用于检测BRAF基因突变的引物组合、试剂盒、模型、构建方法及检测方法与流程

用于检测braf基因突变的引物组合、试剂盒、模型、构建方法及检测方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及一种用于检测braf基因突变的引物组合、试剂盒、模型、构建方法及检测方法。


背景技术：

2.成人朗格汉斯细胞组织细胞增生症(lch)的临床特征和预后因素尚不明确。但已在lch中发现了重现性的braf v600e等位点的体细胞突变，而且多数基因组分析来自于儿童，初诊lch组织标本中，进行一代包加二代包基因外显子突变检测，63.2％患儿存在braf基因突变，突变位点主要集中在第12和第15两个外显子上。p.v600e型占到50.6％；非p.v600e型突变阳性率为12.6％，包括：p.n486_t491delinsk、p.v600d(c.1799_1800delinsat)、p.n486_p490del、p.l485_p490delinsf，以及三种散发阳性突变(p.v600d(c.1799_1800delinsac))、p.v600delinsdatv和p.v487_t491del。
3.但目前缺乏技术便于对braf基因以上位点进行突变检测，难以对患者治疗过程以及康复出院之后的突变进行预测或监测。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术的不足，本发明所要解决的问题是：如何提供一种用于检测braf基因突变的引物组合、试剂盒、模型、构建方法及检测方法，以解决现有技术中对braf基因相关位点突变检测不便的问题。
5.为了解决上述问题，本发明采用了如下的技术方案：
6.一种用于检测braf基因突变的引物组合，包括用于检测braf基因第12个外显子和/或第15个外显子的特异性引物，
7.所述用于检测braf基因第12个外显子的特异性引物为：
8.exon12-f：ggtgatgtggcagtgaaaatgt，
9.exon12-r：actcctacttcatttttgaaggct；
10.所述用于检测braf基因第15个外显子的特异性引物为：
11.exon15-f：cacagtaaaaataggtgattttggtct，
12.exon15-r：tcaaactgatgggacccactc。
13.一种用于检测braf基因突变的试剂盒，包括上述用于检测braf基因突变的引物组合。
14.具体的，所述用于检测braf基因突变的试剂盒包括用于第一次pcr扩增的试剂盒和用于第二次pcr扩增的试剂盒；所述用于第一次pcr扩增的试剂盒包括权利要求1所述用于检测braf基因突变的引物组合和2
×
kapa hifi hotstart ready mix；所述用于第二次pcr扩增的试剂盒包括2
×
kapa hifi hotstart ready mix、pe 1.0和barcode。
15.一种用于检测braf基因突变的反应体系，包括用于第一次pcr扩增的反应体系和
用于第二次pcr扩增的反应体系；
16.所述用于第一次pcr扩增的反应体系包括：
17.25体积份的2
×
kapa hifi hotstart ready mix、3体积份的权利要求1所述用于检测braf基因第12个号显子和/或第15个号显子的特异性引物和22体积份的游离核酸样本；
18.所述用于第二次pcr扩增的反应体系包括：
19.25体积份的2
×
kapa hifi hotstart ready mix、1体积份的pe 1.0、1体积份的barcode和23体积份的第一次pcr扩增后纯化dna产物。
20.一种构建检测braf基因突变模型的方法，包括：
21.1)、提取cfdna样本；
22.2)、基于提取的cfdna样本，配置上述用于检测braf基因突变的反应体系并相应进行pcr扩增；
23.3)、对所述步骤2)扩增产物进行加接头及pcr富集制备测序文库，对所述测序文库进行定量与质控，采用基因测序仪进行高通量测序；
24.4)、采用生物信息分析软件对测序数据分析，得到所述cfdna样本的braf基因第12号外显子和第15号外显子特定位点的相关信息，构建所述检测braf基因突变模型。
25.采用正常cfdna样本，建立的所述检测braf基因突变模型，输入待测样本进行检测，与所述正常cfdna样本的braf基因第12号外显子和第15号外显子特定位点相关信息进行比对。
26.具体的，braf基因第12号外显子和第15号外显子特定位点包括：
27.所述braf基因第12号外显子特定位点为：c.1459_1473del:p.v487_t491del和/或c.1458_1472del:p.n486_t491delinsk和/或c.1457_1471del:p.n486_p490del和/或c.1455_1469del:p.l485_p490delinsf；
28.所述braf基因第12号外显子特定位点为：c.1799_1800delinsat:p.v600d和/或c.c.1798_1799insatgctacag:p.v600delinsdatv和/或c.1799t》a:p.v600e和/或c.1801a》c:p.k601q和/或c.1799_1800delinsac:p.v600d。
