用结合血小板糖蛋白IB(GPIB)α胞外结构域的化合物治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝细胞癌(HCC)的制作方法

用结合血小板糖蛋白ib(gpib)
α
胞外结构域的化合物治疗非酒精性脂肪性肝炎(nash)和肝细胞癌(hcc)
发明领域
1.本发明基于以下发现：化合物与血小板糖蛋白ib(gpib)α胞外结构域的特异性结合降低了非酒精性脂肪肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)的发生和进展，或与nafld或nash相关的病症或病况例如由nafld或nash发展的病症或病况(例如肝细胞癌)的发生和进展。本发明基于与gpib胞外结构域的特异性结合，优选通过削弱gpib-凝血酶相互作用，为nafld/nash和hcc患者提供新的治疗选择。本发明提供了用于鉴定适合治疗nafld/nash和hcc的化合物的医学治疗以及筛选方法。
2.描述
3.生活方式和饮食的改变大大增加了肥胖、超重和代谢综合征的发病率。超重和肥胖不仅是西方发达国家的问题。同时，发展中国家的儿童和成人也受到严重影响(anstee等人，2019)。最新的who报告预测，肥胖疾病的数量在未来二十年将翻两至三倍(stewart和wild，2014)。
4.肝脏是人体最重要的代谢器官，受到慢性高热量摄入、肥胖、久坐不动的生活方式和由此产生的病理学的严重影响。全球最常见的肝病非酒精性脂肪肝病(nafld)是超重/肥胖和代谢综合征的临床表现(图1)。nafld是一种慢性疾病，可以持续长达数十年。nafld的特征是主要的大囊泡性脂肪变性和肝脏代谢恶化，但不一定有明显的临床症状。目前，9000万美国人和4000万欧洲人患有nafld(ringelhan等人，2018；anstee等人，2019)。肥胖与癌症发病率之间的密切联系是众所周知的(calle和kaaks，2004)。事实上，相当多的nafld患者会发展非酒精性脂肪性肝炎(nash)(脂肪肝疾病的病理表现，其易患纤维化和肝细胞癌(hcc)(anstee等人，2019))或肝功能障碍。
5.在美国和欧洲，患有nafld和nash的人数正在稳步增加(loomba等人，2013；ringelhan等人，2018；anstee等人，2019)。因此，肥胖、脂肪变性和脂肪性肝炎作为导致肝功能障碍和hcc发病率增加的原因，是西方国家关注的主要原因(white等人，2012)。
6.到目前为止，慢性病毒感染(例如乙型和丙型肝炎病毒)一直是导致工业化国家肝功能障碍和hcc发展的最普遍的病因。然而，nafld患者的数量每天都在增加，因此nafld已成为发达国家和发展中国家最普遍的肝病。因此，hcc是美国患者增长率最高的癌症，并且欧洲已经观察到类似的趋势(anstee等人，2019)。
7.同时，没有有效的治疗方法来治疗nash，晚期nash诱导的hcc的治疗选择有限(villanueva等人，2014；ringelhan等人，2018；anstee等人，2019)。这主要是因为直到最近才了解触发这种慢性炎症/代谢性肝病的最重要机制。因此，迫切需要不会引起副作用的特定治疗方法。
8.在过去十年中，已经建立了几种模型来模拟nash和nash向hcc的转变。一方面，这些模型是由遗传驱动的，另一方面，这些模型是通过不同的饮食来源触发的(anstee等人，2019)。重要的是，迄今为止使用的大多数临床前模型(遗传和饮食)未能对疾病的慢性以及随nash发现的附带疾病(co-lateral disease)的伴随存在(2型糖尿病、腹部肥胖、nash相
关的肝脏病理学——代谢综合征的慢性存在)进行表型模拟。
9.此外，许多模型含有一方面诱导nash和hcc高发病率和快速疾病发展的遗传异常，这并不一定反映nash(发展缓慢并持续数十年的疾病)的病理生理动态。在c57bl/6小鼠中，nash可以通过甲硫氨酸/胆碱缺乏饮食(mcd)或胆碱缺乏饮食(cd)诱导，但不能单独通过高脂肪饮食(hfd)诱导(hebbard和george，2011)。然而，喂养mcd或cd的c57bl/6小鼠不会发展肥胖、代谢综合征或hcc，并且由于体重减轻(高达40％)或恶病质必须在几个月后停止饮食(hebbard和george，2011)。因此，这些短期方法无法概括在人类肝脏和可能的其他代谢器官中发现的nash诱导的长期后果。
10.由于缺乏合适的小鼠模型，因此导致nash和hcc的确切长期机制在很大程度上仍然未知。报道了nafld患者中必需的营养胆碱缺乏会加剧nafld和nash(guerrerio等人，2012)。此外，胆碱摄取不足的人在肝脂蛋白分泌、线粒体功能障碍引起的氧化损伤和er应激方面存在缺陷(corbin和zeisel，2012)。这些临床观察形成了本发明的基础(wolf等人，cancercell，2014)：发明人将胆碱缺乏与高脂肪饮食(cd-hfd)或西方饮食(wd)(高脂肪；果糖；胆固醇)结合12个月，从而在c57bl/6小鼠中建立模型，导致代谢综合征、慢性nash和nash驱动的hcc。使用关于免疫细胞在实验性诱导的nash中的作用的短期体内实验，曾经公开了矛盾的结果(martin-murphy等人，2014；lynch等人，2012；bhattacharjee等人，2014)。相比之下，最近的数据首次表明，基于导致c57bl/6小鼠中代谢综合征的长期cd-hfd或wd，免疫细胞在触发脂肪变性、nash和nash驱动的hcc中发挥重要作用(wolf等人，cancercell，2014)(mahlemir等人，nature medicine 2019；通过引用整体并入本文，特别是其中图6所示的描述和结果)。
11.因此，本发明的一个目的是为nafld/nash和最终的hcc患者提供新的治疗选择。
12.发明概述
13.一般而言，通过简要说明，本发明的主要方面可以描述如下：
14.在第一方面，本发明涉及一种化合物，其用于治疗非酒精性脂肪肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)或与nafld或nash相关的病症或病况，例如从nafld或nash发展的病症或病况(例如肝细胞癌)，其中该化合物特异性结合血小板糖蛋白ib(gpib)的胞外结构域。
15.在第二方面，本发明涉及包含根据第一方面的化合物的药物组合物。
16.在第三方面，本发明涉及用于生产抗体、抗体样分子或其抗原结合片段的方法，包括以下步骤：用肽免疫非人动物，其中所述肽包含gpib的胞外结构序列域的序列，或由gpib的胞外结构域的序列组成，并且从该免疫的哺乳动物中分离出表达这种抗体、抗体样分子或其抗原结合片段的免疫细胞。
17.在第四方面，本发明涉及鉴定适合治疗非酒精性脂肪肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)或与nafld或nash相关的病症或病况例如从nafld或nash发展的病症或病况的化合物的方法，该方法包括以下步骤
18.(a)提供(x)表达gpib或gpib变体的蛋白质或mrna的第一细胞，或提供(y)包含gpib或gpib变体的胞外结构域，或(基本上)由gpib或gpib变体的胞外结构域组成的第一测试蛋白质，
19.(b)提供候选化合物，
20.(c)使第一细胞或第一测试蛋白质与候选化合物接触，和
21.(d)在步骤(c)之后确定以下一项或两项：
22.(i)候选化合物与第一细胞或第一测试蛋白质的结合；和/或
23.(ii)候选化合物与第一细胞或第一测试蛋白质的结合，其中该结合与凝血酶蛋白质竞争；
24.其中(i)中的结合或(ii)中的竞争性结合表明候选化合物适用于治疗非酒精性脂肪肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)，或与nafld或nash相关的病症或病况，例如从nafld或nash发展的病症或病况。
