和目的质粒的用量，用不含血清的dmem培养基补平至500μl，转染体系如下：
132.辅助质粒ps:辅助质粒pm：pll3.7-nkg2d-car(或者是pll3.7-cxcr4-nkg2d-car)＝5μg：3μg：5μg混合液，短暂涡旋5次，室温静置5min。
133.2.1.3根据转染细胞数量，按50μl/ml/皿配制转染试剂聚乙烯亚胺(pei)稀释液，用不含血清的dmem培养基补平至500μl，短暂涡旋5次，室温静置5min。
134.2.1.4使用1.5ml ep管混合质粒混合液和pei稀释液:先向管中加入500μl质粒混合液，再沿管壁缓慢加入500μl pei稀释液，立即涡旋震荡使溶液充分混合，短暂涡旋2s，连续涡旋10次。
135.2.1.5室温静置聚合20min。
136.2.1.6取出生长状态良好的上述293t细胞，一边前后轻轻摇晃培养皿，一边将混合液缓慢滴加至细胞培养上清，滴加时，需近液面、轻柔缓慢滴加，防止滴加速度过快或用力过大导致细胞漂浮。
137.2.1.7轻晃培养皿使转染液与培养上清混合均匀，37℃ 5％二氧化碳培养箱转染6
cxcr4-nkg2d-car的病毒在nk92细胞上的感染效率接近100％，所得两种目的细胞nkg2d-car-nk92、cxcr4-nkg2d-car-nk92的阳性率分别为94.5％、97.2％。
159.将上述细胞用trizol细胞裂解液裂解细胞，抽提总rna，进行逆转录。rt-pcr分析cxcr4在不同修饰组car-nk92细胞的表达情况。结果如图3所示pll3.7-cxcr4-nkg2d-car慢病毒感染细胞后能提高nk细胞中cxcr4的表达。
160.2.5靶细胞的选择及car-nk92细胞杀伤功能的研究
161.2.5.1实验室前期的研究发现nkg2d配体和cxcr4配体cxcl12高表达的胰腺癌细胞株为panc28。
162.2.5.2构建带有luciferase胰腺癌细胞株panc28：将胰腺癌细胞株panc28单细胞悬液与luciferase病毒混合后接种到6孔板中，24h后更换新鲜的dmem培养基。48h后加入1μg/ml的puromycin进行筛选。
163.2.5.3靶细胞与效应细胞共孵育
164.将处于对数生长期的带luciferase胰腺癌细胞株panc28，sw1990，panc1，进行细胞计数,调整细胞密度至1
×
104/孔，为了避免细胞贴壁，将细胞接种低吸附96孔板中；将nkg2d-car-nk92，cxcr4-nkg2d-car-nk92细胞和对照组nk92细胞分别按照效靶比1:1、2.5:1、5:1接种至靶细胞中，每组设两个复孔，每孔加nk92完全培养基补至200μl，混匀后，37℃，5％二氧化碳培养箱培养4h，4h后经流式检测其杀伤率。
165.2.5.4用上述阳性cxcr4-nkg2d-car-nk92细胞和nkg2d-car-nk92细胞对胰腺癌细胞株panc28、sw1990、panc1细胞进行杀伤实验。
166.如图4所示，在和nkg2d配体mica/b和cxcr4配体cxcl12高表达的胰腺癌细胞株panc28共孵育的过程中发现相比nk92细胞，nkg2d-car-nk92细胞的杀伤能力有显著提高，而过表达cxcr4能够显著增强nkg2d-car-nk92细胞对panc28细胞的杀伤能力。
167.在和nkg2d配体mica/b和cxcr4配体cxcl12低表达的胰腺癌细胞株sw1990共孵育的过程中发现nk92，nkg2d-car-nk92和cxcr4-nkg2d-car-nk92细胞的杀伤能力无显著性区别。
168.在和nkg2d配体mica/b高表达和cxcr4配体cxcl12低表达的胰腺癌细胞株panc1共孵育的过程中发现相比于nk92细胞，nkg2d-car-nk92细胞杀伤能力显著提高，nkg2d-car-nk92和cxcr4-nkg2d-car-nk92细胞的杀伤能力无显著性区别。
169.2.5.5颗粒酶b检测：将靶细胞胰腺癌细胞株panc28、sw1990、panc1细胞与cxcr4-nkg2d-car-nk92和nkg2d-car-nk92、nk92效应细胞按照效靶比e：t＝5：1分别共孵育4h后，破膜固定检测胞内颗粒酶b的含量。
170.颗粒酶b是nk细胞在发挥细胞毒作用时释放的细胞颗粒之一，行使非常重要的功能。颗粒酶b可以与穿孔素联合作用，进入靶细胞的细胞质中，激活靶细胞的caspase信号级联反应，使靶细胞迅速凋亡。因此，颗粒酶b是判定nk细胞活性的一个重要指标。
171.2.5.6 ifn-γ的检测：将靶细胞胰腺癌细胞株panc28、sw1990、panc1细胞与cxcr4-nkg2d-car-nk92和nkg2d-car-nk92、nk92效应细胞按照效靶比e：t＝5：1分别共孵育4h后，破膜固定检测胞内ifnγ的含量。
