一种检测黄瓜CsPsy1基因SNP位点的分子标记及其应用

一种检测黄瓜cspsy1基因snp位点的分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物生物技术和分子育种领域，具体涉及一个检测黄瓜八氢番茄红素合成酶基因cspsy1 snp位点的分子标记snp-cspsy1及其应用。


背景技术：

2.黄瓜(cucumis sativus l.)作为世界上重要的十大蔬菜作物之一，其栽培面积仅次于番茄。自上世纪70年代以来，我国黄瓜的栽培面积与总产量始终位居世界第一，2010年以来我国的黄瓜产量甚至达到了全世界黄瓜总产量的70％。黄瓜肉质脆嫩，汁多味甘，生食生津解渴，且有特殊芳香，即可生吃又可炒食，是消费者普遍接受和喜爱的蔬菜作物，随着我国农业供给侧结构改革，黄瓜的种植还将有更快的增加趋势。
3.目前我国黄瓜育种主要集中于产量、风味、瓜形、瓜色、瓜瘤/刺、抗病性等农艺性状的改良，但与营养相关的品质性状却常常被忽略，微量营养元素很少被列为育种目标，已经育成的黄瓜品种中的胡萝卜素、维生素等物质的含量还不十分明确。现代医学发现，70％的慢性疾病(包括糖尿病、心血管疾病、癌症、肥胖症、亚健康等)都与人体营养素摄取的不均衡有关，这些微量营养元素缺乏又称“隐性饥饿”，已经成为全球最普遍的公共健康问题。1993年前后，国际农业研究磋商组织(cgiar)下属的研究中心首先提出培育富含微量营养元素作物新品种的设想。2003年启动生物强化挑战项目，同年7月更名为“harvest plus”，意为在高产的基础上，使作物新品种富含更多营养以解决日益突出的隐性饥饿问题。随着黄瓜需求量不断增加，如何实现黄瓜营养、健康功能品质的改良提高，改善中国人群营养状况，是我国黄瓜育种中亟待解决的重要问题。
4.胡萝卜素是一种具有生理活性的微量营养元素，在人体内可转化成具有生理活性的维生素a。通常成人每人每天应摄入胡萝卜素3.6～4.5mg左右，少年儿童每天最低的摄入量为3.6～6.3mg，胡萝卜素摄入不足会造成维生素a缺乏症，维生素a在抵抗自由基、维持正常的视觉反应、上皮组织形态与功能、骨骼发育和皮肤细胞功能等方面具有重要的功能，缺乏维生素a会使上皮细胞的功能减退，导致皮肤弹性下降，变干和粗糙，失去光泽，严重的维生素a缺乏症可导致失明甚至死亡。维生素a缺乏是一个全球性问题，在农村以及欠发达地区尤为严重，维生素a缺乏影响着全球1亿9000万名学龄前儿童和1900万名孕妇和哺乳期妇女以及东亚区域的8300万青少年，根据联合国儿童基金会调查，每年有大量儿童由于维生素a缺乏症而失明，而通过增加维生素a的摄取量可以有效缓解该情况。β-胡萝卜素是类胡萝卜素家族中活性最高、最主要的维生素a原，目前，β-胡萝卜素已经被联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合委员会认定为a类营养色素，并且在多个国家被批准使用。
5.生物强化是通过育种手段、基因技术或农艺措施来提高作物中能为人体吸收利用的微量元素含量的一种策略，即通过遗传改良提高作物自身营养价值，不同于食品加工过程中添加营养物质的食物强化。生物强化不同于普通的营养强化，其他营养强化途径主要是在合成加工的过程中人为的加入微量营养物质，而生物强化是在不改变人群传统饮食习惯的情况下，通过调控作物生长过程，提高作物中有效性微量元素含量和生物有效性来满
足人们对微量营养的需求，这种手段可以经济、有效、根本性地解决人体微量元素营养不平衡问题。分子标记辅助选择高维生素a原的作物，是作物分子育种史上最成功的生物强化育种案例。目前在作物中已鉴定了类胡萝卜素代谢途径中3个关键基因psy1、lcye和crtrb1的多态性位点，这些功能位点已被开发为简单好用的以pcr为基础的分子标记应用于分子标记辅助选择。虽然在作物领域通过分子标记辅助选择的生物强化育种已经取得了重大突破，但是在黄瓜育种领域仍然有待加强。