25.在第五方面，本发明涉及用于治疗非酒精性脂肪肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)，或与nafld或nash相关的病症或病况例如从nafld或nash发展的病症或病况的方法，其中该治疗包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的与血小板糖蛋白ib(gpib)的胞外结构域特异性结合的化合物的步骤。
26.发明详述
27.在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与特定实施方案一起列出，然而，应该理解它们可以以任何方式和任何数量组合以创建额外的实施方案。各种描述的示例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持和涵盖将两个或更多个明确描述的实施方案组合或将一个或多个明确描述的实施方案与任何数量的公开和/或优选的要素组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本技术中所有描述的要素的任何排列和组合都应该被认为是由本技术的描述所公开的。
28.如本文所用，术语“[本]发明”、“依据本发明”、“根据本发明”等旨在指代本文所描述和/或所主张的本发明的所有方面和实施方案。
[0029]
如本文所用，术语“包含”应被解释为涵盖“包括”和“由
……
组成”，这两种含义是根据本发明特别预期的以及因此单独公开的实施方案。在本文中使用时，“和/或”将被视为对两个指定特征或组件中的每一个与另一个或不与另一个一起的具体公开。例如，“a和/或b”将被视为对(i)a、(ii)b和(iii)a和b中的每一个的具体公开，就好像每一个在本文中单独列出。在本发明的上下文中，术语“大约”和“接近”表示本领域技术人员将理解以仍然确保所讨论的特征的技术效果的精度区间。该术语通常指示与指示数值
±
20％、
±
15％、
±
10％，例如
±
5％的偏差。如普通技术人员将理解的，对于给定技术效果的数值的具体这种偏差将取决于技术效果的性质。例如，自然或生物技术效果通常比人造或工程技术效果具有更大的偏差。如普通技术人员将理解的，对于给定技术效果的数值的具体这种偏差将取决于技术效果的性质。例如，自然或生物技术效果通常会比人造或工程技术效果具有更大的偏差。指单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“一”、“一个”或“该”，这包括该名词的复数形式，除非另有明确说明。
[0030]
应当理解，鉴于本文包含的教导，将本发明的教导应用于特定问题或环境，以及包括本发明的变体或对其的附加特征(例如进一步的方面和实施方案)，将在本领域普通技术人员的能力范围内。
[0031]
除非上下文另有说明，否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。
[0032]
本文引用的所有参考文献、专利和出版物均通过引用整体并入本文。
[0033]
在第一方面，本发明涉及用于治疗非酒精性脂肪肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)或与nafld或nash相关的病症或病况例如从nafld或nash发展的病症或病况(如肝细胞癌)的化合物，其中该化合物特异性结合血小板糖蛋白ib(gpib)的胞外结构域。
[0034]
因此，本发明特别涉及通过各种化合物结合gpib胞外结构域的医学应用，用于治疗肝病症，例如nafld、nash和/或hcc。在该第一方面，应当理解，诸如“用于治疗的化合物”等短语同样公开了相应的“用于通过使用化合物治疗病症的方法”和“化合物在制造用于治疗病症的药物中的用途”。
[0035]
因此，本发明在第一方面还涉及用于治疗非酒精性脂肪肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)或与nafld或nash相关的病症或病况，例如从nafld或nash发展的病症或病况(例如肝细胞癌)的化合物，其中该化合物是血小板糖蛋白ib(gpib)(α)与凝血酶、优选与α-凝血酶的结合/相互作用的调节剂。
[0036]
术语“血小板糖蛋白ib(gpib)”应通常是指在血小板上发现的膜定位的糖蛋白。优选的是血小板糖蛋白ib(gpib)α链(gpibα)，最优选人gpibα。人gpibα是一种由位于17p13.2染色体上的基因糖蛋白ib血小板亚基α表达的蛋白质。该基因可见于登录号hgnc:4439(欧洲生物信息学研究所的hugo基因命名委员会；https://www.genenames.org/)。gpibα的蛋白质显示为seq id no:1中的氨基酸序列，并且可以在uniprot数据库中以登录号p07359鉴定(https://www.uniprot.org/uniprot/p07359；nucleicacidsres.47:d506-515(2019年))。
[0037]
此外，本发明上下文中的术语“血小板糖蛋白ib(gpib)”可以指人gpibα的变体或片段。这样的变体或片段可以是人gpibα的直系同源物(ortholog)、同系物(homolog)或旁系同源物(paralog)。或者，此类变体或片段是具有与人gpibα的胞外结构域序列(优选人gpibα的全长蛋白质)具有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列的蛋白质。gpib的片段优选是这样的蛋白质，其包含gpib的胞外结构域，优选人gpibα的胞外结构域，但缺乏蛋白质的任何跨膜或细胞内部分。最优选地，gpib的片段保留结合凝血酶的功能，或至少包含与凝血酶的结合位点，或相邻的蛋白质序列(与该结合位点相邻10、20、50、100或200个氨基酸)。在一些实施方案中，gpib的变体是这样的蛋白质，其是(i)gpib的凝血酶结合片段，和/或(ii)具有与seq id no：1所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的蛋白质。
[0038]
本发明在第一方面还提供了通过干扰凝血酶与gpibα结合来治疗nafld、nash和/或hcc的化合物和方法。此类化合物和组合物优选地例如通过特异性结合其胞外结构域并由此削弱凝血酶与gpibα的结合而直接靶向gpibα。然而，在一些实施方案中，本发明在本文公开的所有方面和实施方案中都排除了与凝血酶或α-凝血酶特异性结合的化合物。
[0039]
如本文所用，术语“凝血酶”是指将可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白链并催化许多其他凝血相关反应的丝氨酸蛋白酶。除非另有说明，否则该术语不是物种特异的。该术语涵盖α-凝血酶(它是凝血酶的天然形式)以及γ-凝血酶(一种由α-凝血酶产生的保留了大部分的血小板活化能力的非凝血衍生物)。
[0040]
术语“gpib的胞外结构域”蛋白是指gpib蛋白的暴露在细胞的脂质双层的细胞质侧的部分，优选为包含这种gpib蛋白的血小板。确定蛋白质胞外结构域的方法是本领域已知的(singer(1990)；high等人(1993)，和mcvector软件，oxford molecular)。gpibα的胞外
结构域是众所周知的。在人类蛋白质中，蛋白质的n末端位于细胞外，而c末端尾部位于细胞质中。跨膜区最有可能位于氨基酸532-552之间(优选不包括信号肽)。因此，本发明上下文中gpib的胞外结构域优选包含位于人gpibα的前531个连续n-末端氨基酸中的区域。这种胞外结构域还包括富含亮氨酸的重复结构域，其是根据本文公开的发明所靶向的优选结构域。因此，根据本发明使用的化合物特异性结合gpib胞外结构域中包含富含亮氨酸重复序列的结构域。胞外结构域优选地至少包含至少100、优选地至少200并且最优选地至少290个gpib的n-末端的连续氨基酸，并且优选从n-末端开始。
[0041]
在一些实施方案中，本发明涉及根据所公开的医学应用使用的化合物，其中所述化合物特异性结合gpib的外部位点i和/或ii。
[0042]