172.ifn-γ是一种参与免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等多种作用的细胞因子，可由活化的nk细胞产生。ifn-γ是鉴定活化的细胞毒性细胞的免疫标志物，可作为判定nk细胞杀伤活
性的一个重要指标。
173.如图5a所示，在和nkg2d配体mica/b和cxcr4配体cxcl12高表达的胰腺癌细胞株panc28共孵育的过程中，nkg2d-car-nk92细胞的ifn-γ和gzmb含量相对于nk92细胞有所提高，cxcr4-nkg2d-car-nk92细胞的ifn-γ和gzmb含量相对于nkg2d-car-nk92细胞显著提高。
174.如图5b所示，在和nkg2d配体mica/b和cxcr4配体cxcl12低表达的胰腺癌细胞株sw1990共孵育的过程中，nk92细胞，nkg2d-car-nk92细胞，cxcr4-nkg2d-car-nk92细胞的ifn-γ和gzmb含量无显著性差异。
175.如图5c所示，在和nkg2d配体mica/b高表达和cxcr4配体cxcl12低表达的胰腺癌细胞株panc1共孵育的过程中，nkg2d-car-nk92细胞的ifn-γ和gzmb含量相对于nk92细胞有所提高，而nkg2d-car-nk92和cxcr4-nkg2d-car-nk92细胞的ifn-γ和gzmb含量无显著性差异。
176.综上实验结果可以看出，相比于nk92细胞，nkg2d-car-nk92能够特异性靶向识别nkg2d配体高表达的胰腺癌细胞，增强nk92细胞抗肿瘤效果，而在过表达cxcr4后，可以明显提高nkg2d-car-nk92细胞对胰腺癌细胞的抗肿瘤效果，因此二者的共表达具有协同作用，其效果优于单一的靶向nkg2d配体的嵌合抗原受体的nk92细胞的效果。
177.2.6 car-nk92细胞趋化能力的检测
178.趋化活性检测采用3μm孔径transwell小室检测，实验前将cxcr4-nkg2d-car-nk92细胞，nkg2d-car-nk92细胞以及对照组nk92细胞饥饿处理4小时(用不含血清的培养基培养)。在24孔板中加入500μl无血清dmem培养基，过夜培养的panc28细胞培养上清；transwell小室放入孔中，然后将500μl的饥饿处理的上述细胞5
×
105个加入transwell上室。另设一个对照组，将cxcr4配体cxcl12高表达的胰腺癌细胞株panc28细胞培养上清同时加入到transwell小室的上室和下室，于37℃，5％二氧化碳的培养箱培养4小时，收集下室细胞，轻轻混匀重悬，于显微镜下观察计数，用血球计数板进行细胞计数。
179.细胞的迁移率(％)＝实验组的下室中细胞的数量-自发迁移组下室中细胞的数量(仅含dmem培养基)/最大值(5
×
105)-自发迁移组下室中细胞的数量(仅含dmem培养基)
×
100。
180.如图6结果显示，相比于不含血清的dmem培养基，加入cxcr4配体cxcl12高表达的胰腺癌细胞panc28细胞培养上清后可促进cxcr4-nkg2d-car-nk92细胞迁移；而在transwell小室的上室和下室加入cxcr4配体cxcl12高表达的胰腺癌细胞panc28细胞培养上清后，这种趋化现象消失；可以说明cxcr4-nkg2d-car-nk92细胞可能受到cxcr4配体cxcl12高表达的胰腺癌细胞panc28细胞培养上清中cxcl12的影响，迁移能力明显增强。即cxcr4可以增强cxcr4-nkg2d-car-nk92细胞的趋化能力。
181.2.7 cxcr4-nkg2d-car-nk92细胞体内抗肿瘤效果的检测为进一步验证cxcr4-nkg2d-car-nk92细胞体内抗肿瘤效果，我们以nsg小鼠为动物模型进行体内抗肿瘤效果的研究。取6周龄小鼠进行皮下荷瘤，待肿瘤长到100mm3，按照肿瘤大小平均分为四组：pbs组，nk92组，nkg2d-car-nk92组，cxcr4-nkg2d-car-nk92组，每周进行尾静脉注射治疗，在治疗期间，对小鼠进行活体成像，对荧光强弱进行统计学分析。图7为肿瘤荧光强度的统计学分析。同时测量肿瘤体积大小变化，绘制肿瘤生长曲线，如图8所示。综合可以看出，与对照组
nk92相比，nkg2d-car-nk92组具有很强的体内抗肿瘤效果；在过表达cxcr4后，nkg2d-car-nk92组具有更强的体内抗肿瘤效果。
182.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以作各种改动或修改。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。