6.近年来，随着人们对类胡萝卜素的需求量逐渐增大，天然类胡萝卜素受到人们极大重视。黄瓜作为含有胡萝卜素的蔬菜之一，因其含量偏低，并没有引起人们普遍关注。我国云南存在一些地方品种，俗称“版纳黄瓜”(c.sativus l.var.xishuangbannanesis qi et yuan)，是我国特有的橙黄色果肉黄瓜种质资源。β-胡萝卜素积累是橙黄果肉颜色形成的主要原因，不同种质间的β-胡萝卜素含量差异明显。研究表明，“版纳黄瓜”富含胡萝卜素，果实中β-胡萝卜素含量可达700μg/100g鲜重，是普通栽培黄瓜(22-48μg/100g鲜重)的几十倍。作为一类高胡萝卜素含量的特异黄瓜种质，西双版纳黄瓜是拓宽黄瓜品质育种遗传背景的重要材料。已有研究表明，β-胡萝卜素积累主要受到1～3个不同的隐性基因控制，这些基因决定了果皮和果肉中的胡萝卜素含量。八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,psy)是类胡萝卜素生物合成途径中的第1个限速酶，对高等植物类胡萝卜素的合成与积累起着重要作用。黄瓜基因组中有3个编码八氢番茄红素合成酶的基因，分别是cspsy1(csa5g320430)、cspsy2(csa4g280510)和cspsy3(csa4g063980)，在黄瓜果实中对胡萝卜素生物合成途径起主要作用的是cspsy1基因。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一个检测黄瓜八氢番茄红素合成酶基因cspsy1 snp位点的分子标记及其应用，通过对收集的黄色果肉的西双版纳变种群黄瓜和白色果肉的栽培黄瓜变种群黄瓜基因组重测序和基因片段测序来分析cspsy1基因序列，依据两种黄瓜cspsy1基因序列的差异设计得到一个检测黄瓜cspsy1基因snp位点的分子标记，可以简便、快速、高通量地用于黄瓜分子标记辅助育种。
8.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
9.本发明提供的一个检测黄瓜八氢番茄红素合成酶基因cspsy1 snp位点的分子标记，命名为snp-cspsy1，由如seq id no.1(gattcgttcattaaaagccttggaatttttctagtgggattaaaatcgattgatatgtcttttacttcatcgttagttgtttctcccaacgttgaactttcccc atccaactttgggtttcttgattctcttcgagatggaccccaaattcccg)所示的核苷酸序列片段和seq id no.2(gattcgttcattaaaagccttggaattcttctagtgggattaaaatcgattgatatgtcttttacttcatcgttagttgtttctcccaacgttgaactttcccc atccaactttgggtttcttgattctcttcgagatggaccccaaattcccg)所示的核苷酸序列片段组成；其中：seq id no.1所示为cspsy1基因类型1的部分核苷酸序列，seq id no.2所示为cspsy1基因类型2的部分核苷酸序列。
10.优选地，所述snp-cspsy1由seq id no.3所示的上游引物和seq id no.4所示的下游引物扩增得到。
11.上述seq id no.1为snp-cspsy1在黄瓜cspsy1基因类型1中扩增的序列，seq id no.2为snp-cspsy1在黄瓜cspsy1基因类型2中扩增的序列，两序列均由154个核苷酸组成，
但两者之间在cspsy1基因起始密码子atg上游第27个核苷酸处有一个t/c的单核苷酸变异。对snp-cspsy1在cspsy1基因类型1和类型2中的pcr扩增产物进行ecor i酶切，然后进行8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果表明cspsy1基因类型1的pcr产物因不能被ecor i酶切，显示为154bp的dna片段；cspsy1基因类型2的pcr产物被ecor i酶切为131bp和23bp的dna片段，主要显示为131bp的dna条带。此共显性的snp分子标记有利于黄瓜cspsy1基因类型鉴定和分子标记辅助体系的建立，可简便、快速、高通量地应用于育种实践。