29.进一步，所述步骤1)提取的cfdna样本浓度为0.1ng/ul-50ng/ul。
30.具体的，所述步骤2)相应进行pcr扩增包括：
31.第一次pcr扩增程序为：95℃、3min，循环一次；98℃、20s，60℃、15s，72℃、15s，循环30次；72℃、1min，循环一次；4℃保持；
32.第二次pcr扩增程序为：98℃、5min，循环一次；98℃、20s，65℃、30s，72℃、20s，循环30次；72℃、5min，循环一次；4℃保持。
33.上述构建检测braf基因突变模型的方法所构建的检测braf基因突变的模型。
34.一种检测braf基因突变的非疾病诊断的方法，包括：
35.1)、基于上述检测braf基因突变的模型，提取待测cfdna样本；
36.2)、基于提取的待测cfdna样本，配置权利要求4所述用于检测braf基因突变的反应体系并相应进行pcr扩增；
37.3)、对所述步骤2)扩增产物进行加接头及pcr富集制备测序文库，对所述测序文库进行定量与质控，采用基因测序仪进行高通量测序；
38.4)、采用生物信息分析软件对测序数据分析，得到所述待测cfdna样本的braf基因第12号外显子和第15号外显子特定位点的相关突变信息，与正常cfdna样本的braf基因第12号外显子和第15号外显子特定位点相关信息进行比对。
39.具体的，braf基因第12号外显子和第15号外显子特定位点包括：
40.所述braf基因第12号外显子特定位点为：c.1459_1473del:p.v487_t491del和/或c.1458_1472del:p.n486_t491delinsk和/或c.1457_1471del:p.n486_p490del和/或c.1455_1469del:p.l485_p490delinsf；
41.所述braf基因第12号外显子特定位点为：c.1799_1800delinsat:p.v600d和/或c.c.1798_1799insatgctacag:p.v600delinsdatv和/或c.1799t》a:p.v600e和/或c.1801a》c:p.k601q和/或c.1799_1800delinsac:p.v600d。
42.进一步，所述步骤1)提取的cfdna样本浓度为0.1ng/ul-50ng/ul。
43.具体的，所述步骤2)相应进行pcr扩增包括：
44.第一次pcr扩增程序为：95℃、3min，循环一次；98℃、20s，60℃、15s，72℃、15s，循环30次；72℃、1min，循环一次；4℃保持；
45.第二次pcr扩增程序为：98℃、5min，循环一次；98℃、20s，65℃、30s，72℃、20s，循环30次；72℃、5min，循环一次；4℃保持。
46.本发明的有益效果在于：本发明提供用于检测braf基因突变的引物组合、试剂盒、模型、构建方法及检测方法，对braf基因第12外显子能检出含0.09％的braf基因相关位点突变的游离核酸样本，对第15外显子能检出含0.05％的braf基因相关位点突变的游离核酸样本，可提高生物临床检测水平，为普及应用奠定基础。
具体实施方式
47.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
48.需要说明的是，这些实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下本方法的简单改进，都属于本发明要求保护的范围。
49.实施例1
50.braf基因第12和第15两个外显子的特异性引物：
[0051][0052]
braf基因第12和第15两个外显子检测位点：
[0053]
[0054]
实施例2
[0055]
本方案实验样本采用已知临床信息的样本测试，如下
[0056]
序号样本号基因外显子碱基氨基酸突变频率119ca25984brafexon12c.1458_1472delp.n486_t491delinsk8％219ca25736brafexon15c.1799t》ap.v600e3.54％
[0057]
一、血浆样本的游离核酸(cfdna)提取
[0058]
血浆样本提取采用天根生化科技(北京)有限公司生产的磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(天根，dp710-01)，取1000μl血浆样品提取完的cfdna后qubit检测浓度，浓度范围在0.1ng/ul-50ng/ul不等。测定合格后建议立即进行pcr扩增，或者直接放于-20
±
5℃条件下保存，保存时间不超过一个月，期间避免反复冻融，建议冻融次数不超过10次。
[0059]
二、第一步pcr扩增
[0060]
针对braf基因第12和第15两个外显子分别设计特异性引物进行扩增。
[0061]
1.试剂配制：pcr采用市售的pcr试剂盒，本实施例采用的试剂盒品牌为kapa，名称为2
×
kapa hifi hotstart ready mix，货号为kk2602。
[0062]
针对1号样本采用12号外显子引物进行扩增，2号样本采用15号外显子引物进行扩增，故分别配制体系如下表，n＝待检样本数 1。
[0063][0064]