在本发明的特别优选的实施方案中，结合gpib胞外结构域的化合物与凝血酶优选α-凝血酶竞争结合gpib的胞外结构域。通过竞争性结合，该化合物因此削弱了gpib和凝血酶之间的正常相互作用。然而，本发明还包括本发明化合物削弱凝血酶-gpib相互作用的其他机制。
[0043]
在另一个实施方案中，与gpib的胞外结构域结合的化合物不与血管性血友病因子(von willebrandt factor，vwf)、p-选择蛋白、mac-1、凝血因子xi和/或凝血因子xii竞争结合gpib的胞外结构域。因此，本发明的化合物优选不影响或削弱此类gpib配体，也不影响它们的生物学途径或作用。
[0044]
如本文所用，术语“非酒精性脂肪肝病”或“nafld”是指在肝细胞中具有共同脂肪累积的一组病况，nafld的范围从单纯性脂肪肝(脂肪变性)到非酒精性脂肪性肝炎(nash)到肝硬化(不可逆的晚期肝脏瘢痕形成)。术语“nafld”包括疾病进展的任何阶段或程度。
[0045]
如本文所用，术语“非酒精性脂肪性肝炎”或“nash”涉及重要形式的慢性肝病，其特征在于与饮酒无关的肝脏的炎性和脂肪浸润。
[0046]
在本发明的上下文中，术语“与nafld或nash相关的病症或病况”应是在病理上直接受nafld或nash影响(affect)或影响(influence)的任何病症或病况。优选地，该术语包括从nafld或nash发展的病症或病况，意指此类病症或病况是由进展中的例如未治疗的nafld或nash引起的。优选的实例是肝硬化或肝细胞癌(hcc)。
[0047]
如本文所用，术语“肝细胞癌”或“hcc”是指最常见的肝癌类型，也称为恶性肝细胞瘤。hcc可能有许多不同的原因，但在本发明的一些优选实施方案中，肝病的根本原因是非酒精性脂肪肝病(nafld)。nafld是西方工业化国家最常见的肝脏病症。它被认为是代谢综合征的肝脏表现。因此，nafld倾向于在超重或肥胖和/或患有糖尿病、高胆固醇或高甘油三酯的人群中发展。对于大多数人来说，nafld不会引起任何体征和症状，也不会有并发症。但在一些患有nafld的人中，累积在肝脏中的脂肪会导致肝脏炎症和瘢痕形成，这被认为会导致纤维化和肝硬化。这种更严重的nafld形式有时被称为非酒精性脂肪性肝炎(nash)。值得注意的是，代谢综合征和2型糖尿病已被证明是hcc的独立危险因素——患有此类危险因素的患者是根据本发明的待治疗的优选患者，因为优选地治疗还包括使用本发明的化合物和方法的预防性治疗来避免或减少发展nafld/nash和/或hcc的机会。
[0048]
本发明上下文中的治疗包括预防性治疗，以减少例如在患有疾病危险因素的患者中发展病症的机会。然而，优选地，本发明的治疗是减轻或减少nash和/或hcc的进展或其症状或并发症。处于发展nash风险的受试者是例如并且优选为糖尿病患者、肥胖患者或者患
有代谢综合征或另一种代谢紊乱的患者。
[0049]
在一些实施方案中优选的是，本发明的治疗是减少、停滞或逆转nafld/nash进展为肝硬化，优选减少、停滞或逆转nash进展为肝细胞癌(hcc)。进一步优选的是，该治疗是在有发展肝硬化和/或hcc风险的nash患者中预防hcc。
[0050]
在本发明的一些优选实施方案中，待治疗的受试者不患有选自酒精性肝损伤、药物诱导的肝损伤、慢性活动性肝炎、肝脂肪变性和肝细胞凋亡的组的病况，并且优选其中患者患有炎症的脂肪肝。
[0051]
如上所述，在本发明的上下文中令人惊讶地发现gpib的胞外结构域涉及nafld特别是nash的发展或进展。众所周知，gpib具有多种生物学功能，可以结合许多不同的配体。然而，本发明特异地将凝血酶与gpib的相互作用鉴定为nafld/nash和hcc病理学的关键靶标。因此，如所附实施例所支持的，本发明提供了用于削弱这种相互作用的手段，作为用于治疗和预防所指示病症的新治疗策略。
[0052]
在本发明的一些实施方案中，该化合物结合凝血酶结合位点，优选结合α-凝血酶结合位点，其中所述结合位点位于gpib的胞外结构域内；和/或其中所述化合物结合gpib的胞外结构域，使得在化合物和gpib之间结合后，凝血酶(例如α-凝血酶)与gpib的进一步结合被减少或削弱，例如通过空间阻碍gpib-凝血酶相互作用和/或通过改变gpib的3维构象。
[0053]
优选地，根据本发明使用的化合物是一种化合物，其特征在于它，优选地当与gpib的胞外结构域结合时，减少血小板向肝脏的运输，和/或减少血小板与kupffer细胞的相互作用，和/或减少血小板聚集体大小，和/或减少血小板面积，和/或减少血小板-内皮覆盖。
[0054]
此外，根据本发明使用的化合物的特征在于，在一些备选或另外的实施方案中，该化合物，优选地当施用于nafld/nash/hcc患者时，具有以下活性/作用或特征中的一种或多种或其组合：
[0055]
·
降低施用该化合物的受试者的血清胆固醇、肝脏甘油三酯、血清alt和/或ast水平；和/或
[0056]
·
降低施用该化合物的受试者的血清ldl-和/或hdl-胆固醇；和/或
[0057]
·
防止施用该化合物的受试者中脂质代谢相关基因的mrna表达失调；和/或
[0058]
·
减轻施用该化合物的受试者的肝损害；和/或
[0059]
·
减少肝内cd8 t细胞和/或nkt细胞；和/或
[0060]
·
减少肝内中性粒细胞累积和/或巨噬细胞流入/活化；和/或
[0061]
·
降低几种促炎和稳态细胞因子/趋化因子的蛋白质表达；和/或
[0062]
·
减少脂质累积；
[0063]
或优选：
[0064]
·
减少肝内血小板累积，和/或
[0065]
·
减少肝内炎症，和/或减少肝内免疫细胞浸润，和/或
[0066]
·
减少脂肪变性，和/或
[0067]
·
减少肝脏体积，和/或
[0068]
·
降低肝脏甘油三酯，和/或
[0069]
·
减少肝损害，和/或
[0070]
·
减少nas，和/或
[0071]
·
减缓(dampen)肝纤维化。
[0072]
与gpib蛋白或gpib蛋白变体的胞外结构域特异性结合的化合物优选为蛋白结合化合物(pbc)，优选为抗原结合蛋白(abp)。
[0073]
如本文所用，术语“特异性结合gpib的胞外结构域”是指通过elisa测量的化合物与相应抗原(靶)或抗原表达细胞的结合，其中所述elisa优选包括包被相应抗原(gpib的胞外结构域)至固相支持物，在允许与相应抗原或蛋白质形成复合物的条件下添加所述化合物，通过使用与根据本发明的化合物结合的二抗并使用过氧化物酶介导的显色作为非限制性实例测量光密度值(od)来检测所述复合物。
[0074]
根据本发明的术语“抗原”是指用于免疫的抗原或包含所述抗原作为其蛋白质序列的一部分的蛋白质。例如，为了免疫，可以使用蛋白质的细胞外结构域的片段(例如前20个氨基酸)，并且为了检测/测定等，可以使用蛋白质的细胞外结构域或全长蛋白质。
[0075]
本发明的这种结合化合物优选是多肽、肽、糖蛋白、肽模拟物、抗原结合构建体(例如，抗体、抗体样分子(例如纳米抗体)或其他抗原结合衍生物，或其抗原结合片段)、核酸例如dna或rna，例如核酶或rna或dna适体，包括其变体或衍生物例如肽核酸(pna)，或者是小分子化合物。
[0076]
优选地，该化合物是结合所述gpib的胞外结构域或所述gpib变体的胞外结构域的抗原结合构建体(例如，抗体、纳米抗体、scfv、fab、抗体样分子或其他抗原结合衍生物，或其抗原结合片段)。
[0077]
在特定实施方案中，本发明的化合物可以是抗体或其抗原结合片段或衍生物。
[0078]