12.本发明对西双版纳变种群黄瓜材料和栽培黄瓜变种群黄瓜材料进行基因组重测序和cspsy1基因片段测序，序列分析表明不同黄瓜材料中cspsy1基因主要有两个类型，它们在基因起始密码子atg上游第27核苷酸处有一个t/c的单核苷酸差异，在西双版纳变种群中为t(类型1)，栽培黄瓜变种群中为c(类型2)。利用此单核苷酸差异设计得到一个检测黄瓜cspsy1基因起始密码子atg上游第27核苷酸处snp位点的分子标记snp-cspsy1，序列表中seq id no.1和seq id no.2所示的核苷酸组成，分别由类型1和类型2经snp-cspsy1 pcr扩增片段测序获得。该标记可以快速、高通量的在黄瓜候选材料的任何阶段对cspsy1基因上的snp位点进行判断，可以用于黄瓜分子标记辅助育种。
13.与现有技术相比，本发明的共分离分子标记snp-cspsy1为共显性，能够区分cspsy1基因类型1和类型2的纯合子以及它们的杂合子，在黄瓜生长发育的任何时期均可进行基因型鉴定，此snp标记条带差异明显，用8.0％的聚丙烯酰胺凝胶电泳可清晰地区分cspsy1基因的不同类型，既准确又省时省力，可用于黄瓜分子标记辅助育种过程中不同类型cspsy1基因检测。
附图说明
14.图1是黄瓜两种不同类型cspsy1基因起始密码子上游snp位点及旁侧序列。
15.图2是分子标记snp-cspsy1对不同黄瓜材料pcr扩增产物酶切电泳图(8％聚丙烯酰胺凝胶)；其中，1-10分别代表西双版纳变种群材料：bn01、bn02、bn03、bn04、bn05、bn06、bn07、bn08、bn09和bn10，11-20分别代表栽培黄瓜变种群材料：wd1、422、sw1、s05、7088、wz1、tmg1、g38、h34和wx1。
具体实施方式
16.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
17.下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆(molecular cloning：a laboratory manual,sambrook编著，new york：cold spring harbor laboratory press,1989)或植物分子生物学－实验手册(plant molecular biology－a laboratory manual,melody s.clark编，springer-verlag berlin heidelberg,1997)，或者按照制造厂商所建议的条件。
18.以下实施例中分子标记snp-cspsy1 pcr扩增采用的上游引物和下游引物由上海生工合成。
19.实施例1
20.(1)黄瓜基因组中cspsy1、cspsy2和cspsy3基因序列分析
21.黄瓜基因组中有3个编码psy酶的基因，cspsy1(csa5g320430)、cspsy2(csa4g280510)和cspsy3(csa4g063980)，分别位于黄瓜第5、第4和第4染色体。对cspsy1、cspsy2和cspsy3三个基因的氨基酸序列进行比对分析，结果表明cspsy1与cspsy2和cspsy3蛋白的氨基酸序列相似性分别为60％和59％，氨基酸序列差异较大。cspsy1与cspsy2和cspsy3基因的核苷酸序列相似性均不到50％，cspsy2和cspsy3与cspsy1基因核苷酸序列相似度低，不影响黄瓜基因组中cspsy1基因序列的扩增和鉴定。
22.(2)黄瓜cspsy1基因的序列分析
23.参考黄瓜已测序材料9930中cspsy1(csa5g320430)基因序列，通过软件primer5设计用于cspsy1基因扩增的特异性引物f1：tctcgattcctctgcgattcgttc；r1：tgcataagccattggcaaagcc，以该特异性引物，利用takara公司的高保真长片段扩增酶primestar gxl dna polymerase(产品号为code no.r050a)首先对黄色果肉的西双版纳黄瓜材料bn35-11和白色果肉的华北型自交系wd1中的cspsy1(csa5g320430)基因的dna片段进行了pcr扩增。pcr的反应体系为：基因组dna 10ng，引物0.2μmol/l，200μmol/l dntps，1