2.扩增：扩增条件如下。
[0065][0066][0067]
3.纯化：纯化磁珠采用本公司自产磁珠。
[0068]
3.1磁珠充分混匀，取0.8倍体积的磁珠加入。
[0069]
3.2涡旋震荡，室温放置5min，使dna充分吸附在磁珠上；
[0070]
3.3短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置5min；待溶液清亮，用枪头吸弃上清液，避免吸到磁珠；
[0071]
3.4加入180μl当天配置的80％乙醇漂洗，静置30sec；吸弃乙醇；
[0072]
3.5重复步骤3.5；
[0073]
3.6短暂离心，将离心管放置在磁力架上，用10μl枪头彻底将液体吸净；
[0074]
3.7室温干燥5min使乙醇尽量挥发干净；
[0075]
3.8加入25μl ddh2o，涡旋混匀，室温静置5min；短暂离心，将离心管放在磁力架上5min；
[0076]
3.9转移23μl dna溶液至干净的标记好的pcr管中。
[0077]
三、第二步pcr
[0078]
1.试剂配制：pcr采用市售的pcr试剂盒，本实施例采用的试剂盒品牌为kapa，名称为2
×
kapa hifi hotstart ready mix，货号为kk2602。
[0079]
在上一步产物的pcr管中按下表配制体系。
[0080][0081]
2.扩增：扩增条件如下。
[0082][0083][0084]
3.纯化：纯化磁珠采用本公司自产磁珠。
[0085]
3.1磁珠充分混匀，取与pcr产物体积等体积的磁珠加入(例如：50μl pcr产物加入50μl磁珠)；
[0086]
3.2涡旋震荡，室温放置5min，使dna充分吸附在磁珠上；
[0087]
3.3短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置5min；
[0088]
3.4待溶液清亮，用枪头小心吸弃上清液，避免吸到磁珠；
[0089]
3.5加入180μl当天配置的80％乙醇漂洗，静置30sec；吸弃乙醇；
[0090]
3.6重复步骤3.5；
[0091]
3.7短暂离心，将离心管放置在磁力架上，用10μl枪头彻底将液体吸净；
[0092]
3.8室温干燥5min使乙醇尽量挥发干净；
[0093]
3.9加入20μl ddh2o，涡旋混匀，室温静置5min；
[0094]
3.10短暂离心，将离心管放在磁力架上5min；
[0095]
3.11转移18μl dna溶液至干净的标记好的pcr管中。
[0096]
3.12qubit测定浓度，将文库稀释至1.5ng/μl，进行测序。测序数据量每例样本0.1g。
[0097]
四、高通量测序
[0098]
高通量测序使用illumina novaseq高通量测序平台，按照测序仪标准操作规程进行测序。
[0099]
五、测序结果：
[0100]
1.基本统计：2例样品的cfdna进行建库测序，进行基本统计，从下表结果上看，平均深度大于100000x，结果符合检测需求。
[0101][0102][0103]
2.突变频率结果
[0104]
样本报告突变率refcountaltcount本方法检测突变率比对18％229611199377.99％结果基本一致23.54％31519471388904.22％结果基本一致
[0105]
实施例3
[0106]
braf基因第12和第15两个外显子检测限的研究
[0107]
本方案实验样本采用已知临床信息的样本测试，如实施例2中已知临床信息的样本。
[0108]
序号样本号基因外显子碱基氨基酸突变频率119ca25984brafexon12c.1458_1472delp.n486_t491delinsk8％219ca25736brafexon15c.1799t》ap.v600e3.54％
[0109]
一、血浆样本的游离核酸(cfdna)提取
[0110]
血浆样本提取采用天根生化科技(北京)有限公司生产的磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(天根，dp710-01)，取1000μl血浆样品提取完的cfdna后qubit检测浓度，浓度范围在0.1ng/ul-50ng/ul不等，测定合格后建议立即进行pcr扩增，或者直接放于-20
±
5℃条件下保存，保存时间不超过一个月，期间避免反复冻融，建议冻融次数不超过10次。
[0111]
二、exon12检测限研究
[0112][0113]
包含以下四个位点：
[0114]
exon12:c.1459_1473del:p.v487_t491del
[0115]
exon12:c.1458_1472del:p.n486_t491delinsk
[0116]
exon12:c.1457_1471del:p.n486_p490del
[0117]
exon12:c.1455_1469del:p.l485_p490delinsf
[0118]
选取位点c.1458_1472del:p.n486_t491delinsk进行exon12检测限研究。
[0119]
序号样本号基因外显子碱基氨基酸突变频率119ca25984brafexon12c.1458_1472delp.n486_t491delinsk8％