如本文所用，术语“抗体”可以在最广义上理解为能够与其表位结合的任何免疫球蛋白(ig)。抗体本身是一种abp。全长“抗体”或“免疫球蛋白”通常是约150kda的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链和两条相同的重链组成。每条轻链通过一个共价二硫键连接到重链，而二硫键的数量在不同免疫球蛋白同种型的重链之间有所不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链都有氨基末端可变结构域(vh)，后跟三个羧基末端恒定结构域(ch)。每条轻链都有可变的n端结构域(vl)和单个的c端恒定结构域(cl)。vh和vl区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，散布着更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与细胞或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(clq))的结合。其他形式的抗体包括重链抗体，即仅由两条重链组成且缺少抗体中常见的两条轻链的抗体。重链抗体包括诸如单峰骆驼、骆驼、美洲驼和羊驼等骆驼科动物的hcigg(igg样)抗体，以及软骨鱼类(例如鲨鱼)的ignar抗体。还有其他形式的抗体包括单结构域抗体(sdab，被开发者ablynx称为nanobody)是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。单结构域抗体通常由重链抗体产生，但也可源自常规抗体。
[0079]
抗体(或可从中分离其片段的那些)可以包括，例如，具有双重或多重抗原或表位特异性的嵌合、人源化、(完全)人或杂合抗体、抗体片段和抗体亚片段，例如，fab、fab'或f(ab')2片段、单链抗体(scfv)等(如下所述)，包括任何免疫球蛋白或任何天然、合成或基因工程蛋白质的杂合片段，其作用类似于抗体与特异性抗原结合以形成复合物。
[0080]
因此，在某些实施方案中，本发明的化合物可以包含抗体重链，或其抗原结合片
段，和/或抗体轻链，或其抗原结合片段。
[0081]
术语“纳米抗体”(或vhh，hamers-casterman等人，1993)表示单链多肽，其主要由由四个fr结构域(对于框架区)分开的三个cdr(互补决定区cdr1、cdr2和cdr3)组成，并且基本上没有轻链或恒定结构域。术语“纳米抗体”、“纳米抗体”、“vhh”、“vhh抗体片段”或“单结构域抗体”可互换使用。纳米抗体通常具有以下结构：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。优选地，本发明的纳米抗体是通过重组或化学技术产生的合成分子。纳米抗体呈现高表位特异性和亲和力。它们比传统的igg分子小约十倍。它们是单链多肽，非常稳定，可抵抗极端ph值和温度条件。此外，它们可以抵抗蛋白酶的作用。在本发明的一些实施方案中，作为特异性结合gpib胞外结构域的化合物的纳米抗体是优选的。优选地，根据本发明的纳米抗体从羊驼获得。
[0082]
在优选的一些实施方案中，本发明的化合物，优选其中所述化合物是抗体或纳米抗体，或其抗原结合片段或衍生物，与已知的抗gpibα抗体pop/b竞争，如kleinschnitz等人所公开的(circulation vol.115，第2323-2330页(2007))。在其他优选的实施方案中，本发明的化合物是抗gpibα抗体pop/b，或其抗原结合片段，优选如本文所定义。
[0083]
在可能优选的一些进一步的实施方案中，本发明的化合物，优选其中所述化合物是抗体或纳米抗体，或其抗原结合片段或衍生物，不是或不包含已知的抗gpibα抗体pop/b，如kleinschnitz等人所公开的(circulation vol.115第2323-2330页(2007))，或不包含其抗原结合片段，例如此类抗体的可变结构域重链和/或轻链序列。
[0084]
在第二方面，本发明涉及包含根据第一方面的化合物的药物组合物。优选地，本发明的药物组合物用于根据第一方面的用途。此外，本发明的药物组合物优选进一步包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0085]
如本文所用，语言“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、增溶剂、填充剂、稳定剂、粘合剂、吸收剂、碱、缓冲剂、润滑剂、控释载体、稀释剂、乳化剂、湿润剂、润滑剂、分散介质、涂层、抗菌剂或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。用于药物活性物质的此类介质和试剂的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在组合物中的用途。补充剂也可以掺入组合物中。在某些实施方案中，药学上可接受的载体包括血清白蛋白。
[0086]
本发明的药物组合物被配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如鞘内、动脉内、静脉内、皮内、皮下、口服、经皮(局部)和经粘膜施用。最优选地，施用途径是直接靶向待治疗受试者的肝脏的途径。
[0087]
在治疗应用中，向已经患有如所述的nafld、nash或hcc的患者施用组合物，其量足以治愈或至少部分地停止疾病及其并发症的症状。药物组合物的合适剂量很容易根据几种公认的方案中的任何一种来确定。例如，动物研究(例如对小鼠或大鼠)通常用于确定每千克体重生物活性剂的最大可耐受剂量。通常，至少一种测试的动物物种是哺乳动物。动物研究的结果可以外推以确定用于其他物种(例如人类)的剂量。什么构成有效剂量还取决于病症或病况的性质和严重程度，以及患者健康的一般状态。
[0088]
在预防性应用中，将含有例如与gpib胞外结构域特异性结合的化合物的组合物施用于易患肝病或处于肝病风险中的患者。这样的量被定义为“预防有效”的量或剂量。在这种使用中，精确的量取决于患者的健康状况和体重。
[0089]
在治疗性和预防性治疗中，包含在药物组合物中的拮抗剂可以以数个剂量或作为单剂量施用，直到达到所需的反应。通常监测治疗并且可以根据需要给予重复剂量。每当需要削弱凝血酶与gpib的相互作用时，本发明的化合物可以根据建立的剂量方案施用。
[0090]
产品的每日剂量可在每个成人每天0.01至1,000mg的宽范围内变化。优选地，该组合物含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg的活性成分，用于对待治疗患者进行剂量的症状调整。药物通常含有约0.01mg至约500mg的活性成分，优选1mg至约100mg的活性成分。通常以每天0.0002mg/kg至约20mg/kg体重，特别是每天约0.001mg/kg至10mg/kg体重的剂量水平提供有效量的药物。然而，应当理解，任何特定患者的具体剂量水平和剂量频率可以变化，并取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、代谢稳定性和该化合物的作用长度、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用方式和时间、排泄率、药物组合、特定病况的严重程度以及接受治疗的宿主。
[0091]
在本发明的用于口服、舌下、皮下、肌内、静脉内、经皮、局部或直肠施用的药物组合物中，活性成分(单独或与另一种活性成分组合)可作为与常规药物支持的混合物以单位施用形式施用至动物和人。合适的单位施用形式包括口服途径形式，例如片剂、凝胶胶囊、粉剂、颗粒剂和口服混悬剂或溶液、舌下和含服施用形式、气雾剂、植入物、皮下、透皮、局部、腹膜内、肌内、静脉内、皮下、透皮、鞘内和鼻内施用形式和直肠施用形式。
[0092]
施用的适当单位形式包括口服施用的形式，例如片剂、明胶胶囊、粉剂、颗粒剂和口服溶液或悬浮液，舌下和含服施用的形式，气雾剂、植入物、皮下形式、肌内、静脉内、鼻内或眼内施用和直肠施用形式。
[0093]
在本发明的药物组合物中，活性成分通常被配制成每剂量单位含有0.5至1000mg，优选1至500mg，更优选2至200mg的所述活性成分的剂量单位，用于每日施用。
[0094]
当制备片剂形式的固体组合物时，可以将润湿剂如十二烷基硫酸钠添加到任选微粉化的活性成分中，然后将其与药物载体如二氧化硅、明胶、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石粉、阿拉伯树胶等混合。片剂可以用蔗糖、各种聚合物或其他合适的物质包衣，或者它们可以被处理以具有延长或延迟的活性并连续释放预定量的活性成分。