×
缓冲液，1.25u gxl dna聚合酶，总反应体系为50μl。扩增程序为：95℃150s；35cycles：95℃15s，60℃15s，72℃150s，72℃300s。在pcr产物中加入goldview荧光染料3ul，4℃下放置10min让染料同dna结合，然后加入上样缓冲液2ul，混匀后通过1％琼脂糖凝胶电泳分离检测得到的pcr扩增产物，获得符合预期大小的片段，在紫外灯下切下目标片段放入1.5ml的离心管中，用dna回收试剂盒回收；其中dna回收试剂盒为上海生工uniq-10柱式dna胶回收试剂盒(产品号为cat.no.sk1132)，将回收产物与测序引物一并送到上海生工生物有限公司进行相关序列的测定。序列分析结果表明，位于cspsy1基因起始密码子上游序列第27个碱基在bn35-11和wd1间存在差异，bn35-11中cspsy1基因此处碱基为t，wd1中cspsy1基因此处碱基为c。
24.为确认该碱基差异普遍存在于黄色果肉的西双版纳变种群和白色果肉的栽培黄瓜变种群之间，对已进行重测序的黄瓜材料的基因组序列进行分析。结果表明在10个栽培黄瓜自交系(422、sm1、s05、7088、wz1、tmg1、g38、h34、wx1、s52)中cspsy1基因起始密码子上游序列第27个碱基均为c，10个西双版纳黄瓜材料(bn01、bn02、bn03、bn04、bn05、bn06、bn07、bn08、bn09和bn10)的基因组序列，西双版纳黄瓜材料该处的碱基均为t。分析已测序黄瓜材料9930和gy14以及115份重测序的黄瓜材料基因组数据，结果表明19份西双版纳黄瓜材料中cspsy1基因起始密码子上游序列第27个核苷酸均为t，94份栽培黄瓜材料此处核苷酸均为c，2份材料数据缺失，结果证明cspsy1基因起始密码子上游序列第27个核苷酸处的t/c单核苷酸差异普遍存在于西双版纳变种群和栽培黄瓜变种群之间，可以以此为基础开发用于检测黄瓜cspsy1基因snp位点的分子标记，区分西双版纳变种群和栽培黄瓜变种群的cspsy1基因类型。
25.(3)用于检测黄瓜cspsy1基因snp位点分子标记的开发与鉴定
26.在分析材料中，黄色果肉的西双版纳变种群黄瓜材料cspsy1基因起始密码子上游序列第27个核苷酸为t，白色果肉的栽培黄瓜变种群黄瓜材料cspsy1基因此处核苷酸为c。将此处核苷酸为t的命名为cspsy1基因类型1，此处核苷酸为c的命名为cspsy1基因类型2。根据此处的核苷酸差异开发一个检测黄瓜cspsy1基因snp位点的分子标记，命名为snp-cspsy1。利用snp-cspsy1引物(seq id no.3所示的上游引物：
gattcgttcattaaaagccttggaatt和seq id no.4所示的下游引物：cgggaatttggggtccatctcgaag)，对10份西双版纳黄瓜和10份栽培黄瓜材料基因组dna进行pcr扩增，pcr扩增的反应体系为：基因组dna 5ng，引物0.2μmol/l，200μmol/ldntps，1
×
缓冲液，0.25u gxl dna聚合酶，总反应体系为10μl，不足用dd h2o补齐。扩增程序为：95℃150s；35cycles：95℃15s，60℃15s，72℃15s；72℃300s。扩增后的pcr产物用ecor i(酶切识别位点为gaattc)进行酶切，酶切反应体系为：8μlpcr产物，0.5u的ecor i内切酶，1
×
酶切缓冲液，总反应体系为10μl，不足体积用dd h2o补齐。酶切2h后，在酶切产物中加入上样缓冲液1ul，混匀后取3ul酶切产物通过8％聚丙烯酰胺凝胶电泳2h后进行分析。cspsy1基因类型1的pcr产物无ecor i内切酶酶切位点，电泳显示酶切产物为一条154bp的dna片段；类型2的pcr产物被ecor i酶切掉23bp，电泳显示酶切产物为131bp的dna片段。
27.综上所述，本发明的snp分子标记具有高稳定性，可以快速、高通量的在黄瓜候选材料的任何阶段检测黄瓜cspsy1基因snp位点，从而区黄瓜cspsy1基因的两种类型。
28.