[0120]
1.将该样本cfdna稀释至0.2ng/μl，记作a；再找1例正常人样本cfdna，测浓度，稀释至0.2ng/μl，记作b。按照下表配制上机样本：
[0121]
编号突变率配制方法braf-18％直接使用a，体积＞25μlbraf-24％a和b，按照体积比1:1混合，终体积＞25μlbraf-31％braf-2和b，按照体积比1:3混合，终体积＞25μlbraf-40.5％braf-3和b，按照体积比1:1混合，终体积＞25μlbraf-50.1％braf-4和b，按照体积比1:4混合，终体积＞25μlbraf-60.09％braf-5和b，按照体积比9:1混合，终体积＞250μlbraf-70.07％braf-6和b，按照体积比7:2混合，终体积＞250μlbraf-80.06％braf-7和b，按照体积比6:1混合，终体积＞250μlbraf-90.05％braf-8和b，按照体积比5:1混合，终体积＞250μl
[0122]
2.第一步pcr：
[0123]
2.1按照下表配置反应体系，其中braf-6，braf-7，braf-8和braf-9各重复10次，即各建库10管，命名为braf-6-1、braf-6-2.....braf-6-10，braf-7-1、braf-7-2.....braf-7-10，braf-8-1、braf-8-2.....braf-8-10，braf-9-1、braf-9-2.....braf-9-10
[0124][0125][0126]
2.2扩增
[0127][0128]
2.3纯化：纯化磁珠采用本公司自产磁珠。
[0129]
2.3.1磁珠充分混匀，取0.8倍体积的磁珠加入。
[0130]
2.3.2涡旋震荡，室温放置5min，使dna充分吸附在磁珠上；
[0131]
2.3.3短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置5min；
[0132]
2.3.4待溶液清亮，用枪头小心吸弃上清液，避免吸到磁珠；
[0133]
2.3.5加入180μl当天配置的80％乙醇漂洗，静置30sec；吸弃乙醇；
[0134]
2.3.6重复步骤3.5；
[0135]
2.3.7短暂离心，将离心管放置在磁力架上，用10μl枪头彻底将液体吸净；
[0136]
2.3.8室温干燥5min使乙醇尽量挥发干净；
[0137]
2.3.9加入25μl ddh2o，涡旋混匀，室温静置5min；
[0138]
2.3.10短暂离心，将离心管放在磁力架上5min；
[0139]
2.3.11转移23μl dna溶液至干净的标记好的pcr管中。
[0140]
3.第二步pcr：
[0141]
3.1试剂配制：pcr采用市售的pcr试剂盒，本实施例采用的试剂盒品牌为kapa，名称为2
×
kapa hifi hotstart ready mix，货号为kk2602。在上一步产物的pcr管中按下表配制体系。
[0142][0143][0144]
3.2扩增：扩增条件如下。
[0145][0146]
3.3纯化：纯化磁珠采用本公司自产磁珠。
[0147]
3.3.1磁珠充分混匀，取与pcr产物体积等体积的磁珠加入(例如：50μl pcr产物加入50μl磁珠)；
[0148]
3.3.2涡旋震荡，室温放置5min，使dna充分吸附在磁珠上；
[0149]
3.3.3短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置5min；
[0150]
3.3.4待溶液清亮，用枪头小心吸弃上清液，避免吸到磁珠；
[0151]
3.3.5加入180μl当天配置的80％乙醇漂洗，静置30sec；吸弃乙醇；
[0152]
3.3.6重复步骤3.5；
[0153]
3.3.7短暂离心，将离心管放置在磁力架上，用10μl枪头彻底将液体吸净；
[0154]
3.3.8室温干燥5min使乙醇尽量挥发干净；
[0155]
3.3.9加入20μl ddh2o，涡旋混匀，室温静置5min；
[0156]
3.3.10短暂离心，将离心管放在磁力架上5min；
[0157]
3.3.11转移18μl dna溶液至干净的标记好的pcr管中。
[0158]
3.3.12qubit测定浓度，将文库稀释至1.5ng/μl，进行测序。测序数据量每例样本0.1g。
[0159]
4.高通量测序
[0160]
高通量测序使用illumina novaseq高通量测序平台，按照测序仪标准操作规程进行测序。
[0161]
5.测序结果：
[0162]
1.基本统计：检测限样品的cfdna进行建库测序，进行基本统计，从下表结果上看，平均深度大于100000x，结果符合检测需求。
[0163]
[0164][0165]
[0166][0167]
2.检测限结果：
[0168]
位点exon12:c.1458_1472del：llod(重复10次，检出率为90％)为0.07％；lloq(重复10次，检出率为100％)为0.09％。
[0169]
三、exon15检测限研究
[0170][0171]
包含以下五个位点：
[0172]
exon15:c.1799_1800delinsat:p.v600d