[0095]
明胶胶囊形式的制剂通过将活性成分与稀释剂如二醇或甘油酯混合并将获得的混合物倒入软或硬明胶胶囊中而获得。
[0096]
糖浆或酏剂形式的制剂可以包含活性成分以及甜味剂(优选不含卡路里)、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、调味剂和适当的颜色。
[0097]
水分散性粉剂或颗粒剂可以含有与分散剂或润湿剂或悬浮剂如聚乙烯吡咯烷酮以及甜味剂或调味剂混合的活性成分。
[0098]
使用在直肠温度下熔化的粘合剂例如可可脂或聚乙二醇制备的栓剂进行直肠施用。
[0099]
使用含有药理学相容的分散剂和/或润湿剂，例如丙二醇、丁二醇或聚乙二醇的水性悬浮液、等渗盐水溶液或无菌和可注射溶液进行肠胃外、鼻内或眼内施用。
[0100]
因此，共溶剂，例如醇如乙醇或二醇如聚乙二醇或丙二醇，以及亲水表面活性剂如吐温rtm80可以用于制备可通过静脉途径注射的水溶液。活性成分可以通过甘油三酯或甘油酯溶解以制备可通过肌肉途径注射的油性溶液。
[0101]
使用其中活性成分为醇溶液形式的多层贴片或储库(reservoir)来实现透皮施
用。
[0102]
使用含有例如脱水山梨糖醇三油酸酯或油酸以及三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或任何其他生物相容的推进剂气体的气雾剂来实现通过吸入施用。
[0103]
活性成分也可以配制成微胶囊或微球，任选地与一种或多种载体或添加剂一起。
[0104]
在可用于慢性治疗的延长释放形式中，可以使用植入物。这些可以制备成油性悬浮液形式或在等渗介质中微球的悬浮液形式。
[0105]
在第三方面，本发明涉及生产抗体、抗体样分子或其抗原结合片段的方法，包括以下步骤：用肽免疫非人类动物，其中所述肽包含gpib的胞外结构域序列，或由gpib的胞外结构域序列组成，并从免疫的哺乳动物中分离出表达这种抗体、抗体样分子或其抗原结合片段的免疫细胞。
[0106]
优选地，gpib和/或其胞外结构域如上文对于本发明的第一方面所定义。
[0107]
因此，在特定的方面，本发明还涉及用于鉴定、产生和/或生产(例如，特异性地)结合gpib的胞外结构域或其变体或片段/表位的abp的方法，该方法包括使用这种结构域(或变体或片段/表位)(i)以筛选多个abp的展示文库(例如噬菌体展示文库)；(ii)以免疫动物，特别是哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、山羊、骆驼或美洲驼)。
[0108]
尤其在这样的实施方案中，筛选展示多个abp的展示文库(例如，噬菌体展示文库)，其中，优选地，针对结合这种蛋白质的abp筛选这种文库。
[0109]
在优选的实施方案中，免疫动物包括向动物施用免疫组合物的步骤，其中该免疫组合物包含gpib的胞外结构域或其变体或其至少一个或多个表位或包含在其中的至少一个或多个表位(例如，作为蛋白质或作为编码这种结构域或其表位的核酸)，并且任选地与药学上可接受的载体和/或赋形剂一起，更优选地，这种免疫组合物包含一种或多种佐剂。根据本发明的免疫组合物在免疫动物中引发对gpib的胞外结构域(或其变体)特异的免疫反应，优选通过产生针对这种蛋白质的抗体。免疫后，本发明的某些此类实施方案可以包括从动物分离以下各项的进一步的步骤：(i)包含特异性结合所述gpib的胞外结构域(或其变体)的abp的血清；和/或(ii)表达与igsf11(或其变体)的所述结构域特异性结合的abp的b细胞。
[0110]
在任何此类方法或使用方面中，用于医学的abp通常是(并且例如如本文别处进一步详细描述的)：
[0111]
替代地或另外地，在任何此类方法或使用方面中，abp(并且例如如本文别处进一步详细描述的)：
[0112]
·
降低施用该化合物的受试者的血清胆固醇、肝脏甘油三酯、血清alt和/或ast水平；和/或
[0113]
·
降低施用该化合物的受试者的血清ldl-和/或血清hdl-胆固醇；和/或
[0114]
·
防止施用该化合物的受试者中脂质代谢相关基因的mrna表达失调；和/或
[0115]
·
减轻施用该化合物的受试者的肝损害；和/或
[0116]
·
减少肝内cd8 t细胞和/或nkt细胞；和/或
[0117]
·
减少肝内中性粒细胞累积和/或巨噬细胞流入/活化；和/或
[0118]
·
降低几种促炎和稳态细胞因子/趋化因子的蛋白质表达；和/或
[0119]
·
减少脂质累积；
[0120]
在任何此类方面(并且例如如本文别处进一步详细描述的)中，abp可以是抗体或纳米抗体，或其抗原结合片段。特别地，抗体/纳米抗体可以是单克隆抗体，或者其中抗原结合片段可以是单克隆抗体的片段。例如，这样的抗体可以是人抗体、人源化抗体或嵌合人抗体，或者抗原结合片段可以是人抗体、人源化抗体或嵌合人抗体的片段。
[0121]
在第四个方面，本发明涉及鉴定适合治疗非酒精性脂肪肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)或与nafld或nash相关的病症或病况，例如从nafld或nash发展的病症或病况的化合物的方法，该方法包括以下步骤
[0122]
(a)提供(x)表达gpib或gpib变体的蛋白质或mrna的第一细胞，或提供(y)包含gpib或gpib变体的胞外结构域，或(基本上)由gpib或gpib变体的胞外结构域组成的第一测试蛋白质，
[0123]
(b)提供候选化合物，
[0124]
(c)使第一细胞或第一测试蛋白质与候选化合物接触，和
[0125]
(d)在步骤(c)之后确定以下一项或两项：
[0126]
(i)候选化合物与第一细胞或第一测试蛋白质的结合；和/或
[0127]
(ii)候选化合物与第一细胞或第一测试蛋白质的结合，其中该结合与凝血酶蛋白质竞争；
[0128]
其中(i)中的结合或(ii)中的竞争性结合表明候选化合物适用于治疗非酒精性脂肪肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)，或与nafld或nash相关的病症或病况，例如从nafld或nash发展的病症或病况。
[0129]
在优选的实施方案中，第一细胞是血小板。
[0130]
在一些实施方案中，候选化合物与第一细胞或第一测试蛋白质的结合是候选化合物与gpib的胞外结构域之间的相互作用，优选是与凝血酶结合位点的结合，优选是与α-凝血酶结合位点的结合，其中所述结合位点位于gpib的胞外结构域内；和/或其中所述候选化合物结合gpib的胞外结构域，使得在化合物和gpib之间结合后，凝血酶(例如α-凝血酶)与gpib的进一步结合被减少或削弱，例如通过空间阻碍gpib-凝血酶相互作用和/或通过改变gpib的3维构象。
[0131]
在第五个方面，本发明涉及用于治疗非酒精性脂肪肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)，或与nafld或nash相关的病症或病况，例如从nafld或nash发展的病症或病况的方法，其中所述治疗包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的与血小板糖蛋白ib(gpib)的胞外结构域特异性结合的化合物的步骤。优选地，其中所述化合物如上文所公开。
[0132]
鉴于上述情况，应当理解，本发明还涉及以下逐项实施方案：
[0133]
项1：化合物，其用于治疗非酒精性脂肪肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)或与nafld或nash相关的病症或病况，例如由nafld或nash发展的病症或病况(例如肝细胞癌)，其中该化合物特异性结合血小板糖蛋白ib(gpib)的胞外结构域。
[0134]