[0173]
exon15:c.c.1798_1799insatgctacag:p.v600delinsdatv
[0174]
exon15:c.1799t》a:p.v600e
[0175]
exon15:c.1801a》c:p.k601q
[0176]
exon15:c.1799_1800delinsac:p.v600d
[0177]
选取位点c.1799t》a:p.v600e进行exon15检测限研究。
[0178]
序号样本号基因外显子碱基氨基酸突变频率219ca25736brafexon15c.1799t》ap.v600e3.54％
[0179]
1.将该样本cfdna稀释至0.2ng/μl，记作a；再找1例正常人样本cfdna，测浓度，稀释至0.2ng/μl，记作b。按照下表配制上机样本：
[0180]
[0181][0182]
2.第一步pcr：
[0183]
2.1按照下表配置反应体系，其中braf-6，braf-7，braf-8和braf-9各重复10次，即各建库10管，命名为braf-6-1、braf-6-2.....braf-6-10，braf-7-1、braf-7-2.....braf-7-10，braf-8-1、braf-8-2.....braf-8-10，braf-9-1、braf-9-2.....braf-9-10
[0184][0185]
2.2扩增
[0186][0187]
2.3纯化：纯化磁珠采用本公司自产磁珠。
[0188]
2.3.1磁珠充分混匀，取0.8倍体积的磁珠加入。
[0189]
2.3.2涡旋震荡，室温放置5min，使dna充分吸附在磁珠上；
[0190]
2.3.3短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置5min；
[0191]
2.3.4待溶液清亮，用枪头小心吸弃上清液，避免吸到磁珠；
[0192]
2.3.5加入180μl当天配置的80％乙醇漂洗，静置30sec；吸弃乙醇；
[0193]
2.3.6重复步骤3.5；
[0194]
2.3.7短暂离心，将离心管放置在磁力架上，用10μl枪头彻底将液体吸净；
[0195]
2.3.8室温干燥5min使乙醇尽量挥发干净；
[0196]
2.3.9加入25μl ddh2o，涡旋混匀，室温静置5min；
[0197]
2.3.10短暂离心，将离心管放在磁力架上5min；
[0198]
2.3.11转移23μl dna溶液至干净的标记好的pcr管中。
[0199]
3.第二步pcr：
[0200]
3.1试剂配制：pcr采用市售的pcr试剂盒，本实施例采用的试剂盒品牌为kapa，名称为2
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kapa hifi hotstart ready mix，货号为kk2602。在上一步产物的pcr管中按下表配制体系。
[0201][0202]
3.2扩增：扩增条件如下。
[0203][0204]
3.3纯化：纯化磁珠采用本公司自产磁珠。
[0205]
3.3.1磁珠充分混匀，取与pcr产物体积等体积的磁珠加入(例如：50μl pcr产物加入50μl磁珠)；
[0206]
3.3.2涡旋震荡，室温放置5min，使dna充分吸附在磁珠上；
[0207]
3.3.3短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置5min；
[0208]
3.3.4待溶液清亮，用枪头小心吸弃上清液，避免吸到磁珠；
[0209]
3.3.5加入180μl当天配置的80％乙醇漂洗，静置30sec；吸弃乙醇；
[0210]
3.3.6重复步骤3.5；
[0211]
3.3.7短暂离心，将离心管放置在磁力架上，用10μl枪头彻底将液体吸净；
[0212]
3.3.8室温干燥5min使乙醇尽量挥发干净；
[0213]
3.3.9加入20μl ddh2o，涡旋混匀，室温静置5min；
[0214]
3.3.10短暂离心，将离心管放在磁力架上5min；
[0215]
3.3.11转移18μl dna溶液至干净的标记好的pcr管中。
[0216]
3.3.12qubit测定浓度，将文库稀释至1.5ng/μl，进行测序。测序数据量每例样本0.1g。
[0217]
4.高通量测序
[0218]
高通量测序使用illumina novaseq高通量测序平台，按照测序仪标准操作规程进行测序。
[0219]
5.测序结果：
[0220]
1.基本统计：检测限样品的cfdna进行建库测序，进行基本统计，从下表结果上看，平均深度大于100000x(黄色标注)，结果符合检测需求。
[0221]
[0222]
[0223][0224]
2.检测限结果：
[0225]
位点exon15:c.1799t》a：llod(重复10次，检出率为90％)为0.03％；lloq(重复10次，检出率为100％)为0.05％。
[0226]
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参
照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。