项2：根据项1使用的化合物，其中该化合物结合凝血酶结合位点，优选结合α-凝血酶结合位点，其中所述结合位点位于gpib的胞外结构域内；和/或其中所述化合物结合gpib的胞外结构域，使得在化合物和gpib之间结合后，凝血酶(例如α-凝血酶)与gpib的进一步结合被减少或削弱，例如通过空间阻碍gpib-凝血酶相互作用和/或通过改变gpib的3维构象。
[0135]
项3：根据项1或2使用的化合物，其中该化合物减少血小板向肝脏的运输，和/或减少血小板与kupffer细胞的相互作用，和/或减少血小板聚集体大小，和/或减少血小板面积，和/或减少血小板内皮覆盖。
[0136]
项4：根据项1至3中任一项使用的化合物，其中该化合物
[0137]
(a)降低施用该化合物的受试者的血清胆固醇、肝脏甘油三酯、血清alt和/或ast水平；和/或
[0138]
(b)降低施用该化合物的受试者的血清ldl-和/或血清hdl-胆固醇；和/或
[0139]
(c)防止施用该化合物的受试者中脂质代谢相关基因的mrna表达失调；和/或
[0140]
(d)减轻施用该化合物的受试者的肝损伤；和/或
[0141]
(e)减少肝内cd8 t细胞和/或nkt细胞；和/或
[0142]
(f)减少肝内中性粒细胞累积和/或巨噬细胞流入/激活；和/或
[0143]
(g)降低几种促炎和稳态细胞因子/趋化因子的蛋白质表达；和/或
[0144]
(h)减少脂质累积。
[0145]
项5：根据项1或4中任一项使用的化合物，其中该化合物特异性结合gpib的胞外结构域中的含有富含亮氨酸重复序列的结构域。
[0146]
项6：根据项1至5中任一项使用的化合物，其中gpib为gpibα链(gpibα)。
[0147]
项7：根据项1至6中任一项使用的化合物，其中gpib是人gpib或其变体，并且优选其中人gpib包含seq id no：1所示的氨基酸序列(uniprot ref：p07359)。
[0148]
项8：根据项7使用的化合物，其中gpib的变体是(i)gpib的凝血酶结合片段，和/或(ii)具有与seq id no:1中所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的蛋白质。
[0149]
项9：根据项1至8中任一项使用的化合物，其中该化合物与gpib的外部位点i和/或ii特异性结合。
[0150]
项10：根据项1至9中任一项使用的化合物，其中该胞外结构域至少包含gpib的n末端的至少100个、优选至少200个、最优选至少290个连续氨基酸，并且优选以gpib的n端开始。
[0151]
项11：根据项1至10中任一项使用的化合物，其中该化合物与凝血酶，优选α-凝血酶竞争结合gpib的胞外结构域。
[0152]
项12：根据项1至11中任一项使用的化合物，其中该化合物不与血管性血友病因子(vwf)、p-选择蛋白、mac-1、凝血因子xi和/或凝血因子xii竞争。
[0153]
项13：根据项1至12中任一项使用的化合物，其中该化合物在施用于nafld/nash/hcc患者时具有以下作用中的任何一种或组合：
[0154]
(a)减少肝内血小板累积，
[0155]
(b)减少肝内炎症，和/或减少肝内免疫细胞浸润，
[0156]
(c)减少脂肪变性，
[0157]
(d)减少肝脏体积，
[0158]
(e)降低肝脏甘油三酯，
[0159]
(f)减少肝损害，
[0160]
(g)减少nas，和/或
[0161]
(h)减缓肝纤维化。
[0162]
项14：根据项1至13中任一项使用的化合物，其中该化合物与pop/b-抗体或其抗原结合片段竞争结合gpib。
[0163]
项15：根据项1至14中任一项使用的化合物，其中该化合物选自蛋白质结合化合物(pbc)，优选抗原结合蛋白(abp)，并且可以是多肽、肽、糖蛋白、肽模拟物、抗原结合构建体(例如，抗体、抗体样分子(例如纳米抗体)或其他抗原结合衍生物，或其抗原结合片段)，核酸例如dna或rna，例如核酶或rna或dna适体，包括其变体或衍生物，例如肽核酸(pna)，或者是小分子化合物。
[0164]
项16：根据项1至15中任一项使用的化合物，其中该化合物是抗原结合构建体(例如，抗体、纳米抗体、scfv、fab、抗体样分子或其他抗原结合衍生物，或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合构建体结合所述gpib的胞外结构域，或所述gpib的变体的胞外结构域。
[0165]
项17：根据项1至16中任一项使用的抑制剂，其中所述治疗是缓解或减少nash和/或hcc的进展。
[0166]
项18：根据项1至17中任一项使用的化合物，其中所述治疗是减少、停滞或逆转nafld/nash进展为肝硬化，优选减少、停滞或逆转nash进展为肝细胞癌(hcc)。
[0167]
项19：根据项1至18中任一项使用的化合物，其中所述治疗是在有发展成肝硬化和/或hcc风险的nash患者中预防hcc。
[0168]
项20：根据项1至19中任一项使用的化合物，其中所述治疗是在有发展nash风险的患者中进行的，例如糖尿病患者、肥胖患者或者患有代谢综合征或另一种代谢紊乱的患者。
[0169]
项21：根据项1至20中任一项使用的化合物，其中，待治疗的受试者不具有选自由以下各项组成的组的病况：酒精性肝损伤、药物诱导的肝损伤、慢性活动性肝炎、肝脂肪变性和肝细胞凋亡，并且优选其中患者患有炎症的脂肪肝。
[0170]
项22：根据项1至21中任一项使用的化合物，其中与nafld或nash相关的病症或病况是肿瘤疾病，例如肝细胞癌(hcc)。
[0171]
项23：一种药物组合物，包含项1至22中任一项所述的化合物。
[0172]
项24：根据项23的药物组合物，其用于项1至20中任一项所述的用途。
[0173]
项25：生产抗体或其抗原结合片段的方法，包括以下步骤：用包含gpib的胞外结构域或由gpib的胞外结构域组成的肽免疫非人类动物，并从该免疫的哺乳动物中分离表达这种抗体的免疫细胞。
[0174]
项26：根据项23的方法，其中所述抗体是项1至22中任一项所述的化合物。
[0175]
项27：鉴定适合治疗非酒精性脂肪肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)或与nafld或nash相关的病症或病况，例如从nafld或nash发展的病症或病况的化合物的方法，该方法包括以下步骤
[0176]
(a)提供(x)表达gpib或gpib变体的蛋白质或mrna的第一细胞，或提供(y)包含gpib或gpib变体的胞外结构域或(基本上)由gpib或gpib变体的胞外结构域组成的第一测试蛋白质，
[0177]
(b)提供候选化合物，
[0178]
(c)使第一细胞或第一测试蛋白质与候选化合物接触，和
[0179]
(d)在步骤(c)之后确定以下一项或两项：
[0180]
(i)候选化合物与第一细胞或第一测试蛋白质的结合；和/或
[0181]
(ii)候选化合物与第一细胞或第一测试蛋白质的结合，其中该结合与凝血酶蛋白质竞争；
[0182]
其中(i)中的结合或(ii)中的竞争性结合表明候选化合物适用于治疗非酒精性脂肪肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)，或与nafld或nash相关的病症或病况，例如从nafld或nash发展的病症或病况。
[0183]
项28：根据项27的方法，其中所述第一细胞是血小板。
[0184]
项29：根据项27或28的方法，其中所述候选化合物与所述第一细胞或所述第一测试蛋白质的结合是候选化合物与gpib的胞外结构域之间的相互作用，优选地是与凝血酶结合位点的结合，优选地与α-凝血酶结合位点的结合，其中所述结合位点位于gpib的胞外结构域内；和/或其中所述候选化合物结合gpib的胞外结构域，使得在化合物和gpib之间结合后，凝血酶(例如α-凝血酶)与gpib的进一步结合被减少或削弱，例如通过空间阻碍gpib-凝血酶相互作用和/或通过改变gpib的3维构象。
[0185]
项30：治疗非酒精性脂肪肝病(nafld)或非酒精性脂肪性肝炎(nash)或与nafld或nash相关的病症或病况，例如从nafld或nash发展的病症或病况的方法，其中所述治疗包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的与血小板糖蛋白ib(gpib)的胞外结构域特异性结合的化合物的步骤。
[0186]
项31：根据项30的方法，其中所述化合物为项1至22中任一项所述的化合物。
[0187]
附图和序列的简要说明
[0188]
附图示出：
[0189]
图1：示出nash和hcc发病率的自然史以及非酒精性脂肪肝病和肝癌的连续病理生理状态的示意图。久坐不动的生活方式和高热量摄入为脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎(nash)奠定了基础。与nash诱导的hcc相反，脂肪变性和nash似乎是高度动态的并且很可能是可逆的。nash可以在存在或不存在肝纤维化和肝硬化的情况下引起肝癌。在大约30％的所有病例中nash可以在没有纤维化/肝硬化的情况下导致肝癌。
[0190]
图2：示出血小板衍生的gpibα抑制是nash的可行靶标。(a)血清胆固醇、肝脏甘油三酯和(b)6个月nd、cd-hfd或cd-hfd/hil4rα/gp1bα-tg喂养小鼠的alt水平(n≥4/组)。通过流式细胞术对(i)中所示小鼠的肝内免疫细胞((左)cd8 t细胞、(中)活化的cd8 t细胞、(右)nkt细胞)进行定量(n≥4/组)。(c)所示小鼠的代表性h/e染色，受损肝细胞(星号)和卫星现象(satellitosis)(箭头)的迹象，比例尺：100μm 10x，和25μm 40x。(d)苏丹红染色和苏丹红阳性区域的定量，nas评估，(e)6个月nd、cd-hfd或cd-hfd/hil4rα/gp1bα-tg喂养小鼠的纤维化定量和天狼星红(sirlus red)染色(n≥4/组)。(f)12个月nd、cd-hfd或cd-hfd/hil4rα/gp1bα-tg喂养小鼠的alt水平(n≥10/组)。(g)(r)中示出的小鼠肿瘤的宏观图像，肿瘤结节用箭头表示)，比例尺：750mm。所示小鼠通过cd44v6、胶原蛋白iv(colliv)和ki67染色对hcc进行表征。箭头表示阳性肝细胞，虚线表示肿瘤(t)边界，比例尺：200μm(cd44v6和colliv)，50μm(ki67)。来自12个月cd-hfd或cd-hfd/hil4rα/gp1bα-tg喂养小鼠的hcc发病率(t＝hcc；nt＝非肿瘤)，(cd-hfd：n＝13/51；cd-hfd/hil4rα/gp1bα-tg：n＝0/24)。所有数据均显示为平均值
±
sem。*：p《0.05。**：p《0.01。***：p《0.001。****：p《0.0001。n.s.：不显著。改编自mahlemir等人，nature medicine 2019，整体通过引用并入本文。
[0191]
图3：示出缺乏功能性血小板gpibα防止肝脏脂肪变性、损伤和炎症(a)6个月cd-hfd或cd-hfd/hil4rα/gpibα-tg喂养小鼠的代表性cd42b染色(nd n＝5小鼠，cd-hfd＝5小鼠，cd-hfd/hil4rα/gpibα-tg n＝3小鼠)，比例尺：50μm。(b)血小板(绿色)/肝内皮(灰色)相互作用的3d共聚焦图像(nd n＝5只小鼠，cd-hfd＝5只小鼠，cdhfd/hil4rα/gpibα-tg n＝4只小鼠)，比例尺：20μm。(c)定量血小板(plt)聚集体大小、总plt表面积和定量观察焦点中的血小板/肝内皮覆盖率(fov；nd n＝9只小鼠，cd-hfd＝9只小鼠，cd-hfd/hil4rα/gpibα-tg n＝4只小鼠)。对于血管内事件的可视化，正弦曲线渲染的透明度设置为50％。(d)体重发展(nd n＝5只小鼠，cd-hfd＝4只小鼠，cd-hfd/hil4rα/gpibα-tg n＝3只小鼠)。统计数据：nd与cd-hfd(黑色星号)、cd-hfd与cd-hfd/hil4rα/gpibα-tg(黄色星号)。(e)ast(nd n＝4只小鼠，cd-hfd＝3只小鼠，cd-hfd/hil4rα/gpibα-tg n＝4只小鼠)，ldl和hdl水平(n＝3只小鼠/组)(f)参与脂质代谢/β-氧化的基因的实时qpcr分析(nd n＝4只小鼠，cdhfd＝4只小鼠，cd-hfd/hil4rα/gpibα-tg n＝3只小鼠)。统计数据：cd-hfd与cd-hfd/hil4rα/gpibα-tg小鼠(黄色星号)。(g)代表性cd3、f4/80、mhcii和ly-6g染色(nd n＝5只小鼠，cdhfd＝5只小鼠，cd-hfd/hil4rα/gpibα-tg n＝3只小鼠)，比例尺：50μm。(h)cd3 细胞和f4/80 聚集体的定量(nd n＝5只小鼠，cd-hfd＝5只小鼠，cd-hfd/hil4rα/gpibα-tg n＝3只小鼠)。(i)分析(a)中所示的小鼠合并肝组织的肝内细胞因子/趋化因子谱(n＝2/组)。所有数据均显示为平均值
±
sem。(c)、(e)和(h)中的数据通过单因素方差分析和事后tukey多重比较检验进行分析。(d)中的数据通过双向方差分析和事后bonferroni多重比较检验进行分析。(f)中的数据通过双尾mann whitney检验进行分析。n.s.：不显著*：p《0.05。**：p《0.01。***：p《0.001。****：p《0.0001。
[0192]
图4：示出抗gpibα抗体治疗减少nash和纤维化。(a)6个月nd或cd-hfd喂养小鼠的gpibα(绿色、绿色箭头)/kupffer细胞(红色、红色箭头)相互作用的代表性3d共聚焦图像。肝内皮(灰色)，比例尺：30μm。(b)6个月nd或cd-hfd喂养的小鼠的gpibα(绿色)/kupffer细胞(红色)和gpibα(绿色)/lsecs(灰色)相互作用的高放大倍数3d共聚焦图像和量化(n＝4/组)，比例尺：3μm。对于血管内事件的可视化，正弦曲线渲染的透明度设置为50％。(c)在6个月cd-hfd喂养的小鼠中，gpibα阻断或对照fab 5周后的代表性的h/e和cd42b染色，比例尺：50μm。血小板用箭头表示。(d)(c)中所示小鼠的血小板定量、nas评估、alt水平、肝脏甘油三酯和天狼星红阳性区域定量(n≥5/组)。
[0193]
图5：示出gpibα结构。(a)人gpibα(左)与α-凝血酶(右)在的晶体结构。(http://www.ebi.ac.uk/)。(b，a的插图)处gpib胞外结构域的晶体结构(mcewan等人，2010)。
[0194]
图6：示出免疫羊驼以产生纳米抗体。用相应的抗原(例如体外翻译的)与佐剂组合攻击羊驼。分离b细胞后——将对可变区特异性的vhhs pcr产物的b细胞来源的(deried)m-rna亚克隆到vhhs噬菌体文库中并进行细菌表达。在第一次选择纳米抗体时，通过elisa和其他特异性测定来测试这种罕见的形式——(另见第二阶段)。
[0195]
序列示出：
[0196]
seq id no：1：人血小板糖蛋白ibα链：
[0197]
实施例
[0198]
本发明的某些方面和实施方案现在将通过实施例的方式并参照本文中列出的描述、附图和表格来说明。本发明的方法、用途和其他方面的这些实施例仅是代表性的，不应被视为将本发明的范围仅限于这些代表性实施例。
[0199]
实施例显示：
[0200]
实施例1：血小板衍生的gpibα抑制是nash的可行靶标
[0201]
通过gpibα激活血小板是促进免疫细胞吸引的货物囊泡的血小板衍生分泌的先决条件。为了在遗传模型中研究，是否阻断gpibα的胞外结构域功能对疾病进展很重要，发明人用cd-hfd喂养了在gpibα-/-背景中表达il-4rα/gpibα融合蛋白的转基因小鼠6个月，其中配体结合的gpibα的胞外结构域被人il-4受体的α亚基取代(hil4rα/gp1bα-tg)(图2)。值得注意的是，与cd-hfd喂养的c57bl/6对照相比，cdhfd喂养的hil4rα/gpibα-tg小鼠的血小板聚集体大小、血小板面积和血小板-肝内皮覆盖率显著降低(图3a-c)。当喂养cd-hfd时，hil4rα/gpibα-tg和c57bl/6小鼠的体重增加相似(图3d)。cd-hfd/hil4rα/gpibα-tg小鼠中的血清胆固醇、肝甘油三酯、血清alt和ast水平显著降低(图3e)，同时伴有较少的ldl和hdl胆固醇(图3e)。类似地，在cd-hfd/hil4rα/gpibα-tg小鼠的肝脏中，cd-hfd喂养的c57bl/6小鼠肝脏中脂质代谢相关基因的失调的mrna表达被阻止(图3f)。本发明人还通过流式细胞术分析观察到肝内cd8 t和nkt细胞的强烈和显著减少。使用免疫组织化学观察到cd3 减少和巨噬细胞流入和活化减少(图3g，h)
[0202]
有趣的是，缺乏主要血小板粘附受体p-选择蛋白(selp-/-)、血管性血友病因子(vwf-/-)或mac-1(mac1-/-)(迄今为止描述的gpibα胞外结构域的同源配体)的小鼠，在cd-hfd(6个月)的情况下显示出全面的nash(nature medicine vol25/2019年4月/641-655扩展数据图8-10，通过引用并入本文)。
[0203]
这些数据表明，与gpibα胞外结构域结合的另一种配体可能对gpibα活化以驱动血小板相关免疫学、促炎功能很重要，而不会影响止血。
[0204]
最后，研究了hil4rα/gpibα-tg小鼠是否会在长期cd-hfd后发展为hcc。值得注意的是，接受cd-hfd 12个月的hil4rα/gpibα-tg小鼠表现出显著降低的纤维化、血清alt水平，并且缺乏任何hcc的宏观或微观证据(图2f，g)。这些数据表明gpibα是nash、nash-hcc治
疗的有效靶点。
[0205]
实施例2：血小板衍生的gpibα抑制是nash的可行靶标
[0206]
据假设，在nash期间，gpibα可能确实介导炎症肝脏中的血小板运输/激活，有助于有效地将免疫细胞募集到肝脏。因此，发明人分析了gpibα与nash中的实质和非实质肝细胞(lsec；kupffer细胞等)的相互作用(图4a、4b)。3d重建揭示了gpibα 血小板和kupffer细胞之间最频繁的相互作用，但在小鼠和人类样本中与lsec的相互作用较少。
[0207]
为了在6个月的cd-hfd喂养的小鼠中阻断gpibα的主要配体结合结构域，使用抗gpibα抗体pop/b的fab片段持续5周。证明该抗体结合gpibα的胞外结构域。
[0208]
值得注意的是，在nash饮食存在的情况下，这种相对较短的治疗时间框架已经显著减少了肝内血小板累积。因此，脂肪变性、nas、肝损伤和肝内免疫细胞浸润显著减少(平均减少50％以上)；纤维化被减缓(图4c和4d)。此外，抗gpibα抗体治疗降低了几种促炎和稳态细胞因子/趋化因子的蛋白质表达——将肝内血小板活化和随后的货物释放与炎症介质联系起来(malehmir等人，2019，nature medicine)。
[0209]
实施例3：抗gpibα纳米抗体的产生
[0210]
与其他方法相比，在羊驼和其他骆驼中生产纳米抗体具有明显的优势，因为可实现纳米抗体池的更大多样性，从而提供了更好的机会获得具有所需特性的纳米抗体，即高亲和力、独特的表位、最佳动力学。本发明的纳米抗体的产生如图6所示。
[0211]
正如所理解的，用三种不同的抗原制备这样的纳米抗体以产生纳米抗体。一个表位将涵盖人gpibα的整个胞外结构域。第二个抗原将含有人gpibα胞外结构域5`和3`上游的30个氨基酸(见图5)。用于免疫的最后一个肽将是19个氨基酸的片段，其涵盖位于人gpibα胞外结构域中的凝血酶结合位点。用于体外翻译的各个质粒的质量控制已经完成。
[0212]
实施例4：新型纳米抗体的筛选和验证
[0213]
在获得许多对gpibα具有未知结合亲和力和结合特异性的抗体/纳米抗体后，关于以下几个生物学特征对所产生的纳米抗体进行表征：(i)与血小板结合，(ii)体外gpibα的凝血酶结合结构域的功能性阻断，(iii)体外对血小板活化的功能影响。
[0214]
将应用五种不同的测定法：
[0215]
(i)：为了测试纳米抗体的亲和力和亲合力，本发明人进行了biacore分析以测试哪些抗体对结合到金表面的人重组gpibα具有最高的亲和力和亲合力。
[0216]
(ii)：将进行elisa以筛选/证实纳米抗体与人gpibα的结合。
[0217]
(iii)：对于与血小板的结合，将使用荧光团标记的纳米抗体进行facs分析。
[0218]
(iv)：将使用或不使用纳米抗体处理凝血酶激活的血小板，并测试血小板激活(例如通过重组凝血酶)。
[0219]
(v)为了再确保与凝血酶结合的特异性，人gpibα在小鼠中血小板上表达，无论是全长人gpibα还是具有一个氨基酸置换的gpibα突变形式，该氨基酸置换消除了凝血酶与gpibα的结合。这些小鼠的血小板将用于在体内和离体测试纳米抗体的特异性。进一步观察到凝血酶与gpibα结合的阻断，并测试抗体是否抑制凝血酶诱导的血小板活化(另见iv)。
[0220]
获得的定量结果将用于针对gpibα的凝血酶结合结构域对不同的纳米抗体进行排名。
[0221]
实施例5：在体内验证选定的纳米抗体
[0222]
对于体内验证，使用nash饮食(缺乏胆碱的高脂肪饮食；cd-hfd和西方饮食(wd))的几种鼠模型。用相应的nash饮食喂养小鼠6个月，并用血清标志物和超声(us)进行无创监测。在所有小鼠都出现nash的时间点(另见mahlemir等人，nature medicine 2019)，一个将开始使用纳米抗体进行12周的治疗。4周和8周后，通过血清标志物(alt、ast、碱性磷酸酶)无创地测试治疗功效，并将密切监测小鼠的行为——由于个体纳米抗体的意外毒性。此外，血小板在体内和离体被激活，以测试在非nash、非代谢综合征的情况下，获得的纳米抗体是否可以抑制血小板激活。
[0223]
这将包括c57b/6/j小鼠，它们由nash(cd-hfd和wd)诱导，将用鼠抗体(抗gpibα抗体)治疗
–
以便进行基线比较并评估nash可逆性
–
基于mahlemir等人，2019nature medicine的出版物(小鼠组n＝8)。
[0224]
·
nash cd-hfd 6个月饮食——随后在饮食存在的情况下进行12周治疗。
[0225]
·
nash wd 6个月饮食
–
随后在饮食存在的情况下进行12周治疗。
[0226]
·
nd-对照6个月的饮食——随后在饮食存在的情况下进行12周治疗。
[0227]
这将包括gpibα转基因c57b/6小鼠和缺乏凝血酶结合位点的gpibα转基因c57b/6小鼠，它们由nash(cd-hfd和wd)诱导，将用6种不同的预选的抗gpibα纳米抗体治疗，基于mahlemir等人，2019nature medicine的出版物(小鼠组n＝8)。用相应的nash饮食喂养小鼠6个月，并用血清标志物和超声(us)进行无创监测。在所有小鼠都出现nash的时间点(另见mahlemir等人，nature medicine 2019)，开始使用纳米抗体治疗12周。将使用两剂量治疗(高剂量和低剂量)。治疗4周和8周后，进行非侵入性分析以跟踪治疗效果。在治疗阶段结束时，处死小鼠并分析nash的肝脏组织学(例如h/e和特殊染色)，以进行nas评分、facs分析以及免疫细胞、纤维化、脂肪沉积的组织学，进行用于脂质代谢的分子分析，进行elisa和单细胞原位代谢组学。
[0228]
一组一个实验(例如人源化gpibα小鼠；每组n＝8)
[0229]
a)nash cd-hfd 6个月饮食——随后在饮食存在的情况下进行12周纳米抗体治疗。
[0230]
b)nash wd 6个月饮食——随后在饮食存在的情况下进行12周纳米抗体治疗。
[0231]
c)nd-对照6个月饮食——随后在饮食存在的情况下进行12周的纳米抗体治疗。
[0232]
组织学(h/e、苏丹红、b细胞、t细胞、t-reg等免疫组织化学)、细胞学(facs)、血清学(alt、ast)和分子分析(例如转录组、肝脏甘油三酯)将有助于鉴定用于额外实验的纳米抗体候选者。同时，对最重要的器官(心脏、肺、胰腺、肾脏、胃肠道)进行组织学分析，以分析可能的毒性作用。